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免疫突触骨架网络的表观遗传调控增强γδT细胞介导的肺癌细胞毒性

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发表时间:2021-04-19 09:55作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

γδT细胞是一种独特的T细胞亚群,它连接先天免疫系统和适应性免疫系统,并能以不受限制的方式攻击癌细胞。在实体肿瘤中进行过继性γδT细胞转移的试验取得了有限的成功。在这里,我们证明DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTis)上调了与γδT细胞活化相关的肿瘤细胞表面分子,这是通过定量表面蛋白质组学来实现的。DNMTI对人肺癌的治疗增强了体外扩增的Vδ1富集的γδT细胞对肿瘤的杀伤作用.机械地说,DNMTi通过DNA甲基化和染色质可及性的协调改变,促进免疫突触的形成,并介导细胞骨架的重组。粘附分子的遗传耗竭或肌动蛋白聚合的药理学抑制,使DNMTi的增强作用消失。临床上,DNMTi相关的细胞骨架特征可以判断肺癌患者的预后.这些结果支持了DNMTIS和γδT细胞免疫治疗在肺癌治疗中的组合策略。

导言

免疫治疗已成为肺癌治疗的一种很有前途的策略。然而,只有一小部分患者对目前的检查点阻断疗法有反应。因此,以肿瘤细胞为靶点的免疫细胞过继转移已成为一种很有吸引力的治疗方法。1,2,3。γδT细胞是T细胞的一个独特的子集,它能感知病原体感染或转化的细胞的分子应激信号,能够以一种主要的组织相容性复合体(Mhc)无关的方式显示出广泛的肿瘤靶向能力。4。这些细胞提供了潜在的治疗机会,为那些由于较低的突变负担而对检查点阻断没有反应或在TCR-MHC轴上有缺陷的患者提供了潜在的治疗机会。然而,在早期临床试验中,自体或异基因γδT细胞过继转移的效果有限。5,6,7。因此,需要更好地理解γδT与肿瘤细胞之间的肿瘤溶解相互作用,才能最大限度地提高γδT免疫治疗的疗效。

DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTis)已被美国FDA批准用于治疗血液系统恶性肿瘤。然而,这些药物作为单一药物在实体肿瘤中的治疗效果并不令人满意。有令人信服的证据表明,靶向MHC和T细胞受体(TCR)轴的DNMTis具有免疫调节作用。8,9,10,11,12。另一方面,对于DNMTis是否和如何重塑癌细胞表面蛋白以促进MHC-不受限制的识别和细胞免疫治疗中的肿瘤溶解,目前还知之甚少。此外,可能受益于这种免疫调节的患者的分子特征尚未确定。

本文以细胞培养(SILAC)为基础的定量蛋白质组学(SILAC)为基础,应用氨基酸稳定同位素标记技术,研究了DNMTis对肺癌细胞表面蛋白质组的影响。这些实验显示,短暂的DNMTi在低剂量处理后,多个MHC-无限制的免疫识别分子被上调。DNMTi诱导的表面蛋白组的基因本体论分析揭示了γδT细胞活化的高度相关性。我们证明,DNMTI对肿瘤细胞的治疗促进了体外扩增的异基因γδT细胞与肿瘤细胞之间的免疫突触形成,增强了γδT细胞的抗肿瘤免疫能力。对DNA甲基化体、mRNA-seq和Omni-ATAC-seq进行的全基因组联合分析揭示了免疫突触细胞骨架网络的协调表观调控模式。此外,原发性肺癌组织可以通过免疫细胞骨架模式进行分层,以指示对γδT介导的细胞毒性的反应,这可能有助于患者在未来的临床试验中进行精确的免疫治疗。这些发现支持了DNMTIS在肿瘤细胞骨架重构中的广泛适用性,可用于不受限制的γδT细胞治疗。

结果

DNMTi上调与γδT细胞活化相关的表面分子

FDA批准的两种DNMTis(dacgen,dac)和azacytidine(vidaza,aza)是胞苷类似物,它们结合到dna/rna中,通过酶的不可逆结合来消耗dnmts,然后蛋白酶体降解。13。DNMTis已被证明在转录水平上调节与抗原处理/呈递、人类白细胞抗原(HLA)和干扰素反应有关的不同癌症类型的通路。11,12.

