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核苷类逆转录酶抑制剂和kamuvudine对淀粉样β诱导的视网膜色素上皮变性的抑制作用

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发表时间:2021-04-14 14:34作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

非纤维蛋白淀粉样蛋白-β寡聚体(Aβos)是视网膜下色素上皮细胞外沉积的主要成分,是老年性黄斑变性的常见原因之一。我们报告说,AβOS诱发视网膜色素变性,这是一个临床标志的地理萎缩(GA),一种视力威胁晚期的AMD,目前是无法治疗的。我们证明,βos在小鼠体内可诱导NLRP 3炎症小体的激活,而βO所致的RPE变性需要嘌呤能ATP受体P2RX7的表达,P2RX7是NLRP 3炎症小体激活的上游介质。两类小分子炎症抑制剂--核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIS)及其抗逆转录惰性类似物Kamuvudine--均能抑制Aβos诱导的RPE变性。这些发现明确了P2RX7和NLRP 3在AMD疾病相关模型中的重要性,并将炎症抑制物作为GA的潜在治疗手段。

导言

地理萎缩(GA)是一种不可逆转且无法治疗的干燥老年性黄斑变性(AMD),在全世界数百万人中造成失明。1视网膜色素上皮(RPE)外的细胞外沉积是AMD的特征性病理特征。前炎症成分存在于杜鲁森,被认为是驱动炎症和疾病的进展在GA。2淀粉样蛋白-β寡聚体(Aβos)与GA中的RPE变性有关.3,4,5抑制淀粉样蛋白(Aβos)诱导的神经炎症一直是淀粉样蛋白驱动的神经退行性疾病的一种治疗策略。6因此,识别介导βos诱导的RPE变性的分子传感器和炎症通路,可以为GA治疗的发展提供理论依据。

炎症体是一种多聚胞浆蛋白复合物,可识别独特的病原体相关分子模式(PAMPs)或损伤相关分子模式(DAMP),并通过激活caspase-1依赖的细胞因子产生和细胞死亡来触发天然免疫反应。7βos诱导神经退行性疾病模型中含有3(NLRP 3)炎症体的NLR家族Pyrin结构域的激活。8,9,10在其他GA模型中,NLRP 3炎性小体激活是RPE变性不可缺少的驱动因素。11,12,13因此,抑制NLRP 3的激活是阻止或延缓GA中RPE变性和疾病进展的有效途径。

NLRP 3炎症小体的激活一般包括两步过程,在此过程中,需要启动和伴随的激活信号才能产生功能性炎症。14NLRP 3的转录上调是启动的重要环节,尤其是在非免疫细胞(如RPE)中,因为基础表达水平被认为不足以启动炎症小体组装。NLRP 3炎症体激活还需要组装多蛋白复合物,通过适配器蛋白asc(一种包含caspase招募结构域的凋亡相关的斑点样蛋白)来招募亲caspase-1。ASC聚合是NLRP 3炎症体活化所必需的,15其特点是形成大量的细胞内聚集物,称为ASC斑点,是炎症小体聚集的标志。在组装过程中,前caspase-1被切割成caspase-1,而caspase-1则将细胞因子前体-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的IL-1β和IL-18,它们对RPE具有细胞毒性。14

嘌呤能P2X7受体(P2RX7)是许多系统中NLRP 3激活所必需的重要介质。16P2RX7在几种GA模型中被认为是药物靶点。17,18,19,20βos诱导的NLRP 3激活需要P2RX7在小胶质细胞中表达。21最近有报道称,βos诱导的RPE细胞毒性是由线粒体功能紊乱和活性氧(ROS)所致,22NLRP 3炎症激活的特征性诱导剂。23尽管有多项研究报告βOS诱导RPE中NLRP 3活化,24,25,26P2RX7的作用尚不清楚。因此,我们检测P2RX7在βos诱导的RPE变性中是否需要表达。

核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIS)由于具有抑制P2RX7及随后NLRP 3激活的能力,具有内在的抗炎活性,与其抗逆转录病毒功能无关。17重新使用NRTIs被认为是治疗几种慢性疾病的一种可能的治疗策略。17,27,28然而,与全身性NRTI使用相关的毒性,归因于它们对细胞聚合酶的非目标抑制,降低了人们对此类治疗项目的热情。29,30有趣的是,NRTIS的抗炎作用与其抑制逆转录酶的能力无关.改良的NRTI称为Kamuvudine,它保留了抑制炎症体激活的能力,但缺乏抑制逆转录酶的能力,因此也缺乏相应的毒性,是治疗P2RX7-NLRP 3介导的疾病的较好的候选药物。17,27因此,我们研究了NRTIS和Kamuvudine对Aβos诱导的RPE变性的抑制作用。

