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治疗性B细胞缺失逆转阿尔茨海默病的进展

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发表时间:2021-04-13 11:04作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

B细胞在阿尔茨海默病(AD)中的作用尚不完全清楚。虽然以淀粉样β(Aβ)为靶标的免疫球蛋白可能会干扰斑块的形成,进而影响疾病的进展,但B细胞的贡献可能不仅仅是产生免疫球蛋白。我们发现AD与循环中活化的B细胞的积累有关,与B细胞浸润脑实质有关,从而导致免疫球蛋白沉积在Aβ斑块周围。使用三种不同的小鼠转基因模型,我们提供了违反直觉的证据表明AD的进展需要B细胞。尽管AD促进基因的表达,仅B细胞的丢失就足以减少A型β斑块负担和疾病相关的小胶质细胞。它可以逆转行为和记忆缺陷,并恢复转化生长因子β。+小胶质细胞。此外,B细胞在疾病开始时的治疗性耗竭阻碍了AD在小鼠体内的进展,这表明靶向B细胞也可能对AD患者有好处。

导言

阿尔茨海默病(AD)是一种进展性神经退行性疾病,主要影响老年人。它与脑实质中毒性蛋白聚集物的清除受损有关,如淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的淀粉样蛋白(Aβ,Aβ)肽。1。虽然驻留的小胶质细胞吞噬胞外A型β斑块,但借助星形胶质细胞和转化生长因子β(参考文献)。2,3)、慢性炎症和β产生失调,导致小胶质细胞增生并随后被疾病相关的小胶质细胞所替代。4。遗传性转化生长因子β缺乏症小胶质细胞病和神经元死亡小鼠AS5,DAM进一步加重AD的神经炎症和神经元变性。6,7,至少部分是通过表达促炎细胞因子和下调A型β斑块的吞噬功能来实现的。8,9,10。AD风险与老年呈正相关11,当全身炎症增加时12,疾病的进展也取决于外周炎症和天然免疫细胞的激活。13。然而,适应性免疫在AD中的作用尚不清楚,主要与发挥有益和有害功能的T细胞有关。例如,在表达人APP的K670N和M671L瑞典突变的APP/PS1小鼠和L166P突变的早产儿1(PS1)中,Th1 CD4的浸润+大脑中的T细胞要么改善14或加重AD15。此外,Rag2缺乏的APP/PS1小鼠AD的改善主要与致病性T细胞的丢失有关。16。虽然RAG缺陷也延缓了功能性B细胞(T细胞)的发育,但B细胞在AD中的作用很少被探讨,而且大多被认为是有益的。他们的主要产品是人外周血和脑脊液中的非特异性免疫球蛋白和β特异性抗体。17,18老鼠19,20对AD有神经保护作用。5×FAD小鼠在瑞典(K670N,M671L)、佛罗里达(I716V)和伦敦(V717I)突变以及PS1(M146L和L286V突变)中过度表达APP,RAG缺陷使AD加重,原因是缺乏激活小胶质细胞吞噬功能的非特异性免疫球蛋白,从而清除Aβ斑块。21。然而,B细胞是一个异质的细胞群体。其功能和子集的积累受炎症环境的调节。例如,我们最近报道了炎症激活单核细胞将固有的b1A细胞转化为致病的4-1 bbl。+肿瘤坏死因子α+MHC-ΙB细胞(称为4BL细胞),然后诱导细胞溶解CD8。+T细胞与老年人、猕猴和小鼠胰岛素抵抗的关系22,23。然而,这些或其他活化的B细胞在老年性疾病(如AD)中的作用尚不清楚。

在这里,我们使用三种广泛应用的转基因AD小鼠模型,无论是否存在遗传B细胞缺陷,我们提供了证据和机制上的洞察力,认为仅仅失去成熟的B细胞就足以明显延缓AD的进展。虽然B细胞被认为不会渗透到AD大脑,但我们将它们在大脑实质中的存在与疾病的进展联系起来。重要的是,在疾病开始时循环B细胞的治疗性耗竭消除了B细胞,它们的免疫球蛋白沉积在大脑中并阻断AD的表现。我们的数据不仅证明了在AD患者中B细胞是致病的、AD的促进细胞,而且他们的B细胞应该成为控制疾病进展的靶点。

