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肌醇治疗通过抑制表观遗传驱动的代谢适应抑制髓母细胞瘤

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发表时间:2021-04-16 14:17作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

在最常见的小儿恶性脑肿瘤髓母细胞瘤的发病机制中,染色质修饰剂的解除起着至关重要的作用。在这里,我们确定了一种依赖于BMI 1的敏感性,解除对部分髓母细胞瘤肌醇代谢的管制。以BMI 1为特征的G4分子亚群的髓母细胞瘤中mTOR通路的激活和代谢适应。;CHD 7低层签名和显示这可以抵消IP6处理。最后,我们证明ip 6协同顺铂在体外增强其细胞毒性,并在临床前bmi 1中延长存活时间。;CHD 7低层异种移植模型

导言

髓母细胞瘤是儿科最常见的恶性肿瘤。大型国际财团聚集了这一相对罕见的肿瘤的大量群体,并产生了完整的基因组、表观基因组和转录数据集,这些数据为新的MB分子分类提供了一个新的分子亚群(wnt、shh、g3和g4),每个亚类进一步细分为具有不同预后和治疗反应的亚型。1,2,3,4。尽管在解剖MB异质性方面取得了显著进展,但这些观察对患者的治疗方式仍然缺乏翻译性的影响。事实上,目前的护理标准包括多种模式的治疗,包括手术、无线电和/或化疗。5这并不能解释导致肿瘤生长的特定分子机制。这一制度治疗了相当一部分患者,尽管它几乎总是伴随着严重的副作用。评估分子量身定做的治疗方法,包括新的药物组合,利用获得的MB发病机制的生物学知识,现在是一个优先事项。

全基因组测序6,7,8,9已发现一些基因突变,如组蛋白去甲基酶、去乙酰化酶、赖氨酸甲基转移酶和染色质重塑,以及多梳群蛋白的过表达。10,11,12尤其是在G4MB中,所有亚组中最不了解的,尽管是最常见的,与不良的预后有关。神经干细胞(NSC)自我更新的关键调节因子pcG蛋白bmi 113,14,在广泛的癌症中被上调,包括脑瘤,如胶质瘤。15,与晚期临床分期及预后不良有关。16。在MB中,bmi 1的最高表达水平与其维持肿瘤生长的g4亚群有关。10,17。我们先前证明,bmi 1的高表达,再加上ATP依赖的染色质重塑者色域解旋酶dna结合蛋白7(Chd 7)的功能丧失,共同作用于诱导mb的形成,此时谷氨酸能祖细胞表达代表神经转录因子Math1的前体细胞是针对睡眠美驱动的前向基因筛选。10。此外,我们还证明了BMI 1;CHD 7低层在G4MB的比例中发现了签名,这是一个最近被证明与单极毛笔细胞(UBC)祖细胞有个体发育联系的亚组,它是从Math1发展而来的。+18.

表观遗传机制不仅通过调节控制细胞增殖的基因的表达,而且通过调节参与细胞代谢的途径来维持肿瘤的生长。19。肿瘤细胞的能量代谢发生改变,即使在氧气存在的情况下,癌细胞的糖酵解能力也会增强,有利于从葡萄糖中产生乳酸。20随着其他代谢过程,包括蛋白质,核酸和脂质生物合成,也被加强作为肿瘤代谢重组的一部分。组蛋白修饰和DNA高甲基化改造染色质有助于抑制糖异生酶,从而激活不同癌症的糖酵解。21,22,23。好氧糖酵解为MB提供了多达60%的ATP产量。24但这种肿瘤类型是否受表观遗传机制的调控,目前尚不清楚。

能量的产生被精细地调节到细胞的功能和状态,并且已知受到一些信号途径的调节,例如Akt/mTOR,其中磷酸肌醇和焦磷酸肌醇是其中的关键因素。25,26。肌醇(肌醇和六磷酸肌醇的磷酸化形式,ip 6)是一种高能量的多磷酸盐分子,在细胞的多种生理和病理特性中发挥着关键作用,可能是通过磷酸化依赖于多种信号途径而发挥作用的。27。解除对肌醇代谢的控制已被描述在不同的疾病中,包括癌症,它主要发挥抗肿瘤作用,主要调节细胞生长,诱导分化和凋亡。28,29,30。然而,肌醇是否具有治疗效果和维持MB生长的作用尚未阐明。

在这里,我们对建立bmi 1模型的患者源性MB细胞进行了表观基因组、转录和蛋白质组学研究。;CHD 7低层通过建立基因工程和异种移植模型,阐明BMI 1和CHD 7融合的分子机制、对MB代谢的影响以及在临床前水平上的可药性。

结果

BMI 1的建模;CHD 7低层小鼠的签名会导致Eomes数量的增加+UBC,但没有髓母细胞瘤

检测BMI 1的致癌潜能;CHD 7低层分子签名10,我们在Math1中生成了高表达bmi 1的小鼠。+祖先(Math1Cre;STOPFLorBmi1),然后进一步与CHD 7浮动小鼠杂交(CHD 7浮子)获得马蒂1Cre;STOPFLOXBmi1;CHD 7F/+。观察12个月(0/13小鼠),复合小鼠健康,未发生髓母细胞瘤。为了评估这些基因修饰是否导致发育异常,我们将重点放在源自Math1的神经元群上。+小脑的祖细胞。Math1在一个共同的祖细胞中表达,产生单极刷状细胞(Ubc)和颗粒细胞(Gc)。12,18,31因此,我们分析了UBC和GC在马蒂1Cre;STOPFLOXBmi1;CHD 7F/+分别用Eomes(Eomesodermin)和Neun免疫染色法对转基因对照进行比较。Neun没有在ubc中表达。32。我们观察到,在P7和P21阶段,复合突变体小脑中表达的UBC增多(图1)。1A,b和补充图。斯1A-c),而小脑皮质成熟GC的数量却减少了(如图所示)。1C和补充图。斯1D)。重要的是,在克隆扩张期(P7),颗粒细胞祖细胞(GCP)的增殖潜能没有明显变化(附图)。斯1E,f).

