您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2021
Wuhan Xinqidi Biotech Co.Ltd
本企业通过iso9001质量体系认证

树突状细胞TIM4表达介导肿瘤相关抗原的摄取及抗肿瘤反应

 二维码
发表时间:2021-04-16 11:58作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

1型树突状细胞(Cdc 1)获取细胞相关肿瘤抗原是诱导和维持肿瘤特异性CD8的关键。+T细胞通过交叉呈现。本研究表明,在小鼠肺肿瘤进展过程中,肺组织cDC 1对细胞相关抗原的捕获和吞噬具有抑制作用。机械地说,吞噬功能的丧失与肿瘤介导的磷脂酰丝氨酸受体TIM4的下调有关,该受体在正常肺组织cDC 1中高表达。TIM4受体阻断和cDC 1缺失对肿瘤特异性CD8激活的影响+T细胞促进肿瘤的进展。在人肺腺癌中,TIM4转录本增加了cDC 1信号的预后价值,并预测了对PD-1治疗的反应。因此,肺内cDC 1上的TIM4参与了免疫监视,其在晚期肿瘤中的表达受到抑制。

导言

组织生长于Batf 3依赖型1型树突状细胞,命名为cdc 1,擅长CD8的活化。+T细胞是外生获得的抗原,对于检测肿瘤和介导新生病变的排斥反应是必不可少的。1,2,3,4。此外,肿瘤内cdc 1在T细胞介导的免疫清除过程中支持T细胞的功能。5,6,而且它们在几种人类癌症中的丰度与更好的预后有关。5,7,8。肿瘤中cDC 1的积累依赖于NK细胞和CCL 58,9进而导致肿瘤特异性T细胞的原位募集和扩增7,10。这些正相关可能反映了cdc 1的残留活性,因为许多报告表明DC受到肿瘤免疫微环境(Tme)中的信号的负面影响。10,11,12,13,14,15,16,17,18.

以往的研究证实cdc 1介导的抗肿瘤免疫主要依赖于吞噬即将死亡的肿瘤细胞来获得细胞相关抗原。5,6,16。然而,控制肿瘤组织中cDC 1获取肿瘤细胞相关抗原的受体,以及这一过程是否是抑制性TME的靶点尚未被研究。CD 36、DEC-205、DNGR 1/Clec9A、SCARF 1和Axl等受体对死亡细胞的识别/结合以及细胞相关抗原的交叉表达均受cdc 1的控制。19,20,21,22,23,24,在不同的情况下。TIM4(T细胞免疫球蛋白粘蛋白-4)主要表达于腹腔巨噬细胞,它识别凋亡细胞(AC)上的磷脂酰丝氨酸(PtdSer)。25,26,27和一些发展中国家的子集28,29,30,31,32。这些吞噬受体在组织内cDC 1上的表达及其在肿瘤生长过程中对肿瘤抗原摄取和调节的贡献仍未得到充分的研究。

本研究采用可移植的肺腺癌(来源于kras/p5 3 kp小鼠)的Kp模型。16,33,34研究肺内cDC 1在肿瘤发生过程中吞噬细胞相关抗原的能力。Cdc 1主动吞噬并呈现细胞相关抗原至CD8。+T细胞处于肿瘤发生的早期阶段,但晚期肿瘤的抗原摄取、提呈和T细胞活化受到抑制。基因表达谱显示TIM4在正常肺cDC 1中高表达,在晚期肿瘤相关细胞中表达下调。此外,跨肺吞噬细胞的横断面显示,与其他组织不同的是,TIM4在肺内巨噬细胞或与肺肿瘤相关的巨噬细胞上不表达。TIM4受体阻断和cDC 1基因缺失调节cDC 1吞噬肺内死亡细胞和肿瘤细胞的能力,并诱导肿瘤特异性CD8反应,控制肿瘤生长。联合应用cDC 1/在人肺腺癌中的应用Timd 4基因信号可以预测早期患者的生存,以及肺腺癌患者对PD-1治疗的反应。