结果

为了评估B细胞在AD中的参与程度,我们首先进行了B细胞在同型、性别和年龄匹配的C57BL/6(WT)和3×tgAD小鼠循环中的流式细胞术评估,后者是一种早期发病的AD模型(eoad,携带瑞典APP突变,ps1上的m146v突变和MAPT中的p301L)。24,25。注:从现在起,除非有明确规定,我们使用年龄较大的雌性3×tgAD小鼠,因为它们的AD症状更明显。25。与对照组相比,3×TgAD小鼠在循环和次级淋巴器官中B细胞的频率和数量显著增加(附图)。1A而不是描绘;门的策略在补充图中。9A),天生的CD5+B1A和CD5B1B细胞(CD11b)+或/和CD 23CD 43+CD 19+脾淋巴结和颈淋巴结中的B_2细胞明显增多,B_2细胞减少(CLN;图1)。1A-C和补充图。1B-D)。3×TgAD小鼠在循环中也有较高数量的活化B细胞表达IFNγ、IL 6、IL 10和β。1D-G),主要在B1A细胞内,其次是B1B和滤泡B细胞(补充图)。1E-H)。AD小鼠B细胞,尤其是B1A细胞,明显上调4-1BBL(补充图)。1I,J),与老年人致病性B1A细胞相似。22,23暗示他们可能参与了AD。为了验证这一可能性,我们已经产生了缺乏B细胞的3×TgAD小鼠(称为3×TgAD-BKO,补充图).2A)与J杂交3×TgAD小鼠。HT小鼠由于免疫球蛋白J缺乏功能B细胞H在亲B细胞阶段终止B细胞发育的位点缺失26。当小鼠达到50-60周龄时,采用Morris水迷宫(MWM)任务对小鼠海马依赖的认知行为进行评估。在为期5天的隐性平台训练中,3×TgAD和3×TgAD-BKO小鼠表现相似(未显示)。然而,在上一次训练24小时后,在没有隐藏平台的情况下进行的一项探测试验显示,3×TgAD-BKO小鼠在目标象限内的时间明显长于3×TgAD小白鼠(p=0.017,n=13-15,图1。2A),表示对平台位置的更强的空间记忆。我们还测试了在3×TgAD小鼠中常用的开放式竞技场(OFA)的探索性行为异常。27,28)。与WT小鼠相比,3×tgAD小鼠在OFA中的活性降低,但在年龄匹配的3×tgAD-bko小分子中不能再检测到这种损伤(左面板,单因素方差分析)。F(2,29)=21.68,p < 0.0001; WT vs 3×TgAD p < 0.0001, 3×TgAD vs 3×TgAD-BKO p < 0.0001, n=10-11,图1。2B),这意味着3×TgAD相关的行为障碍需要B细胞。

图1:3×TgAD小鼠激活的B细胞增多。

与同型、年龄、性别相匹配的WT小鼠比较,b1A(CD5)。+CD11b+CD 19+, A)和B1B细胞(CD5)CD11b+CD 19+, B)增加,而B2细胞(CD5)增加。CD11bCD 19+, C)3×TgAD小鼠颈部淋巴结减少。AD还激活B细胞,因为它们上调了IFNγ(D)、IL6(E),IL 10(F),以及转化生长因子β(G)小鼠外周血中。显示频率(%)平均值±SEM,每个符号代表单个鼠标,n=5-6英寸AC, n=15英寸DG。门控策略如图所示。9A. **p < 0.01; ***p < 0.001 in unpaired t测试一下。