尽管如此,这些转录改变可能并不能完全反映表面蛋白的改变,这些改变解释了免疫治疗的易感性。因此,我们试图通过用EZ-link Sulfo-NHS-SS-生物素辅助生物素法从A 549人肺癌细胞中分离细胞表面蛋白,获得一种由十硝巴滨(DAC)改变的表面蛋白的综合图谱,然后采用基于SILAC的定量蛋白质组学方法(图1)。1A)14。我们采用了在我们之前的研究中建立的低剂量治疗方案来显示药物的表观遗传效应而不是细胞毒性。15。首先,在含有高浓度精氨酸(L-Arginine-)的细胞培养基中,对肺癌细胞进行差异标记。13C6)/赖氨酸(L-赖氨酸-13C6)或正常精氨酸/赖氨酸。SILAC标记细胞(重细胞)和未标记细胞(轻细胞)分别用磷酸盐缓冲液和100 NM DAC处理3天(D3),在无药培养基中再培养3天(D3R3)(图3)。1B)。细胞表面蛋白经生物素化后,D3和D3R3处理细胞的总细胞裂解物为1:1,与相应的模拟蛋白混合,经表面蛋白分离后进行定量蛋白质组学研究。我们分别在D3和D3R3的A 549细胞中鉴定了666和831基因本体(GO)注释的表面蛋白(对应于8791和11,898个独特的肽)。(无花果)1C和补充图。1A)。停药后发现的表面蛋白持续增加,这与我们先前关于短暂药物暴露后表观遗传记忆效应的报道是一致的。15。在所有已鉴定的蛋白质中,我们主要关注314种蛋白质,它们在dA治疗后持续上调至少1.4倍于D3和D3R3,因为它们在停药后继续诱导,提示可能是表观遗传调控(图1)。1D)。其中许多是与免疫相关的蛋白质。除了MHC分子和某些免疫检查点蛋白,这些蛋白质以前被DAC上调。11,12我们发现了大量参与天然免疫或MHC-无限制免疫的蛋白质,如MHCⅠ类多肽相关序列A和B(即MICA,MICB),它们是NKG2D在γδT和NK细胞上的配体(图)。1E)16,17。DAC还上调UL16结合蛋白2和3(即ULBP 2和ULBP 3),这是另一组NKG2D配体,在许多癌症和应激/受损组织中表达。1E)18,19,20。这些分子已被确认为天然免疫系统用于肿瘤免疫监视的靶点,并可诱导抗肿瘤免疫,而不需要常规的mhc限制抗原呈递。21。此外,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的两种死亡受体(即TRAIL-R1和TRAIL-R2)作为免疫监测的一部分可诱导肿瘤细胞凋亡。22D3R3显著上调(图1)。1E).

图1:倍他滨促进与γδT细胞活化有关的表面免疫分子。

a细胞培养中氨基酸稳定同位素标记(SILAC)的定量蛋白质组学在模拟处理的肺癌细胞中的生物素化表面蛋白的实验图。SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,LC-MS/MS液相色谱-串联质谱。bDAC每日100 nm治疗72h(D3),停药3d(D3R3)。cVenn图显示A 549细胞在D3和D3R3处鉴定的表面蛋白数目。dD_3和D_3R_3作用于A 549细胞后表达的蛋白散点图。e热图显示dac处理的A 549细胞在D3和D3R3时免疫相关表面分子的变化为对数2倍。fVenn图显示A 549、H 1299和CL1-0细胞在D3R3上常见的表面蛋白数目。g在D3R3处理A 549、H 1299和CL1-0细胞表面蛋白质组中,与模拟细胞相比,BAR图显示了与天然免疫相关的所选表面蛋白的相对丰度。n=1适用于单个细胞株的每次处理。h德西他滨在D3R3上调蛋白免疫相关途径的黑豹基因列表分析。FDR错误发现率

有趣的是,对另两株人肺癌细胞株H 1299和CL1-0中SILAC基表面小体的分析显示,DAC诱导的表面蛋白具有高度相似的结构。在D3R3肺癌细胞株中,D3R3共表达431种蛋白。1F和补充图。1B)。Dac诱导的表面分子参与天然免疫反应是很明显的,我们将这些蛋白质与innatedb的天然免疫相互作用(Innatedb)进行了映射,这是一个关于天然免疫途径和相互作用的广泛策划的数据库。23。我们发现DAC介导的天然免疫分子参与粘附/细胞-细胞相互作用(如CD 97和ICAM-1)、细胞骨架(如ARPC 2和Vasp)、热休克蛋白反应、整合素相关通路和各种信号转导网络(图1)。1g)。接下来,我们使用黑豹基因列表分析工具进行了基因本体(GO)术语的丰富。24在DAC诱导的表面蛋白质组上寻找相关的免疫途径。值得注意的是,γδT细胞激活是所有免疫相关过程中最重要的富集途径,其次是自然杀伤(NK)细胞介导的免疫--这两种主要的免疫细胞类型参与了对癌症的天然免疫应答(图1)。)7,25.

具有抗肿瘤功能的人Vδ1γδT细胞的体外扩增

根据dac介导的表面小体数据,我们认为表观基因治疗有可能增强γδT细胞对肿瘤的攻击。为了对γδT细胞进行临床前功能研究,本研究小组在γδtcr/CD3激动剂抗体存在的情况下,进一步优化了一种序贯细胞因子刺激方案,用于γδT细胞的体外临床分级扩增,优先富集Vδ1+亚群“DeltaOne T”(DOT细胞)。26,来自健康献血者的外周血。这一过程不需要前几次报告中所示的γδT细胞纯化和αβT细胞耗竭的步骤。26,27,28。在21天内,CD3+细胞群中γδT细胞总数的百分比从10%以下增加到90%以上,而Vδ1+T细胞约占γδT细胞总数的70%。2A和补充图。2A)。一致地,我们观察到Vδ1 T细胞1571-14,245倍(第21天/天0),但在另5名健康供者中仅为Vδ2 T细胞的3至59倍,使用相同的方案(补充图)。2B,c)。为了评估扩增的γδT细胞的免疫表型,我们在基线和体外扩增后用抗体板对PBMCs进行了单细胞分析,以表征T细胞和MHC-不受限制的免疫相关受体。我们采用t分布随机邻居嵌入(t-SNE)方法研究了T细胞在体外扩张前后的差异和细胞异质性。扩张14天后外周血中Vδ1+细胞优先富集(图1)。2B和补充图。3A,b)。在扩大的Vδ1+亚群中,我们观察到MHC-非限制性免疫相关受体的差异表达,包括NKG2D、CD 226、CD 244、NTB、CRACC和NKp 30,这些受体的表达水平呈高度相关(图一)。2C)。此外,我们体外扩增的γδT细胞表达溶细胞脱颗粒标记物(如CD107a)以及分泌抗肿瘤效应细胞因子(即肿瘤坏死因子和干扰素-γ)。另一方面,扩增后的γδT细胞几乎不分泌肿瘤原或负调节细胞因子,如IL-17A和IL-10,也不表达与精疲力竭状态相关的免疫检查点PD-1(如图1所示)。2B和补充图。3B,c)。这就排除了在体外扩增方案中持续的细胞因子刺激会导致γδT细胞过早衰竭的担忧。数据表明,扩展的DOT样细胞(以下简称γδT细胞)处于激活和增殖阶段,其抗肿瘤表型适合于潜在的治疗用途。

