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Rip-i和xrcc 4的相互调节将dna修复与rip-i免疫信号联系起来

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发表时间:2021-04-16 14:26作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

RNA传感通路参与DNA损伤剂诱导的Ⅰ型干扰素(IFN)的产生.然而,RNA传感器在DNA修复中的潜在作用尚不清楚。在此,我们发现维甲酸诱导基因I(Rig-I)是识别RNA病毒并启动Mavs-IRF 3型IFN信号级联的一种关键的细胞内RNA传感器,被招募到双链断裂(DSBs)并抑制非同源末端连接(NHEJ)。在机械上,钻机-I与XRCC 4相互作用,而钻机-I/XRCC 4相互作用阻碍了DSB中XRCC 4/LIG 4/XLF复合物的形成。基因的高表达破坏了DNA的修复,使癌细胞对放射治疗产生了敏化作用。相反,在体外和体内,甲壳素-I的耗竭会使细胞对辐射产生抵抗力.此外,这一机制提示了一种保护作用的钻机-I在阻止逆转录病毒整合到宿主基因组通过抑制NHEJ途径。与之相反,XRCC 4由于其DNA修复功能而受到抑制,但通过平台-I相互作用,XRCC 4在Rig-I免疫信号传递中起着关键作用。XRCC 4通过促进平台Ⅰ的寡聚和泛素化,从而抑制RNA病毒在宿主细胞中的复制,从而促进平台Ⅰ信号转导。在小鼠体内,沉默XRCC 4可促进流感病毒在小鼠体内的复制,这些小鼠的体重下降速度快,存活率差,流感病毒感染所致的肺损伤程度更大。这种相互调节的钻机-I和XRCC 4揭示了一种新的功能,在抑制DNA修复和病毒整合到宿主基因组,同时赋予XRCC 4在增强天然免疫反应的关键作用,从而帮助宿主在对抗病毒的战斗中获胜。

导言

细胞的基因组不断受到辐射(IR)、致癌物和复制应激等外源性和内源性dna损伤剂的挑战,可能威胁基因组的完整性,导致发育缺陷、免疫缺陷和癌症等多种疾病。1,2。为了保持基因组的稳定性,细胞进化出了一个复杂的dna损伤反应(Ddr)系统,负责检测dna损伤和修复受损dna。3。双链断裂(Dbs)是细胞中最致命的dna损伤之一,主要通过同源重组(HR)和非同源末端连接(Nhej)途径修复。4,5。HR是一个无错误的途径,它需要一个完整的姐妹染色单体作为S/G2期的模板,而nhej在整个细胞周期中都会发生错误,在没有序列同源性的情况下直接连接断裂的dna末端。6,7.

最近的研究将基因组不稳定与先天免疫反应联系起来。8,9。细胞内核酸感应通路是众所周知的介导保护性免疫防御的病原体感染途径,它可以增强有效的抗肿瘤免疫反应。DNA损伤剂可引起DNA传感器环GMP-AMP合成酶(CGAS)检测到的胞浆中DNA片段或微核的积累。Cgas一旦被胞浆dna激活,就会催化循环gmp-AMP的产生,然后作为第二信使激活IFN基因的下游适配蛋白刺激因子,从而启动sick/irf 3/I型干扰素(IFN)信号级联。10,11。Ⅰ型干扰素依赖的天然免疫和适应性免疫有助于放射治疗的疗效。12,13。值得注意的是,有几项研究报道,抑制某些染色质调节剂,包括赖氨酸特异性组蛋白脱乙基酶1和dna甲基转移酶,可触发双链rna(Dsrna)的胞质感应,并在不同的癌细胞中诱导Ⅰ型干扰素应答。14,15,16。冯等人认为cgas/stp依赖的dna传感通路和线粒体抗病毒信号蛋白(Mavs)依赖的RNA传感通路在不同的细胞株中,在存在或不存在atr抑制剂的情况下,对IR诱导的Ⅰ型IFN的产生有不同程度的贡献。17。这些数据表明RNA传感通路在某些情况下对抗肿瘤免疫也是至关重要的.然而,RNA传感器是否参与DNA修复尚不清楚。

维甲酸诱导基因i是一种重要的细胞内病毒rna传感器,它检测到广泛的病毒RNA,如阴性或正极性的单链rna和dsrna。18,19,20。钻机-I包含两个N端卡域(2 CARD),一个螺旋酶结构域和一个C末端结构域(CTD).在没有病毒RNA的情况下,钻机-I处于一种自抑制状态,其中2 CARD通过与CTD的分子内相互作用而被抑制。RNA通过螺旋酶结构域与CTD结合,导致2 CARD的释放,形成四聚体,并通过卡卡相互作用招募小牛。这种相互作用使Mavs卡状丝形成,这反过来又成为一个信号平台来招募下游信号分子,从而启动Mavs/IRF 3/I型IFN信号级联。21。E3连接酶RIPLET在RIPLET介导的天然免疫反应中起着重要作用。22。RIPLET优先在dsRNA上识别和泛素化预寡聚的平台-I.此外,riplet还可以在较长的dsRNAs上跨桥ri-i丝状体,并能放大rip-i免疫信号。23,24。有趣的是,最近的研究提出,我可以感知病毒复制并诱导抗病毒免疫,这意味着以前未被识别的rip-i亚细胞环境。25,26,这促使我们探索核弹中钻机-I的潜在功能意义。

