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克罗莫林抑制人小胶质细胞分泌炎性细胞因子(HMC 3)

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发表时间:2021-04-14 14:39作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

克罗莫林是已知的肥大细胞稳定剂,并被批准用于治疗哮喘和其他过敏症状。克罗莫林,一种新设计的干粉配方,正在与小剂量布洛芬联合治疗早期阿尔茨海默病(AD)患者的一项关键临床试验中进行试验。为了更好地了解克罗莫林在减缓或抑制AD进展相关神经炎症反应中的作用,我们检测了克罗莫林对人HMC 3小胶质细胞炎症反应的抑制作用。克罗莫林对HMC 3小胶质细胞的直接作用是炎症细胞因子TNF-α激活后细胞因子和趋化因子的产生。CXCL 10、CCL 2、CCL 3和CCl 4等细胞因子包括IL-1β、IL-6、IL-8和IFN-γ等细胞因子和趋化因子CXCL 10、CCL 2、CCL 3和CCl 4。这些结果加强了我们对克罗莫林平台如何调节毒性小胶质细胞行为的理解,作为神经退行性疾病的一种未来动态治疗方案。

导言

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的常住巨噬细胞,在免疫监测、突触维持和神经元健康等方面具有重要作用。1。小胶质细胞不同于其他髓样细胞,如单核细胞和外周巨噬细胞,并对脑内的变化有极强的反应性,这些变化共同存在于由中枢神经系统特定区域对细胞外变化作出反应以保护其免受感染的稳态需求所决定的异质种群中。2,3,4。小胶质细胞通过分泌细胞因子、趋化因子以及生长和神经营养因子来介导这些重要而多样的功能。5。此外,小胶质细胞还具有直接的抗微生物活性,可通过吞噬和产生微杀菌活性氧(Ros)和一氧化氮(NO)。6.

小胶质细胞在调节炎症中的突出作用通常由两种表型中的一种指定:小胶质细胞产生促进炎症的神经毒性细胞因子的m1型,这种细胞因子的慢性产生导致神经网络功能障碍并传播炎症反应;或M2型,其中小胶质细胞分泌抗炎介质和神经营养因子,参与恢复脑内动态平衡。6。将小胶质细胞简化成两种名称,就可以更简单地表示小胶质细胞的广义激活状态,但更有可能的是,小胶质细胞存在于动态光谱上,而这种动态频谱是针对导致中枢神经系统神经变性的慢性应激源而激活的。7.

人们普遍认为,单核细胞和小胶质细胞早期激活成M2表型,可能通过调节免疫反应来减缓神经退行性变的进程,而不会触发促炎细胞因子的分泌,从而使神经变性恶化。8。人们已经研究了调节单核细胞和小胶质细胞活动的策略,特别是那些能够防止小胶质细胞介导的神经毒性的策略。9,10,11。我们的研究重点是建立我们的克罗莫林类似物作为调节神经退行性疾病,如阿尔茨海默病(AD)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)的病理平台的效用。脑淀粉样斑块和神经原纤维缠结所引起的神经炎症反应及其相关的神经元丢失在AD病理中的作用得到了充分的证实和广泛的研究。12,13,14,15。大量研究表明,小胶质细胞介导的炎症参与了AD的进展,小胶质细胞与淀粉样蛋白-β(A-β)沉积密切相关。16.

克罗莫林是一种被批准用于治疗哮喘的小分子。17。虽然对分子作用机理还不十分清楚,但克罗莫林作为“肥大细胞稳定器”已经有一段时间了。18对中性粒细胞(PMN)有其他抗炎作用。19巨噬细胞20。对美国已达到临床试验阶段的化合物的药物库的筛选表明,克罗莫林与托吡酯和溴隐亭联合使用,有可能降低人ipsc衍生神经元中Aβ42:β40的负担20%和50%以上。21。这独立地证实了Hori等人在体内的cromolyn研究,该研究在一周内将可溶性Aβ降低了50%,并显示了小胶质细胞经济的改变。22。最近,克罗莫林被证明能促进小鼠bv 2小胶质细胞对Aβ42的非炎性吞噬作用,提高TBS可溶性Aβ40和Aβ42的清除率,改善Tg 2576 AD模型小鼠的神经保护作用。10。此外,克罗莫林还能降低sod 1转基因小鼠ALS模型中促炎细胞因子和肥大细胞的活性。23.