结果

晚期肺癌组织中cdc 1不能摄取细胞相关抗原

为探讨肺内cDC 1在肿瘤发生过程中对细胞相关抗原的摄取,我们通过静脉接种(i.v.)建立了原位肿瘤模型。克拉斯G12D/+P53−/−原发性肿瘤细胞33,34。我们定义了两个时间点,早期肿瘤(KP(E),10~14天)肿瘤面积占肺实质的5-10%,晚期肿瘤占肺总面积的30%以上(KP(L),28~35天)(补充图)。1A)。以注射PBS的小鼠为对照组(正常肺,非肺)。已建立的肿瘤中性粒细胞增加,SiglecF的频率不变。+CD11c+肺泡巨噬细胞(AM)和Ly6C单核细胞减少T细胞的频率(附图)。1B)。区议会舱(附图)S1c-e)晚期肿瘤的特征是mdc和cdc 2较cdc 1增加,这与以前的数据一致。16,18。CDC 1家族特异性和成熟标记的表达在肿瘤相关的cDC 1中不受影响。1F)。为了研究cDC 1吞噬死亡细胞的能力,我们首先在体内注射标记凋亡的胸腺细胞(I.T.)控制或携带肿瘤的动物。接种后2h与吞噬细胞相关的荧光定量显示AM的摄取较高,cDC 1和cDC 2的摄取较低。1AS2A)。早期和晚期肿瘤中cDC 2和AM的摄取与对照组相比无明显变化,而cDC 1在晚期肿瘤中的摄取受到明显抑制(图一)。1A)。为了直接检测细胞肿瘤片段在组织中的摄取,我们构建了一个KP-BFP报告系.在肿瘤接种后的早期,我们观察到肺cDC 1的BFP荧光比在cDC 2和AM中高,这可能是由于后者的细胞内货物降解速度更快(补充图)。2B)5,35。在晚期肿瘤中,与cDC 1相关的BFP明显减少,而在cDC 2和AM中则保持不变,提示cDC 1可选择性地降低肿瘤细胞的吞噬能力(图1)。1B和补充图。2B)。为了观察单个细胞水平的摄取,我们从对照组、早期和晚期KP荷瘤小鼠中分离出cDC 1,并将其与标记的凋亡胸腺细胞体外孵育。来自正常肺和早期肿瘤的cDC 1有效捕获并吞噬死亡细胞。相反,从晚期肿瘤中分离出的cDC 1在与死亡细胞的结合和吞噬方面受到损害(见图)。1C,d和补充图。2C,d)。我们的结论是,KP肿瘤的TME抑制cDC 1吞噬死亡细胞的内在能力。Cdc 1通过吞噬获得交叉存在的肿瘤相关抗原,激活肿瘤特异性CD8。+T细胞5,6,24。为了了解摄取缺陷对交叉存在抗原能力的影响,我们建立了一株KP-OVA细胞系,表达低水平的模型抗原OVA(OVA,克隆G11,补充图)。3A)。KP-OVA肿瘤比亲本KP肿瘤长得少,并在晚期出现较小的结节(附图)。3B)。CD8耗竭+肿瘤挑战后的前2周,T细胞导致肿瘤负担急剧增加,说明肿瘤抑制是由CD8介导的。+T细胞(附图)3C)。用25D-1.16抗体染色检测cDC 1组织上的交叉表达肽MHC OVA,发现早期KP-OVA具有较高的抗原密度,晚期荷瘤肺的抗原密度较低(如图1所示)。1E和补充图。三维空间)。为了进一步探讨交叉表达肿瘤相关抗原能力的变化,我们从早期或晚期KP-OVA肿瘤小鼠中分离出cDC 1、cDC 2和AM。在早期肿瘤中,cDC 1是唯一能够有效激活OVA特异性CD8的细胞,这与以前的报道是一致的(见图)。1F和补充图。3E)3,5,6,36。这种特性在晚期肿瘤的cDC 1中被明显抑制,表明在晚期肿瘤中,肿瘤组织中提取的抗原交叉呈现消失(图1)。1F)。为了证实对细胞相关抗原交叉表达的抑制,我们在肺内传递了载药的凋亡胸腺细胞。CD8 T细胞在对照组和早期荷瘤动物中均有增殖,但在晚期荷瘤动物中未见增殖。1g)。体内自发产生的IL-12略有下降,但细胞对体外再刺激反应有效,这表明DC1的细胞因子信号并没有受到很大影响(补充图1)。3F,g)。此外,肽脉冲cDC 1还可诱导OVA特异性CD8的鲁棒激活。+T细胞,表示与T细胞的正常相互作用,没有共同刺激信号的损害(补充图.)3I)。在晚期肿瘤cdc 1中,在体内外传递的可溶性蛋白抗原的交叉表达减少,这与以前的报道一致。13(补充图。3J)。因此,通过解剖DC1活性的个别步骤,我们证实了肿瘤组织cDC 1捕获抗原的一个主要缺陷。