图1:BMI 1建模后UBC的增加和Eomes的表达;CHD 7低层祖细胞的特征。

a, b颜色识别STOPFLOXBMI 1(黄色),CHD 7F/+(橙色),Math1Cre;STOPFlorBmi1(绿色)或Math1Cre;STOPFLorBmi1;CHD 7F/+(粉红色)整个数字的基因型。P7小脑中UBC的EomesIHC染色及定量研究(a)或P21(b)发育阶段。a n=每只STOPFLASBMI 1和Math1Cre的2只不依赖生物的动物;STOPFLASBMI 1基因型,n=每CHD 7有3只独立的生物动物F/+和Math1Cre;STOPFlorBmi1;CHD 7F/+基因型b n=3只不依赖生物的动物,每只STOPFLASBMI 1和CHD 7F/+基因型,n=4只不依赖生物的动物,每只Math1Cre;STOPFlorBmi1;CHD 7F/+基因型单向变异。cNUNIHC染色及P7小脑GC的定量分析。n=每只STOPFLASBMI 1和Math1Cre的2只不依赖生物的动物;STOPFLASBMI 1基因型,n=每CHD 7有3只独立的生物动物F/+基因型,n=4只不依赖生物的动物,每只Math1Cre;STOPFlorBmi1;CHD 7F/+基因型,单因素方差分析。d热图显示人上菱形唇(浅蓝色)、小脑(黄色)和小脑皮质(绿色)在8~17 PCW中的uBC标记表达的z分数。e显示相对表达式的热图BMI 1CHD 7从小脑(黄色)或纹状体(绿色)分离出的HNCs系与MB细胞系(粉红色)比较。fQPCR分析埃梅斯CHD 7沉默时hNSC的表达水平(BMI 1);CHD 7低层、紫色)与对照(CTRL、紫罗兰)比较。n=4个独立于生物的实验,双尾未配对t测试一下。gCDH 7沉默或对照细胞增殖试验。n6生物独立实验,双向方差分析。所有图表均为±SEM。P价值:*P < 0.05, **P < 0.01 or ****P < 0.0001. Scale bars = 100 µm. Source data are provided as a Source Data file.

接下来,我们查阅了“人类艾伦大脑图谱”,绘制了所有被报道在ubc中表达的基因的表达模式,尽管不一定是完全的。18在人类小脑发育的过程中。我们发现所有基因的表达增加,包括ubc特异性标记。埃梅斯,从第13周开始(图1)。1D)。表达水平BMI 1CHD 7我们还研究了人类神经干细胞(HNSC)在不同发育阶段(胶质瘤细胞遗传学资源)来源于胎儿小脑的细胞系(图1)。1E)。从13周样本中提取的hnsc基因表达量最高。BMI 1CHD 7因此,选择这个时间点,用shRNAs(补充图)来检测CHD 7表达沉默的效果。斯1g),在UBC标记表达式上。我们发现埃梅斯(无花果)1F在hNSC中,CHD 7在BMI 1表达背景下沉默,导致细胞增殖增加(图1)。1g而新生小脑原位注射无MB形成(8.5个月时0/10只小鼠)。

我们展示了BMI 1;CHD 7低层签名使发育中的小脑中的ubc数量增加,成熟的gc数减少,这增加了它有利于区分普通Math1的可能性。+向UBC血统的先驱者。UBC是G4MB最有前途的来源细胞,因此,我们的结果为BMI 1和CHD 7在这一MB亚型的发病机制中的潜在作用提供了强有力的指标,尽管它们本身并不足以在基因工程小鼠或hNSC异种移植模型中诱导MB的形成。

MTOR信号通过bmi 1激活于g4mb线路,但不激活小脑hnsc。;CHD 7低层签名

为了进一步了解BMI 1;CHD 7分子在肿瘤和非肿瘤环境中所起的作用之间的差异,我们对ICb 1299和CHLA-01-Med MB细胞株的甲基和转录体进行了综合分析。之所以选择这些细胞模型,是因为bmi 1没有获得稳定的病人源性异种移植物(Pdx)。;CHD 7低层G4患者,使BMI 1-高表达细胞株的体外基因修饰成为评估信号在MB发病中的作用的唯一合适模型。ICb 1299和CHLA-01-Med MB细胞系显示G3/G4亚群10,31,33,34,35,反映了这两个子群之间公认的可塑性边界。31,36。CHD 7在BMI 1过表达的背景下通过CHD 7沉默实现了这两行信号的建模,而与前面所述的正常小脑相比,这是通过CHD 7沉默实现的。10。细胞模型与G4MB肿瘤样本数据集的集成4确保焦点将集中在这些细胞模型和亚组特定组织样本之间共享的事件上(如图所示)。2A)。用361个差异甲基化探针(DMP)鉴定了214个差异表达基因(DEG),并在G4MB组织中鉴定了2454个DMP和138个DMP(补充图)。斯2A)。标准路径分析发现,在四个数据集中,每一个数据集都显着地丰富了与信号和代谢相关的途径,包括脂类和磷脂代谢以及能量产生(图一)。2B和补充图。斯2B)。结果的比较分析揭示了一个单一的共同的和保守的途径,超途径的肌醇磷酸酯化合物(图)。2C),当G3MB肿瘤之间存在或不存在BMI 1时,未发现明显的DEG。;CHD 7低层签名分析(附图)。斯2C),与此代谢途径之间的相关性是与G4亚组特别相关的。