在目前的研究中,我们发现钻机-I被招募到双链断裂(DSBs)并抑制NHEJ。机械上,钻机-I与XRCC 4相互作用,阻碍了DSB中XRCC 4/LIG 4/XLF络合物的形成。此外,我们还发现通过抑制NHEJ途径阻碍逆转录病毒整合到宿主基因组中,这与其通过启动天然免疫反应来抑制RNA病毒感染的典型作用不同。此外,我们还发现XRCC 4在I型免疫信号传导中起着重要的作用,并通过促进有效的Ⅰ型IFN反应来抑制RNA病毒在宿主细胞中的复制。综上所述,我们的发现揭示了一种抑制作用的钻机-I在DNA修复和XRCC 4在钻机-I免疫信号传递中的关键作用。这种相互调节的钻机-I和XRCC 4连接DNA修复与钻机-I免疫信号,并提供了新的见解,复杂的机制背后的病毒和宿主相互作用。

结果

我被招募到dna dsb站点并压制nhej。

为检测人肺癌细胞(A 549)和乳腺腺癌细胞(MDA-231)对DNA损伤是否有反应,采用IR对细胞内定位进行检测。IR处理使处理后的细胞染色质组分中的RAP-I积累,而不影响其核定位(图1)。1A,b和补充图。1A)。此外,钻机-I激动剂治疗诱导表达的钻机-I,和大量的钻机-I定位于染色质(补充图)。1B)。此外,我们还检查了钻机-I是否被招募到DNA损伤点。染色质免疫共沉淀(Ip)测试显示,rip-i被招募到特定站点的dsb站点,这些dsb是由阿西西限制性酶27(无花果)1C)。我们利用U2OS细胞中的一个报告系统,利用FokI诱导DSB的方法,对Rig-I的定位进行了研究。在DSB的诱导下,我们发现钻机-我定位于损坏的地点(如图所示)。1D)。此外,钻机-I也可以招募到激光诱导的DNA损伤位点后,微红外(补充图)。1C),暗示钻机-I可能参与调控DNA DSB修复。

图1:我被招募到dna dsb位点并抑制非同源的末端连接.

a放射治疗A 549细胞(IR,10 Gy,2h)。Westernblot法检测细胞液(C)和核(N)组分的蛋白质水平。b用IR(10 Gy)照射A 549细胞。采用Westernblot法检测可溶性和染色质组分的蛋白质水平。c将ER-Asisi U2OS细胞转染空载体或Flat-Rig-Ⅰ,用4-OHT诱导DSBs。用芯片-qPCR方法检测Asisi所产生的DNA损伤位点上的标志-rig-I的积累.数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。d将U2OS-FokI细胞分别用1mm-Shield-1和1mMM-4-OHT处理5h,诱导FokI诱导位点特异性双链断裂,然后固定免疫荧光试验。钻机-I(绿色)定位在U2OS-FokI细胞中的DSB站点,其中DSB是由FokI(红色)诱导的。标尺,10μm。e用NHEJ报告基因转染人HEK293T细胞,取细胞进行NHEJ检测。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。f将pEYFP线性化质粒转染HEK293T细胞12 h后,qPCR检测已连接的EYFP区,测序结果为无切侧翼DNA序列。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。g将NHEJ报告子转染HEK293T细胞后,取细胞进行NHEJ检测。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。h将pEYFP线性化质粒转染HEK293T细胞12 h后,qPCR检测已连接的EYFP区,测序结果为无切侧翼DNA序列。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。i以转化生长因子-β1、IL-4和CD 40配体为配体刺激CH12F3-2a细胞,并对其进行类转换分析。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。有代表性的图片(j)和量化(k)γH2AX病灶在对照组,用IR(2Gy)处理U2OS细胞,在指定时间内敲除U2OS细胞。数据是三个独立实验的代表。每个点代表一个细胞,每组100个细胞用于本实验。误差条代表±SEM。P值由未配对的双面决定。t-测试。标尺,10μm。lIR(2Gy)作用于对照组和RIP过表达的U2OS细胞中γH2AX灶的定量显示时间。数据是三个独立实验的代表。每个点代表一个细胞,每组100个细胞用于本实验。误差条代表±SEM。P值由未配对的双面决定。t-测试。

HR和NHEJ是dna dsb的两条主要修复途径。4。为了评估钻机-I是否参与DSB修复,进行了HR和NHEJ记者检测。钻机-I过表达能显著抑制NHEJ,但对HR无明显抑制作用(图1)。1E,f和补充图。1D,e)。相反,另一个RNA传感器MDA 5或适配器蛋白Mavs对NHEJ(补充图)没有影响。1F-I)。此外,我们还评价了钻机-I激动剂对NHEJ的影响,发现两种钻机-I激动剂(3p-hpRNA,Poly:IC)对NHEJ有明显的抑制作用,但对HR(补充图)没有明显的抑制作用。1J-n)。I型激动剂对NHEJ的抑制作用被基因敲除所逆转,提示这种抑制作用是通过钻机-I来实现的。接下来,我们研究了内源性钻机-I在NHEJ修复中的作用。如图所示。1g,h和补充图。10,p,钻机-I耗竭导致NHEJ效率的提高。此外,我们还评估了rip-i在类开关重组中的作用。28。与对照细胞相比,Rig-I基因敲除细胞的类开关效率有所提高(图1)。1I和补充图。1Q),表明钻机-I耗尽增强了NHEJ。