图1:cDC 1对晚期肺癌细胞相关肿瘤抗原的摄取受到抑制。

a对照组小鼠(n肺)或携带早期(E)或晚期(L)KP肿瘤的小鼠受到I.T攻击。用CTV标记凋亡胸腺细胞。2小时后,用流式细胞仪分析全肺细胞悬液,检测与荧光相关的吞噬细胞比例。具有代表性的cDC 1(CD 45门控)流式细胞仪分析+/CD11c+/Siglechf/MHC-II/CD11b)和定量摄取,以CTV的百分比表示。+Cdc 1.在两个独立的实验中对数据进行了检验:n=8,KP(E)n=5,KP(L)n=5,单向方差,然后是图基的后测。b用KP-BFP细胞攻击小鼠。在激发后的早期或晚期取肺,制备全肺细胞悬液。有代表性的流式细胞仪图显示BFP的百分比+Cdc 1和相应的量化。从两个实验中收集到的数据n=每组8只老鼠,两尾未配对t-测试。c, d分类-cDC 1细胞从肺,早期或晚期整个肿瘤组织孵育30‘(结合,c)或2小时(摄取,d)用CFSE标记的凋亡胸腺细胞。c有代表性的显微照片显示cDC 1与胸腺细胞结合。在两个独立的实验中,对在分离场中获得的30个单个细胞进行了cDC 1与至少一个胸腺细胞接触的百分比测定。d有代表性的显微照片显示胸腺细胞摄取。至少吞噬了一个细胞片段的cDC 1的百分比被描绘为摄取。在两个独立的实验中,数据代表了30个细胞/条件。在……里面cd单因素方差分析及图基后测。E腹腔注射诱发肿瘤。注射KP-OVA表达细胞。用MHC OVA特异性抗体(25D1.16)标记全肺组织,流式细胞术检测cdc 1交叉表达(CD 45)。+/CD11c+/西格莱赫-F/MHC-II/CD11b)。代表直方图和定量的阳性细胞百分比的基础上所描绘的直方图。数据来自两个独立的实验:kp(E)n=4,KP(L)n=3(cdc 1来自两只小鼠进行分析),双尾未配对。t-测试。fCDC 1与CFSE标记的OVA特异性T细胞(OT-I)混合,从早期和晚期Kp-OVA肿瘤的全肺细胞悬液中分离。典型的CFSE峰值和增殖定量(细胞至少经历两个周期的增殖超过总T细胞)。每个点对应于从KP(E)中分离出来的cdc 1。n=3或KP(L)n=4只小鼠在三个独立实验中,两尾未配对。t-测试。gCsFE标记的OT-I被转移到非肺、早期和晚期荷瘤动物。卵子负载凋亡胸腺细胞。观察2天后纵隔淋巴结T细胞增殖情况。数据来自两个独立的实验,n=9/7,KP(E)n=4或KP(L)n=7,单向方差,然后是图基的后测。所有数据均以均值±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。

肺cDC 1不能激活CD8+晚期肿瘤的肿瘤反应

探讨cdc 1抗原表达减少与肿瘤进展是否与CD8的损害有关。+体内T细胞反应,我们追踪内源性CD8。+随着时间的推移,KP-OVA冲击动物血液中的T细胞。循环干扰素-γ+CD8+T细胞在攻击后第14天观察到,第21天达到高峰,第28天下降到几乎基线(见图)。2A,b)。肺组织CD8也有相同的变化趋势。+T细胞在比较早期和晚期时间点时(如图所示)。2C)。免疫组化显示CD8高密度+早期结节中T细胞较少,CD8较少。+晚期肿瘤的T细胞局限于肿瘤边缘(如图所示)。二维空间)。因为T细胞反应的丧失可能是由于晚期肿瘤中OVA阴性肿瘤细胞的选择所致。33采用流式细胞术和免疫组织化学方法检测OVA的表达。OVA表达CD 45的百分比细胞在早期和晚期肿瘤中相似(附图)。4A)。OVA染色的强度在早期肿瘤的小结节和晚期肿瘤的大结节中相似(附图)。4B),表明抗原仍在晚期病变中表达。CD8细胞内源性衰竭的鉴别+T细胞从缺陷抗原提呈,我们分析了天真的cfse标记的CD8的增殖。+卵特异性T细胞转移到早期和晚期荷瘤肺。早期肿瘤可有效诱导增殖,晚期肿瘤不能有效诱导增殖,提示原位APC缺乏启动(图1)。2E,f)。此外,Batf 3的增殖也减少了。−/−小鼠3,表明cDC 1在此模型中完全激活T细胞是必需的(如图所示)。2G,h)。这些数据表明肿瘤特异性CD8的启动效率不高。+建立的肿瘤T细胞与cDC 1的抗原呈递丢失相一致。

图2:CD8+晚期肿瘤T细胞反应和肿瘤抗原交叉表达受cDC 1抑制.