图2:bmi 1中对磷酸肌醇代谢的放松管制;CHD 7低层G4MB和mTOR通路的激活是在MB细胞中观察到的。

aBMI 1比较分析的图式表示;CHD 7低层MB细胞株和G4患者,无论是否有标记,进行基因差异表达(DE)和差异甲基化探针(DMP)和常见的解除管制的途径。b代表MB细胞或有或没有BMI 1患者之间差异富集的典型通路的饼图;CHD 7低层在RNA-Seq或DNA甲基化分析中鉴定的特征。标准路径根据iPA类别列表进行分类,并相应地进行颜色编码。c为差异表达的基因富集的典型通路的Venn图(蓝色和浅绿色图,如ab)或甲基化(橄榄绿和红色ab)在BMI 1中;CHD 7低层细胞系和GR4 MBS具有匹配的签名。强调了磷酸肌醇化合物(磷酸肌醇)的超途径,这是所有分析过的数据集所共有的。d气泡图显示BMI 1蛋白组学分析中获得的重要反应途径;CHD 7低层MB线。气泡根据FDR值着色,大小与特定通路的基因数目成正比。e, fMB细胞的细胞活力测定(e)或香港国家安全委员会(f)与(BMI 1);CHD 7低层)或无标记(CTRL)处理72h后,增加FLT 3抑制剂(TCS)浓度。直方图表示活细胞相对于未经处理的细胞(顶部)的百分比。测量曲线下面积(AUC)(底部),比较对治疗的总体反应。e n=6个生物独立实验,(f) n=4项生物独立实验,双向方差分析。g, hMB细胞的细胞活力测定(g)或香港国家安全委员会(h)与(BMI 1);CHD 7低层)或无特征(CTRL)处理72h后,增加MET抑制剂浓度(PHA)。直方图表示活细胞相对于未经处理的细胞(顶部)的百分比。测量曲线下面积(AUC)(底部),比较治疗后的总体反应。g n=6个生物独立实验,h n=4项生物独立实验,双向方差分析。iMB细胞磷酸化/总RPS 6(pRPS 6,Ser 240/244)的Westernblot和定量研究。用GAPDH免疫反应法进行蛋白载量的正常化。n=4项生物独立实验,单向方差分析。j(BMI 1)对MB细胞活力的测定;CHD 7低层、红色或无标记(CTRL、绿色)在处理72h后,增加mTOR途径抑制剂(雷帕霉素和托林)的浓度。直方图表示活细胞相对于未经处理的细胞(顶部)的百分比。测量曲线下面积(AUC)(底部),比较对治疗的总体反应。n=5个生物独立实验,双向方差分析。k对照(绿色)或BMI 1中IP6浓度增加24h后磷酸化/总RPS 6(pRPS 6,Ser240/244)的Westernblot和定量研究;CHD 7低层(红色)MB细胞。用GAPDH免疫反应法进行蛋白载量的正常化。n=4项生物独立实验,双向方差分析。所有图表均为±SEM。P价值:*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 or ****P < 0.0001. Source data are provided as a Source Data file.

肌肌醇和六磷酸肌醇(Ip 6)的磷酸化形式是通过调节磷酸化依赖途径而调节多种生理细胞特性的高能聚磷酸盐分子。27。为了研究磷酸化依赖的事件,可能与肌醇代谢有关,我们对bmi 1进行了磷蛋白组学分析。;CHD 7低层MB行和控件。我们发现1499个明显放松的磷酸肽,684个高磷和815个低磷化(补充图)。斯二维空间),并对此数据进行了反应体通路分析,证实了磷酸肌醇代谢的调节(图一)。二维空间)。此外,我们还发现了由受体酪氨酸激酶(Rtk)和一些相关途径(包括MAPK/ERK)介导的信号的丰富,正如前面所描述的那样。10。因为hnsc也对这一途径进行了放松管制。10,我们认为这不足以触发MB的形成。在我们的磷蛋白组分析中,MET和FLT 3 RTK也被富集。二维空间)两种受体在BMI 1中的表达均显著增高。;CHD 7低层MB与对照组相比差异无显着性(P>0.05),而hNSC(补充图)无显着性差异。斯2E,f)。为了评估观察到的MB特异性表达增加对这两种RTK的功能的影响,我们分别分析了FLT 3和MET的特异性抑制剂TCS 359和PHA 665752处理MB或hNSC细胞的活性。药物抑制FLT 3受损细胞的活力,特别是在MB建模的标志(图一。2E),而不影响hNSC(图1.2F)。此外,BMI 1;CHD 7低层MB细胞更容易受到MET抑制。2G),尽管hNSC也受到了影响,尽管方向相反,即那些模拟签名的人具有更强的抵抗力(图1)。2H)。这些结果证实了酪氨酸激酶受体FLT 3和MET在bmi 1中对信号增强的硅预测。;CHD 7低层MB,但在具有相同分子特征的hNSC中不存在。

Rtk调节多种下游磷酸化依赖信号级联。37,38。DE基因和磷酸化依赖蛋白的整合通路分析预测了bmi 1中mTOR信号的影响。;CHD 7低层MB,一种在具有相同特征的肿瘤样本中也被观察到的调制物(如图所示)。二维空间和补充图。斯2H)。为了验证这一点,我们分析了核糖体蛋白S6(RPS 6)的磷酸化,RPS 6是mTOR通路的一个重要靶点。我们证实了mTOR通路在MB细胞中的过度激活,该信号既依赖CHD 7的沉默,又依赖于BMI 1的同时表达(图1)。2I和补充图。斯2F,g)。FLT 3和MET激活AKT/mTOR信号39,40,41。与BMI 1的观察一致;CHD 7低层MB细胞对FLT 3和MET信号的依赖性增强,我们发现它们的抑制降低了bmi 1中mTOR的激活。;CHD 7低层MB细胞(附图)斯2i,j)。重要的是,在bmi 1中没有观察到对rps 6磷酸化的影响。;CHD 7低层补充图斯2K),增加了对mTOR通路的影响是特定于MB的可能性。在BMI 1中使用两种mTOR抑制剂(雷帕霉素和托林)可观察到细胞活力受损。;CHD 7低层MB与控制相比较(图1)。2J和补充图。斯2I)和IP6处理降低了bmi 1中的mTOR活性。;CHD 7低层MB单元与没有签名的单元相比(如图所示)。2K).

