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共轭亚麻酸引起的嗜温性细胞死亡是由ACSL 1介导的

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发表时间:2021-04-16 12:20作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

铁吞作用与多不饱和酰基链氧化产生的脂质过氧化有关。谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx 4)可降低脂质过氧化产物,而Gpx 4抑制剂可诱导铁吞作用。然而,多不饱和脂肪酸诱发癌细胞铁吞的治疗潜力尚不清楚。在此,我们确定了共轭亚油酸(α-eleostearicacid,α,ESA)是铁下垂的诱导剂.α欧空局不改变Gpx 4的活性,但与细胞脂类结合,促进不同类型癌细胞的脂质过氧化和细胞死亡。αesa引发的死亡是由酰基辅酶A合成酶长链异构体1介导的,它促进αesa掺入中性脂中,包括三酰甘油。干扰三酰甘油生物合成可抑制α引起的铁下垂,但不抑制Gpx 4的抑制。口服富含αESA的桐油对小鼠的肿瘤生长和转移有抑制作用,其转录变化与铁下垂相一致。总之,这些发现说明了一种潜在的铁下垂途径,补充了Gpx 4的抑制作用。

导言

铁下垂是一种非凋亡、铁依赖、受调节的细胞死亡,与脂质过氧化物(一种活性氧(Ros))有关。1,2,3,4,5,6,7。对诱导癌细胞铁下垂的治疗潜力的兴趣导致了一个主要的研究重点,即抑制细胞抗氧化途径,以对抗铁下垂。Gpx 4是已知唯一能有效地将酯化、氢过氧脂肪酸还原成无反应醇的过氧化物酶。8。近年来,通过对辅酶q的循环利用,发现铁吞抑制蛋白1(Fsp 1)是第二种抑制下垂的机制。10,一种诱捕自由基的抗氧化剂9,10。到目前为止,引发铁吞的小分子包括直接抑制gpx 4的药物,消耗gpx 4辅因子谷胱甘肽的分子,以及氧化铁的化合物。1,9,11,12。脂质过氧化物是由非酶氧化或脂氧合酶或细胞色素P 450氧化还原酶生成的。13,14,15。氢过氧化物破坏膜结构,产生反应醛,并导致细胞死亡。16。与抗氧化途径的治疗性靶向不同,我们在促进脂质过氧化产物生成的基础上,探索了一种铁下垂诱导的互补策略。

氢过氧化物可以通过自由基介导的链式反应传播,导致相邻的多不饱和酰基链的氧化,因此,更高水平的这种物种增加了对过氧化物繁殖的脆弱性。事实上,用花生四烯酸补充细胞会使他们对Gpx 4抑制剂引起的铁下垂过敏。17,18。同样,透明细胞癌易受gpx 4抑制剂的影响,这是由于hif-2α依赖的多不饱和脂质积聚所致。19。相反,增加单不饱和酰基链的相对比例,而以多不饱和脂类为代价,则抑制了对铁下垂的敏感性。20,21。因此,增加癌细胞中的多不饱和脂质可增加其对铁下垂的脆弱性。重要的是,这种方法可以利用癌细胞从环境中清除脂肪酸的倾向。22.

在此,我们报告了由某些植物产生的具有共轭双键的亚麻酸可以作为一种单一的药物在不同的癌细胞中诱导铁下垂。共轭亚油酸通过一种不同于典型的铁下垂诱导剂的机制触发铁下垂。细胞死亡是由酰基辅酶A合成酶长链家族成员1(ACSL 1)介导的,这一亚型参与了铁下垂.此外,口服天然富含共轭亚油酸α-eleostearicacid(αESA)的桐油可抑制小鼠乳腺癌异种移植模型的肿瘤发生和转移。α欧空局代谢产物在小鼠肿瘤中被检测到,并与表达一种渐近基因信号有关。这些结果介绍了一种独特的下垂诱导因子,并为深入了解嗜铁酶敏感性的分子基础提供了理论依据。这些膳食性,亲嗜性脂肪酸,解决了目前缺乏有效的gpx 4抑制剂在体内使用,并提出了一个机会来开发跨癌症亚型的代谢责任。

结果

谷胱甘肽耗竭触发三阴性乳腺癌细胞的吞噬作用

谷胱甘肽生物合成抑制剂丁硫氨酸磺胺肟(BSO)杀死了几个三阴性乳腺癌细胞系。1A还有参考文献。23)。然而,负责细胞死亡的ROS的具体细胞池尚不清楚。谷胱甘肽缺乏在某些情况下会引起铁下垂24,在操作上由三个标准来定义:它与脂质过氧化的关系,使用亲脂抗氧化剂如铁抑素-1(fer-1)抑制细胞死亡的能力,以及铁依赖性。1。与铁下垂相一致的是,BSO处理的BT-549细胞的细胞毒性被FER-1所阻断,而不是被凋亡抑制剂Z-VAD-FMK所阻断。1A,b)。同样,铁螯合剂、去铁胺和去铁倾向也能抑制BSO介导的细胞死亡。1C,补充图。1A)。此外,BSO处理导致脂质过氧化产物的积累,这是被FER-1所抑制的(图1)。1D,e)。因此,谷胱甘肽耗竭引起BT-549细胞的死亡与铁下垂相一致,并确定脂质过氧化物是这些细胞中谷胱甘肽成瘾的致死性活性氧。