a, b内源性CD8产生IFN-γ动力学的代表性图及定量研究+KP-OVA刺激小鼠T细胞。数据来自第7至28天的两个独立实验或第14-21天的3个独立实验。在……里面bKruskal-Wallis接着是Dunn的测试后第7天n=6,第14天n=15,第21天n=6,第28天n=4只小鼠。c干扰素-γ产生内源性CD8的百分比+早期或晚期KP-OVA肿瘤的肺组织T细胞。KP(E)n=7,KP(L)n=8只小鼠在两个独立实验中,两尾未配对。t-测试。dCD8+T细胞在早期和晚期KP-OVA肿瘤中的定位。标尺200毫升.CD8密度的量化+T细胞作为结节面积的函数,在连续三次切片/样本上自动计算。数据来自金伯利进程(E)n=11,KP(L)n=7,双尾未配对t-测试。e, fOT-I在MLN中的增殖特征(e)或肺(f)观察移植后2天内荷瘤小鼠的Kp-OVA肿瘤发生情况。描述了增殖指数(至少经历了两个周期增殖的细胞)和增殖细胞的绝对数目。在……里面e增殖百分比KP(E)n=12,KP(L)n=7;绝对数字KP(E)n=6,KP(L)n=4.在f扩散百分比KP(E)n=12,KP(L)n=7;绝对数字KP(E)n=7,KP(L)n=5.数据来自三个独立的实验,两尾未配对。t-测试。g, hKP-OVA肿瘤在WT和Batf 3中的诱导−/−老鼠。g过继转移的OVA特异性CD8 T细胞增殖和IFN-γ产生及内源性CD8产生IFN-γ+肺内T细胞。%扩散WTn=3,Batf 3−/− n=3;干扰素γ+OTI(%)与干扰素γ+CD45.2+CD8(%)WTn=4,Batf 3−/−n=4;双尾未配对t-测试。hTT-I在MLN中产生干扰素-γ.数据表示两个独立的实验(n=4只老鼠/组),双尾未配对t-测试。所有数据均以均值±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。

基因表达谱显示肺癌相关cdc 1中TIM4缺失

为了探讨晚期肿瘤抗原获取缺失的分子基础,我们比较了正常肺(n肺)和晚期KP肿瘤肺组织中cDC 1的转录谱。决定cDC 1谱系的因素在对照组和肿瘤相关的KP cDC 1中同样表达,表明cDC 1保持了他们的身份(图1)。3A)。基因表达分析得到40多份差异表达的转录本(假发现率为≤5%,绝对折叠变化≥2;补充图2)。5A和补充表1)。在肿瘤相关的cDC 1中富集的转录本优先属于干扰素α通路、细胞内贩运和抗原处理(补充图)。5B-d)。我们将重点放在吞噬细胞受体上,寻找一种丢失抗原摄取的机制。如图所示。3B,c; Timd 4,编码PtdSer受体TIM425,在非肺组织cDC 1中高表达,在晚期肿瘤中表达强下调。其他与凋亡细胞结合和吞噬有关的受体(Clec9a,CD 36,Axl,Lrp 11,Ly75,Stab 1,MerTK,Marco,Tyro3,Scf 1)除Cd300lf,PtdSer的第二个受体,已知抑制DC的胞吐作用。37,和镉209 a(dc-标志),这是轻微的向下调制。由于肺cDC 1选择性高表达TIM4的报道,我们通过对公开数据集的分析来验证我们的数据。正常肺组织单细胞数据集(自然. Https://doi.org/10.1038/s41586-018-0590-4)确认的共同表达Timd 4在一簇髓系细胞中含有cDC 1的标记物(如图所示)。三维空间)。重要的是,分析最近从对照组和KP肿瘤小鼠肺生成的scRNA数据集。16证实TIM4在cDC 1细胞中的选择性表达和肿瘤条件下的明显减少(如图所示)。3E)。流式细胞术证实TIM4蛋白在肺cDC 1中高表达,而在其他肺吞噬细胞亚群中缺乏表达(附图)。6a,b)。进一步分析多个小鼠组织38在组织内的巨噬细胞、皮肤中的Langerhans细胞和真皮cdc 1中均有预期的高表达。32。TIM4在肝脏cDC 1、迁移性cDC 1/cDC 2在纵隔LNS、脾和骨髓cDC 1/cDC 2中有少量表达,证实幼稚小鼠肺cDC 1表达最高(补充图1)。6C,d).

图3:肺吞噬细胞中PtdSer受体TIM4的选择性表达及肿瘤的下调。

a从非肺或晚期KP肿瘤中分离出cDC 1,分析其转录谱。该图显示cDC 1和cDC 2系特异性基因在非肺分类和肿瘤分类的cDC 1中的表达。数据用平均±sd表示。n=4,KP(L)n=3。b火山图显示了编码清道夫受体的基因的折叠变化(显著调节的基因用红色和蓝色表示,使用q-数值<5%,假发现率(Fdr)为5%,≤为1倍变化≥2或≤2),采用显着性分析微阵列(SAM)算法。c圆点图显示了基因的相对丰度。b使用线性表达式值的颜色和大小比例。dT分布随机邻居嵌入(TSNE)图的单细胞表达谱在小鼠肺(Tabula Muris)。基于基因表达的全局相似性,颜色表示不同子集的聚类。我们进一步分析了与dc-巨噬细胞相对应的簇,以评估cdc 1标记物和Timd 4成绩单,如方框中所示。e人肺癌和KP肺癌的scRNA seq16分析以可视化Timd 4-在肺DC的三个亚群中表达细胞。小提琴的情节表现出Timd 4在cDC 1、cDC 2和mregDC中。统计分析苏拉特R包,同时考虑到表达细胞的数量和表达水平。f代表直方图和定量表达TIM4的细胞在肺早、晚期肿瘤中的表达率(直方图显示阳性和阴性细胞的门)。数据来源于龙n=3,KP(E)n=6,KP(L)n=9只老鼠。采用单因素方差分析(ANOVA)和图基后测(TUKEY‘s)后测显着性,数据以均值±SEM表示。gTIM4在总CD 45上表达的代表直方图和CD 45+N肺和晚期KP肺的细胞和所有肺吞噬细胞亚群。肺泡巨噬细胞(AM)、间质巨噬细胞(IM)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、单核细胞(Mono)。每个峰值都覆盖在相应的FMO控件(黑线)上。源数据作为源数据文件提供。