本研究小组提供临床前证据,证明克罗莫林在治疗APP/PS1小鼠AD动物模型中的作用。10,22。在此基础上,克罗莫林目前正在进行早期AD的晚期临床试验(NCT 02547818-A期ALZT-OP1在早期阿尔茨海默病患者中的安全性和有效性研究)和ALS(NCT 04428775-A期ALZT-OP1a在轻度-中度ALS患者中的安全性和生物标志物研究)。为了确定cromolyn是否抑制小胶质细胞分泌促炎症介质,我们研究了cromolyn对hmc 3小胶质细胞株的影响。24用肿瘤坏死因子-α刺激后。CXCL 10、CCL 2、CCL 3和CCl 4等趋化因子可显著抑制多种炎症介质的分泌,其中包括IL-1β、IL-6、IL-8和IFN-γ等细胞因子。在我们的实验中,改变克罗莫林的结构,以增加亲脂性和血脑屏障吸收,导致桥羟基取代氟生产氟-克罗莫林。25。在本研究中,我们发现核心的Cromolyn结构基序能够影响活化的人HMC 3小胶质细胞释放细胞因子和趋化因子,而改良的F-cromolyn则保留了这些优势。这些结果扩展了强大的Cromolyn平台,包括抑制由小胶质细胞分泌的炎症介质,进一步支持Cromolyn作为一种抗神经变性的兴奋疗法。

材料和方法

化学品和试剂

DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)(猫#1995065)、DMEM无酚红(猫#21063029)、PBS-pH7.2(猫#20012050)、L-谷氨酰胺(猫#25030081)、胰蛋白酶-EDTA(猫#25200056)和青霉素链霉素(Cat#15140122)是吉布科公司的产品。FBS(胎牛血清)(Cat#F 4135)、DMSO(二甲基亚砜)(Cat#D 2438)和吐温-20(Cat#P 1379)是从Sigma-Aldrich购买的。3mL注射器/针头与Luer-Lok™针尖(Cat#8936G82)、13 mm注射器(PVDF,0.22m)(猫#1159T77)联合购买。重组人肿瘤坏死因子-α(Cat#300-01A),重组人干扰素-γ(Cat#300-02)购自PeproTech。AZ治疗公司提供Cromolyn和F-cromolyn,并使用DMEM作为稀释剂,以达到指定的最终浓度。

细胞株与细胞培养

人小胶质细胞株HMC 3(CRL-3304)来源于ATCC。在含10%FBS、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养HMC 3细胞。细胞在37℃孵化器中保持在5%CO。2.

流式细胞术

HMC 3细胞再悬浮,用露娜-Ⅱ细胞自动计数器计数,接种于6孔板(300 K细胞/2mL培养基/孔),隔夜孵育,使细胞附着。以5种不同浓度(0、0.0 1、0.0 3、0.1、0.3g/mL)的TNF-α或IFN-γ处理细胞24h,诱导细胞活化。上清液完全抽吸,加入1mL新鲜DMEM清洗细胞层,去除脱落细胞和碎片。附着细胞再悬浮,用PBS洗涤。细胞经流式细胞仪(FACS)缓冲液(2%FBS)洗涤后,用僵尸紫可固定活力染料(#423114,Biolegend,1:500稀释)和人FC受体阻断液(#422302,Biolegend,1:20)在FACS缓冲液中稀释10 min。用FACS缓冲液洗涤细胞,用以下细胞表面抗体孵育20 min:FITC抗MHCⅡ(#361706,Biolegend),PerCP/Cy5.5抗CD11b(#301328,Biolegend),BV 605抗CD 40(#334336,Biolegend),PE抗CD 86(#374206,Biolegend),PE/Cy7抗CD 163(#326514,Biolegend),APC抗CD 206(#321110,Biolegend)和PerCP/Cy5.5 antiCD 14(#367110,Biolegend)。所有细胞表面抗体在FACS缓冲液中稀释1:20。细胞经转录因子固定/渗透缓冲液(#424401,Biolegend)渗透。然后用以下细胞内抗体孵育:APC/Cy7抗CD 68(#333822,Biolegend)、纯化的抗IBA 1(#PA5-27436、Invitrogen)、山羊抗兔-Alexa Fluor 647(#A 21245,Invitrogen)、纯化的抗-GFAP(#644702,Biolegend)和Goat-抗小鼠-Alexa Fluor(488,Invitrogen)。所有细胞内抗体在渗透缓冲液(1x)中稀释1:100。细胞用渗透缓冲液洗涤,固定在固定缓冲液中(#420801,Biolegend)。流式细胞术用attune NXT声学聚焦细胞计(热费雪科学)进行。流式细胞术数据用FCS Express 7(DeNovo软件)进行分析。所有的流式细胞术图表都在附图中提供沙一.