图1:谷胱甘肽耗竭触发TNBC细胞亚群的嗜铁作用,而多不饱和脂肪酸水平升高与易受铁下垂影响有关。

aBT-549细胞在20μ、Z-VAD-FMK或FER-1存在或不存在的情况下,用10μM BSO作用72h。标尺表示200μm。bBt-549细胞在BSO处理72h后,20μM Z-VAD-FMK,或2μM FER-1(n=4项独立实验)。这里和下面的误差条表示以平均值为中心的标准偏差。括号上方的数字是来自学生t测试(双面)的p值,除非另有说明。P值未经多次测试校正,除非注明。c10μM BSO处理Bt-549细胞的相对存活率和所指示浓度的去铁胺(DFO)作用72h(n=3)。对数值进行了标准化,以说明与DFO相关的生存能力损失。dBT-549细胞经载体、BSO(50μM)、BSO和FER-1(2μM)作用48h后的典型荧光显微照片,绿色对应于脂质过氧化产物修饰的细胞大分子(Click-it脂质过氧化检测试剂盒,热费舍尔科学)。DNA被染成蓝色。标尺表示20μm。e单个细胞脂质过氧化产物的定量研究(n=每种情况50)d。线条代表平均。f原木2-集成电路的转换比50每株细胞在有或不存在2μM FER-1的情况下。FER-1降低BSO细胞死亡率>8倍的细胞系被命名为“FER-1-可抑制的”。g圆木的盒子和胡须地块2-转换集成电路50ML 162在非Fer-1-可抑制(蓝色)和FER-1-可抑制(红色)TNBC细胞系中的值(如f)。这条线代表中值,方框定义四分位数范围(25至75百分位数),晶须显示最小值和最大值。h显示原木的方框图10-转化,中位归一化的磷脂酰胆碱相对水平(C18:0,C18:2)和i磷脂酰胆碱(C16:0,C18:2)在非FER-1和FER-1可抑制的TNBC细胞株中均有表达.每个细胞系至少有5个重复。p基于方差分析并经多次检验修正的值。这条线显示中间值,方框显示四分位数范围,晶须表示上下相邻值,离群点显示为点。源数据作为源数据文件提供。

对铁下垂的敏感性与多不饱和脂质的积累有关。

FER-1抑制了半数三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系的BSO毒性,与铁下垂相一致。1F、红条)。这些细胞系对gpx 4的小分子抑制剂ML 162也比较敏感。25(韦尔奇的t检验,p=0.01,图1。1g,补充图。1B)。因此,FER-1抑制性细胞死亡是TNBC细胞中谷胱甘肽耗竭的常见反应,与Gpx 4的活性密切相关。此漏洞并不是由于Gpx 4表达减少(补充图)。1C)。我们对这些细胞系进行了先前代谢组学数据的方差分析。23比较FER-1拯救BSO介导的细胞死亡的TNBC细胞株和未被BSO介导的细胞死亡的单个代谢物水平(图1)。1F),发现3种最显著的差异累积代谢物中有2种是亚油酸(18:2)-取代磷脂酰胆碱(图1)。1H,I)。这些膜磷脂在经历FER-1抑制性死亡的细胞系中更加丰富.这一发现表明,多不饱和脂质的富集可能会增加对Gpx 4的依赖和对铁下垂的易感性(如图所示)。1g).

αesa引发癌症选择性下垂

我们推测,升高多不饱和脂质水平可能使TNBC细胞对铁下垂敏感。我们对多种脂肪酸进行了测试,并鉴定了α-电硬脂酸[(9Z,11E,13E)-十八碳-9,11,13-三烯酸;αESA]。2A)作为一种脂肪酸,与BSO联合使用可增强细胞死亡。2B)。α欧空局在某些植物(如苦瓜和桐树)中非常丰富。26并曾被证明能以抗氧化剂可逆的方式抑制乳腺癌细胞的生长。27。其他人认为αesa会引发凋亡细胞死亡。28,29,30,31,32,33虽然没有研究铁下垂的作用。出乎意料的是,我们发现αESA作为单一药剂触发了细胞死亡,而FER-1抑制了这一死亡(如图1所示)。2B),铁螯合剂去铁胺(图1)。2C),并由亲脂抗氧化剂维生素E(补充图。2A),并与FER-1可抑制的脂质过氧化产物的增加有关(图1)。二维空间)。Z-VAD-FMK和坏死抑制因子NEC-1s均未阻断α、ESA-诱导的细胞死亡(附图)。2B,c)。这些研究结果表明,αesa作为一种单一的药物可诱导铁下垂,并将αesa与花生四烯酸和肾上腺素脂肪酸区分开来,后者使细胞对gpx 4的抑制敏感,但不引起铁下垂。13,17.

图2:共轭亚麻酸α-硬脂酸被结合到细胞脂质中,并诱导铁下垂。

aα-硬脂酸(α,ESA)的结构。bα、ESA和MDA-MB-231细胞中指定的附加化合物的细胞活力剂量-反应曲线。细胞被处理了72小时,这个面板和随后的面板中的误差条表示以平均值为中心的标准差。cMDA-MB-231细胞与α、ESA和DFO共同孵育72h(n=3项独立实验)。对数值进行了标准化,以说明与DFO相关的生存能力损失。d特定试剂处理4h后单个细胞脂质过氧化产物的定量。这条线表示平均值。从左到右,n=42、29、36和15。p从双面学生t测试的值显示。e处理72h后,三个α细胞系(红系)和非癌变MCF-10A对照组(黑色虚线)的细胞活力剂量-反应曲线。fα和α与FER-1(2μM)联合作用72h后,3株TNBC细胞的相对细胞活力n=2项独立实验)。α欧空局对HCC 1806和HCC 1143的剂量分别为100μM和20μM。g含有18:3(18碳,3双键)脂肪酸的每一类脂肪的摩尔分数的百分比,符合αESA(n=每个条件下3个生物复制)。hMDA-MB-231细胞与载体、2μM FER-1、50μMαESA、50μMαESA和2μM FER-1或250 NM ML 162共孵育3小时后,每类脂质的摩尔百分比n=每个条件下3个生物复制)。Ce=胆固醇酯,Cer=神经酰胺,DAG=二酰基甘油,Hexer=己基神经酰胺,lpc=溶血磷脂酰胆碱,lpc-=醚键合溶血磷脂酰胆碱,lpe=溶血磷脂酰乙醇胺,lpe O-=醚键合溶血磷脂酰乙醇胺,液化石油气=溶血磷脂酰甘油,lpi=溶血磷脂酰肌醇,LPS=溶血磷脂酰胆碱,PA=磷酸磷脂酰胆碱,PC=磷脂酰胆碱,pc O=乙醚连接磷脂酰胆碱,PE=乙醚磷脂酰胆碱,PE O-醚连接磷脂酰乙醇胺,PE=磷脂酰乙醇胺,磷脂酰胆碱=磷脂酰磷脂酰胆碱,磷脂酰胆碱=磷脂酰磷脂酰胆碱,磷脂酰磷脂酰胆碱=磷脂酰磷脂酰胆碱,磷脂酰胆碱=磷脂酰胆碱,磷脂酰胆碱=磷脂酰胆碱,磷脂酰胆碱源数据作为源数据文件提供。