为进一步证实RAP-Ⅰ在调节DSB修复中的作用,采用免疫荧光法检测γH2AX和IR对RIT-Ⅰ基因敲除或过表达细胞的影响,以确定其是否影响DDR和修复。如图所示。1J,k与对照组相比,缺乏γ的细胞中的H2AX病灶较少.与之形成对照的是,在晚期(8和24小时),过度表达的细胞表现出γH2AX病灶增加(如图所示)。1L和补充图。1R)。钻机-I激动剂治疗还导致γH2AX病灶在IR处理后的晚期时间点增加(补充图)。1s,t),这说明了Rig-I在负调控DNA修复中的重要作用。

接下来,我们问我是如何被招募到DSB网站的。我们研究了钻机-I与核心NHEJ组分(DNA-PK、Ku、XRCC 4、LIG 4和XLF)的相互作用。有趣的是,钻机-I与XRCC 4相互作用,但不与其他相互作用,这种相互作用在IR作用下增加,并且具有高度的RNA依赖性(图一)。2A,b和补充图。2A)。我们产生了两个在结合RNA上有缺陷的平台-i突变体(K 858,861A;T347A)。29,30,并考察了它们与XRCC 4的相互作用。如附图所示。2B,cIR处理后,野生型突变体(WT)与XRCC 4的相互作用增强,而缺乏RNA结合的平台-I突变体与XRCC 4的相互作用增强,说明在DNA损伤后,ROC-I与XRCC 4的相互作用是必需的,XRCC 4可能有助于DSB位点的重组。正如预期的那样,在XRCC 4基因敲除细胞中,对DSB的定位显著降低(图1)。2C和补充图。二维空间)。在DNA损伤后不能有效诱导与XRCC 4相互作用的WT,而不是RNA结合缺陷的Rig-I突变体的过度表达,抑制了NHEJ(补充图)。2E)。另一方面,Mavs,这是必不可少的钻机-I免疫信号,不是必需的钻机-I介导的抑制NHEJ(补充图)。2F,g)。此外,在没有XRCC 4的情况下,rig-I的过度表达不会进一步抑制NHEJ(图4)。二维空间和补充图。2H)。这些结果表明,在DSB位点以XRCC 4依赖的方式被招募到RIP-I,而RAP-I过度表达抑制了通过XRCC 4的NHEJ通路。

图2:需要XRCC 4才能招募到DSB现场的钻机-I。

a将空载体转染HEK293T细胞。然后用抗国旗琼脂糖珠溶解和免疫沉淀细胞.用指示的抗体对珠进行煮沸和探测。bIR(10 Gy,1~2h)处理A 549细胞。裂解细胞,用抗甲壳素I抗体免疫沉淀核仁.用RNase A处理,煮沸后用指示抗体涂抹。c对照组和XRCC 4基因敲除ER-Asisi U2OS细胞,转染Flat-Rig-Ⅰ,然后用4-OHT诱导DSBs。用芯片-qPCR方法检测Asisi所产生的DNA损伤位点上的标志-rig-I的积累.数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。d对照组和XRCC 4基因敲除HEK293T细胞,转染NHEJ报告子,转染HEK293T细胞,取细胞进行NHEJ检测。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。

钻机-I通过干扰DSB点XRCC 4/LIG 4/XLF复合物的形成来抑制NHEJ。

接下来我们想知道我是如何监管NHEJ的。结果表明,在DNA损伤的作用下,钻机-I与XRCC 4的相互作用显著增强。因此,我们询问钻机-I是否调节XRCC 4/LIG 4/XLF复合物在DSBs上的形成和稳定性,这对NHEJ的DNA修复非常重要。为了检验这一假设,我们首先检查了XRCC 4和LIG 4或XLF之间的相互作用。平台-I过度表达或平台-I激动剂治疗明显阻碍XRCC 4与LIG 4或XLF的相互作用,而不影响DNA损伤引起的Ku 80的相互作用(图一)。3A和补充图。3A结论:I型钻机的高表达影响XRCC 4/LIG 4/XLF复合物的形成,而不影响KU 80对XRCC 4的吸收。