AO/PI染色法测定细胞活力

用露娜FL全自动荧光细胞计数器检测细胞活力。有核细胞呈绿色荧光,染色有核细胞呈红色荧光。将18μL的样品与2μL吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色混合。

MSD U-PLEX检测平台-细胞因子和趋化因子分泌

HMC 3细胞再悬浮,用露娜-Ⅱ细胞自动计数器计数,接种于6孔板(400 K细胞/2mL培养基/孔),隔夜孵育,使细胞附着。第二天移除培养基和分离细胞。细胞层在PBS中清洗3次,在无血清和无酚DMEM(SPFM)中冲洗一次。细胞在α(0.3g/mL)和(或)克罗莫林(0.3M,3M)或F-cromolyndiacid(0.3M,3M)处理前孵育4h,收集条件培养基,在1000×rCF(G)下离心5 min,分离细胞和大碎片,再用PVDF膜过滤0.22m。上清液的样本放在冰上(#07210041,费舍尔科学)上进行快速冷冻,并保存在−80℃直到使用。

中尺度U-PLEX平板检测细胞因子面板,包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α,以及包括IP-10/CXCL 10、MCP-1/CCL 2、MIP-1α/CCL 3、MIP-1β/CCl 4、eotaxin/CCL 11在内的趋化因子板。在MSD板的每口井中用条件培养基的25 L检测分析物。然后在MSD QuickPlex SQ 120仪器上对平板进行分析。补充图提供了本研究中检测的细胞因子和趋化因子的所有标准浓度曲线。S3.

逆转录和定量PCR

总RNA是从细胞使用快速RNA迷你准备试剂盒(Zymo研究),根据制造商的指示。用高容量cDNA反转录试剂盒(Thermo)从总RNA中提取cDNA.反转录后,用95°C循环2 min(Ⅰ期),40次95°C循环20 s,60°C 30 s,70°C 30 s,65°C 5 s(Ⅲ期)进行定量PCR。通过从感兴趣基因的CQ值中减去负荷控制GAPDH的CQ值来确定折叠变化。结果被标准化为未处理的对照组。用于qRT-PCR的引物如下:人GAPDH-F:ACAACTTTGTATCGGGGGGGGAGG;人GAPDH-R:GCCATCACCACAGTTTC;人IL6-F:ACTCACCTCTTCACACAGAGAGAGAGAATTG;人IL6-R:CCATCTTTTTGGAGGGGTTG;人IL8-F:ACTGAGAGTGATTGAGGTTGAC;人IL8-R:AACCCTCTGCACCCCCACAGGTTC;人CD11b(ITGAM)-F:ACTTGGGGGAGAGAACAT;人TG(GCDb)

量化与统计分析

所有数据均为平均±标准误差,每次至少三次,一式三份。两组间的统计显着性采用学生t检验,多组比较采用单因素方差分析,随后采用Pad Prism 7(GraphPad Software,Inc.)进行Bonferroni后测。*的概率值p < 0.05 was considered to be significant.