非转化MCF-10A(图1)。2E)和MCF-12A(附图)。二维空间)αESA对乳腺上皮细胞株的死亡有抗性。相比之下,所有TNBC细胞株都是易感的,在所有情况下,FER-1都能防止死亡(图1)。2B,f)。值得注意的是,即使是对谷胱甘肽缺乏没有发生铁吞作用的细胞系也是如此(如图所示)。1F)对αESA敏感,提示一种明显的铁下垂诱导机制。α欧空局处理BT 549细胞的时间推移显微镜观察(补充电影)1)显示,在24小时的后期,本来健康的出现的细胞会突然死亡,形态类似于典型的铁下垂诱导剂ML 162(补充电影)所致的细胞死亡。2与细胞凋亡不同(补充电影)3).

αesa被整合到不同的细胞脂类中。

为了研究α欧空局是如何被代谢的,我们对α欧空局处理了3小时的MDA-MB-231细胞进行了脂质体分析,直到细胞明显死亡。含有18个碳和3个双键(18:3)的含酰基链的脂类,与αESA一致,在未处理的细胞中是罕见的(图1)。2G,蓝条),但在αesa处理过的细胞中发现了不同的脂类,包括磷脂和中性脂(绿条;补充数据)。1)。FER-1共处理并没有显著改变含有18:3酰基链的脂类的光谱(比较绿色和紫色条)。与对照组相比,αESA和αESA+FER 1处理的细胞中二酰甘油和三酰基甘油脂的相对丰度增加了2倍,这与αESA被纳入储存脂类相一致(图1)。2H)。α欧空局诱导的脂肪体变化并不是铁下垂的下游后果,因为它们没有通过ML 162的处理复制(如图中的橘子条)。2G,h).

共轭PUFA的结构活性分析

为了表征铁下垂所需的αESA的结构特征,我们筛选了相关的共轭和非共轭多不饱和脂肪酸以诱导死亡。α欧空局在碳9、11和13处分别与顺、反、反立体化学具有共轭双键(图1)。2A)。我们研究了αESA的顺反式立体异构体,发现在第9位(β−eleostearic acid)或在9和13(己二酸)的异构化反应保持了细胞死亡活性,而单在13位异构化(柔顺酸)则导致效能下降了4倍(如图所示)。3A)。Jacaricacid(共轭物18:3,顺-8,反-10,顺-12)对细胞的杀伤作用最强(1.8M)。50),证明移动双键定位,同时保持顺式顺式,顺式,顺式立体化学的扑尼卡酸,并没有破坏活动。α−钙调酸(共轭18:3,反-8,反-10,顺-12)也是一种具有同样功效的立体异构体。因此,细胞杀伤并不严格依赖于脂肪链中双键的精确定位或立体化学。共轭亚油酸(18:2)与α欧空局的两个双键具有相似的位置和立体化学,是细胞死亡的不良诱因,说明第三共轭双键是活性所必需的。此外,所有测试的非共轭多不饱和脂肪酸(PUFAs)都是细胞死亡的单因素诱导剂(补充图)。2E)包括花生捐赠,这在某些情况下增强了下垂。17,18。花生四烯酸所致的细胞杀伤不能被FER-1、Liproxstatin或去铁胺所挽救,这说明了结合和非共轭PUFAs活性之间的重要区别(附图)。2F)。相反,叶酸和己二酸引起的死亡被FER-1(补充图1)所抑制.2G)。BT-549细胞也有类似的结果(附图)。2H),表明18:3结合脂肪酸的保守性能触发铁下垂。

图3:共轭亚麻酸对多种癌细胞具有毒性。

a表示18-碳共轭多不饱和脂肪酸的位置和双键几何的原理图。细胞活力IC50MDA-MB-231细胞在处理72h后,至少两次生物复制的结果显示了每个结合的PUFA值。b肿瘤细胞系脂肪酸毒性评价。将100株条状编码的人癌细胞株与所指示的脂肪酸按0~35 M的剂量处理一式三份,每种细胞株的活细胞在处理48h后进行定量。小提琴图显示了细胞株特异性毒性的分布(以剂量依赖性细胞活力曲线上的面积计算)。毒性值1表示完全丧失活细胞,0相当于与车辆处理的对照者相似的生存能力。暗条表示对面板中所有细胞株的中毒性,虚线表示四分位数的边界。c的热图显示癌症细胞系面板上各活动区的Pearson相关系数。b每对脂肪酸的测试集为14。红色表示正相关,蓝色表示负相关。该条表示下列共轭亚麻酸从左到右、从上到下的位置:夹克酸、过氧化氢酸、α-钙钛酸、β欧空局和αESA。源数据作为源数据文件提供。

为了验证这些脂肪酸作为细胞死亡诱导剂的相对效力,我们使用PRISM筛选平台,分析了它们对6个剂量的100个人癌细胞株的存活率的影响。34。图诺35对剂量-反应曲线进行拟合,计算曲线上的面积(活动面积),以反映细胞杀伤的能力。35。反映每种脂肪酸在细胞板上活动区域范围的直方图如图所示为小提琴图。3B。Jacaric和己二酸对面板的毒性最大,其次是α-calendic酸、αESA和βESA。这些共轭亚麻酸的差异效力是否与它们的代谢有关,是由特定的酶引起的,还是由于溶解度或其它理化性质的差异而引起的,是一个重要的悬而未决的问题。果酸和花生四烯酸的抗增殖活性明显降低,其余的对照脂肪酸基本不活跃。这些结果支持了共轭亚麻酸独特的死亡诱导活性。

来源于细胞株的组织似乎与α、ESA的敏感性或耐药性无关。然而,单个细胞系对一种共轭亚麻酸盐的敏感性与对另一种共轭亚麻酸的敏感性有关,而与对照脂肪酸无关(图一)。3C)。综上所述,这些结果表明共轭亚麻酸对多种不同组织来源的癌细胞具有广泛的毒性。此外,对共轭亚麻酸的敏感性或抵抗力是每个细胞系固有的。