图2:倍他滨增强γδT细胞介导的肺癌细胞溶解作用.

a条形图显示了γδT细胞亚群在CD3+人群中的百分比,这些亚群来自健康供者体内扩张后的外周血。数据表示为均值(SEM)的平均±标准误差。n=3,独立实验。b外周血单个核细胞CD3+T细胞TSNE图谱在基线和体外扩增后的叠加用质量流式细胞仪分析。每个点代表一个单元格。颜色表示指示标记的表达式级别。红色高,蓝色低。c体外扩增γδT细胞表达标志的皮尔逊相关分析。d10 0 NM十氮他滨单独、γδT细胞单独或DAC/γδT细胞联合治疗人肺癌细胞株AnnexinV和PI凋亡的典型流式细胞术分析。效应器与靶标(E:T)之比为3:1,门控策略如附图所示。16. e中所描述的细胞凋亡分析的三个生物复制点图(平均±扫描电镜)d. f恶性胸腔积液患者肺癌细胞系pd#0899的AnnexinV和碘化丙啶细胞凋亡检测(平均±SEM)n=3,独立实验)。gγδT细胞(上腔)向模拟或dac处理的肺癌细胞(下腔)迁移的Transwell分析。每个高功率场计算低室中的γδT细胞数。γδT细胞(Hoechst 33342标记;绿色)和肺癌细胞(Calcein-保留;红色)的典型图像显示在下腔室。数据以平均±标准差(SD)表示。n=15个高功率场,通过三个独立的实验。标尺:100μm。p值采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验(面板)计算。a, ef)或双边曼恩-惠特尼试验(g).

DnMTi增强γδT细胞介导的肺癌细胞杀伤作用

随后,我们研究了低剂量dac预处理是否能增强肺癌细胞对γδT细胞攻击的敏感性。首先,我们发现未经治疗的肺癌与γδT细胞以3:1的效应物与靶标(E:T)的比例进行体外共培养时,A 549人肺癌细胞的细胞溶解率仅为20-30%(附图)。4A)。100 NM DAC对人肺癌细胞(HCC 827、H 1299和A 549细胞)72h后,能显著增强γδT细胞在相同E:T比下对肺癌细胞的杀伤作用。另一方面,仅用AnnexinV和碘化丙酸丙啶进行细胞凋亡分析,可导致微小或中度细胞死亡(图二)。2D,e)。我们观察到类似的增强作用在其他几个肺癌细胞系,包括H 2981,PC9,PC9-IR(Iressa抗药性),H 157,CL1-0和CL1-5,以及来自恶性胸腔积液的肺癌细胞,PDC#0899(见图)。2F和补充图。4B)。我们还跟踪了dac对γδT细胞杀伤的增强效应,这是一种实时监测γδT细胞杀伤过程的生物物理方法。γδT细胞介导的细胞溶解通常在30分钟至几小时内发生.在不引起明显细胞毒性的剂量下,DAC预处理可以增强这种效应(补充图)。4C)。值得注意的是,这种增强作用可以观察到在其他类型的肿瘤,如HCT 116结肠癌细胞(补充图)。4D)。另一方面,我们观察到,与体外扩增的γδT细胞联合治疗后,健康供者外周血单个核细胞的细胞毒性没有明显增加;补充图。4E),提示这种增强效应可能不影响正常细胞。

活化的γδT细胞除了通过直接接触而产生颗粒外吐依赖的细胞毒性途径外,还可能通过分泌TRAIL受体和下游凋亡途径的途径,通过非接触细胞毒性触发癌症死亡。29,30。为了评估分泌TRAIL介导的凋亡在dac增强作用中的意义,我们使用了一个跨阱系统,允许γδT细胞分泌的轨迹扩散到没有直接细胞接触的癌细胞。24小时后未见明显的癌细胞死亡(附图)。5),提示dac增强的γδT细胞杀伤需要直接的细胞接触.此外,我们还评估了dac是否通过一种允许γδT细胞通过膜的跨孔共培养系统来增强γδT细胞的趋化作用,并且在底部井中,γδT细胞迁移到模拟治疗或dac治疗的肺癌细胞的数量没有显著差异。数据表明,DAC的增强作用不依赖于γδ启动的癌细胞增加对T细胞的趋化作用(图1)。2G).