结果

F-Cromolyn理由

在治疗中枢神经系统疾病时,需要克服的一个重大困难是将一种药物注射到中枢神经系统中,同时保持体内稳定性和随后的药物活性。在药物化学中,氟取代物被用来增加药物的重要药动学性质,如血脑屏障通透性、代谢稳定性和生物利用度。26。C-F键比C-H和C-O键具有更高的键能,从而提高了对蛋白质降解的稳定性和相对亲脂性。26。化合物的log P是衡量其亲脂性的指标,与其跨越血脑屏障的能力有关,氢和其他功能基团取代氟是已知的调节化合物log P的方法。27。由于羟基被认为是氟的生物异stere,所以C-F和C-O键具有相似的键长和等电子性质。28在我们的实验中,氟取代的F-cromolyn化合物有望提高代谢稳定性和亲脂性,以便更好地跨细胞膜吸收,并更协调地跨越血脑屏障进入中枢神经系统,从而使F-cromolyn可能作为一种口服可用药物使用。25.

Hmc 3小胶质细胞在肿瘤坏死因子-α暴露后表现出炎性表型。

肥大细胞是人体皮肤和粘膜表面天然免疫系统和炎症过程中不可或缺的组成部分,但也普遍存在于人脑中。29。一旦成熟,它们的脱颗粒和随后释放的细胞因子和其他促炎介质和引诱剂会启动复杂而有力的反应,以帮助消除感染。对于哮喘,过敏的免疫反应,肥大细胞脱颗粒可以通过吸入克罗莫林来减轻哮喘发作。17。炎症是衰老和神经退行性疾病的主要特征。30以及在小胶质细胞炎症中起调节作用的小胶质细胞蛋白(如TREM 2)的基因突变。31还有一些是发展AD的危险因素。32.

肿瘤坏死因子-α是一种重要的炎症细胞因子,负责介导和维持包括小胶质细胞在内的多种细胞类型的炎症反应,临床证据显示肿瘤坏死因子-α、衰老和阿尔茨海默病之间存在联系。一项纵向研究发现,424名认知正常的老年成年人的年血浆肿瘤坏死因子-α浓度随着时间的推移显著增加,并与脑的解剖变化(包括灰质体积和白质高强度负荷)相关,表明外周肿瘤坏死因子-α在与年龄有关的下降中可能具有机械作用。33。血清中的肿瘤坏死因子-α浓度在AD和MCI中也有升高的趋势。34,与低基线α-α的AD患者相比,血清肿瘤坏死因子-α水平升高的患者认知能力下降的比率提高了四倍。35。脑脊液中肿瘤坏死因子-α水平升高与ApoE 4大脑中涉及记忆、语言和更高决策的区域之间功能连接的状态和下降36。总的来说,这些研究表明高血清和CSFTNF-α水平、炎症和AD进行性认知下降之间存在着持久的联系。因此,我们寻求确定的能力,我们的克罗莫林平台,以抑制炎症介质的分泌在肿瘤坏死因子-α诱导的HMC 3人小胶质细胞的行为类似于小胶质细胞在中枢神经系统。

人小胶质细胞克隆3(Hmc 3)是通过人原代小胶质细胞SV 40永生化而形成的,通过调节小胶质细胞活化的典型标志,能够对炎性刺激作出反应。24。小胶质细胞的密度在大脑的所有区域并不均匀,活化的小胶质细胞表面标记物的存在取决于它们在中枢神经系统中的位置不同。37。因此,神经炎症的小胶质细胞模型不需要显示所有可能的炎症生物标志物,尽管m1样炎症表型的活化小胶质细胞的常用生物标记物包括CD 40、CD 86、mhc-ii、iba-1、CD11b、CD 14和CD 68。37,所有这些在我们的实验中,除了CD11b在一开始还没有被检测到(数据没有显示)之外,在IFN-γ给药后都会增加(如图所示)。1A和补充数字沙一)。尽管如此,我们通过Q-PCR证实,在加入肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ后,小胶质细胞标志物CD11b和TMEM 119的mRNA表达水平仍存在一定程度的上调,但与对照组相比略有升高(见图)。1b)。小胶质细胞的广义表面标记物CD11b和Iba-1在AD患者多脑区不一致地上调,而mhc-Ⅱ和CD 68激活标记物在AD患者中表达更一致。38。有趣的是,我们分别观察了星形胶质细胞生物标志物胶质纤维酸性蛋白在静息、未处理的hmc 3小胶质细胞中的表达,以及在tf-α和phn-γ处理后胶质纤维酸性蛋白表达的增加,并通过q-pcr证实了这一结果。S2)。据我们所知,GFAP尚未被报道在hmc 3细胞中表达,但其他人发现小胶质细胞具有形态学上的动态,可以从多种损伤性刺激中表现出经典的星形胶质细胞标记物。39,40,41。抗炎吞噬表面标记CD 163和CD 206在加入干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α前后仍未表达,且未见变化。1A和补充数字沙一)。总之,hmc 3小胶质细胞在神经炎症模型中的表现是合理的。24.