为了验证TIM4在肿瘤中的下调动力学,我们分析了与cDC 1功能相对应的早期阶段。我们观察到轻微的,不明显的,减少的趋势(如图所示)。3F),提供了受体水平与吞没能力之间的因果联系(图一)。1A,b)。有趣的是,单叶原位注射KP足以引起对侧叶的轻微减少(补充图)。7A)。在包括TAMS在内的晚期肿瘤中未检测到其他肺吞噬细胞的表达,在基质或肿瘤细胞(CD 45阴性部分)中也未检测到表达(如图所示)。第三代),与以往关于乳腺肿瘤和黑色素瘤的数据形成对比29,31。TIM4在早期原发性KP肿瘤中也有轻微下降(附图)。7b),以及与Lewis肺癌相关的cDC 1(补充图)。7C).

TIM4对肺cdc 1细胞相关抗原摄取的控制作用

TIM4在腹腔巨噬细胞凋亡细胞的束缚和吞噬中起着非冗余的作用。27,39。TIM4在dc室或cdc 1中是否可作为死细胞摄取的受体,目前文献甚少。28。为了分析TIM4在BFP-KP细胞吞噬过程中的作用,我们首先证实了肺组织中肿瘤细胞接触磷脂酰丝氨酸(附图)。7D)。我们接下来在肿瘤植入的初始阶段使用TIM4阻断抗体或同类型对照。受体阻断是有效的,不改变成熟或绝对数量吞噬细胞排除旁观者效应(补充图)。7E)。TIM4阻断导致cDC 1吞噬BFP肿瘤细胞的比例显著减少,而不影响其他亚群的摄取(图1)。4A和补充图。7F)。我们进一步检测了TIM4阻断对死亡胸腺细胞吞噬功能的影响。非肺组织TIM4阻断抗体选择性地减少了cDC 1的摄取,几乎达到KP肿瘤的水平,并且在肿瘤肺中没有加性效应(如图1所示)。4B)(附图。7g)。从wt或Timd 4中分离出的cdc 1的摄取也减少了。−/−小鼠,并与凋亡的胸腺细胞孵育,标记的pH罗多,一种探针,成为荧光,只有在酸性条件下。39,40(无花果)4C)。TIM4的阻断或基因缺失对抗原表达的后续步骤也有同样的影响。阻断抗体减少组织cDC 1标记的KP-OVA抗原(肽:MHC OVA复合物)的抗原提呈(图1)。4D),并将CD8 T细胞过继转移到接受OVA负载凋亡胸腺细胞的小鼠体内(见图)。4E)。最后,用TIM4阻断Abs处理的动物早期KP-OVA肺组织中分离出的cDC 1不能诱导OVA特异性T细胞的体外增殖(图一)。4F)。在使用Tim4时,观察到了同样的减少。−/−动物作为接受者(图一。4G)。我们的结论是,TIM4在肺cDC 1中的表达是捕获和表达正常肺和早期肿瘤组织中细胞相关抗原的必要条件。

图4:TIM4控制cdc 1肺内细胞相关抗原的捕获和交叉表达.