在这里,我们证明P2RX7是βos诱导的RPE变性不可缺少的组成部分,NRTIs和Kamuvudines对P2RX7的抑制作用可以阻断Aβos诱导的RPE变性。

结果

一种βOs诱导RPE中NLRP 3炎症小体组装的实验研究

在视网膜下注射βos后,我们监测了视网膜内NLRP 3炎症启动的情况。NLRP 3-GFP小鼠,一种荧光报告基因转录受内源性调控的报告小鼠系。NLRP 3监管要素。31在NLRP 3位点插入GFP使这些小鼠在NLRP 3中功能缺陷。尽管NLRP 3蛋白表达被破坏,我们也用玻璃体内注射caspase-1抑制剂ac-YVAD-fmk来消除由于潜在渗漏引起的任何残留的炎症。这使我们能够可视化绿色荧光蛋白信号,不受潜在退化细胞产生的扭曲。视网膜下注射βOS后NLRP 3-GFP小鼠,共聚焦显微镜分析显示,与对照眼相比,注射βos的小鼠眼中GFP表达增加(图1)。1A),提供了NLRP 3启动在RPE中的原位证据,因为GFP在这些转基因小鼠中的表达与NLRP 3 mRNA和蛋白表达的增加有关。32,33

图1

βOS在RPE中促进NLRP 3炎症启动和组装。aRPE扁平坐骑,染色为闭锁带-1(ZO-1;红色)NLRP 3-与生理盐水注射小鼠相比,视网膜下注射Aβos的gfp基因表达增强(绿色),n=6。b视网膜下注射Aβos,而不是pbs,可使ASC-Citine内的ASC斑点形成增加。弗洛克斯/Best1-CRE+小鼠。ASC-Citrine融合蛋白被检测为绿色信号.视网膜下注射βOs并不能诱导ASC-Citine中的ASC斑点形成。弗洛克斯老鼠,n=6。cASC-Citrine在RPE平台上观察到的ASC斑点的高倍率图像弗洛克斯/Best1-CRE+小鼠视网膜下注射A,β,Os显示斑点的大小。黄色方格突出显示的选定感兴趣区域描绘了放大的区域。标尺(50μm)

接下来,我们用asc-citrine对rpe体内的炎症小体进行了监测。弗洛克斯/Best1-CRE+小鼠,由ASC-Citrine杂交而成。弗洛克斯老鼠,一个报告老鼠模型,显示荧光的ASC斑点,34Best1-CRE+小鼠,在RPE中特异性表达CRE。视网膜下注射βOs后弗洛克斯/Best1-CRE+小鼠与对照组相比,1~2μm ASC颗粒的形成增加(图2)。1B,c)。ASC斑点仅限于表达CRE的RPE细胞。1).

NLRP 3炎症是βos诱导的RPE变性的必要条件

视网膜下注射1-40肽的βos,而非对照反向肽40-1诱导野生型小鼠视网膜色素上皮变性(附图)2;然而,小鼠缺乏炎症成分NLRP 3,Gasdermin D(编码为格斯德),caspase-1(由CASP 1),或ASC(由皮卡德)不受βos诱导的RPE变性的保护(图1)。2A-E和补充图。3)。RPE扁平坐骑的形态计量学分析显示,WT小鼠的多形性(61.5%±3.9%)明显高于WT小鼠(P<0.001)。NLRP 3−/−(38.0%±2.1%)皮卡德−/−(36.5%±0.6%)CASP 1−/−(37%±2.7%)和格斯德−/−(37.2%±1.6%)小鼠。这些数据显示了NLRP 3炎症复合体的功能需求和Aβos诱导的细胞毒性的信号级联。

图2

βos诱导的RPE变性呈NLRP 3炎症依赖性。单次视网膜下注射1μM AβOS治疗眼。注射7d后取组织。aeβOS诱导WT小鼠退变,n=8(a)但不是在NLRP 3−/−, n=8(b), 皮卡德−/−, n=8(c), CASP 1−/−, n=8(d)或格斯德−/−, n=8(e)老鼠。眼底照片,顶部行;平坐骑染色为封闭性带状动物-1(ZO-1;红色),底部行。由白色箭头描绘的退化。二值化(健康%)和形态计量学(PM,聚甲基化(SEM))定量显示rpe退化(Fisher‘s精确检验二进制;双尾)。t-形态计量试验;*P < 0.001). Loss of regular hexagonal cellular boundaries in ZO-1 stained flat mounts is indicative of degenerated RPE. Scale bars (50 μm)