图1

肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ对人小胶质细胞株HMC 3的炎症激活作用。(a流式细胞仪分析显示,IFN-γ(0.3g/mL,24h)处理的HMC 3细胞中,炎性小胶质细胞标志物(IBA-1、CD 40、MHC-Ⅱ、CD 68、CD 14和CD 86)蛋白表达增加,而抗炎小胶质细胞标志物CD 163和CD 206的表达无明显变化。肿瘤坏死因子-α(0.3g/mL,24h)(蓝色)也能增加炎症小胶质细胞标志物(IBA-1,CD 40,CD 14)的表达。(bQPCR结果显示,HMC 3小胶质细胞在加入0.3g/mL肿瘤坏死因子-α或0.3g/mL干扰素-γ2 4h后,CD11b和TMEM 119表达增加,折叠改变与未处理对照组一致。以GAPDH为内对照,对各样本测量基因的mRNA水平进行正常化(n=5次独立实验)。定量分析(c)和有代表性的荧光显微照片(d实验结果表明,肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ在人小胶质细胞中均以浓度依赖性(0,0.01,0.03,0.1,0.3g/mL)诱导细胞死亡24 h。荧光绿色特征为活细胞AO染色,荧光红染色为染色细胞PI染色。*p < 0.1, **p < 0.01, ***p < 0.001, and NS (no significant difference).

我们通过细胞活力实验证实,肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ均以浓度依赖性的方式产生小胶质细胞坏死,每个细胞的浓度为0.3g/mL(图1)。1c)。在图4×10×放大率下,给出了具有代表性的0.3g/mL肿瘤坏死因子-α的AO/PI荧光图像。1有趣的是,我们观察到细胞因子和趋化因子分泌对肿瘤坏死因子-α的反应比用干扰素-γ刺激更有活力(数据未显示)。这部分是由于肿瘤坏死因子-α在相同浓度下比干扰素-γ诱导的细胞死亡少,因此在加入克罗莫林和F-克罗莫林之前,肿瘤坏死因子-α被HMC 3小胶质细胞用于诱导细胞因子和趋化因子的分泌。