图3:钻机-I通过干扰DSB位点XRCC 4/LIG 4/XLF复合物的形成来抑制非同源的末端连接。

a将FLAG-XRCC 4和GFP-钻机-Ⅰ转染HEK293T细胞,再用IR(10 Gy,1h)处理。用抗国旗琼脂糖珠溶解细胞,免疫沉淀。用SDS-PAGE对珠体进行煮沸,用指示抗体进行分析。b转染HEK293T细胞后,再用IR(10 Gy,1h)处理。对可溶性和染色质组分进行SDS-PAGE分离,并用指示抗体进行分析.ce将FLAG-XRCC 4、FLAG-XLF或FLAG-LIG 4转染Er-Asisi U2OS细胞,用4-OHT诱导DSBs。旗-XRCC 4(c),国旗-XLF(d),以及国旗-LIG 4(e)用芯片-qPCR法检测阿西西引起的DNA损伤位点的积累。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。f本研究中使用的XRCC 4结构的示意图表示(TOP)。用GFP-XRCC 4表达载体转染HEK293T细胞。细胞裂解物与抗GFP琼脂糖珠孵育。免疫沉淀用指示抗体(底部)涂抹。g在本研究中使用的钻机-I结构的示意图表示(顶部)。转染HEK293T细胞,转染GFP-XRCC 4。细胞裂解物与抗国旗琼脂糖珠孵育。免疫沉淀用指示抗体(底部)涂抹。h转染HEK293T细胞,转染FLAG-XRCC 4和野生型(WT)或缺乏C-末端结构域(Δ-Ⅰ)突变体,再用IR(10 Gy,1~2h)处理HEK293T细胞。用抗国旗琼脂糖珠溶解细胞,免疫沉淀。用SDS-PAGE对珠体进行煮沸,用指示抗体进行分析。i将转染HEK293T细胞的对照细胞和WT突变体(ΔCTD)转染HEK293T细胞,取细胞进行NHEJ检测。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。

正如预期的那样,染色质分馏研究也显示LIG 4和XLF的染色质结合减少,而Ku 80和XRCC 4对IR诱导的过度表达细胞DNA损伤没有影响(图1)。3B和补充图。3B)。此外,钻机-I激动剂治疗也降低了LIG 4和XLF的染色质结合,而且这种降低高度依赖于Rig-I(补充图1)。3C)。此外,我们还评价了钻机-I对DSB位点XRCC 4/LIG 4/XLF复合物定位的影响。如图所示。3C-E过量表达导致LIG 4和XLF的定位降低,而XRCC 4在DSB位点的定位不明显。

接下来,我们绘制了XRCC 4与Rig-I交互所需的域图。如图所示。3F,分别负责XRCC 4与XLF或LIG 4相互作用的XRCC 4的N端磁头域和线圈盘管结构域。31,32,33,是需要它的最佳互动与钻机-I,建议钻机-我竞争与LIG 4和XLF绑定到XRCC 4(图一)。3A和补充图。3A)。这些结果可以解释在钻机-I存在下XRCC 4和LIG 4/XLF相互作用减弱的原因。此外,我们还绘制了负责XRCC 4相互作用的Rig-I域。如图所示。第三代,删除的CTD的钻机-I严重损害了它与XRCC 4的相互作用。因此,缺乏CTD的基因突变体的过度表达对XRCC 4与LIG 4或XLF的相互作用以及NHEJ的修复效率均无影响(图5)。3H,I),建议通过与XRCC 4的交互来抑制NHEJ。这些结果表明,钻机-I通过与XRCC 4相互作用来抑制NHEJ,从而破坏了DSB位点XRCC 4/LIG 4/XLF复合物的形成。

钻机-I在红外反应中的作用

本实验测定了甲壳素-Ⅰ对细胞IR敏感性的影响。钻机-I过度表达致敏细胞对IR的治疗(图1)。4A和补充图。4A)。此外,在没有XRCC 4的情况下,RAP-I过表达引起的IR超敏反应没有额外的影响,提示其调节IR敏感性的作用是高度XRCC 4-依赖性的(图一)。4B和补充图。4B)。先前的一项研究表明,rip-i可以通过IFN信号来调节IR的敏感性。34。我们发现,在缺乏IFN-β信号的情况下,RAP-I的高表达也促进了IFNAR 2基因敲除细胞对IR处理的敏感性,说明在我们的实验模型中,RAP-I调节IR的敏感性(补充图)。4C-E)。其次,我们评价了钻机-I激动剂对IR敏感性的影响.如附图所示。4F,Rig-I激动剂处理使细胞对IR处理敏感,而处理细胞中的rig-i丢失能够逆转rig-i激动剂处理所引起的IR敏感性的增加,这证明了Rig-I激动剂以依赖于钻机-I的方式调节了IR的敏感性。此外,钻机-I激动剂治疗不能进一步提高XRCC 4基因敲除细胞对IR治疗的敏感性(补充图1)。4G),揭示XRCC 4在钻机-I激动剂介导的IR超敏反应中的参与。我们的结果表明,通过抑制NHEJ通路,高表达的Rig-I或Rig-I激动剂可使癌细胞对IR的治疗敏感。

图4:反转录病毒I通过阻止非同源的末端连接来抑制逆转录病毒整合到宿主基因组中.