βos诱导的变性需要P2RX7的rpe表达。

视网膜下注射βO_2未引起视网膜退变P2rx 7−/−老鼠(图1.3A和补充图。4),与位于NLRP 3炎症体上游的P2RX7信号通路一致。35然而,人类与啮齿动物P2RX7在免疫激活和应答方面存在显著的物种异质性。36此外,P2rx 7−/−据报道,由于逃避失活的剪接变异,小鼠有部分功能的P2X7R。37为了克服这两个令人困惑的问题,我们测试了P2rx 7HP2RX7Flox/Best1-CRE+小鼠,我们用Best1-CRE+小鼠与P2rx 7HP2RX7Flox老鼠,其中的老鼠P2rx 7将基因位点替换为人源化P2RX7等位基因。37我们发现视网膜下注射βOs可引起视网膜色素变性。P2rx 7HP2RX7Flox表达人P2X7R但未诱导RPE变性的Best1-CRE+小鼠P2rx 7HP2RX7/Best1-CRE+小鼠,P2RX7在RPE中的表达被清除(见图)。3B-d和补充图。4)。RPE平板支架的形态计量学分析显示,(P < 0.001) polymegethism in P2rx 7HP2RX7Flox小鼠(68%±8.0%)P2rx 7−/−(35.7%±0.5%)和P2rx 7HP2RX7Flox/Best1-CRE+小鼠(37.2%±1.9%)。这些发现为AβOS诱导人P2RX7信号转导提供了证据,这对于AβO诱导的RPE变性是必要的。

图3

P2RX7在βos诱导的RPE变性中的表达是必需的。单次视网膜下注射1μM AβOS治疗眼。注射7d后取组织。a P2rx 7−/−保护小鼠免受βOS引起的RPE变性,n=8。bRPE平板架的低放大率(左面板)和高倍率(右面板)P2rx 7HP2RX7FloxP2rx 7HP2RX7Flox/白僵菌素(白色)和P2RX7(黄色)染色Best1-CRE+小鼠,显示P2RX7信号在RPE中减少。P2rx 7HP2RX7Flox/Best1-CRE+小鼠与P2rx 7HP2RX7Flox老鼠。黑色箭头指向P2rx 7HP2RX7Flox/Best1-CRE+小鼠,P2RX在非RPE组织中持续表达。c一种βOS诱导的退变P2rx 7HP2RX7Flox (n=6)但不是在P2rx 7HP2RX7Flox/Best1-CRE+小鼠(n=8)(d)。显示了具有代表性的图像。眼底照片,顶部行;平坐骑染色为封闭性带状动物-1(ZO-1;红色),底部行。由白色箭头描绘的退化。二值化(健康%)和形态计量学(PM,聚甲基化(SEM))定量显示rpe退化(Fisher‘s精确检验二进制;双尾)。t-形态计量试验;*P < 0.01, **P < 0.001). Loss of regular hexagonal cellular boundaries in ZO-1 stained flat mounts is indicative of degenerated RPE. Scale bars for lower magnification (100 μm) and higher magnification (50 μm)

NRTIS和Kamuvudine对βos诱导的RPE变性的抑制作用

接下来,我们测试了两类小分子炎症抑制剂:NRTIs和Kamuvudine(改良NRTIs)。我们测试了这些药物的剂量范围。阿鲁RNA诱导的RPE变性。17,38我们发现,玻璃体内注射两种NRTI(拉米夫定和齐多夫定)或两种卡姆夫定(2-乙基齐多夫定和3-甲基-拉米夫定),以剂量依赖性的方式阻止了βOS引起的RPE变性(图1)。4A和附图。S5, S6)。RPE平板支架的形态计量学分析显示,(P < 0.001) polymegethism in vehicle-treated mice (63.0% ± 4.2%) compared to mice treated with 3TC (32.7% ± 1.3%), K-9 (34.7% ± 1.5%), AZT (34.5% ± 1.2%), and K-8 (36.2% ± 1.2%). In addition, optical coherence tomography (OCT) imaging demonstrated disruption of the RPE and the photoreceptor outer segments after subretinal injection of AβOs that was prevented by intravitreous administration of K-8 (Fig. 4B)。接下来,我们在玻璃体内注射K-8后4周评估视网膜解剖和功能,剂量为治疗剂量的25倍:我们通过组织学检查和全场视网膜电图检查发现,K-8不影响视网膜的形态或功能(附图)。7).