Gpx 4在αESA诱导的铁下垂中的作用

接下来,我们寻求机械的洞察下垂诱导由α欧空局。一种可能是α欧空局通过直接或间接地通过消耗谷胱甘肽来抑制Gpx 4,从而触发铁吞作用。与硫酸钡不同的是,α欧空局治疗后,尽管细胞活力下降,但对细胞内总谷胱甘肽水平没有明显影响(图1)。4A)。直接的gpx 4抑制剂已被证明可以降低gpx 4蛋白水平。17。我们对ML 162和RSL 3证实了这一点,但发现α、ESA或阴性对照麦角素对Gpx 4水平没有影响(图1)。4B),表明αESA并不直接抑制Gpx 4。作为检测αESA是否抑制Gpx 4的另一种方法,我们比较了单独和联合使用αESA、ML 162和RSL 3处理的α-MB-231细胞的铁下垂动力学。两种Gpx 4抑制剂在500 nm时联合作用,可抑制FER-1细胞死亡,其动力学与单独Gpx 4抑制剂相似,表明这是一种饱和剂量的抑制剂(图1)。4C)。相反,当细胞与500 nm ML 162和50 Mαesa共同处理时,细胞活力的丧失速度更快,这是一种剂量的αESA,比单独使用gpx 4抑制剂诱导细胞死亡的时间要长。与铁下垂相一致,FER-1(图中绿色)可以挽救细胞死亡。4C)。α欧空局在Gpx 4受到最大抑制时增强细胞死亡动力学的能力表明,α、ESA和Gpx 4抑制剂通过不同的机制引起细胞凋亡。

图4:α欧空局引起的下垂的机理分析。

a20μM bSO处理24h后,md-mB-231细胞的相对活力(蓝色)和总谷胱甘肽(红色)水平,或特定剂量的αesa(n=2项独立实验)。bMDA-MB-231细胞裂解液中Gpx 4蛋白水平经指示剂处理4h后的密度定量测定。n=3项独立实验。此面板和后续面板中的误差条表示以平均值为中心的标准偏差。p此面板和后续面板中的值是使用双边学生t测试计算的。c按规定处理的MDA-MB-231细胞的细胞活力随时间的变化而变化。*表示p比较ML 162和RSL 3处理的细胞与αESA和ML 162处理细胞的存活率。p从左到右的值为0.003、0.0001、0.02和0.008。d处理72h后,ML162和α欧空局指示剂量对BT-549细胞的活性剂量-反应曲线(?)n=2项独立实验)。eWesternblot显示mda-mbb-231细胞转染mdm-mb-231细胞48 h后gpx 4蛋白水平。Gpx 4-靶向或非靶向siRNA。除非另有规定,β-actin是对此和随后的西部印迹的加载控制。右侧面板显示了αesa在gpx 4耗尽和对照mada-mb-231细胞中的细胞活力剂量-反应曲线(n=3项独立实验)。转染48h后加入α欧空局。f内源性Gpx 4的Westernblot分析及外源性表达V5标记的GXP 4在BT-549和MDA-MB-231细胞中的表达。在指示剂量下培养48h后,这些细胞的相对活力g、ML162(n分别为BT-549和MDA-MB-231=4和3)或h、αESA(nBT-549和MDA-MB-231分别为5和4)。p-学生t-测验的数值显示。Mda-mb-231或bt-549细胞经指示剂量处理48h后的相对活力i、ML162或j、αESA和Vehicle、iFSP 1、FER-1(2μM)或IFSP 1和FER-1。源数据作为源数据文件提供。

α欧空局增强了Gpx 4抑制剂在多个细胞系中的毒性(如图所示)。4D和补充图。3),提示Gpx 4对α引起的铁下垂有一定的抑制作用。与此模型一致的是,siRNA对Gpx 4的瞬时击倒也增强了αESA对Gpx 4的杀伤作用。4E)。最后,我们构建了稳定高表达Gpx 4或EGFP的MDA-MB-231和BT 549细胞作为对照。4F)并发现高表达Gpx 4的细胞株对ML 162引起的铁下垂有抗性(图1)。4G)和αESA诱导的铁吞作用,尽管αESA引起的抗铁吞作用在BT-549细胞中的活性较弱(如图所示)。4H).

FSP 1介导与Gpx 4平行运行的第二条过氧化氢中和途径。通过还原辅酶Q10,fsp 1保持活跃的池,这种自由基捕获脂溶性抗氧化剂。9,10。如所料,fsp 1的小分子抑制剂ifsp 1。9,ML162对BT-549和MDA-MB-231细胞的杀伤作用增强。4I)。相反,iFSP 1对BT-549细胞的αESA毒性无影响,而对MDA-MB-231细胞的杀伤作用增强(图一)。4J),强调了αESA诱导的铁下垂与典型的铁下垂诱导剂之间的进一步区别。

αesa-诱导的下垂是依赖于acsl 1的。

脂肪酸酯化制脂的第一步是其与辅酶A(CoA)的结合,由酰基-CoA脂肪酸连接酶催化。在脂肪酸特异性和亚细胞定位方面,有五种长链特异性亚型(Acsls)。36。ACSL 4优先作用于某些PUFAs,包括花生四烯酸和ACSL 4的丢失,保护细胞免受直接或间接抑制Gpx 4所致的铁下垂(图1)。5A)37,38,39。然而,α欧空局对ACSL 4-缺乏Pfa 1细胞和对照亲本细胞。5B),支持α、ESA和典型铁下垂诱导剂在作用机制上的差异。αESA诱导的细胞死亡被FER-1在这两个细胞株中挽救,与铁下垂相一致(补充图)。4A)。为了鉴定ACSL亚型是否参与了αESA诱导的铁吞作用,我们用RNAi技术分别下调了BT-549和MDA-MB-231细胞中五种亚型的表达。4B,c)。正如预期的那样,ML 162的毒性被ACSL 4这两种细胞系的耗竭(图1。5C和补充图。4D-f)。然而,α欧空局的毒性却被击倒而被显著抑制。ACSL 1,虽然其他ACSL亚型也可能有贡献。