DNMTI促进肿瘤与γδT细胞间突触的形成

由于免疫细胞对癌细胞的有效溶解依赖于功能性的免疫突触来促进溶解颗粒的定向和协同传递。31我们用磷酸化酪氨酸(PTyr)的免疫荧光染色法研究了γδT细胞与dac预处理的癌细胞之间形成免疫突触的效率。pTyr是一种具有活性信号的免疫突触标记物。32。我们观察到在γδT和dac处理的H 1299肺癌细胞之间形成的免疫突触数目比模拟处理的细胞高得多(图1)。3A)。为了寻找参与突触相互作用的关键分子,我们比较了DAC诱导的两株人肺癌细胞株H 1299和A 549的表面蛋白组。在已鉴定的蛋白质中,细胞间粘附分子1(ICAM-1)在两种细胞系中均有较高的表达(图一)。3B)。WESTERNBLOTTING证实DAC能显著上调许多肺癌细胞系和来自恶性胸腔积液的肺癌细胞系pdc#062中的ICAM-1蛋白(如图1所示)。3C)。ICAM-1是一种表面糖蛋白,是免疫球蛋白超家族的成员.它作为一种普遍的粘附分子存在于免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞中。我们证明,ICAM-1与其他经典免疫突触蛋白(包括LFA-1和T细胞激活剂)一起定位于肿瘤-γδT免疫突触内(LAT;图1)。三维空间)。有趣的是,击倒了ICAM 1(高-ICAM 1)与CRISPR技术(补充图)。6a,b)在肺癌细胞(A 549、H 1299和CL1-0)中,A 549、H 1299和CL1-0最终降低了A 549、H 1299和CL1-0对三种细胞株γδT细胞杀伤的增强作用(图1)。3E,f)。另一方面,过度表达ICAM 1(奥夫-ICAM 1)在肺癌细胞株中使用Tet-on系统(补充图)。6B)明显增强γδT细胞对人肺癌细胞的杀伤作用,模拟dac预处理的作用。3G,h)。如预期,发援会处理ICAM 1-基因敲除细胞未能促进肺癌与γδT细胞之间的免疫突触形成(如图所示)。3I)。这些数据表明,ICAM-1介导的突触结构的粘附和稳定是DAC增强γδT细胞抗肿瘤免疫的关键。

图3:替米他滨促进肺癌与γδT细胞间免疫突触的形成。

aP酪氨酸染色对H 1299肺癌与γδT细胞免疫突触的免疫荧光显像每个肿瘤细胞的免疫突触在每种治疗的8个随机高功率场上的定量显示在点图中(平均±SD)。标尺:100μm.DAPI:4‘,6-二氨基-2-苯环吲哚.bD_3R_3诱导H 1299和A 549细胞表面蛋白组的散点图。c人肺癌细胞ICAM-1表达的Westernblot分析。β-肌动蛋白:加载控制。进行了两个独立的实验。dγδT与DAC处理的H 1299肺癌细胞免疫突触ICAM-1的免疫荧光染色。标尺:10μm。eCRISPR基因敲除法检测H 1299肺癌细胞凋亡ICAM 1(高-ICAM 1肺癌细胞受γδT细胞杀伤作用2h,分别用模拟T细胞、dA T细胞、γδT细胞或γδT细胞联合治疗。f显示三种人肺癌细胞株(KO-)细胞死亡的条形图ICAM 1)以γδT细胞杀伤2h,对每个细胞株的两个独立的敲除克隆进行了总结(平均±扫描电镜)。gTet on表达系统检测H 1299肺癌细胞凋亡ICAM 1(奥夫-ICAM 1)γδT细胞杀伤2h。h显示人肺癌细胞死亡的条形图ICAM 1γδT细胞杀伤2h后,各细胞株分别获得两个独立高表达克隆的数据(均值±扫描电镜)。iH 1299 kO-间免疫突触的免疫荧光显像ICAM 1细胞和γδT细胞。标度:100μm,每个肿瘤细胞在6个随机高功率场上的免疫突触的定量显示在点图中(平均±SD)。这个p数值由双边Mann-Whitney检验(a, i)或单向方差分析(f, h)。面板浇口策略eg如附图所示。16.

虽然Vδ1细胞是体外扩增的γδT细胞的主要细胞亚群,但细胞制剂中可能含有Vδ2细胞和CD8 T细胞的小亚群。2A和补充图。2)。为进一步分析各细胞亚群对免疫突触形成和肿瘤溶解活性的潜在贡献,采用荧光活化细胞分选法分离出单个细胞亚群(Vδ1、Vδ2和CD8 T细胞),与H 1299肺癌细胞进行共培养实验。值得注意的是,Vδ1细胞表达的CD107a水平高于Vδ2或CD8 T细胞(补充图)。7a,b)。我们还观察到肿瘤细胞与Vδ1细胞之间形成的免疫突触数目多于Vδ2或CD8 T细胞(附图)。7C)。数据表明,Vδ1细胞可能是γδT细胞介导的抗肿瘤反应的主要参与者,因为它们在细胞数量和功能能力方面占主导地位。值得注意的是,γδtcrs的假定配体对非Vδ1细胞(如Vδ2细胞),包括btn 2A1细胞。33,34、BTN3A35,以及其他36,从我们的表面蛋白质组学研究来看,DAC并不总是在所有的癌细胞株中被上调(补充图)。8A),BTNL 3也不是37,Vγ4Vδ1 TCRs的配体。因此,在这种背景下,这些配体对γδT细胞的杀伤活性可能不是必需的。

此外,我们还进行了γδTCR和NKG2D阻断试验,以确定DAC介导的ICAM-1上调是否通过γδTCR或NKG2D在γδT细胞与DAC预处理的肺癌细胞之间的界面覆盖传统的肿瘤识别机制。值得注意的是,阻断NKG2D衰减的γδT-介导的细胞溶解dac预处理的肺癌细胞(补充图)。8BNKG2D受体配体轴对γδT细胞的免疫识别也有重要作用,DNMTI诱导ICAM-1的作用进一步加强了成功的肿瘤溶解所需的细胞与细胞的相互作用。