我们的数据显示,BMI 1对MB细胞和G4肿瘤标本中的肌醇代谢和rtk进行了放松管制。;CHD 7低层MTOR信号通路在这些细胞中的特征和激活,而在具有相同分子特征的hNSC中则不然。

BMI 1;CHD 7低层信号在MB中诱导代谢适应,而在hNSC中不诱导代谢适应。

磷酸肌醇和mTOR通路主要通过调节能量的产生来调节细胞的活力。42,43,44,45。因此,我们研究了bmi 1的能量状态。;CHD 7低层分别用氧耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)测定线粒体呼吸和糖酵解。BMI 1中OCR降低;CHD 7低层MB细胞的基础,ATP连接和最大呼吸减少,表明线粒体功能受损(见图)。3A和补充图。斯3A)而不是线粒体数量减少,因为没有检测到线粒体DNA的显著变化(附图)。斯3B)。用一种依赖于潜能的mitotracker染料染色显示线粒体膜电位增加,提示bmi 1线粒体超极化。;CHD 7低层MB细胞(附图)斯3C)。有趣的是,线粒体功能障碍是bmi 1中发现的显著富集途径之一。;CHD 7低层G4MB组织样本(附图)斯2B)。与此形成对照的是,在具有此特征的MB细胞中,ECAR增加,糖酵解和糖酵解能力增强(如图所示)。3B)。这些结果表明BMI 1的代谢适应。;CHD 7低层MB细胞,导致线粒体呼吸受损和有氧糖酵解增强。

图3:BMI 1的代谢适应;CHD 7低层肌醇处理可使MB细胞恢复。

a海马细胞外通量法测定氧化消耗率(OCR)。BMI 1;CHD 7低层(红色)或对照(绿色)MB细胞分别在指定的时间点(虚线)用寡霉素、P-三氟甲基氧化羰基氰基苯肼(FCCP)或抗霉素A和鱼藤酮联合处理。直方图(右)显示OCR在基础呼吸、ATP连接和最大呼吸过程中的产生.n=4项独立于生物的CTRL或n=5个与生物无关的BMI 1实验;CHD 7低层,双尾未配对t测试一下。b用海马细胞外通量法分析细胞外酸化率(ECAR)。BMI 1;CHD 7低层或对照MB细胞依次用葡萄糖、寡霉素或2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)在指定的时间点(虚线)。直方图(右)显示代表糖酵解和糖酵解能力的ECAR。n=7项独立于生物的实验,两尾未配对t测试一下。cBMI 1中ATP含量的定量研究;CHD 7低层或对照MB细胞,以总蛋白量为标准。n=9生物独立实验,双尾未配对t测试一下。dBMI 1中ADP/ATP比值的定量研究;CHD 7低层或者控制MB单元。n=10,双尾未配对t测试一下。e海马细胞外通量法分析ECAR。BMI 1;CHD 7低层或对照MB细胞与IP61mm孵育24h,然后依次用葡萄糖、寡霉素或2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)在指定的时间点(虚线)。直方图(右)显示代表糖酵解和糖酵解能力的ECAR。n=4项生物独立实验,单向方差分析。f海马细胞外通量法测定氧化消耗率(OCR)。BMI 1;CHD 7低层(紫色)或对照(紫罗兰色)hNSC细胞在指定的时间点(虚线)依次用寡霉素、FCCP或抗霉素A和鱼藤酮联合处理。直方图(右)显示OCR在基础呼吸、ATP连接和最大呼吸过程中的产生.n=3生物独立实验,双尾未配对t测试一下。g用海马细胞外通量法分析细胞外酸化率(ECAR)。BMI 1;CHD 7低层或对照hNSC细胞依次用葡萄糖、寡霉素或2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)在指定的时间点(虚线)。直方图(右)显示代表糖酵解和糖酵解能力的ECAR。n=3生物独立实验,双尾未配对t测试一下。hBMI 1中ATP含量的定量研究;CHD 7低层或控制hNSC细胞,正常表达总蛋白量。n=9生物独立实验,双尾未配对t测试一下。iBMI 1中ADP/ATP比值的定量研究;CHD 7低层或者控制hNSC细胞。n=10个生物独立实验,双尾未配对t测试一下。所有图表均为±SEM。P价值:*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 or ****P < 0.0001. Source data are provided as a Source Data file.

为了评估这一发现是否对未来的临床应用有用,我们确定了bmi 1。;CHD 7低层对手术切除的肿瘤标本进行磁共振波谱分析的一组患者的G4MB。46。我们显示,与没有签名的样品相比,在具有特征的MB中,亮氨酸和缬草碱(BCAA)的含量增加,以保持肿瘤组织中糖酵解状态的增强(补充图)。斯三维空间)。一直以来,我们发现HK2, PFKP, ENO 4, PDK 1低密度血红蛋白,编码调节糖代谢的关键酶,在BMI 1中;CHD 7低层G4MB肿瘤样本(附图)斯3E)但在G3肿瘤中没有同样的特征(补充图。斯3F),进一步确认BMI 1的相关性。;CHD 7低层专门为G4MB子群签名。

线粒体和糖酵解产生ATP,因此,我们确定了在稳定状态下产生的ATP总量,并发现bmi 1。;CHD 7低层MB细胞比对照组产生更多的ATP(如图所示)。3C)。ADP/ATP比值分析结果无显着性差异(图5)。三维空间),表明ATP的利用在有或没有这种特征的MB细胞之间没有区别,并表明OCR和ECAR的观察到的放松管制最终影响了能量的产生。重要的是,ip 6治疗恢复了bmi 1中观察到的代谢适应。;CHD 7低层MB细胞通过降低ECAR和糖酵解能力(见图)。3E),而不影响OCR(附图)。斯第三代)。相反,BMI 1;CHD 7低层HNSC显示线粒体增加。3F和补充图。斯3H,I)和糖酵解功能。第三代)与没有签名的等基因hNSC相比。然而,BMI 1;CHD 7低层HNSC显示ATP总生成量减少(如图所示)。3H)可能是由于与没有签名的hNSC相比,ADP/ATP比值增加所表明的ATP利用率增加(如图所示)。3I)。有趣的是,IP6治疗不影响BMI 1的ECAR、糖酵解和糖酵解能力。;CHD 7低层补充图S3j表明IP6介导的对糖酵解功能的抑制是在MB环境下实现的。