图5:ACSL 1介导由αESA触发的下垂。

细胞活力.对照细胞的剂量-反应曲线ACSL 4-PFA细胞a、ML162或b、αESA.误差条表示以平均值为中心的三个独立实验的标准偏差。c条形图显示bt-549相对于非靶向sirna转染细胞的比例在转染指定的72小时后发生了翻倍的变化。ACSLI-靶向siRNA,然后用ML 162(蓝色,n=3个独立实验)或αESA(红色,n=4项独立实验)。此面板和后续面板中的误差条显示以平均值为中心的标准偏差。p从学生的t-测验(单侧)的值<0.05。dWestern显示对照bt-549细胞中存在acsl 1蛋白水平,表达非靶向性引导RNA和3个单细胞bt-549克隆,其中ACSL 1用CRISPR/Cas9技术(ACSL1KOL1-3)中断。使用一个独立的方法观察到了类似的结果。ACSL 1-靶向导向RNA(补充图)。4G). e相对细胞活力的控制和ACSL 1经指定剂量的α、ESA或f、ML162(n=4项独立实验)。P-值显示在此面板和随后的面板(双面学生t测试)的比较器栏上.gV5 westernblot(左)显示V5标记的抗CRISPR转基因基因的重新表达。ACSL 1 (ACSL 1(右)控制的相对可行性(EGFP),ACSL 1KO(EGFP),或ACSL 1KO细胞表达ACSL 1用α欧空局指示剂量处理48h后的CR。h在稳定高表达蛋白的BT-549细胞中,V5标记的ACSL 1的westernblot(左)与表达EGFP的对照细胞相比,与表达EGFP的对照细胞相比,与表达EGFP的对照细胞相比,稳定地高表达该蛋白;源数据作为源数据文件提供。

我们用CRISPR/Cas9构建了多克隆Bt-549细胞株。ACSL 1(无花果)5D)。与对照组相比,ACSL 1的丢失降低了α欧空局的敏感性(如图所示)。5E)并增加了对ML 162的敏感性(如图所示)。5F)。类似的结果得到了使用独立的引导RNA(补充图)。4G,h)。重新表达抗CRISPRACSL 1在……里面ACSL 1-缺陷细胞恢复了α欧空局的敏感性。5G),并不断增加ACSL 1BT-549细胞的表达进一步增强了α的毒性。5H)。这些结果表明,ACSL 1促进了α、ESA引发的细胞死亡。此外,它们还强调了α、ESA和典型铁下垂诱导剂之间的机械区别,并扩展了与铁下垂有关的ACSL亚型的光谱。

ACSL 1调节α欧空局代谢

为了阐明ACSL 1对脂质代谢的影响,我们对两种独立的脂肪进行了脂质体分析。ACSL 1-缺乏细胞系以及ACSL 1-过表达线及其亲本控制细胞(图1)。6)。总的来说,在没有或存在α欧空局的情况下,ACSL 1调制引起的脂质富集或耗竭的模式是相似的(比较图)。6(左、中面板)。在差异表达的脂类中,我们注意到二酰甘油(Dgs)和三酰甘油(标签)在ACSL 1-与对照组或ACSL 1-αESA处理过表达的细胞(补充数据)2)。这些发现与先前将ACSL 1与这些脂类的生产联系在一起的研究是一致的。40,41.

图6:ACSL 1促使α欧空局加入中性脂类。

的热图表示相对脂质丰度ACSL 1-不足(ACSL 1Ko L1,L2)或过度表达(ACSL 1BT-549细胞经50μMαESA(右、中)处理16h后,与对照细胞(左)相比,其摩尔百分数发生了翻倍的变化。最右边的热图只显示18:3酰基链的脂类的子集。黄色表示相对丰度增加,蓝色表示相对丰度下降。PL=磷脂,CE=胆固醇酯,Cer=神经酰胺,DAG=二酰基甘油,PC O-=乙醚连接磷脂酰胆碱,PE O-=醚连接磷脂酰乙醇胺,SM=鞘磷脂,Tag=三酰基甘油。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们专门研究了ACSL 1对含18:3酰基链的脂类的影响(图1)。6,右)。18:3类脂类的摩尔分数在α中略有降低,但显著降低。ACSL 1−/−细胞与欧洲航天局(α)处理的对照组比较(p=0.006,费舍尔综合测验)。这表明ACSL 1-α-ESA缺乏细胞可能与α-ESA掺入减少有关。脂质亚组重点分析显示,18:3的磷脂酰甘油、dGs和标记(补充数据)特别减少(补充数据)。3)。相反,我们观察到18:3含胆固醇酯和乙烯基醚连接的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺在α中显著增加。ACSL 1-缺乏细胞。一种潜在的解释是,αesa也可能被其他acsl异构体弱利用,例如Acsl 4,已知的Acsl 4可以将底物导向胆固醇酯。40。通过比较,发现了相似的和更稳健的差异。ACSL 1-缺乏ACSL 1-过度表达细胞。它们包括明显低于18:3的脂类(p=0.0002,费舍尔综合检验),特别是在DAGS(p=1×10−10)和标签(p=0.0002)。在一个独立的实验中,我们证实了ACSL 1表达式(图1.7A)减少了18:3链的掺入到欧空局处理的细胞标记物种(图一。7b)。这些发现共同证明了ACSL 1在将α、ESA和其他脂肪酸结合到DAGS/Tags中的作用,这可能暗示了脂滴在α引起的萎缩中的作用。