a不同剂量辐射(IR)对A 549细胞的集落形成实验及RAP I过表达的影响。所显示的数据代表了三个独立的实验,其数值为技术复制品的平均值±扫描电镜。n=3)。P值由未配对的双面决定。t-测试。b对照组和XRCC 4基因敲除A 549细胞过度表达RQI-I,用一定剂量的IR处理。细胞存活率采用集落形成试验。所显示的数据代表了三个独立的实验,其数值为技术复制品的平均值±扫描电镜。n=3)。P值由未配对的双面决定。t-测试。基因敲除的细胞存活分析(c)或击倒(d)IR处理A 549细胞。所显示的数据代表了三个独立的实验,其数值为技术复制品的平均值±扫描电镜。n=3)。P值由未配对的双面决定。t-测试。eNOD-SCID小鼠侧皮下注射对照或Rig-I基因敲除A 549细胞。用或不加IR治疗小鼠。监测肿瘤体积。数据点表示(平均±扫描电镜)n=5个生物独立样本t测试一下。f转染HEK293T细胞,转染FLAG-RQI,或用DNA-PK抑制剂(Nu-7441,2μM,24h)处理HEK293T细胞。这些细胞随后被绿色荧光蛋白阳性的慢病毒感染。提取基因组DNA。用qPCR分析基因组DNA中GFP的含量。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。g对照组和XRCC 4基因敲除HEK293T细胞,转染Flat-rig-I,然后感染GFP阳性慢病毒。用qPCR分析基因组DNA中GFP的含量。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。h转染HEK293T细胞,转染野生型(WT)或缺乏C-末端结构域(Δ)突变体,感染GFP阳性慢病毒。用qPCR分析基因组DNA中GFP的含量。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。i, j控制和钻机-i击倒MEF细胞(I)感染GFP阳性慢病毒。用qPCR分析基因组DNA中绿色荧光蛋白(GFP)的含量。j)。数据(j)给出了四个独立实验的平均值±扫描电镜。P值由未配对的双面决定。t-测试。k对照组或基因敲除MEF细胞感染GFP阳性慢病毒。用qPCR分析基因组DNA中的前病毒拷贝数。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。

接下来我们研究了内源性钻机-I在细胞对IR的敏感性中的作用。以IR处理对照组和Rig-I基因敲除或敲除细胞,用集落形成法分析细胞存活情况。如图所示。4C,d和补充图。4H,i,钻机-I耗竭使细胞对IR治疗更有抵抗力。在缺乏I的细胞中,NHEJ效率增加,γH2AX病灶减少(补充图)。4J-o),表明通过促进NHEJ使细胞对IR治疗更有抵抗力。此外,我们还在体内研究了钻机-I在细胞对IR的敏感性中的作用。如图所示。4E和补充图。4P在异种移植模型中,钻机-I耗竭使肿瘤对IR更有耐受性。这些结果提示通过促进NHEJ使肿瘤对IR更有耐受性。

钻机-I通过阻止NHEJ阻止逆转录病毒整合到宿主基因组中。

NHEJ在逆转录病毒整合到宿主基因组中起着至关重要的作用。35。这是可能的,钻机-I,除了其在抗病毒免疫方面的既定作用,在阻断病毒整合到宿主基因组中的作用。因此,我们测试了钻机-I是否调节逆转录病毒整合到基因组中。我们用GFP阳性慢病毒感染了过度表达的细胞,并检测了基因组DNA中GFP的水平。如图所示。4F和补充图。4Q从基因高表达细胞提取的基因组DNA中检测到较少的GFP基因水平和前病毒拷贝数,提示该基因阻碍反转录病毒整合到基因组中。相反地,Mavs是Rig-I免疫信号不可缺少的适配蛋白,它并不是RQI介导的病毒整合抑制所必需的(补充图1)。4R)。钻机-I激动剂治疗也导致逆转录病毒整合减少(补充图)。4S,t)。我们通过定量检测慢病毒感染早期(2h)细胞中GFP RNA水平来评价病毒感染效率。如附图所示。4U,3p-hpRNA处理细胞和未处理细胞中GFP RNA水平相当.此外,无论是过表达还是耗竭,都没有对病毒感染宿主细胞有显著影响(补充图)。4V,w),这表明病毒整合到宿主基因组中,而不是最初病毒感染到宿主细胞中,受到了rig-I的调控。此外,我们还发现,在没有XRCC 4的情况下,没有观察到钻机-I对逆转录病毒整合的抑制作用(见图4)。4G),暗示rig-I以XRCC 4依赖的方式调节逆转录病毒整合。此外,我们发现WT的过度表达,但不能与XRCC 4相互作用的平台I突变体,阻碍了逆转录病毒的整合(图一)。4H),表明该平台-I通过与XRCC 4相互作用而阻碍逆转录病毒整合,从而抑制NHEJ。接下来,我们研究了内源性的钻机-I在病毒整合中的作用。如图所示。4i-k和补充图。4x与对照细胞相比,缺乏基因的MEF细胞中GFP DNA水平较高,前病毒拷贝数较多,说明基因缺失促进病毒整合到宿主基因组中。

总之,我们的结果揭示了TRAP-I通过阻断NHEJ通路在调节逆转录病毒整合到宿主基因组中的抑制作用,与其通过启动天然免疫反应抑制RNA病毒感染的典型作用不同。这种双重功能的钻机-我可以增强抗病毒活性。

XRCC 4的缺失减弱了Rig-I免疫信号

虽然DDR蛋白是dna修复所必需的,但它参与了胞内外源dna的感知,从而引发了一种先天免疫反应。36,37,38,39,40,41。我们已经证实了钻机-I与XRCC 4相互作用并调节NHEJ通路,我们询问XRCC 4是否也调节了对抑制宿主细胞中RNA病毒感染必不可少的Rig-I免疫信号。为了验证这一假设,我们首先研究了XRCC 4和Rig-I在胞浆中的相互作用。有趣的是,胞质XRCC 4与Rig-I相互作用,而且这种相互作用在Rig-I激动剂的作用下明显增强,并且具有高度的RNA依赖性(图一)。5A和补充图。5A).