DNMTi通过重新排列细胞骨架来稳定突触间隙

当我们进一步破译DAC如何影响突触结构以发挥MHC-无限制细胞毒性时,我们观察到在免疫突触附近的癌细胞膜上有明显的丝状肌动蛋白(F-actin)积累(如图所示)。4A,b)。当我们击倒ICAM 1在H 1299肺癌细胞中,DAC诱导的F-肌动蛋白在免疫突触中的积累明显减少(图1)。4C和补充图。9A),这与突触间隙宽度明显减少有关(见图)。4D)。相比之下,dac处理的肺癌细胞ICAM-1表达正常,在癌和γδT细胞之间建立了明显的突触分裂的免疫突触(如图所示)。4D)。值得注意的是,细胞松弛素B(CytoB)对肌动蛋白聚合的药理作用阻断了DAC诱导的免疫突触F-actin聚集和pTyr信号,但对ICAM-1表达的影响微乎其微(如图1所示)。4E和补充图。9B)。此外,细胞松弛素B也减少了DAC对突触间隙宽度的影响(补充图)。9C,d)。此外,细胞松弛素B显著抵消DAC对免疫突触形成的增强作用(图一)。4F,g)。因为F-actin的积累和较大的突触间隙是激活而不是抑制性免疫突触的特征。38,我们的数据表明,DAC重塑了肌动蛋白的细胞骨架,以促进肿瘤与γδT细胞之间激活免疫突触的形成。

图4:依地他滨通过增强肌动蛋白细胞骨架来稳定免疫突触裂开。

aγδT细胞与dA预处理的H 1299肺癌细胞在D3R3处免疫突触的F-actin(红色)、ICAM-1(绿色)、pTyr(磷酪氨酸,白色)免疫荧光染色。DAPI:4‘,6-二氨基-2-苯基吲哚。标尺:10μm,进行3个独立实验。bγδT细胞与H 1299肺癌细胞界面的免疫荧光图像ICAM 1击倒ICAM 1))。F-肌动蛋白(红色)信号在H 1299癌细胞的周围显示在下面板的二维半维(2.5D)图像中。标尺:10μm,进行3个独立实验。cγδT细胞与H 1299肺癌细胞(亲代或KO-)之间5个pTry阳性免疫突触F-actin和ICAM-1信号强度的点图ICAM 1)三个独立实验(平均±SD)。dγδT细胞(T标记)与H 1299肺癌细胞(C标记)免疫突触免疫荧光图像(ICAM-1,F-actin,pTyr)染色。进行了三个独立的实验。eγδT细胞与H 1299细胞免疫突触F-actin信号强度的点图。H 1299细胞经PBS(Mock)、DAC单独或DAC预处理(D3R3)和1μg/mL CytoB(细胞松弛素B)预处理后,与γδT细胞共培养1.5h(平均±SD)。n=13-20个免疫突触通过三个独立的实验。fγδT细胞与H 1299细胞间免疫突触的免疫荧光图像显示:PBS单独处理,DAC与CytoB联合处理,每组治疗的方形区域的鼓膜图像均显示在下面板上。箭头表示γδT和H 1299细胞之间的免疫突触。标尺:100μm(上)和20μm(下面板)。进行了两个独立的实验。g用PBS(Mock)、DAC和DAC和CytoB(平均±SD)联合处理的H 1299细胞,在8个高功率场上显示每个癌细胞的免疫突触数。这个p数值由双向变异数(c)或单因素方差分析与Tukey的多重比较检验(e, g).

Dnmts的缺失导致γδT敏感的细胞骨架基因模式

正确的细胞骨架动力学和免疫细胞的排列是令人满意的免疫反应的关键。然而,细胞骨架在免疫突触的癌细胞侧的表达模式、它们的调控以及相关的功能后果仍然不完全清楚。根据我们对DAC诱导的肌动蛋白细胞骨架重组的观察。4)我们推测,Dnmts的破坏可能与免疫相关的细胞骨架基因网络的协调调控有关。事实上,dac处理后的5种肺癌细胞系(a 549、cl1-0、cl1-5、pc 9和h 1299)的全基因组mrna-seq数据显示,参与细胞骨架动力学和重组的基因/酶具有明显的诱导作用,包括CORO1A39, HCLS 140, FES41,其中之一(图1)。5A)。基因集富集分析(GSEA)也揭示了与肌动蛋白细胞骨架重组相关的基因集和中间丝基过程的显著富集。相反,与微管相关的基因似乎被下调了(图一)。5B,c)。同样地,dnmts的基因缺失也会重述类似的细胞骨架基因表达谱,因为我们分析了结肠癌细胞系(例如hct 116和ddd 1)的转录数据,而shRNA的目标是丁姆特s42(无花果)5D)。因此,数据表明,特定的细胞骨架重塑模式是DNMT依赖的。

图5:Dnmts的缺失诱导γδT敏感细胞骨架基因在癌细胞中的表达.