图2:AD的进展所需的B细胞。

AD相关认知障碍(A,MWM测试)和非认知运动活动(B3×tgAD 3×tgAD-BKO小鼠在30 min OFA实验中,总行程、左板、中间区时间、右侧视野时间均有改善(P<0.01),3×tgAD-bko小鼠(3×tgAD-bko小鼠)(n=10-15名女性)。与WT小白鼠相比,APP/PS1小鼠增加了IL 10的数量。+外周血B细胞(C)。APP/PS1小鼠认知能力受损D,到达逃逸平台的延迟;E在APP/PS1-BKO小鼠中,MWM试验(探针试验)的平台穿越次数被逆转。平均±扫描电镜显示,每个符号为一只老鼠。A, BD, E分别独立繁殖了三次和两次。门控策略如图所示。9A. *p < 0.05; ***p < 0.001 in unpaired t试验(A),曼-惠特尼试验(C),单向方差分析(B(左),Kruskal-Wallis试验(B,右和E)或双向方差(D).

为了证实这一结论,我们测试了另一种Eoad模型APP/PS1小鼠,与3×TgAD小鼠相比,APP/PS1小鼠具有早期AD病理。29。值得注意的是:随后的实验是在雌性和雄性,20-35周龄的小鼠身上进行的.流式细胞仪检测发现APP/PS1小鼠外周血B细胞表达IL 10也明显上调(图1)。2C3×TgAD小鼠。1F)。然而,APP/PS1小鼠不上调4-1bbl。+B细胞(大概是由于他们相对较年轻的年龄22,23)尽管B1A细胞循环和CLN明显增加,但与对照组相比(补充图)。2B、C)。接下来,我们通过杂交app/ps1和j,产生了B细胞缺陷型APP/PS1-BKO小鼠。HT小鼠。利用MWM对空间学习的分析表明,与年龄和性别匹配的APP/PS1或WT短时相比,B细胞缺乏明显改善了APP/PS1小鼠的学习缺陷,表现为到达逃避平台的潜伏期。F(2,33=8.288,p=0.0012;WT vs APP/PS1p=0.0006,APP/PS1 vs APP/PS1-BKOp=0.003,n=12,图1。二维空间;在平台区域交叉的次数中,在24小时后进行探针测试(Kruscal-Wallis ANOVA)(Kruscal-Wallis ANOVA)。p=0.0004;WT vs APP/PS1p=0.0002;APP/PS1 vs APP/PS1-BKOp=0.028,图1。2E)。APP/PS1小鼠探究性行为障碍的缺失30我们的小鼠在OFA中的探索行为没有差异(未描述)。因此,APP/PS1所表现的空间学习障碍是B细胞依赖性的。