图5:XRCC 4的丢失减弱了Rig-I免疫信号.

a用3p-hpRNA(0.5μg/ml,8h)转染A 549细胞。细胞溶解后,用抗甲壳素I抗体免疫沉淀。用RNase A处理,煮沸后用指示抗体涂抹。b用3p-hpRNA(0.5μg/ml)转染A 549细胞。细胞分为可溶性细胞质(SC)、细胞质膜(CM)和可溶性核(SN)组分。用所指示的抗体进行Westernblot。c用3p-hpRNA(0.5μg/ml)转染A 549细胞。细胞分为胞浆组分(Cyto)组分和线粒体组分(MITO组分)。用所指示的抗体进行Westernblot。d用qRTPCR方法检测转染3p-hpRNA(0.5βg/ml,12h)的A 549细胞的IFN-μRNA水平和XRCC 4基因敲除A 549细胞的水平。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。e3p-hpRNA(0.5μg/ml,12h)转染对照组和XRCC 4基因敲除A 549细胞。QRTPCR检测IFN-β水平.数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。f转染XRCC 4基因敲除HEK293T细胞野生型(WT)或XRCC 4突变体缺失头部和线圈结构域(ΔHD/ccd)后,分别转染FLAH和GFP标记的Rip-I和3p-hpRNA(0.5μg/ml,8h)。细胞溶解后,用抗国旗琼脂糖珠免疫沉淀。这些珠子被煮熟,用指示的抗体涂抹。g对照组和XRCC 4基因敲除HEK293T细胞后,分别转染Flat-rig-I和His-Ub,然后转染3p-hpRNA(0.5μg/ml,8h)。用Ni-NTA(His)微球免疫沉淀细胞裂解物,用指示抗体检测印迹。h将重组表达野生型(WT)或XRCC 4突变体(ΔHD/ccd)的XRCC 4基因敲除细胞,分别转染Flat-rig-I和3p-hpRNA(0.5μg/ml,8h)。细胞溶解后,用抗国旗琼脂糖珠免疫沉淀。这些珠子被煮熟,用指示的抗体涂抹。i用3p-hpRNA(0.5Δg/ml,12h)转染XRCC 4重排表达WT或XRCC 4突变体(μHD/CCD)。用定量聚合酶链反应(QPCR)检测IFN-β水平。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。

为了检测XRCC 4是否对Rig-I信号反应,细胞用Rig-I激动剂处理,并检测XRCC 4的细胞内定位。如图所示。5B,c平台-I激动剂处理可使XRCC 4在处理后的细胞线粒体组分中大量积累,表现出与RAP-Ⅰ高度同步的定位,提示XRCC 4可能参与到细胞的免疫信号转导中。为了进一步研究XRCC 4在钻机-I信号转导中的作用,用Rig-I激动剂刺激XRCC 4基因敲除细胞,检测IRF 3磷酸化和IFN-β水平。如图所示。5D和补充图。5B-fXRCC 4缺乏而非失活导致IRF 3磷酸化和IFN-β水平显著降低,且这种降低高度依赖于RAP-I,在没有RIP I的情况下,XRCC 4没有进一步的降低(图1)。5E和补充图。5G-I).

接下来,我们想知道XRCC 4是如何调节rig-i信号的。RIPLET在rip-i免疫信号传递中起着至关重要的作用。19,22。RIPLET在dsRNA上识别预组装的钻井-I型寡聚体,并泛素化钻机-I。Rig-i的寡聚是一个先决条件,因为riplet与rip-i分子结合在一起,而dsrna至少容纳两个rig-i分子。23,42。众所周知,XRCC 4主要以二聚体形式存在,既可以形成同质多聚体,也可以形成高阶结构或细丝。31。因此,我们询问XRCC 4是否可以通过与钻机-I的相互作用和锚定来调节钻机-I的齐聚。为了验证这一点,我们将FLAG和GFP标记的钻机-I共转染293 T细胞,然后加入IP。如图所示。5F和补充图。5J在XRCC 4击倒细胞中,我被旗舰钻机击倒的情况要比在对照组细胞中的要少得多,这表明XRCC 4的耗竭损害了钻机-I在钻机-I激动剂上的齐聚和组装。一直以来,XRCC 4的丢失导致了RIPLET无法有效识别和泛素化的钻机-I泛素化,因为没有足够的寡聚化平台。5G)。此外,在没有XRCC 4的情况下,与Mavs高度依赖于基因泛素化和寡聚化的rig-I的结合受到了损害(图4)。5H和补充图。5K)。此外,我们还发现WT的过表达(但没有XRCC 4的突变体)与钻机-I没有相互作用,可以逆转由于XRCC 4的丢失而导致的平台-I和Mavs的寡聚不足和Mavs的相互作用受损(图1)。5F,h),表明XRCC 4通过与钻机-I相互作用,促进平台-I的寡聚和泛素化,从而促进了钻机-I的信号传递。与这些结果相一致的是,WT的过度表达,而不是缺乏与钻机-I相互作用的XRCC 4突变体,可以挽救XRCC 4耗竭引起的干扰素-β水平的降低(图1)。5I)。我们的研究结果揭示了XRCC 4在调节RAP-Ⅰ免疫信号转导中的重要作用,提示XRCC 4可能与ROC-Ⅰ协同抑制RNA病毒感染。