克罗莫林和氟克罗莫林抑制人小胶质细胞分泌炎性细胞因子和趋化因子

众所周知,细胞因子tf-α是由单核细胞(包括小胶质细胞)大量产生的,并且强烈影响许多其他炎症介质,使其在α暴露时被天然免疫细胞所上调。42。我们的实验证明,用肿瘤坏死因子-α处理HMC 3细胞能有效地诱导HMC 3细胞分泌炎性细胞因子,TNF-α作用24h后细胞培养上清液中细胞因子浓度显著增加(见图)。2)。与未处理的hmc 3细胞(对照组)相比,用tf-α(0.3μg/mL)处理hmc 3细胞后,IL-1β增加了1 77个倍。p < 0.001), IL-6 (p < 0.001), and IL-8 (p < 0.001) and caused the previously quiescent cells to secrete IFN-γ. We verified that cromolyn and F-cromolyn do not affect the inflammatory profile of quiescent microglia and provide all cytokine and chemokine secretion data after addition of cromolyn and F-cromolyn to HMC3 microglia not induced by TNF-α in Supplementary Figure S4作为内部控制。在低浓度(0.3M)和高浓度(3M)条件下,我们检测了克罗莫林和F-cromolyn对HMC 3小胶质细胞分泌肿瘤坏死因子(α)诱导的细胞因子分泌的影响。干扰素-γ(p=0.0033;p=0.0013)、IL-6(p=0.0065;p=0.0012),IL-1β(p < 0.001; p < 0.001), and IL-8 (p=0.0006;p < 0.001) concentrations were decreased after addition of the lower 0.3 µM concentration of cromolyn and F-cromolyn, respectively, with only cromolyn dose-dependently reducing IL-6 (p < 0.001) and IL-1β (p < 0.001) after 3 µM addition. The higher 3 µM concentration of cromolyn resulted in > 40% inhibition of IFN-γ, IL-6, and IL-1β, and 25.8% inhibition of IL-8. F-cromolyn also decreased cytokine release at the higher 3 µM concentration, achieving > 50% inhibition of both IFN-γ and IL-1β and 39.8% and 27.9% inhibition of IL-6 and IL-8, respectively.

图2

克罗莫林和氟克罗莫林抑制肿瘤坏死因子-α诱导的HMC 3小胶质细胞分泌促炎细胞因子。MSD定量分析表明,肿瘤坏死因子-γ(0.3g/mL,24h)处理的HMC 3细胞分泌IFN-β、IL-1β、IL-6和IL-8的量显著增加,随后分别被Cromolyn和F-cromolyn(0.3M和3 M)所抑制。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and NS (no significant difference).

为探讨Cromolyn和F-cromolyn对HMC 3小胶质细胞关键炎性细胞因子基因表达的影响,我们进行了qRT-PCR检测IL-6和IL-8mRNA的表达。3)。我们观察到,与未治疗的对照组相比,在加入肿瘤坏死因子-α后,IL-6的表达大约增加了5倍。3a)。分别加入0.3M和0.3mFcromolyn后,IL-6的mRNA水平相对于肿瘤坏死因子-α诱导的水平分别下降了9.0%和9.5%,但是,随着浓度的增加,相对于单纯的肿瘤坏死因子-α,IL-6的表达水平显著下降(P<0.05),而相对于单纯的肿瘤坏死因子-α,升高到3M的浓度则显著降低了IL-6的表达(P<0.01)。p < 0.001; 22.8% and 31.6%, respectively, relative to TNF-α induced levels). Next, we observed an approximately 12-fold increase in mRNA expression of IL-8 after addition of TNF-α relative to untreated controls (Fig. 3b)。0.3mcromolyn和0.3mFcromolyn处理后,IL-8mRNA水平下降(P<0.01)。p=0.0212,占16.7%p=0.0102,相对于肿瘤坏死因子-α诱导的水平分别为18.3%),且随着3μmol/L和3μmol/L F~(-cromolyn)的加入,含量进一步下降(P<0.05)。p < 0.001; 41.5% and 51.9%, respectively, relative to TNF-α induced levels). We also analyzed GAPDH mRNA levels as an internal control43在相同的实验条件下,使总mRNA和细胞蛋白水平正常化。3c)。由于肿瘤坏死因子-α暴露后,GAPDH的表达水平没有明显变化,我们解释说,在实验过程中细胞数量并没有减少,因此炎症细胞因子分泌和表达的减少可能是由于克罗莫林和F-cromolyn的存在所致。

图3

克罗莫林和F-克罗莫林可降低肿瘤坏死因子-α诱导的人小胶质细胞IL-6和IL-8基因表达水平。定量的qRT-PCR分析表明,(1)a)IL-6和(bTNF-α(0.3μg/mL,2 4h)作用于HMC 3细胞后,克罗莫林和F-克罗莫林(0.3μM和3μM)均呈剂量依赖性降低IL-8。折叠变化被规范化为未经处理的控制。(c)用GAPDH作为内部对照,使各样本测量基因的mRNA水平正常化。NS(无显著差异),*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and n = 5 independent experiments.