图7:α的脂质过氧化作用由ACSL 1促进。

aWesternblot显示ACSL 1蛋白在对照组或ACSL 1-沉默的细胞。应用定量PCR(QPCR)技术对siRNA基因敲除的效果进行了独立验证(附图)。4B). b条形图显示在指定条件下BT-549细胞中含有18:3标签的总数量(n=3个生物复制图和随后的条形图)。细胞经25μ、M、α、ESA或Vehicle处理8h。转染后72h,加入两种不同的处理方法。ACSL 1-靶向或非靶向siRNA。在这个面板和随后的面板中,给出了平均值±标准差,p-值显示在比较器栏上(双面学生的)。t-测试)。c火山图显示原木2(折叠变化)和意义(日志)10BT-549细胞经25μMαESA孵育8h后,氧化磷脂(1/p)与载体(甲醇)孵育细胞比较,差异有显着性(1/p)。每种脂类均按磷脂类着色。BMP=双(单酰基甘油)磷酸盐,PS=磷脂酰丝氨酸,PE=磷脂酰乙醇胺,PG=磷脂酰甘油,PI=磷脂酰肌醇,PC=磷脂酰胆碱,CL=心磷脂。箭头表示一种脂类,它的折叠变化无法计算,因为它是在α欧空局治疗后才被检测到的。d条形图显示,与车辆处理的对照相比,α、ESA治疗显着地增加了双氧PE物种的数量。e火山图描绘原木2(折叠变化)与日志10(1/pACSL 1与转染非靶向siRNA的μ、α、ESA处理的α细胞相比,siRNA共孵育8h。该数据集仅限于通过αesa处理而显著改变的51个氧化磷脂物种,如以下所示c。显示金额的条形图(f)、双氧化和(g),单加氧标记物种经αESA处理后以ACSL 1依赖的方式显著增加.源数据作为源数据文件提供。

αesa触发脂类氢过氧化物ACSL 1依赖性的增加。

接下来,我们试图对α欧空局诱导的脂质氧化进行表征。首先,我们用液相色谱-质谱法对BT-549细胞中7个膜脂类的141种单、二、三氧类脂质进行了定量分析,发现经αesa处理的细胞中氧化膜脂的丰度显著增加(p=0.02,学生t检验,单尾)(图1)。7C)。此前有报道称,在发生铁下垂的细胞中,大量的含氧脂质增加,尽管有报道称含花生四烯酸或肾上腺素的磷脂酰乙醇胺具有关键作用。17。在检查的7个脂类中,我们观察到α能显著改变51种(36%)含氧脂质种类,其中大多数种类增加(41/51,80%)。7C)。这些结果与我们观察到的α,ESA处理的细胞中增加的脂质过氧化产物是一致的。二维空间)。氧化增加的种类最多,分别为心磷脂(17/36,47%)和磷脂酰乙醇胺(18/40,45%),包括两种含花生四烯酸残基的双氧磷脂酰乙醇胺。7D,补充图。5).

在与αesa孵育后显著增加的41种含氧膜脂中,10种(24%)对ACSL 1沉默和所有的减少(图)。7E;补充图。5C,e,g,h)。一些(虽然不是全部)由αesa诱导的双氧磷脂酰乙醇胺脂类在.ACSL 1-沉默(图1.7D)。考虑到α欧空局在标记中的大量结合,我们还研究了这种脂质类的氧化。值得注意的是,在α,欧空局处理的而不是对照细胞中,我们检测到了含氧52:4标记(18:1/18:3/16:0)物种,包括单氧和双氧物种(图)。7F,g),与以前的报告一致28。然而,几乎没有发现其他氧化标签(补充数据)4)。ACSL 1沉默降低了这些物种的丰度,亲本未氧化的52:4标记前体(补充图)也降低了这些物种的丰度。5I),证明这些氧化标记物种是以αESA和ACSL 1依赖的方式生成的。

甘油三酯对α欧空局毒性的影响

ACSL 1促进α欧空局在DAG和标签中的积累(如图所示)。6)以及α欧空局的毒性。5),暗示了一种潜在的机械联系。因此,我们研究了二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)在α欧空局毒性中的作用。暂时沉默DGAT1但不是DGAT2α欧空局处理的MDA-MB-231细胞的恢复活力(图)。8A,补充图。6a,b)。同样地,用DGAT1特异性抑制剂PF-04620110而不是DGAT2特异性抑制剂PF-06424439处理细胞,可以抑制α欧空局的毒性(如图所示)。8B)。与冗余相一致,这两种抑制剂的结合对MDA-MB-231细胞产生了加性效应(如图所示)。8B这一组合也抑制了α欧空局诱导的BT-549细胞死亡(图一)。8C)。ML 162的毒性不受这种抑制剂组合的影响。8B,c)表示标记在α、ESA诱导的下垂中所起的作用。降脂甘油三酯脂肪酶(ATGL;补充图)6C),从标记中提取脂肪酸,抑制ML 162的毒性,但不抑制αESA在两个细胞系中的毒性(补充图)。6d-g)。而ATGL的药物抑制剂Atglistatin则同时抑制了αESA和ML 162的毒性(补充图)。6h-j),表明atglistatin可能充当直接的自由基诱捕剂,就像其他小分子抑制剂所观察到的那样。42.

图8:α欧空局与三酰甘油的结合促进了铁下垂。

aMda-mB-231细胞转染72 h后的相对存活率DGAT1-以目标为目标,DGAT2-靶向或非靶向siRNA,然后24小时使用指示剂量的αesa(n=3项独立实验)。此面板和后续面板中的错误条显示以平均值为中心的标准偏差,而此面板和后续面板中的p-值是来自双边学生t-测试的,除非注意到。显示可行部分的条形图(b)、MDA-MB-231或(c),BT-549细胞与6.25μMαESA(n分别为MDA-MB-231和BT-549=3和4)或62.5 NM ML 162(n无论是DGAT1抑制剂(4μM PF-04620110),DGAT2抑制剂(4μM PF-06424439),还是两种抑制剂。d, e条形图显示了两个DAG(18:3/18:3)/二羟基α欧空局加成物的数量,这些加合物是在与α欧空局处理后检测到的,并且被ACSL 1耗竭(n=3个生物复制体)。加合物1和加合物2的m/z分别为940.7278和942.7439。f正常培养基、桐油条件培养基或含有2μM fer-1的桐油条件培养基培养2h后,单个Bt-549细胞脂质过氧化产物的定量。这条线表示平均值。从左到右,n=71、57和46。g条形图显示Bt-549细胞在正常生长培养基或桐油条件培养液中的相对细胞活力,不论是否含有2μM FER-1或50μM DFO(n=6项独立实验)。比较器栏上的值表示来自单边学生t-测试的p值.源数据作为源数据文件提供。