XRCC 4与rig-i协同抑制rna病毒在宿主细胞中的复制

为了进一步证实XRCC 4在钻机-I信号转导中的重要作用,我们进一步研究了XRCC 4对宿主细胞病毒复制的影响。我们用流感病毒感染XRCC 4基因敲除细胞,并监测病毒复制。如图所示。6A和补充图。6AXRCC 4基因敲除细胞中病毒拷贝数明显多于正常细胞,而DNA-PK抑制剂则无此作用。此外,XRCC 4缺失引起的病毒增加可以通过WT的过度表达来逆转,而不能通过缺乏与Rig-I相互作用的XRCC 4突变体的表达来逆转(图1)。6B)。与上述结果相一致,感染流感病毒的XRCC 4基因敲除细胞的IFN-β和干扰素刺激基因水平显著降低,这可以通过WT的过度表达来挽救,而不能与RIP-I相互作用的XRCC 4突变体则能被挽救。6C,d和补充图。6B-c)。我们的结果表明,XRCC 4与钻机-I协调,通过促进宿主细胞高效分泌Ⅰ型干扰素来抑制RNA病毒复制。

图6:XRCC 4与钻机-I配合,抑制RNA病毒在宿主细胞中的复制.

a对照组和XRCC 4基因敲除A 549细胞均感染流感病毒A/PR/8/34(IAV-PR8)。用qRT-PCR法检测IAV NP RNA水平.数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。b用qRT-PCR方法检测了重组野生型(WT)或XRCC 4突变体缺乏头卷结构域(ΔHD/ccd)感染的XRCC 4基因敲除细胞的IAVNP RNA水平。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。c对照或XRCC 4基因敲除A 549细胞均感染IAV-PR8。用qRT-PCR分析IFN-β水平.数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。d用qRT-PCR方法检测了重组表达WT或XRCC 4突变体(ΔHD/Δ)感染的XRCC 4基因敲除细胞的IFN-HBRNA水平。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。e, fC57BL/6小鼠吸入雾化对照或XRCC 4 siRNA 24 h后感染流感病毒A/WSN/1933(IAV-WSN,10只)。3(8~10只小鼠/组)。用体重减轻法测定了XRCC 4对小鼠WSN毒力和感染动力学的影响。e)和累积生存曲线(f)。每2天测量一次体重。误差条代表±SEM。虚线e指示减肥25%的端点。P值由未配对的双面决定。t-测试(e)单面对数级[曼特尔-考克斯]检验(f). gC57BL/6小鼠经对照组或XRCC 4 siRNA处理后感染IAV-WSN。图示有无WSN感染的肺组织。h用qRT-PCR法检测对照组或XRCC 4 siRNA染毒小鼠肺组织中IAV NP RNA水平。数据以三个独立实验的平均值±扫描电镜表示。P值由未配对的双面决定。t-测试。

接下来,我们研究了XRCC 4在体内流感病毒复制中的作用。C57BL/6小鼠用空气压缩雾化器吸入针对XRCC 4或对照siRNA与体内JetPEI混合的siRNA(估计可吸入剂量为3毫克/千克)。43,44,45,46,47。24小时后,小鼠经鼻接种10只。3流感病毒PFU A/WSN/1933。病毒感染后24h和48h分别进行siRNA进一步治疗。如附图所示。6d与对照组相比,XRCC 4 siRNA对小鼠肺组织XRCC 4的表达有明显的下调作用。在病毒感染期间,XRCC 4基因敲除小鼠的体重下降更快,存活率更低(图1)。6E,f)。此外,XRCC 4基因敲除小鼠在流感病毒感染引起的肺损伤程度上明显高于对照组(图1)。6g和补充图。6E),提示肺中XRCC 4的沉默促进了流感病毒在体内的复制。与上述观察相一致的是,XRCC 4基因敲除后的肺组织中病毒Np RNA水平较高,IFNβRNA水平较低,与对照组相比,差异有显着性(图1)。六小时和补充图。6f)。这些结果表明XRCC 4的缺失使小鼠更容易感染流感病毒。