a火山图显示dac处理与模拟处理的人肺癌细胞(即A 549、CL1-0、CL1-5、PC9和H 1299)的差异表达基因。Y轴表示统计意义(−log 10p-价值),以及x轴显示dac处理组和模拟处理组之间的log 2倍变化值。与肌动蛋白细胞骨架、中间丝、微管相关的基因分别以红色、蓝色和绿色标记。b5种DAC处理的肺癌细胞系A 549、CL1-0、CL1-5、PC9和H 1299 mRNA-seq数据的基因集富集分析(GSEA)。显示了与肌动蛋白-细胞骨架重组、中间丝基过程和微管相关基因模块相关的基因集。其他规范化富集评分,GO基因本体论。c用mRNA-seq法检测dac处理和模拟处理的人肺癌细胞肌动蛋白-细胞骨架、中间丝和微管相关过程核心富集基因mRNA的表达。每百万个映射读取的转录本每千字节的FPKM片段。dDNA甲基转移酶1(DNMT 1)基因敲除人大肠癌细胞系HCT 116和DLD 1 mRNA-seq数据的基因集富集分析(GSEA)。显示了与肌动蛋白-细胞骨架重组、中间丝基过程和微管相关基因模块相关的基因集。其他标准化浓缩分数。e框状图显示了100 nmdac处理的人肺癌细胞肌动蛋白细胞骨架、中间丝和微管相关基因模块基因启动子甲基化状态,然后进行3天无药培养(D3R3)。方框表示第25百分位数、中位数和第75百分位数。晶须指示最小值和最大值。甲基化数据由甲基化铟(Infinium MethylationEPIC)阵列分析。n=1适用于单个细胞株的每次处理。M模拟治疗,D DAC治疗。f在肌动蛋白-细胞骨架重组、中间丝基过程和微管相关模块的肌动蛋白细胞骨架重组(−3~+3kb)和微管相关模块上,dac处理的肺癌细胞株的相对染色质可达性(tss 3~+3kb)。TSS转录起始位点。

此外,DAC处理后这些细胞骨架基因的表观遗传调控似乎是一个高度协调的过程。用甲基化铟(Infinium MethylationEPIC BeadChips)检测人肺癌细胞中肌动蛋白(Actin)细胞骨架、中间丝和微管三个细胞骨架基因的启动子DNA甲基化状态,发现肌动蛋白基因模块中的基因在基线时有较高的启动子DNA甲基化,经DAC处理后去甲基化。相比之下,微管模块中的基因往往具有较低的基线甲基化水平,而DAC对甲基化水平的影响最小(图1)。5E)。我们表演了Omni-ATAC-seq43探讨染色质可及性在DAC细胞骨架模块转录调控中的作用。一般情况下,在基线处具有较高启动子DNA甲基化水平的基因往往具有不可接近的染色质,在DAC治疗后,染色质的可获性较低,但至关重要。有趣的是,由DAC上调的低基础启动子DNA甲基化的基因在TSS上有可访问的染色质,在DAC治疗后仍可获得染色质(补充图)。10)。当我们仔细检查细胞骨架相关基因的染色质模式时,我们观察到肌动蛋白或中间丝相关过程中基因启动子处的中度染色质变化。5F)。相比之下,dac下调的微管相关基因的启动子染色质可获性明显降低。5F)。协调的调控模式可以通过每个细胞骨架模块中的单个基因来体现-EVPLL, TUBE 1,和DAPK 3(补充图。11).

TP 53是突触细胞骨架和表观遗传蛋白的枢纽。

为了进一步阐明表观遗传蛋白与免疫突触细胞骨架的关系,我们对肺癌细胞株中的DAC转录产物进行了基因网络分析,揭示了免疫突触分子、细胞骨架和表观遗传蛋白之间的密切联系(附图)。12A)。如网络所示,我们发现微管组织中的基因普遍被下调(即,TUBG 1, DCTN 1,和PLK 1)。相反,参与肌动蛋白和中间丝动力学的基因(即,CORO1A, GFAP,和DES)被上调。ICAM 1将表面免疫受体/HLA分子与细胞质中的细胞骨架连接起来,连接到TP 53和其他表观遗传修饰语(即,丁姆特S,HDACS,和SMARCA 4)在细胞核中(补充图。12A)。进一步的上游调控分析表明T细胞效应细胞因子,如IFNG肿瘤坏死因子,可能增强dac诱导的免疫表面分子的表达模式,包括ICAM 1, ICOSLG,和赫拉补充图S.12b)。此外,TP 53似乎是一个枢纽基因,介导免疫表面分子和细胞骨架在表观遗传修饰反应中的协调变化,暗示一种功能性基因。TP 53网络是有效的免疫增强作用所必需的DAC(补充图)。12C).

DNMTI调制功能γδT细胞亚群

为了评估γδT细胞在临床中可能同时发生的影响,我们用大量的流式细胞术分析了γδT细胞的表型和功能免疫参数。采用x-移位算法对两组细胞的数据进行聚类,计算未处理和dac处理的扩展γδT细胞中各亚群体的频率。如附图所示。13A在CD3+T细胞中发现14个簇(T1~T14,按未处理组和DAC处理组之间的频率差异排列),每组均有明显的表型和功能效应特征。重要的是,dac处理后诱导的前两个细胞簇与Vδ1相对应,并表达较高水平的CD 226、CD 244、CD2和crac,以及更强的功能效应,包括CD107A、TNF、颗粒酶B、IL-2和IFN-γ,而非dac处理后细胞频率下降(补充图1)。13B)。这一结果得到了用10 NMDAC处理的5例健康人Vδ1 T细胞的证实。我们观察到抗肿瘤效应细胞因子如干扰素-γ和肿瘤坏死因子的产生有增加的趋势。13C)。此外,在dac治疗后,5人中有3人(供者#1、#3和#5;补充图5)中的3人共同表达两个或多个效应细胞因子的多功能Vδ1+细胞百分比显著增加。13D)。由于多功能T细胞常被认为是保护性免疫的标志44,45,46增加γδT细胞多功能的数据进一步加强了γδT细胞联合治疗和过继转移的理论基础。