具有共轭双键的脂肪酸和标签与不饱和链的氧化反应不同,与非共轭双键的氧化反应不同。43,44,45,46,47。共轭酰基氧化产物包括醛、过氧化物和高分子量共价聚合物。45,46,47,48,49。我们对α欧空局处理的细胞的低分子量脂质进行了质谱分析,发现了两种不同的双加合α欧空局游离脂肪酸加合物,其中含有两条α欧空局衍生链(如图1所示)。8D,e)。这些加合物仅在α、esa处理的细胞中检测到,并在ACSL 1-打倒细胞,显示ACSL 1依赖于中性脂类αESA衍生酰基链氧化加合物的形成。含有α的高阶聚合物或加成物超出了分析的尺寸范围,因此我们的分析很可能低估了标签氧化的范围。

还有一个问题是中性脂中α、ESA衍生的酰基链的氧化分解是否会导致膜磷脂的氧化。桐树籽油由标记组成,其中约80%的酰基链是酯化的αESA。因此,我们认为桐油是在α欧空局处理过的细胞中积累的富含α的标签的模型(图)。2G)。我们在细胞培养基中制备了桐油乳剂,在沉淀和去除油层后,将条件培养基与BT-549细胞共同孵育。在条件培养基中两小时后,细胞脂质过氧化产物增加,与FER-1共处理后,脂质过氧化产物被抑制(如图1所示)。8F)。条件培养液孵育24 h后,细胞活力显著降低,FER-1或铁螯合作用可部分挽救细胞存活率(图1)。8g)。这些发现表明,富含α、ESA、富含甘油三酯的甘油三酯能够产生一种可扩散的铁下垂介质,有可能将脂质过氧化从中性脂质传播到膜脂。

共轭PUFA在体内具有抗癌活性和促进趋化标志表达的作用

最后,我们评价了桐油在TNBC原位移植模型中的抗肿瘤活性.建立肿瘤小鼠,每周灌胃5次,用100 mg/L桐油灌胃。对照组给予高油酸(18:1)红花油。桐油处理的小鼠体重与对照组无显着性差异(补充图)。7A)。然而,桐油对肿瘤生长有明显的抑制作用(图一)。9A)和终点肿瘤重量(如图所示)。9B与对照组相比,肺转移浸润明显减少(如图所示)。9C,d)。BSO的加入进一步增强了αESA对肿瘤生长的抑制作用(附图)。7b),与硫酸钡增强α欧空局体外毒性相一致(图一)。2B).

图9:桐油对TNBC异种移植物生长和转移有抑制作用。

a用红花油(对照组)或桐油(对照组)口服NSG小鼠原位mDA-MB-231异种移植瘤体积随时间的变化n=双侧肿瘤组小鼠6只)。*表示双面学生的p值t-测试,从左到右分别为0.003、0.00001和0.0003。错误条显示四分位数范围。b治疗24天后单个肿瘤的最终肿瘤肿块。线条代表中值。这个p-比较器栏上方的值来自一个双边学生的t-测试。c有代表性的苏木精和伊红染色肺切片。含有转移性TNBC细胞的区域用绿色标出。d转移细胞浸润肺面积百分比的定量研究。这条线代表中间值,方框显示中间四分位数范围(25至75百分位数),而晶须显示最小值和最大值。这一分析只进行了一次。比较器栏上方的p值来自一个双边学生的t-测试。e桐油治疗肿瘤中DAG 34:3和TAG 52:7的摩尔百分比(左,左)n分别为DAG 34:3和TAG 52:7或mDA-MB-231细胞与50μMαESA共培养3h(对,n=3个生物复制体)。误差条表示以平均值为中心的标准偏差。P值是用单面学生的值计算的。t-检验,不经多假设检验调整。f比例金星图显示基因与转录水平的重叠,在与100μMαesa或125 nmml-162或在mda-mbb 231异种移植瘤中进行上述治疗后5小时内,转录水平显著改变(5%的错误发现率)。a。所有三组数据中通常被改变的基因被列出。源数据作为源数据文件提供。

为了证明肿瘤生长的减少与肿瘤暴露于α欧空局有关,我们对α治疗的肿瘤和对照肿瘤进行了脂质体分析。两种表达差异最大的脂类分别为DAG(34:3)和TAG(52:7),分别增加了30%和60%。9E)。这些脂类的质量与至少一个亚麻酸酯部分是一致的,尽管它们的精确的酰基链组成还没有确定。值得注意的是,这两种脂质在α欧空局处理的培养细胞中的表达也增加了。9E)。因此,增加DAG(34:3)和TAG(52:7)可反映肿瘤暴露于从桐油释放并被肿瘤细胞吸收的循环αESA。

接下来,我们评估了α治疗的小鼠肿瘤是否表达铁下垂的标记物.我们对三种肿瘤分别进行了RNA测序,并以Gpx 4抑制剂ML 162或载体对照物αESA处理的MDA-MB-231细胞为对照,将差异表达的基因与单独的体外实验进行了比较。使用5%的假发现率和rna表达>2倍的过滤器,桐油处理的肿瘤中有124个基因与红花油处理的对照组相比发生了改变(图一)。9F)。值得注意的是,89个基因(89/122,73%)在桐油处理的肿瘤细胞中也发生了改变。Fisher的精确测试显示这些基因集之间有显著的重叠(p=3.2×10−246)所有89个重叠基因均朝同一方向改变。这与我们认为体内抑制肿瘤生长与α在体外引起的细胞死亡有关的假说是一致的。重要的是,桐油体内、体外αESA和ML 162体外处理的基因也有明显的重叠。7F)。费舍尔在任何两个基因集合之间的精确测试p-<7.2×10的数值−61。此外,所有共有的基因都是朝着同一个方向改变的。这些结果表明桐油治疗与αESA治疗之间存在一致的基因信号,这与桐油治疗小鼠肿瘤暴露于αESA的假设一致。此外,α、ESA和ML 162处理细胞的特征重叠提供了强有力的证据,证明这两种治疗都会引发类似的嗜热反应。

这三种处理都改变了一组共有的23个基因(图1)。9F)包括以前发现的在铁下垂过程中增加的基因(RHOB, SLC2A3, DDIT 4,Hmox 1)50,51。此外,先前报道的嗜铁酶的标记物CHAC 150桐油处理的肿瘤和α欧空局处理的肿瘤细胞中普遍存在上调。αESA和桐油都改变了66个基因,但ML 162没有改变,这表明了αESA引起的萎缩症的生物标记物的潜在来源。