a用KP-BFP攻击小鼠,用TIM4或同类型对照的阻断抗体治疗,如图所示。肿瘤激发后第5天测定肺组织中cDC 1的摄取。两个实验的一个代表点图和量化n=3只小鼠/组。b对照组或晚期KP荷瘤小鼠先用同型对照或αTIM4抗体进行预处理,再用CTV标记的凋亡胸腺细胞进行攻击。用流式细胞仪检测激发后2h肺吞噬细胞与荧光相关的百分率。给出了两个独立实验的代表性图和数量化图。n=7,等型KP(L)=9,αTIM4n=8,αTIM4-KP(L)n=3。c肺cDC 1在WT和Timd 4中摄取pH罗多负载胸腺细胞的实验研究−/−老鼠。代表性直方图和量化(pH值RODO的百分比和MFI)+(Cdc 1),用于三个独立实验之一。n=3只小鼠/组。d肺cDC 1交叉表达(用MHC-Ⅰ类:卵肽复合物特异性25D1.16抗体标记),第7天用TIM4阻断剂治疗荷KP-OVA的动物。代表直方图显示MFI值和量化的5个动物/组在两个独立的实验。eI.T诱导过继转移的OT-Ⅰ在体内增殖。注射OVA负载凋亡胸腺细胞,存在TIM4阻断抗体或同类型对照,如方案所示。图表显示CD8增殖的频率和绝对值。+MLN中的T细胞(至少有一个增殖周期)。数据是两个独立实验的代表。%增殖等型n=8,αTIM4n绝对值为5只老鼠/组。fTIM4阻断或同类型治疗后第7天细胞分类的cDC 1诱导体外OT-I增殖。三个独立实验(每个点对应于三只小鼠的cdc 1)的代表性稀释曲线和定量,n=9,αTIM4n=7。gf,cdc 1是从wt或wt诱发的第7天kp-ova肺癌中分离出来的。Tim4d−/−动物(n=5只小鼠在两个独立实验中)。所有数据均为均值±扫描电镜。显着性由单因素方差分析和Tukey后测确定。b,或两尾未配对t-测试。源数据作为源数据文件提供。

TIM4控制抗肿瘤CD8免疫的启动

为了直接评估TIM4介导的吞噬对抗肿瘤CD8反应的影响,我们在肿瘤攻击期间使用TIM4阻断抗体。TIM4阻断抑制OVA特异性效应因子CD8的诱导+KP攻击小鼠外周血中的T细胞(见图)。5A),并降低过继转移的OVA特异性T细胞的活化(补充图)。7H)。为了进一步研究TIM4在T细胞启动过程中的作用,我们将kp-ova肿瘤接种到野生型或Timd 4中。−/−动物。干扰素-γ数+CD8+TIM 4刺激后第7天T细胞显著减少。−/−小鼠与WT对照组比较(图1)。5B)。此外,CD8总数的绝对值+T细胞与OVA五聚体CD8+在Timd 4的肺内减少−/−老鼠(图1.5C,d)。为了克服系统性TIM4阻断和精确定位cdc 1的潜在旁观者效应,我们使用野生型btf 3的混合物生成了混合骨髓嵌合体。/−或Timd 4−/−Batf 3−/−骨髓(附图)8A-c)。干扰素-γ的产生与CD8的积累+CDC 1室中TIM4特异性缺失的动物T细胞减少(如图1所示)。5E,f)。最重要的是,抑制肿瘤生长的作用在Timd 4中减少了。−/−*蝙蝠侠3−/−嵌合体,表现为比野生型重组动物更多的病灶和更大的结节:Batf 3。−/−骨髓(图1.5G)。因此,选择性地消融cDC 1中的TIM4可减少保护性抗肿瘤反应。最后,我们测试了TIM4是否参与了免疫原化疗诱导的排斥反应,从而促进了APC的活化。41,42。我们使用奥沙利铂和环磷酰胺(oxa/cycl)联合使用,以前证明它能诱导CD8。+在同样的KP模型中T细胞的反应和排斥反应34。动物在攻击后第7天和第14天接受KP肿瘤攻击和oxa/cycl治疗(如图所示)。6A)。该药提高了LNS和肺组织中CD8/CD4比值,并显著降低了未经治疗的动物的肿瘤负担(图一)。6B-d)。Oxa/cycl治疗的疗效在Batf 3中被废除。−/−老鼠(图1.6E),说明免疫治疗诱导的反应需要cDC 1。值得注意的是,在服用oxa/cycl前一天加入TIM4阻断抗体会降低免疫治疗的疗效(图一)。6B-dTIM4在药物诱导的凋亡细胞捕获过程中发挥作用,诱导抗肿瘤反应。

图5:TIM4促进抗肿瘤CD8+T细胞反应和肿瘤控制。

aTIM4阻断对内源性CD8活化的影响+KP-OVA小鼠血液中的T细胞受到攻击.干扰素-γ+CD8和OVA特异性-IFN-γ+CD8(Vα2/Vβ5)+)作为CD8和Vα2/Vβ5的函数+T细胞,分别在攻击后的不同时间点。等型n=5,αTIM4n=4,数据代表两个独立的实验之一。bd抗肿瘤T细胞反应在WT和WT中的激活Timd 4−/动物在KP-OVA攻击后7天。b干扰素-γ的代表性图谱和频率+内源性CD8+MLN中的T细胞。cCD8绝对数+T细胞和d卵特异性CD8+T细胞+)在肿瘤部位累积。数据代表两个实验(n=5只小鼠/组)。eg将CD 45.1WT小鼠经致死剂量照射后,注射1:1混合CD 45.2骨髓,产生骨髓嵌合体。10周后,小鼠接种KP-OVA肿瘤.e干扰素-γ的代表性图谱和频率+CD8+T细胞在肿瘤攻击后10d出现在MLN中(n=6只小鼠/组)。fCD8的绝对值与定量+Batf 3在肿瘤部位聚集T细胞−/−WTn=6和Batf 3−/−;Timd 4−/− n=5只老鼠。g肿瘤发生后28天,检测骨髓嵌合体的肿瘤生长情况。肿瘤结节的代表切片和定量根据三个叶/动物的四个连续切片自动计算,并表示为总叶面积的函数。图中的每个值表示每个鼠标的三个叶和四个部分的平均值。所有数据均为均值±扫描电镜。显着性由双向方差分析和西达克后测确定。a,双尾未配对t-测试bf和双尾曼恩-惠特尼试验g。源数据作为源数据文件提供。