DNMTI与γδT细胞联合作用延长小鼠存活时间

随后,我们研究了腹腔注射dac(Dac)后体外扩增的人γδT细胞(静脉注射)在免疫低下的NSG(NOD.cg-prkdc)中的过继转移的体内效应。SCIDIL2RGTm1Wjl/SzJ)荷瘤小鼠H 1299人肺癌异种移植。6A)。与接受生理盐水或单独治疗的小鼠相比,联合治疗组小鼠的肿瘤较小,总体生存率明显提高(图一)。6a,b)。在病理上,联合组肿瘤组织不仅体积较小,而且结构松散,纤维化明显。相比之下,对照组肿瘤组织似乎是超细胞性的,有出血和坏死的区域(如图所示)。6C)。值得注意的是,在体内对γδT细胞迁移的成像显示,γδ治疗组静脉注射γδT细胞后数小时,γδT细胞归巢能力增强,γδT细胞明显浸润,而对照组肿瘤内γδT细胞浸润不良(如图1所示)。6d)。这些数据证明了将DAC与γδT细胞过继转移结合在体内治疗肺癌的前景。

图6:倍他滨联合过继转移γδT细胞可延长肺癌移植小鼠的存活时间。

aNOD-SCID IL2RG的体内实验(NSG)荷瘤小鼠H 1299人肺癌异种移植用DAC,过继人γδT转移,或两者兼用。每次给药周期连续3天腹腔注射,第5天和第12天静脉注射体外扩增的γδT细胞。治疗第3周期后第1天处死小鼠γδT细胞。手术切除肿瘤,测量肿瘤重量。统计结果采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验。n=9只小鼠来自两个独立实验(平均±SEM)。S.C.皮下。b给出各治疗组NSG小鼠Kaplan-Meier生存曲线。这个p数值由Mantel-Cox检验(单边)计算.c各治疗组小鼠典型肿瘤的Η、ematoxylin和eosin(H&E)染色。整个肿瘤的图像是由数字幻灯片扫描仪生成的。d肺癌移植小鼠模型中γδT细胞转运的体内成像研究。体外扩增的γδT细胞用Cyto-ID红长期细胞示踪剂染色。将荷H 1299肺癌异种小鼠腹腔注射dA(0.2mg/kg体重)或生理盐水,连续3d(第1~3天),第5天和第12天尾静脉注射γδT细胞,于注射γδT后2、4 h进行重复实验。这里显示了有代表性的图像。BF亮场,白色圆形肿瘤区。

细胞骨架基因信号预测肺癌患者的生存

在临床试验设计中,正确的病人选择是治疗成功的关键。为了研究dac诱导的细胞骨架信号是否可能对患者的一般免疫反应和(或)表观遗传启动的γδT细胞治疗有潜在的分层作用,我们在台大医院和tcga门户检查了原发性肺癌组织的rna-seq数据。基于来自肌动蛋白-、中间丝-和微管相关基因模块的核心富集基因的原发性肺腺癌组织的无监督聚类。5C)显示三组:免疫敏感组、免疫中间组和免疫不敏感组(如图所示).7A)。免疫敏感组和免疫中间组肿瘤组织中γδTCR基因也有较高表达(附图)。14)。为了进一步探讨细胞骨架特征与免疫应答之间的关系,我们使用由一种改进的cibersort算法生成的cibersor-lm7参考基因标记矩阵,对来自tcga肺癌组织的转录数据进行了计算反褶积。47。我们发现,除γδT细胞外,免疫敏感组的CD4、CD8 T细胞、B细胞、粒细胞、单核细胞和NK细胞等免疫细胞的基因标记也比免疫中间组和免疫不敏感组丰富(补充图)。15)。值得注意的是,我们观察到具有免疫敏感性特征的患者的最佳整体存活率,与dac诱导的肺癌细胞免疫应答模式相对应(肌动蛋白和中间丝模块被上调,微管模块被下调)。7b)。相反,在NTUH和TCGA队列中,免疫细胞不敏感的信号与最糟糕的预后有关(见图)。7b)。该数据强调了细胞骨架表观遗传重组作为判断患者预后的临床指标的重要性,并可用于患者的选择,以最大限度地利用γδT细胞治疗肺癌患者的益处。

图7:肺癌患者的免疫细胞骨架基因标记分层。

a来自台大医院原发性肺腺癌组织mR-seq数据的免疫细胞骨架基因标记热图(NTUH,上)和癌症基因组图谱(TCGA,下)。b免疫细胞骨架基因标记与不同γδT敏感性相关的NTUH(上)和TCGA(下)肺腺癌患者的总体生存分析。这个p数值由Mantel-Cox检验(单边)计算.

讨论

DNA甲基转移酶抑制剂是一种多功能的免疫调节剂。8,48,除了它们的抗肿瘤作用49。这些药物不仅可以增强癌细胞的免疫原性。9,12,50,51但也被证明可以调节αβT细胞的命运决定、分化和衰竭。52,53。尽管DNMTis对检查点抑制剂有增强作用8高突变负荷的肿瘤需要触发常规的αβtcr驱动的、mhc限制的免疫反应,这限制了该方法的额外治疗效益。54。另一方面,不依赖mhc依赖性癌症识别的细胞免疫疗法的临床兴趣正在上升。55,56。采用定量表面蛋白质组学方法和表观/转录分析相结合的方法,通过上调粘附分子和重组免疫合成细胞骨架网络,增强肿瘤与γδT细胞的接触,揭示了DNMTis促进肿瘤细胞溶解的免疫调节作用。