我们接下来测试了克罗莫林和F-cromolyn对0.3g/mLTNF-α处理HMC 3细胞后细胞外趋化因子产生的影响。4)。0.3Mcromolyn治疗后,细胞外IP-10浓度(CXCL 10)显著降低(P<0.01)。p < 0.001), MCP-1 (CCL2) (p=0.0016),MIP-1α(CCL 3)(p=0.0118),以及MIP-1β(CCl 4)(p < 0.001) compared to cells treated with TNF-α alone for 24 h. Further, we observed reduction in extracellular chemokine secretion at a higher concentration of 3 µM cromolyn, with > 40% inhibition of IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), and MIP-1β (CCL4), and 35.6% inhibition of MIP-1α (CCL3) compared to TNF-α cytokine induction levels.

图4

克罗莫林和F-克罗莫林抑制肿瘤坏死因子-α诱导的HMC 3小胶质细胞分泌炎性趋化因子。MSD定量分析表明,TNF-β(0.3g/mL,2 4h)处理的HMC 3细胞分泌IP-10(CXCL 10)、MCP-1(CCL 2)、MIP-1β(CCL 3)和MIP-1β(CCl 4)显著增加,并分别降低了CXCL 10、MCP-1、CCL 3和MIP-1α(0.3μg/mL,2 4h)的分泌。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and NS (no significant difference).

此外,我们还观察到0.3mFcromolyn抑制炎症趋化因子ip-10(CXCL 10)的产生。p < 0.001), MCP-1 (CCL2) (p < 0.001), MIP-1α (CCL3) (p=0.0081),以及MIP-1β(CCl 4)(p < 0.001). We also observed the higher concentration of 3 µM F-cromolyn impacted HMC3 microglia chemokine secretion, resulting in > 40% inhibition of IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), and MIP-1β (CCL4), and 36.0% inhibition of MIP-1α (CCL3). Taken altogether, we conclude that only cromolyn dose-dependently inhibited MCP-1 (CCL2) and MIP-1α (CCL3) secretions but both cromolyn and F-cromolyn dose-dependently reduced secretions of IP-10 (CXCL10) and MIP-1β (CCL4) by HMC3 microglia cells.

由于Cromolyn和F-cromolyn被发现可以降低分泌的神经毒性细胞因子和趋化因子的浓度,我们接下来进行了细胞坏死实验,以验证这种特性是否能提高细胞活力。图形5结果表明,HMC 3细胞给予肿瘤坏死因子-α(0.3μg/mL),可使细胞死亡增加约20%,是对照组的4倍以上。0.3mcromolyn和F-cromolyn分别显著降低细胞死亡.添加较高的3M浓度的克罗莫林和F-cromolyn可进一步降低细胞死亡,比单纯α诱导的HMC 3细胞存活率提高约40%。我们的结论是,克罗莫林和F-克罗莫林能够以浓度依赖性的方式防止肿瘤坏死因子-α诱导的HMC 3小胶质细胞死亡。

图5

克罗莫林和F-克罗莫林降低肿瘤坏死因子-α诱导的HMC 3小胶质细胞死亡.对多组进行单因素方差分析,然后进行Bonferroni后测.*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and NS (no significant difference).

讨论

尽管hmc 3小胶质细胞在加入tf-α后释放出了大量的细胞因子和趋化因子,但我们观察到了一些在我们的实验中表现出轻微或没有显着变化的中介物(补充图)。S5)。肿瘤坏死因子-α暴露后,IL-2在HMC 3小胶质细胞中呈中度表达,而克罗莫林对IL-2分泌量无明显影响。IL-2主要由T细胞和树突状细胞在对细菌脂多糖(LPS)的反应中产生,参与T和B细胞的增殖和分化。44。活化T细胞的核因子介导树突状细胞中多种促炎介质的产生,包括白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-)。44。虽然小胶质细胞实验表明小胶质细胞表达nfat亚型,但tf-α并不像lps那样显着地诱导小胶质细胞中nft驱动的荧光素酶活性,提示小胶质细胞中的nfat信号可能比其他外周免疫细胞更特异地诱导。45。尽管如此,小胶质细胞仍表达IL-2受体,并通过激活其他细胞因子的表达而对IL-2有很强的反应。46肿瘤坏死因子-α本身并不是HMC 3小胶质细胞分泌IL-2的重要诱导剂,而Cromolyn并不能显着地改变这种行为。