综合来看,我们的数据显示BMI 1;CHD 7低层签名在G4MB中诱导代谢适应,而在具有相同信号的hNSC中却不能诱导代谢适应,IP6处理可以抵消它的作用。

BMI 1的IP6敏感性;CHD 7低层MB细胞依赖于bmi 1

考虑到肌醇途径失调通过IP6处理抑制G4MB细胞中mTOR通路的激活和介导的代谢适应,我们开始评估它们对肿瘤细胞活力的影响。我们发现BMI 1细胞增殖受损。;CHD 7低层MB线在所有测试的IP6浓度相比较,控制MB细胞没有签名,这只是受影响的最高浓度使用(图一)。4A,b和补充图。斯4A)。治疗后未发现细胞凋亡(附图)。斯4B),暗示是由IP6介导的细胞静止作用而不是细胞毒性作用。相反,有或不加标记的hNSC处理不影响细胞活力(图1)。4C),增加了IP6对周围发育中的小脑毒性很低的MB的一种新的特异性治疗的可能性。

图4:BMI 1的IP6敏感性;CHD 7低层MB细胞是依赖于BMI 1的。

a对照细胞增殖试验(CTRL,Green),BMI 1;CHD 7低层(红色)或伴随BMI 1沉默(BMI 1);CHD 7低层+shBMI 1,蓝色)MB细胞72h后,IP6浓度增加。n=6生物独立的实验,双向方差分析用于计算p值(颜色编码)相对于未处理的细胞。bBMI 1细胞活力测定;CHD 7低层或伴随的BMI 1沉默MB细胞在24小时,增加浓度的IP6。测量曲线下面积(AUC),比较治疗后的总体反应。n=6项生物独立实验,单向方差分析。c对照细胞活力测定(紫罗兰)或BMI 1;CHD 7低层(紫)hNSC处理24h后,IP6浓度增加。测量曲线下面积(AUC),比较治疗后的总体反应。n=6个生物独立实验,双尾未配对t测试一下。dBMI 1芯片-Seq峰在对照(CTRL)或BMI 1的基因组注释和热图的分布;CHD 7低层MB细胞热图以TSS为中心,按BMI 1强度排列。信号根据BMI 1在启动子周围的分布进行聚类。单边χ2试验P值和影响大小(E.S.)都被报道了。eBMI 1和H3K27me3芯片-Seq峰在CTRL或BMI 1中BMI 1结合启动子上的热图;CHD 7低层MB单元(左面板)。热图以TSS为中心,按BMI 1强度排列。信号根据BMI 1和H3K27me3在启动子周围的分布进行聚类。Venn图显示了BMI 1和H3K27me3基因在启动子(中间面板)上的重叠。Bmi 1和h3k27me3在对照(绿色)或bmi 1中与启动子共同结合的基因显著富集GO生物过程的气泡图。;CHD 7低层(红色)MB单元(右面板)。气泡根据FDR值着色,大小与特定GO条件的基因数目成正比。fVenn图显示了BMI 1、H3K27me3和H3K4me3基因在启动子(顶部)上的重叠。Bmi 1,H3K27me3和h3k4me3在对照(绿色)或bmi 1中与启动子共同结合的基因显著富集GO生物过程的气泡图。;CHD 7低层(红色)G4MB电池(底部面板)。气泡根据FDR值着色,大小与特定GO条件的基因数目成正比。gVenn图显示了一个参与磷肌醇化合物代谢的基因与BMI 1、H3K27me3和H3K4me3基因在BMI 1启动子(Top)上的重叠。;CHD 7低层MB细胞对照(绿)或BMI 1中IP6浓度增加24h后PPIP5K2表达的Westernblot和定量研究;CHD 7低层(红色)MB细胞。用GAPDH免疫反应法进行蛋白载量的正常化。n3生物独立实验,双向方差分析。h显示肌醇相关通路的热图显示bmi 1中差异甲基化基因显着富集。;CHD 7低层(红色)或BMI 1;CHD 7低层伴随BMI 1的沉默(蓝色)。所有图表均为±SEM。P价值:*P<0.05,**P < 0.01 or ****P < 0.0001. Source data are provided as a Source Data file.

依赖CHD 7介导的BMI 1脂质肌醇信号的表观遗传调控;CHD 7低层MB细胞

因为BMI 1的表达在低CHD 7表达的背景下介导了IP6的敏感性(如图所示)。4A,b和补充图。斯4A),我们开始阐明BMI 1在肌醇相关反应中的特异性作用。我们利用染色质免疫共沉淀法(芯片-Seq)询问了BMI 1在两MB细胞株中的全基因组分布,并将焦点集中在共有峰上。我们在chd 7中发现bmi 1结合在基因组中的重新分布。低层细胞背景下,启动子占用率增加了两倍(如图所示)。4D)。其次,我们评估了与磷酸肌醇代谢相关基因启动子在CHD 7沉默中的差异BMI 1结合,并鉴定了FLT 3、MET和磷脂酰肌醇-4-磷酸5-磷酸激酶1β(PIP5K1B)与对照组细胞中BMI 1唯一结合,FLT 3表达增加,BMI 1沉默时MET表达增加(补充图)。斯4C),建议通过BMI 1进行直接监管。为了将BMI 1结合到由多聚梳抑制复合物介导的表观遗传调控的观察中,我们鉴定了那些启动子,这些启动子也被组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)标记,并发现有和没有签名的MB细胞(210和475分别代表启动子上所有BMI 1峰的76.1%和66.4%,Fisher‘s的精确测试):p < 0.0001) (Fig. 4E和补充图。斯4D)。基因本体(GO)富集分析BMI 1和H3K27me3启动子共同占用的基因,鉴定了磷脂酶C(PLC)活性在细胞中特异性激活的特征(图一)。4E和补充图。斯4E)。PLC产生二酰甘油(DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3),从而调节肌醇脂信号通路。47,48。因此,我们的数据表明,依赖于BMI 1的CHD 7介导了对MB细胞中肌醇信号的影响。