图6:TIM4用于免疫原化疗诱导的肿瘤排斥反应。

a实验设计方案。小鼠用KP细胞攻击,未处理或用oxa/cycl和抗TIM4或同类型的方案。b, cMLN中CD8/CD4 T细胞比例的分析b)、未经治疗n=10,Oxa/cycl+等型n=9,Oxa/cycl+αTIM4n=9;在肺部(c)、未经治疗n=10,Oxa/cycl+等型n=10,Oxa/cycl+αTIM4n上一次治疗后2周的小鼠。数据来自两个独立的实验。dTIM4阻断对免疫原化疗疗效的影响第28天,通过计算三个叶/动物的四个连续切片的肿瘤结节覆盖面积来评估肿瘤负担,并以总叶面积的函数表示。结果是未经治疗的n=13,等型+Oxa/cycln=14和Oxa/cycl+αTIM4n=14在两个独立的实验中。eWT和Batf 3−/−用KP细胞攻击小鼠,用oxa/cycl处理或未处理。治疗效果用14 WT和4 Batf 3计算出的肿瘤面积比未治疗对照减少的百分比来表示。−/−老鼠。所有数据均以均值±扫描电镜表示。显着性由单因素方差分析和Tukey后测确定。bd和双尾曼恩惠特尼试验e。源数据作为源数据文件提供。

TIM4在肺腺癌中的表达与保护性免疫细胞的特征相关,并预测对pd-1检查点阻滞的反应。

为了研究我们观察到的在人类癌症中的相关性,我们在肿瘤基因组图谱(TCGA)数据集中探讨了TIM4的表达。我们发现Timd 4人cDC 1和CD8效应T细胞在早期患者中的转录本和基因标记(图1。7A)(补充表2参考文献。7,8)。为了进一步探讨TIM4对预后的潜在影响,我们分析了肺腺癌TCGA数据集中Kaplan-Meier生存曲线。有趣的是,早期表达高cdc 1信号的患者辅之以Timd 4在生存方面显示出微小而显著的优势(图一)。7b)。基于这些观察,我们推断TIM4对促进CD8应答的治疗反应可能很重要。为此,我们分析了最近的数据集,比较治疗前应答者和非应答者对抗PD-1免疫治疗(GSE 126044)的转录谱。值得注意的是,Timd 4对治疗有反应的患者的表达明显高于无反应的患者(见图)。7C),提示TIM4在选择性免疫治疗压力下具有优势。CDC 1信号和CD8效应信号对治疗的阳性反应有相似的预测能力(如图所示)。7D),表示Timd 4可能是识别抗原完整的肿瘤的一个额外的生物标志物。

图7:Timd 4肺腺癌组织中的表达相关性及预测价值。

a相互关系Timd 4CDC 1和细胞毒性T细胞的转录本和基因标记(补充表中描述的基因标记)2)TCGA肺腺癌(LUAD)。皮尔逊相关系数Cor.testR的函数统计包装Two.sided作为替代假设。bKaplan-Meier生存曲线显示TCGA数据集Ⅰ期LUAD病例的生存概率(n=219)。CDC 1或cDC 1+Timd 4高表达或低表达的两组均根据参考文献中所描述的分类规则进行鉴定。60并详细介绍了方法。采用对数秩(Mantel&Cox)检验比较生存期曲线。c, dGSE 126044组中对pd-1治疗有无反应的患者按pd-1治疗前基线表达进行分类。Timd 4 (c)、cdc 1和CD8细胞毒性T细胞信号(d). P数值是用双尾Mann-Whitney试验计算的;n=5,无反应者n=11.源数据作为源数据文件提供。