γδT细胞是T细胞的一个独特的子集,它结合了适应性特征和快速的、与生俱来的反应。人γδT细胞的两个主要亚群Vδ1+和Vδ2+是通过重组TCRγ和δ链来定义的。Vδ1+T细胞主要分布于外周组织,具有较强的抗肿瘤能力,不需要抗原抗体,就像Vδ2+T细胞一样。57,58,59。然而,由于缺乏可靠的扩张方案,Vδ1+T细胞的临床应用受到限制。相反,Vδ2+T细胞可通过氨基双膦酸盐(如唑来膦酸)或磷抗原轻易膨胀,在大多数临床试验中使用,但对实体肿瘤的临床疗效有限。5,6。此外,某些γδT亚群可能具有促进肿瘤的功能。7因此,在用于治疗目的的细胞扩张过程中,应谨慎行事。鉴于DOT细胞生成协议的最新进展26,27,28我们改进的扩展方案消除了αβT耗竭的需要,用抗肿瘤免疫的方法丰富了Vδ1+T细胞,而不是原肿瘤IL-17产生的γδT细胞,这些细胞已经被证明能促进肿瘤的进展。60,61。这种Vδ1+细胞的临床分级扩增方案可促进目前γδT细胞治疗的完善,也可促进双重功能嵌合抗原受体工程的人类γδT细胞(car-γδT细胞)的发展,该T细胞对应激信号和特定的肿瘤抗原均有反应。62,63.

值得注意的是,DNMTis可以重建癌细胞的免疫细胞骨架,或上调ICAM-1等一般粘附分子。这些结构成分在正常生理中起着重要的作用,也存在于正常细胞中。然而,我们没有观察到明显的毒性或正常组织损伤在体外或在体内。DNMTI的增强作用可能是建立在γδT细胞现有的肿瘤识别能力基础之上的。在初次相遇后,药物可以增强γδT与癌细胞之间的相互作用。事实上,我们已经证明,阻断NKG2D可以减弱γδT介导的DC预处理的H 1299肺癌细胞的细胞溶解作用(附图)。8B),提示γδT细胞的传统肿瘤识别机制,如NKG2D/NKG2DL相互作用,部分参与了γδT对dac处理细胞的杀伤作用。64。另一方面,NKG2DL对癌细胞的表观遗传上调可能不是DNMTi增强作用的唯一决定因素。在不同肺癌细胞株的蛋白质组学数据中,DNMTi诱导的γδ、TCR或NKG2D配体的上调存在于某些但不是所有的细胞系中,观察到DNMTis的增强作用。此外,每个γδTCR亚型似乎都有自己的特定目标配体。一种特定的表面配体对γδT介导的杀伤作用的一般增强作用不太可能是由一种特定的表面配体引起的。因此,我们通过协调表观遗传过程发现DNMTi介导的细胞骨架重组,为提高γδT型治疗的有效性提供了一个缺失的环节。

此外,我们在免疫突触的靶细胞侧的免疫突触-细胞骨架网络的数据具有非常重要的临床意义。值得注意的是,根据这一表观遗传的细胞骨架基因标记,两个独立患者队列中的原发性人类肺癌组织可以被清楚地分层。这意味着细胞骨架安排是癌细胞的固有特征,可以作为选择那些可能直接对细胞免疫疗法产生反应或从额外的表观基因重塑中受益的患者的标志。因此,表观遗传将免疫抗性细胞骨架模式转化为免疫敏感模式的可能性可能提供一种潜在的治疗策略,以最大限度地利用细胞免疫疗法的临床益处。

此外,我们描述肺癌细胞表面免疫组特征的整体蛋白质组学方法揭示了先天和适应性免疫蛋白网络,可以被DAC改变,并揭示药物的多方面免疫调节潜力,使其与各种免疫疗法(包括γδT和NK细胞等)结合在一起。64,65,66,67。我们还证明,DAC可能增强Vδ1亚型的多功能,从而发挥抗肿瘤免疫作用。这一发现不同于先前的报道,表明DAC可能上调体外扩增的Vδ2 T细胞的抑制受体KIR2DL2/3,并抑制其增殖和效应功能。68。这一差异可归因于不同的γδT细胞亚群、扩张条件或dac剂量时间表。

同样,联合治疗DNMTI和体外扩增的Vδ1细胞的安全性和有效性可以是上下文依赖性的。特别是,虽然我们观察到对正常PBMCs的毒性很小(补充图)。4E),这一发现并不否定对其他正常细胞或组织类型的潜在的非目标效应,在设计临床试验时应考虑到这一点。此外,虽然我们在免疫损害小鼠模型中显示了DNMTI对γδT介导的肿瘤溶解的增强作用,但该模型仅限于再现肿瘤细胞与完整免疫微环境之间复杂的相互作用。由于ICAM-1是一种普遍的粘附分子,并且可能被其他T细胞亚型(如αβT细胞)所识别,因此可能有类似的ICAM-1依赖机制可能以一种MHC限制的方式参与肿瘤与αβT细胞之间的相互作用。这可能通过增加更多具有细胞溶解功能的T细胞来提高免疫治疗的效果。DAC对CD8 T细胞的中度增强作用(附图)。7)可能是由于异源反应识别。进一步研究αβT和其他免疫细胞在DNMTi增强的γδT治疗中的作用是有必要的。

总之,我们的发现表明,DAC联合过继免疫治疗结合γδT细胞治疗肺癌患者的治疗潜力,这些患者对检查点抑制剂没有反应,或缺乏可靶向突变/特异性肿瘤抗原。尤其是低表达细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的肿瘤或不利于细胞骨架基因标记的人,可以通过表观基因重排来提高γδT细胞的治疗效果。本研究还为药物调节免疫突触-细胞骨架网络获得有效的抗肿瘤免疫提供了分子基础,为精细的临床试验设计提供了支持,并有助于精确免疫肿瘤学时代肺癌治疗策略的发展。


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