BMI 1启动子介导的肌醇脂信号动态表观遗传调控;CHD 7低层MB细胞

因为染色质重塑因子可以通过二价结构域动态调节基因的表达,启动子上有抑制性的H3K27me3和组蛋白H3(H3K4me3)标记的赖氨酸4激活三甲基化。49我们试图找出bmi 1结合启动子区也包含h3k27me3和h3k4me3标记的基因,发现149个和64个基因,占所有bmi 1结合启动子的20.8%或23.2%。;CHD 7低层签名。正如预期的那样,GO浓缩分析揭示了与神经系统发育和神经元命运承诺相关的生物过程的共同富集(图1)。4F和补充图。斯4F),与主要标记关键发育基因的二价结构域的观察一致49。有趣的是,我们还发现了bmi 1中丰富的pc活性的激活。;CHD 7低层MB(图1.4F和补充图。斯4F),提示BMI 1介导的肌醇脂信号的动态表观遗传调控。最后,我们评估了BMI 1、H3K27me3和H3K4me3共同占据的64个启动子基因中是否有一个与Phosphoinositol化合物的超途径有关。PPIP5K2,一种由IP6合成1-IP7的肌醇焦磷酸激酶。50,在bmi 1中得到了明确的鉴定。;CHD 7低层MB细胞,当BMI 1沉默时,H3K27me3标记在其启动子处丢失(如图所示)。4G和补充图。斯4G)。因为IP6给药后PPIP5K2的表达被下调,尤其是在BMI 1中。;CHD 7低层MB细胞(图1.4G),我们的数据提出了PPIP5K2表观遗传调控调节肌醇代谢和增强IP6诱导的细胞毒性的可能性。此外,对CHD 7沉默后差异甲基化基因富集的肌醇相关规范通路被发现从高甲基化状态转变为低甲基化状态(图1)。4H)伴随的BMI 1沉默,包括PPIP5K2(补充图1)。斯4H),为观察到的依赖于BMI 1的肌醇代谢放松是表观调控的结论提供了额外的支持(补充图)。斯4I).

总之,我们的数据显示BMI 1;CHD 7低层通过IP6处理,对肌醇途径改变的特异性反应依赖于BMI 1介导的表观遗传调控。

IP6与顺铂协同作用降低BMI 1细胞存活率;CHD 7低层MB细胞

顺铂和依托泊苷是目前治疗MB患者的化疗药物。5。为了开始评估肌醇治疗作为辅助治疗的潜在价值,我们使用了bmi 1。;CHD 7低层两种化疗药物中的任何一种单独或与IP6联合使用的MB细胞。我们发现,对照细胞对体外使用的顺铂浓度范围是耐药的,而依托泊苷则导致细胞存活率下降(图一)。5A)。相反,BMI 1;CHD 7低层细胞对所有试验剂量的顺铂都是敏感的,而依托泊苷只在最高浓度时引起细胞活力下降(图一)。5A)。与ip 6的联合处理表明,ip 6与顺铂有协同作用,但与依托泊苷无协同作用,增强了其在bmi 1中的细胞毒活性。;CHD 7低层细胞(图1.5B,c).

图5:ip 6与顺铂协同增强bmi 1细胞毒活性;CHD 7低层MB细胞体外培养及改善BMI 1细胞存活率的实验研究;CHD 7低层MB异种移植物

a无(CTRL,绿色阴影,左面板)或有(BMI 1)的MB细胞活力测定;CHD 7低层在治疗72小时后,增加顺铂(CISP)或依托泊苷(ETOP)的浓度。直方图表示活细胞相对于未处理细胞的百分比。n=6项生物独立实验,单向方差分析。b对照细胞活力测定(左)或BMI 1;CHD 7低层(中)联合处理72h后,顺铂和IP6浓度增加。直方图表示活细胞相对于未处理细胞的百分比。n6生物独立实验,双向方差分析。经IP6和顺铂联合治疗后,获得协同效应的表面图(右面板)。n=3项独立于生物的实验。c对照细胞活力测定(左)或BMI 1;CHD 7低层(中)在联合处理72h后,足叶乙甙和IP6浓度增加。直方图表示活细胞相对于未处理细胞的百分比。n6生物独立实验,双向方差分析。经IP6和依托泊苷联合处理后,获得协同效应的表面图(右面板)。n=3项独立于生物的实验。d实验设计分别评价IP6和顺铂在饮用水和腹腔注射(I.P.)中的联合作用。e, fBMI 1移植小鼠的Kaplan-Meier存活曲线;CHD 7低层 (e)或控制(f)用载体、IP6、顺铂或两者(IP6+顺铂)处理的MB细胞。n=每顺铂治疗组6只生物独立动物,n每ip 6+顺铂治疗组7只,每ctrl ip 6治疗组8只,n=每只BMI 1有9只独立的生物动物;CHD 7低层IP6治疗组,n=每个CTRL车辆处理组7只生物独立动物,n=每只BMI 1有9只独立的生物动物;CHD 7低层车辆处理组,双尾P由对数秩检验确定的数值。g中所述小鼠肿瘤面积的量化e)和(f). n=每只BMI 1有8只独立的生物动物;CHD 7低层车辆处理组,n=每只BMI 1 6只独立的生物动物;CHD 7低层IP6+CISP治疗组,n=每个CTRL车辆处理组2只生物独立动物,n每CTRL IP6+Cisp治疗组4只生物独立动物,单因素方差分析。h, iKI-67馏分的定量研究(h)或切割的Caspase-3(i)小鼠肿瘤细胞总数的阳性细胞,如(e)和(f). n=每只BMI 1 5只独立的生物动物;CHD 7低层车辆处理组,n=每只BMI 1有4只独立的生物动物;CHD 7低层IP6+CISP治疗组,n=每个CTRL车辆和IP6+CISP处理组2只生物独立动物,单向方差分析。所有图表均为±SEM。P价值:*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 or ****P < 0.0001. Scale bars = 100 µm. Source data are provided as a Source Data file.