IL-10是一种抗炎细胞因子,由小胶质细胞对微生物脂多糖(lipopoly糖类,LPS)等致病菌相关分子模式(Parmp)产生强烈反应,机体对此产生强烈而持久的免疫反应。47。肿瘤坏死因子-α(TNF-)在48小时暴露于原代人胎儿小胶质细胞中,能以剂量依赖性的方式单独诱导IL-10的分泌。然而,我们使用hmc 3小胶质细胞的实验使用的是肿瘤坏死因子-α浓度的3倍(0.1mg/mL对0.3mg/mL)。48并且产生了大约6个数量级减去IL-10的数量(补充数字)。S5)。这一结果令人惊讶,但其他人发现hmc 3小胶质细胞在静止时不会产生可检测到的IL-10。24我们可以证实。克罗莫林和F-cromolyn对HMC 3小胶质细胞IL-10的表达均无明显影响.此外,SOD 1的体内实验G93A小鼠ALS模型发现,每周5天腹腔注射克罗莫林大约2个月,从出生后60天开始,直到出现大麻痹,尽管小鼠表现出疾病的延迟发作,但脊髓溶解液中的IL-10水平并没有明显改变。23。未来的实验将需要探索共同刺激因子,以模拟抗炎因子IL-10在这一特定的小胶质细胞中的表达,以进一步阐明克罗莫林或氟-克罗莫林是否对其分泌有任何影响。

IL-4通常被认为是一种非慢性表达的抗炎细胞因子,可下调促炎介质的表达,包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-12。49。虽然小胶质细胞对外源性白细胞介素-4特别敏感,细胞因子与降低MHC-Ⅱ的表达有关,但IL-4主要由肥大细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性粒细胞和T辅助细胞产生。50。由于我们观察到白细胞介素4在hmc 3小胶质细胞上注射tf-α后几乎没有表达(补充图)。S5IL-4主要作用于小胶质细胞,影响抗神经炎症的作用,小胶质细胞不分泌IL-4,这是合理的。另外,克罗莫林和氟克罗莫林均不影响肿瘤坏死因子-α诱导的HMC 3小胶质细胞分泌IL-4.

CCL 11是一种趋化因子嗜酸性粒细胞诱导剂,参与过敏反应,在老年人血清和中枢神经系统中均有上调作用。51。虽然小胶质细胞表达CCL 11趋化因子的CCR 3表面受体,并产生神经毒性活性氧,但它是激活的星形胶质细胞,主要被发现产生CCL 11,特别是在0.01g/mLtf-α的存在下,而不是在小胶质细胞中。51。本实验采用较高浓度(0.3g/mL)的肿瘤坏死因子(α)促进hmc 3小胶质细胞中可检测到的ccl 11(>60 pg/mL),但对ccl 11分泌无明显影响(补充图)。S5).

由于克罗莫林和F-cromolyn抑制HMC 3小胶质细胞分泌细胞因子和趋化因子的能力,迫切需要进行RNA测序、蛋白质组结合分析和多种细胞类型的生物标记板的实验,以充分验证克罗莫林抑制细胞因子分泌的作用机制是否是由于更广泛地改变上游/下游细胞因子基因转录或通过本构分泌途径特异性抑制细胞外分泌而引起的。

我们已经证实,HMC 3小胶质细胞在肿瘤坏死因子-α激活时表现出强烈的炎症特征.克罗莫林和氟克罗莫林可减少肿瘤坏死因子-α激活的HMC 3小胶质细胞释放与神经炎症有关的几种关键细胞因子和趋化因子,并呈剂量依赖性。此外,我们发现与肿瘤坏死因子-α激活的对照组相比,克罗莫林和氟-克罗莫林能够以剂量依赖性的方式防止细胞死亡。这些结果进一步扩大了我们潜在的治疗神经退行性疾病的Cromolyn平台,以抑制活化的小胶质细胞的炎症特征。


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