综上所述,我们的结果揭示了RAP-I在NHEJ通路中的抑制作用,从而调节逆转录病毒整合到宿主基因组中,这与其通过启动天然免疫反应来抑制RNA病毒感染的典型作用不同。与之相反,XRCC 4在I型免疫信号传导中发挥关键作用,并与RAP协调,通过促进高效的Ⅰ型IFN的产生来抑制RNA病毒在宿主细胞中的复制。这种相互调节的钻机-I和XRCC 4扩展了钻机-I的抗病毒功能,并赋予XRCC 4在增强天然免疫反应方面的关键作用,从而帮助宿主在宿主与病毒之间的战斗中获胜。

讨论

DNA损伤剂诱导的DNA片段或微核的DNA传感器识别将基因组不稳定性与天然免疫反应联系起来。34。RNA传感通路也参与了dna损伤剂诱导的Ⅰ型干扰素信号转导。17,25。然而,RNA传感器参与DNA修复的可能性尚不清楚。在这里,我们发现一种识别rna病毒并通过启动mavs/irf 3/i型IFN信号级联激活先天免疫反应的关键病毒rna传感器48,被招募到DSBs并压制NHEJ。在机械上,钻机-I与XRCC 4相互作用,而钻机-I/XRCC 4相互作用阻碍了DSB中XRCC 4/LIG 4/XLF复合物的形成。此外,高表达的钻机-I可使癌细胞对IR治疗敏感.此外,我们还评估了在体细胞对IR敏感性的影响,并发现在异种移植模型中,RAP-I的丢失使肿瘤对IR产生了耐药性。综上所述,我们的研究结果表明,rip-i可能是癌症治疗的潜在靶点,并为使用rig-i激动剂作为癌症的无线电敏化治疗提供了基础。有趣的是,cgas是一种细胞内dna传感器,它通过启动SING/IRF 3/I型IFN级联来感知dna病毒并激活免疫反应,最近被证明通过干扰PARP 1-永恒复合物的形成来抑制HR。49。这些观察表明,宿主免疫信号在调节DNA修复中具有独特的作用,并提出了一种可能性,即通过DNA损伤诱导疗法可以更容易地杀死具有激活天然免疫功能的癌细胞,而DNA/RNA传感器可以作为肿瘤治疗中的一个独特的生物标志物,而不依赖于它们在抗肿瘤免疫中的作用。

RNA病毒是一组不同的病原体,是导致包括癌症在内的人类疾病流行和致命的原因之一。Rna病毒可以引起强大的dna损伤,通过引入有害突变,增加肿瘤发生的风险,从而导致病毒的发病。50,51,52。在RNA病毒感染过程中,宿主可以利用胞液启动天然免疫反应,对抗RNA病毒感染,保护宿主。我们的研究还表明,核钻井-I可能被病毒劫持,以抑制NHEJ途径,促进基因组不稳定和增加肿瘤发生的风险。这可能揭示了rig-i在RNA病毒诱发的癌症中的意外参与.

然而,对于逆转录病毒感染而言,这完全是另一回事。NHEJ通路在逆转录病毒整合到宿主基因组中起着关键作用。35,53,54。因此,钻机-I对NHEJ通路的抑制作用可能是一种通过阻碍逆转录病毒整合到宿主基因组中来抑制逆转录病毒感染的宿主保护机制。值得注意的是,无论是过度表达还是耗竭,都没有对病毒最初感染宿主细胞有明显的影响。因此,这一机制与其通过启动天然免疫反应来抑制RNA病毒感染的规范作用是不同的。虽然从最初感染到最终病毒基因组整合的其他步骤仍可能受到基因整合的影响,但考虑到NHEJ在病毒整合到基因组中的关键作用,我们认为它对XRCC 4和NHEJ的抑制作用是一个主要因素。我们的研究提出了钻机-I激动剂或多肽通过阻止逆转录病毒整合到宿主基因组中来阻止逆转录病毒感染的可能性。

我们的研究还提示XRCC 4在Rig-I免疫信号传导中的新作用。XRCC 4通过调节平台Ⅰ的寡聚和泛素化,从而产生高效的Ⅰ型IFN反应,从而抑制RNA病毒在宿主细胞中的复制,从而促进了TRAPⅠ型免疫信号的传递。此外,体内研究表明,干扰XRCC 4在肺中的表达促进了IAV在小鼠体内的复制。XRCC 4基因敲除小鼠对IAV感染有较高的易感性,表现为肺损伤增强,存活率降低,提示XRCC 4是一个重要的宿主因子,并与Rig-I协同防御IAV感染。在RNA病毒感染的情况下,核XRCC 4在NHEJ通路中的典型功能被启动或诱导表达的Rig-I所抑制。这可能会限制病毒整合到宿主基因组中。另一方面,XRCC 4受宿主的委托,与平台I相互作用和协调,以促进高效的Ⅰ型干扰素的产生,对抗RNA病毒感染。这表明XRCC 4在I型介导的NHEJ抑制和病毒整合中起着双重作用,同时在增强I型介导的保护性I型干扰素反应中,表现出对宿主DNA修复过程中病毒干扰的巧妙反应。

综上所述,我们的研究结果揭示了钻机-I在DNA修复中的抑制作用,以及XRCC 4在RAP-I免疫信号传导中的重要作用,并对病毒与宿主之间相互调节的复杂机制提供了新的见解。


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