总之,这些数据提供了ip 6和顺铂在bmi 1中协同作用的证据。;CHD 7低层MB在体外。

IP6联合顺铂治疗提高BMI 1的生存率;CHD 7低层MB异种移植物

利用证据证明,通过饮水注射肌醇可以拯救脑相关的致命基因敲除表型。51因此,即使血脑屏障(Bbb)完好无损,我们也开始评估ip 6治疗是否与顺铂在临床前体内模型中协同作用。

BMI 1;CHD 7低层对照组将MB细胞注射到新生小鼠小脑,在3周龄时单独或与顺铂联合治疗,顺铂持续3周,IP6持续3周,直到出现症状(见图)。5D)。我们观察到BMI 1移植小鼠的存活时间明显缩短。;CHD 7低层MB与对照小鼠比较(附图)。斯5A),与我们先前观察到的BMI 1患者一致;CHD 7低层与其他G4MB患者相比,G4MB预后较差。10。对肿瘤大小的评估证实,这些肿瘤比对照异种移植大(图1)。5G)。接下来,我们观察了治疗对异种bmi 1移植小鼠存活的影响。;CHD 7低层结果发现,与未治疗的小鼠相比,ip 6和顺铂均能显著延长小鼠的存活时间,特别是与两种单一药物(ip 6或顺铂单独用药)相比,联合治疗可延长存活时间(如图6所示)。5E和补充图。斯5B,c)。相反,来自对照细胞的异种移植只受益于顺铂治疗,而联合治疗则没有显着性差异(图1)。5F和补充图。斯5B,c)。与车辆治疗相比,对中位生存期改善的分析显示,BMI 1的存活率增加了一倍。;CHD 7低层异种移植物与对照组相比(无签名)接受同样的治疗(补充图)。斯5B-E)。在机械水平上,Ki-67和裂解的Caspase-3免疫染色结果显示,在MB细胞模型化的肿瘤中,细胞增殖受损,但对凋亡无明显影响(图1)。5H,i),这一发现重新描述了IP6介导的细胞增殖受损的体外观察(图6)。4A和补充图。斯4B).

综上所述,这些数据证实并扩展了我们的体外发现,ip 6仅在模拟bmi 1的MB细胞中增强顺铂的细胞毒性活性。;CHD 7低层为BMI 1患者提供联合治疗有效的临床前证据;CHD 7低层G4MB

讨论

我们发现了一种新的表观遗传调控g4MB中肌醇代谢的bmi 1。;CHD 7低层分子特征。我们发现在G4MB细胞中,mTOR通路过度激活并诱导代谢适应,但在具有相同特征的hNSC中却没有,IP6可以抵消这一作用。我们提供了ip 6与顺铂协同作用的原理证明,在体外和体内的bmi 1前模型中,ip 6协同顺铂增强了其细胞毒活性。;CHD 7低层MB能显著延长异种移植小鼠的存活时间。

在小鼠的前向基因筛选方法中,我们先前描述了染色质重组体bmi 1和chd 7的分子趋同,这也是g4mb的一部分,总存活率显著下降的特征。10。我们已经证明MAPK/ERK信号的过度激活是这种趋同的下游效应,介导MB细胞的增殖和异种移植物的肿瘤生长。因为hNSC在bmi 1过表达的背景下,CHD 7沉默时也能观察到MAPK/ERK通路的增殖和过度激活。10可以想象,这是支持祖细胞转化为G4MB的一个子集的机制。然而,我们在这里显示髓母细胞瘤并不是在数学1中模拟这个特征的基础上发展起来的。+基因工程小鼠的祖细胞。马蒂1+之所以选择祖细胞来检验这一假说,是因为最初在睡美人驱动的转座子屏幕上进行了转化。10同时也是因为它们被认为是g4mb在单细胞转录研究中所占比例的来源细胞,因此在小脑发育过程中比较了mb亚组和祖细胞。18,31。特别是,从Math1派生的UBC祖先+在转录水平上,谱系与g4mb的比例非常相似。18,31。Eomes,一种谷氨酰胺能谱系特异性转录因子,以前被描述为g4mb亚组可能的主调节因子。12,在ubc细胞中表达。18,31。我们发现越来越多的埃梅斯+UBC和减少的Neun数量+颗粒细胞马蒂1Cre;STOPFLOXBmi1;CHD 7F/+小鼠认为,这一特征虽然不足以诱导MB的形成,但倾向于向UBC系而不是颗粒细胞系分化,有可能促使这些细胞获得导致恶性转化的额外遗传/表观遗传病变。

BMI 1和CHD 7是已知通过表观遗传机制调节基因表达的染色质重塑因子。52,53。除了他们作为PRC 1建筑群成员的传统角色54染色质结构的组织55几份报告分别强调了中华人民共和国复合物在DNA甲基化中的直接作用。56,57,58,59而chd 7功能缺失突变与cpgdna甲基化修饰的特定模式有关。60。因此,要全面了解BMI 1所产生的影响。;CHD 7低层在肿瘤和非肿瘤细胞背景下的签名,同时利用大量可公开获得的大体积肿瘤组织的组学数据集进行比较分析,我们研究了MB细胞的转录组和甲基部分,并对其进行了建模,并将结果与G4体肿瘤的结果进行了集成。当所有数据集集成在一起时,我们在磷肌醇化合物的代谢方面表现出惊人的趋同,这表明细胞模型和肿瘤体与bmi 1有共同的机制。;CHD 7低层签名,这是一致的在体外和体内MB的环境条件。