讨论

虽然抗癌活性以前被认为是由各种共轭亚麻酸组成的,包括α,esa。52,53在这里,我们揭示了作为下垂的作用模式,并强调了与现有的下垂诱导剂相比的机理上的差异。我们的发现表明,Gpx 4抑制剂通过抑制谷胱甘肽依赖性的氢过氧化物还原而促进铁下垂,而αESA则通过促进过氧化氢的产生来促进铁下垂。Gpx 4的活性降低了α,欧空局诱导的过氧化氢积累,但最终Gpx 4被淹没。

我们发现ACSL 1介导了α、ESA诱导的下垂以及αESA掺入到特定的脂质中,包括DAG和TAG(图1)。5, 67b)。进一步支持标签在铁吞、耗竭或药物抑制DGAT活性中的作用,可以抑制αESA的毒性(图1)。8A-c)。我们发现acsl 1是由脂滴构成的。54,与其他脂质池相比,αESA集中在中性脂类中。通过三个小时的治疗与α欧空局,标签水平增加了2倍(图)。2H>70%含有至少一个18:3酰基链,而没有膜磷脂类大于20%(图1)。2G)。我们假设含有α、ESA衍生的酰基链的中性脂类在达到脂滴的临界浓度后会发生自发或酶介导的氧化。这种浓度依赖性可以反映脂类自氧化限速繁殖的分子间性质。自氧化的链式反应传播阶段的过氧自由基要么从相邻的氢过氧化物中提取氢原子,要么通过添加碳碳双键形成分子间共价键。共轭亚麻酸三烯体系附近氢原子的萃取速率比非共轭亚麻酸中双烯丙基氢的萃取速率快2.5倍。43。此外,过氧基还以更快的速度加入共轭亚麻酸的三烯体系,而过氧基则不明显地增加非共轭亚麻酸中的双键。这使得共轭亚麻酸的自由基氧化繁殖速度快了8倍以上。43,为这类脂类在阈值浓度以上具有明显的促下垂活性提供了化学基础。

而我们只检测到两种与α相关的氧化标记物种,如图所示。7F,g),我们推测含有酯化αesa的中性脂会发生氧化聚合,形成更高分子量的聚合物,就像以前在体内证明的那样。45,46,47,48。因为我们的分析重点是脂类<;1,200,分子量,种类非常多,任何含氧衍生物都没有被我们的脂肪酶分析所检测。然而,我们演示了自由α欧空局的加成物与含有酯化的α欧空局的DAG(图1)。8D,e),它属于这个大小的截止,支持更大的共价聚集体也可能形成的可能性。

脂滴在增强脂质过氧化中的作用与这种细胞器对氧化应激的保护作用是相反的。55,56。然而,这可以通过共轭亚麻酸的快速自由基氧化传播来解释。膳食共轭亚油酸与人体脂质过氧化增加有关。57,58动物模型59,αesa显示出比这些物种更快的自发氧化。53,60。虽然脂滴可能通过从其他地方产生的ROS物种中分离而保护多不饱和脂质不被氧化,但哺乳动物不自然合成的酯化共轭亚麻酸在脂滴中的积累可能促进它们在那里的氧化和聚合。脂质过氧化从脂滴到膜磷脂的传播可能是通过可溶性介质的扩散来实现的。8F,g)。在脂滴中形成大的共价脂质聚合物也可能引发自噬反应。61这可能会导致下垂62.

脂滴中共轭亚麻酸酰基链的积累也可能解释了α、ESA和Gpx 4抑制剂引起的亚麻酸酰基链在ACSL异构体作用上的差异。Gpx 4抑制剂抑制抗氧化反应,使天然脂质ROS物种积累。在许多情况下,这些都可能是由酶产生的花生四烯基和肾上腺素酰基链的过氧化产物,其与膜磷脂的结合是由ACSL 4介导的。38。相比之下,α欧空局毒性的ACSL 1依赖性似乎至少部分是由ACSL 1驱动的α欧空局掺入标记介导的。总之,这些发现表明共轭亚麻酸通过一种由acsl 1介导的机制引发铁吞,并支持新出现的证据表明脂质组成是决定嗜铬敏感性的关键因素。63.

Gpx 4和FSP 1与ML 162对BT 549细胞抑制α、ESA诱发的下垂能力的差异(图1)。4G-j)也可以用不同来源的脂质过氧化来解释。我们推测Gpx 4和FSP 1可能已经进化并定位于脂质ROS的天然来源。事实上,fsp 1是N-肉豆蔻酰化的,以细胞类型特异性的方式定位于胞内膜和质膜上。9,10。质膜限制的fsp 1恢复了rsl 3对fsp 1缺陷细胞的抗性,而fsp 1针对其他细胞内的位置则没有恢复rsl 3的抗性。10提示质膜是脂自由基聚集抑制Gpx 4的重要部位。相比之下,α欧空局与其他营养脂肪酸一样被代谢,并储存在脂滴中,由于其氧化结合的三烯系统,它可能是脂质ROS的来源,内源性保护机制对其靶向性较差。这一概念对靶向癌细胞有明确的适用性,这些癌细胞能够有力地清除细胞外脂肪酸。22.

研究表明,包括肾癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤在内的癌细胞容易出现铁下垂。38,51,64,65,66,67,68。此外,耐治疗的间充质癌细胞更依赖gpx 4的活性来生存。64,69。这些发现突出了铁下垂的治疗潜力,但目前尚不清楚是否可以利用诱导铁下垂来杀死体内的癌细胞。1。检验这一假说的一个主要挑战是缺乏适合在体内使用的促铁吞剂,如gpx 4抑制剂。70。在此,我们发现,用富含αESA的桐油治疗小鼠,可以抑制肿瘤的生长和转移,并导致肿瘤基因表达的变化与铁下垂一致。数据表明,Gpx 4抑制剂,如果这些在临床上可行,可能会增强α欧空局的抗肿瘤活性。因此,这些发现扩大了我们对调节下睑下垂的途径的理解,并为治疗铁下垂提供了一种方法。


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