图4

NRTIS和Kamuvudine可抑制βos诱导的RPE变性。a昆明小鼠视网膜下注射1μM Aβos,玻璃体腔内注射NRTI/Kamuvudine 0.5nmol(ZO-1;红色),眼底照片(上行)和扁平坐骑染色。玻璃体腔内注射3TC、K-9、AZT或K-8可阻断A型βOS诱导的RPE变性,而PBS则不起作用。由白色箭头描绘的退化。有代表性的n=6-12.RPE退化的二元(健康%)和形态计量学(PM,Polymegethism(SEM))的定量显示(Fisher‘s精确检验二进制;双尾)。t-形态计量试验;*P < 0.001). Loss of regular hexagonal cellular boundaries in ZO-1 stained flat mounts is indicative of degenerated RPE. Scale bars (50 μm). b在视网膜下注射车辆(左)后7天图像引导的光谱域光学相干断层成像(μM AβOs,中)和1μM AβOs加玻璃体内0.5nmolK-8(右)。黑色箭头指向注射部位,红色箭头指向RPE变性,白色箭头指向光感受器外段的破坏。

讨论

我们的研究表明,Aβos诱导NLRP 3炎症启动、组装和激活,βos诱导的RPE变性依赖于NLRP 3。此外,我们还发现,βos诱导的RPE变性需要P2RX7在RPE中的表达。最后,我们确定了两种FDA批准的NRTI,以及它们的毒性较低的Kamuvudine衍生物作为Aβos诱导的RPE变性的抑制剂。再加上我们先前的演示,正弦rna诱导的rpe变性也需要nlrp 3。11以及P2RX 7,18我们的数据表明P2RX7-NLRP 3信号轴是多个与GA相关的RPE退化模型中的一个常见检查点。此外,NRTIs和Kamuvudine通过两种正弦RNA抑制RPE变性的能力17,38而βOS增强了在GA临床试验中测试它们的理论基础。

GA是一种慢性、多基因疾病的一个例子,在这种疾病中,多种遗传变异、环境和生活方式因素之间的复杂相互作用决定了疾病的易感性、进展和严重程度。2,39与其他几种与年龄有关的疾病一样,为GA开发成功的治疗策略仍然具有挑战性,到目前为止,这是一项徒劳无功的努力。这一挑战的主要原因是与多种内在和外在刺激或压力源相关的疾病的多因素性质。39尽管引发事件不同,在遗传算法中RPE的不变丢失支持了这种疾病有一个共同的病理生物学过程的观点。2最近,已经有相当大的重视,以确定共同的途径驱动疾病的发展,在几个年龄相关的疾病。40,41,42慢性炎症已被认为是暂时的标志之一,代表共同的分母老化。43在炎症的几种介质中,NLRP 3炎症体在衰老中始终占据着中心位置,因为它被各种各样的与衰老相关的危险模式所激活。44,45

P2RX7介导的NLRP 3炎性小体激活在几种具有良好特征的GA模型中被认为是RPE变性的重要途径。18,19,20在这里,我们证明P2RX7-NLRP 3炎症体的激活对于Aβos所致的RPE变性是必不可少的,这是与GA发病有关的另一个公认的应激源。补体系统的异常激活也是GA发病过程中潜在的应激源。46,47,48人眼炎症因子HY402H多态性增高,49这与AMD的风险增加有关。50,51此外,RPE细胞培养模型和动物模型也暗示炎症小体激活是补体诱导RPE细胞毒性的重要驱动因素。52,53有趣的是,C3a和C5a是AMD眼睛中补体系统的重要组成部分。54以及GA的药物靶标,55激活NLRP 3炎症体,53,54,56至少部分通过P2RX7。56总的来说,人们很容易推测P2RX7介导的NLRP 3炎症小体的激活是跨GA多种病理途径的统一的分子基石。

NRTIS抑制P2RX7,阻断NLRP 3炎症小体的激活,与其阻断逆转录酶的能力无关。17据报道,NRTIs在动物模型中对AMD、GA和脉络膜新生血管具有治疗潜力。17,38,57此外,最近出现的临床证据表明,使用NRTIS可以减少2型糖尿病的发展,而2型糖尿病是由炎症驱动的。58NRTIs及其无毒修饰Kamuvudine的有效性已在正弦RNA诱导的RPE变性中建立,这是一种特征良好的GA模型。17本研究通过报道NRTIS和Kamuvudine在阻断Aβos诱导的NLRP 3激活和随后的RPE变性中的作用,为探索这些改良NRTI作为治疗GA的候选药物提供了强有力的动力,特别是它们具有较高的治疗指数。


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