BMI 1磷酸化调控关键机制的研究;CHD 7低层G4mb,以及最近对g4特异性磷酸化谱的鉴定。61,62,促使我们通过分析bmi 1中所有的磷调节蛋白来扩大我们的分析范围。;CHD 7低层质谱法检测MB细胞。我们证实了MAPK/ERK信号的丰富,正如预期的那样。10。然而,我们发现BMI 1中的蛋白受磷酸化的调节。;CHD 7低层MB细胞对其他RTK相关通路也有明显的富集作用,Met和FLT 3信号的激活尤为突出。MET受体被认为是MB的靶点。63,64,尽管FLT 3以前从未链接到MB。MET和FLT 3是mTOR激活剂39,65,66。已知mTOR在SHH规范信号中的作用67,68,69,70,71因此,mTOR的抑制被认为是这一亚组的治疗靶点,然而mTOR在G4MB中的潜在作用却没有很好的特征。G4γ亚型的转录组和甲基化特征预测了PI3K/AKT/mTOR信号通路在该亚型中的激活4,结合蛋白质基因组学分析表明rtk和下游信号是g4mb中的核心致癌因素。62。这里我们演示了BMI 1;CHD 7低层特异性地增强mTOR在MB和hNSC中的激活,这一结果与MET和FLT 3在这些细胞中没有解除管制是一致的,也不受FLT 3抑制的影响。在肿瘤背景下,我们的数据支持对mTORC 1信号的特定影响。事实上,mTORC 1和mTORC 2的广泛抑制剂Torin部分影响MB细胞的活力,但mTORC 1特异性抑制剂雷帕霉素只影响bmi 1。;CHD 7低层MB细胞

MTOR信号和肌醇都有助于调节能量的产生。42,43,44,45这对于肿瘤在功能上适应高增殖状态至关重要。我们在bmi 1中展示了一种特定于肿瘤的能量适应。;CHD 7低层在基础条件下,随着线粒体功能的降低,糖酵解活性的增加,ATP的产生也随之增加。这是一种很好的现象,被称为Warburg效应,它允许肿瘤细胞促进有氧糖酵解,并使用糖酵解中间体来支持高分子合成,从而在缺氧条件下维持增殖。20,72。因为bmi 1和chd 7以前都与缺氧有关,bmi 1在胶质母细胞瘤的低氧区特异表达。73CHD 7在低氧状态下被下调74,可以想象BMI 1;CHD 7低层由于我们所描述的代谢适应,签名识别了G4MB在低氧状态下的特定优势。值得注意的是,我们观察到bmi 1的MRS增强了葡萄糖代谢相关酶的基因表达,增加了valine和leucine的水平。;CHD 7低层G4MB组织证实了我们从体外数据中得出的结论,并提出了可以开发影像学生物标记物来识别具有这种特征的患者的可能性。有趣的是,我们发现hNSC中的相同特征并不能产生同样的效果,尽管细胞获得了更多的增殖活性,这就增加了导致代谢适应获得的额外事件对肿瘤转化所必不可少的可能性。

Ip 6的抗肿瘤活性已在不同类型的肿瘤细胞系中得到证实,主要是通过抑制细胞生长来实现的。27,75然而,其在MB中的作用从未得到调查。我们发现ip 6对bmi 1的mTOR激活和代谢适应都有一定的抑制作用。;CHD 7低层抑制MB细胞增殖。重要的是,BMI 1中的IP6敏感性;CHD 7低层Bmi 1和h3k27me3共同占据bmi 1和h3k27me3,bmi 1和h3k27me3共同占据的bmi 1和h3k27me3在bmi 1中特异地证明了bmi 1和h3k27me3共同占据bmi 1,;CHD 7低层MB细胞这些数据与以前观察到的与肌醇-磷酸代谢相关的基因被确定为中华人民共和国靶标的胚胎干细胞是一致的。76。有趣的是,我们还发现bmi 1共定位在MB细胞中标记为h3k27me3和h3k4me3的二价结构域,特别是在pppip 5k2基因的启动子上,该基因是一种激酶,负责将ip 6磷酸化成更高的肌醇产物,在bmi 1中被特别下调。;CHD 7低层肌醇处理后的MB细胞。

我们的数据表明,bmi 1介导的PPIP5k2启动子的调控可能允许bmi 1。;CHD 7低层使细胞在肌醇代谢失调时减少其表达,从而阻止IP6的转化,增强其细胞毒性作用。根据这一解释,PPIP5K2的沉默导致结肠癌细胞增殖减少。77。今后的研究将需要阐明PPIP5K2在MB代谢和生长中的作用,并在bmi 1甲基化状态下探讨其作为预测生物标记物的潜在作用。;CHD 7低层G4MB患者将接受测试;一些在公开数据集中不可能的东西,因为该基因不存在于用于这些研究的DNA甲基化阵列中。此外,我们还发现met和flt 3启动子在chd 7沉默时受到bmi 1的不同约束,这与bmi 1中bmi 1依赖于bmi 1的rtk的抑制相一致。;CHD 7低层MB细胞对其抑制更敏感,mTOR通路激活增强。

癌症治疗通常得益于一种联合疗法,这种疗法依赖于多种途径的靶向治疗,在减少耐药性的同时获得协同和优越的效果。78。辅助性肌醇治疗已被证明可以减轻乳腺癌和结肠癌化疗的副作用。79。我们认为顺铂和IP6联合治疗BMI 1是有效的。;CHD 7低层G4MB因顺铂治疗mTOR通路过度激活80,81,可被ip 6抵消,并通过抑制糖酵解增强顺铂介导的抗肿瘤作用。82,83,也可被IP6诱导。结果表明,ip 6与顺铂在bmi 1中具有协同作用。;CHD 7低层Mb细胞在体外和体内异种移植模型中的应用,提示ip 6可作为辅助治疗g4MB患者的药物,目前正接受顺铂治疗。5。此外,我们没有观察到ip 6对hNSC的毒性,也没有观察到给药后对小鼠的副作用,与以前报告的正常骨髓祖细胞的情况一致。84同时,复方肌醇治疗不影响外周血单个核细胞和T细胞集落形成细胞。27.

总之,染色质重构体bmi 1和chd 7在MB中的分子收敛性反褶积,揭示了一种新的磷肌醇代谢表观遗传调控,介导了bmi 1的代谢能量适应。;CHD 7低层G4MB的亚组,并预测对肌醇途径调制的反应,结合目前用于治疗MB患者的化疗药物。因此,我们确定了这一特定患者群体的潜在可诉脆弱性。


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