讨论

在TME中,髓系细胞已被描述得越来越精确,揭示了它们的复杂性、可塑性以及在促进或限制肿瘤生长中的关键作用。其中,cdc 1的出现总是与多个临床前模型和人类肿瘤的阳性结果相关。5,6,7,8,16。实现cdc 1抗肿瘤特性的一个关键功能是有效捕获肿瘤细胞片段并将其内部化,以便交叉呈现到cdc 1到cd8。+T细胞5,6,19,20,21,36,43,44。在这里,我们表明,这种精致的cDC 1特性是针对肺腺癌的微环境。以往解释TME中DC活性抑制的研究主要集中在可溶性抗原的处理、细胞代谢、成熟降低等后内化事件上。10,11,12,14,45。相反,在肿瘤组织中获取肿瘤抗原的机制及其在肿瘤进展过程中的调控机制还没有得到充分的研究。通过对健康肺组织中cDC 1与早期或晚期肺肿瘤接触者的比较,我们能够追踪抗原捕获作为肿瘤进展的一个函数的进化过程。我们发现在早期病变中cDC 1是提取肿瘤抗原和启动肿瘤特异性CD8反应的关键。相反,在肿瘤晚期,抗原获取变得低效,与抗原呈递丧失和T细胞反应减弱相吻合。因此,维持肿瘤特异性CD8反应的一个主要障碍是通过组织中最有效的交叉提呈亚群抑制抗原的获取。

通过对清道夫受体表达的分析,我们发现PtdSer受体TIM4的缺失是cDC 1失活的主要机制之一。其他细胞内禀变化,如交叉呈现缺陷和细胞因子分泌受损,可能有助于cdc 1的全面抑制。然而,通过撞击抗原获取的第一步,我们认为TIM4的丢失可能在下游事件中占主导地位。死亡细胞的摄取被归因于受体的选择性表达,这些受体能够与cdc 1中的死亡细胞结合并促进其吞噬。19,20,21,22,23,24。这些研究大多使用淋巴驻留的cDC 1和模型抗原,而对cDC 1在不同肿瘤组织中获取肿瘤抗原的受体的研究较少。TIM4与巨噬细胞中PtdSer的结合是吞噬和清除死亡细胞的关键,其基因缺失促进了自身免疫的发展。40,46,47,48。TIM4在DC室中的表达模式和特殊功能一直存在争议,可能是因为过去的分析缺乏对DC子集的正确定义。26,28,29,49,50,51。为了填补这一空白,我们使用最近建立的门控策略,对小鼠组织中的dc亚群进行了广泛的表征。38。除了在大多数组织中建立良好的表达外,我们还发现TIM4在小鼠肺组织cDC 1中的选择性表达高于其他任何组织DC。奇怪的是,肺泡巨噬细胞是少数不表达TIM4的常住巨噬细胞之一。要找出控制TIM4表达的转录和表观遗传调控的组织因子,这将是非常有趣的。52,53处于稳定状态的髓系细胞。第二个重要问题是TIM4在肿瘤中的作用以及受体下调的机制。据报道TIM4在巨噬细胞和DC浸润黑色素瘤和小鼠乳腺肿瘤中表达上调,并与抑制小鼠结直肠免疫反应有关。29,31,54。相反,小鼠肺肿瘤并不诱导髓系细胞表达TIM4,而是抑制其在cDC 1上的表达,阻断T细胞的启动。这些观察表明,高度特异性的组织和环境依赖的调节,这将是重要的研究在更多的肿瘤类型和人类肿瘤。最近的一份报告显示,p38激活导致的衰老巨噬细胞TIM4减少,从而导致清除功能的丧失。55提示cDC 1受体丢失的可能机制。

本研究采用阻断抗体和基因缺失的方法,探讨TIM4在肺cDC 1吞噬死亡细胞和肿瘤细胞以及细胞相关抗原交叉表达中的关键作用。此外,TIM4阻断剂还抑制了在同一肿瘤模型中诱导T细胞应答的免疫原性药物的联合作用。34,56,表明其在促进释放抗原的加工过程中的作用。这些证据共同强调了TIM4在cDC 1中作为一种PtdSer受体在cDC 1中捕获肿瘤抗原的作用,这有助于监测新生肿瘤和启动小鼠肺肿瘤的肿瘤保护反应。这些发现在某种程度上与以前的一项研究相矛盾,该研究表明TIM4通过自噬诱导肿瘤抗原降解,从而抑制免疫。29。与巨噬细胞或CD11c/mhc-ii不同,这种差异可能是由cdc 1中不同的抗原处理机制引起的。对细胞和不同肿瘤组织进行分析。

肿瘤基因图谱(TCGA)的基因表达与Timd 4人cDC 1的转录本和基因签名8,以及cdc 1和cdc 1高表达患者的效应细胞CD8 T细胞和更好的生存期。Timd 4。此外,一项小型试验显示患者对检查点阻滞的反应更好,提示TIM4的表达与肺肿瘤保护性免疫反应有关。需要进一步分析scRNA-seq数据、流式细胞术和免疫组织化学,以建立准确的人体组织表达模式及其对人类疾病的意义。

总之,本研究发现TIM4是一种肺cDC 1吞噬细胞受体,参与早期小鼠肿瘤的免疫监视,其目标是肿瘤进展的晚期,损害抗肿瘤反应。初步证据支持TIM4作为肺肿瘤分层的生物标志物的潜力。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297