因为EoAD的记忆障碍是由Aβ斑块的积累和海马小胶质细胞病变引起的。31我们对APP/PS1-BKO(30周龄)、3×TgAD-BKO(60~70周龄)和年龄和性别相匹配的对照小鼠的A型β斑块(6E10 Ab)和电离钙结合适配器1(IBA,一种小胶质细胞标记物)进行了免疫荧光分析。考虑到在此模型中,早期海马区A区β沉积与认知障碍有关32,AD患者海马CA1区和海马CA1区萎缩增加。33,在此基础上,我们对亚木耳进行了初步的分析。APP/PS1和3×TgAD小鼠(与健康对照组小鼠相比)Aβ斑块明显上调,APP/PS1-BKO小鼠和3×TgAD-BKO小鼠的A型TgAD-BKO斑块均明显升高(P<0.01)。n=4-7,图1。3A-C和补充图。3A-D)。对3×TgAD-BKO小鼠额叶皮质和海马的分析也显示可溶性Aβ的增加。42和一个β40被逆转(n=2-6,图1。三维空间和补充图。3E)。由于3×TgAD和3×TgAD-BKO小鼠海马神经元中APP基因表达水平较高(见图)。3E我们的结论是B细胞缺乏的好处可能是Aβ肽的形成减少和/或清除增加。相应地,大的配子体小胶质细胞(>5μm)2),表明功能失调过度激活34,35和β斑块的间隙受损36,3×TgAD-BKO小鼠显著低于WT小鼠。p < 0.05, compared with 3×TgAD, n=3-9,图1。3F和补充图。3F,G)。相反,在APP/PS1和APP/PS1-BKO小鼠中,激活的小胶质细胞(不论大小)仍在增加。第三代和补充图。3H)。为了了解这种差异,我们比较了小胶质细胞在这两种模型中的作用。用佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯和离子霉素(Pmai)分离和刺激脑髓系细胞,诱导小胶质细胞因子的表达和增殖。37)在单能素存在下作用4~6h,然后表面标记物和细胞内小胶质细胞因子(CD 45)。INTCD11b+)流式细胞仪分析。B细胞的丢失不影响白细胞介素1(IL)1β的表达,在3×TgAD和APP/PS1(补充图)中均显著上调。4A还有无花果。4A而不是描绘;门的策略在补充图中。9B)。相反,我们注意到转化生长因子β明显减少。+和干扰素γ+小胶质细胞(大概是静止的和静止的小胶质细胞)38,39,40)APP/PS1和3×TgAD小鼠。4B、C和补充图。4B-D)。转化生长因子β+(较小程度的干扰素γ)+APP/PS1-KO和3×TgAD-KO小鼠的小胶质细胞均与WT对照水平相适应。4B、C和补充图。4B-D)。脑和海马rna微阵列分析表明,B细胞缺乏可防止转化生长因子β1的丢失。+3×TgAD小鼠海马和脑小胶质细胞表达上调(图1)。4D)而DAM相关的转录标志基因,如伊特加克斯, Cst 7, Clec7a, Mamdc 2,和SAA 3(参考文献)4)在3×TgAD-BKO小鼠中被下调(补充图)。4E,补充数据13,和Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE165111)。B细胞缺乏症不影响IL1β或其他水坝基因,如肿瘤坏死因子α, IGF 1,和Lilrb 4(补充图。4E和补充数据13)。总之,在AD的3×TgAD模型和APP/PS1模型中,尽管AD促进基因表达、DAM积累、Aβ斑块沉积以及疾病的进展都需要B细胞。

图3:B细胞缺乏可减轻AD小鼠海马Aβ斑块负担和小胶质细胞激活。

AC显示APP/PS1中的β斑块数目(A)和3×TgAD(B)小鼠(n3×TgAD和3×TgAD-BKO小鼠的免疫荧光染色C,β斑块(绿色),Iba 1+小胶质细胞(红色)和DAPI(蓝色);鳞片,50μm。D可溶性Aβ的增加1–40和一个β1–423×TgAD-BKO小鼠脑内肽被逆转。小鼠皮层ELISA检测结果n=2-6)。B细胞缺乏对转基因表达无影响,3×TgAD和3×TgAD-BKO均在海马神经元中高表达转基因Happ。E,被6E10染成BC)。B细胞缺乏症可显著减少5~20μm的小胶质细胞数目(#)。2)在3×TgAD(n=3-9,F),但在APP/PS1小鼠(n=4-8,G)。平均±扫描电镜显示,每个符号为一只老鼠。*p < 0.05; ***p < 0.001; NS not significant in Kruskal–Wallis test (A, B, G)或者是单向的A (E, F).

图4:B细胞缺乏至少部分逆转了DAM表型.

白细胞介素1(IL1)β的流式细胞术定量结果+ (A)和转化生长因子β+ (B, C)小胶质细胞(CD11b)+CD 45INT)在被指示的老鼠的大脑中(n=11-12)。APP/PS1小鼠遗传B细胞缺陷(APP/PS1-BKO)B循环B细胞(aCD 20/B220,C)AD发病时(70~79周龄3×tgAD小鼠)逆转AD相关的转化生长因子β下降。+小胶质细胞。3×tgAD小鼠海马和脑(无海马)的基因芯片分析显示,B细胞缺乏(3×tgAD-bko)可上调转化生长因子β1的表达,而不上调转化生长因子β2和转化生长因子β3的表达。D, n=3)。AD发病时B细胞(aCD 20/B 220)的治疗性耗竭改善了AD(EG),因为它明显减少了小窝中的Aβ斑块(量化和有代表性的图像显示在EFβ斑块(绿色)和IBA 1+小胶质细胞(红色,F), n=6-8;独立复制两次)。B细胞耗竭逆转干扰素γ的降低+3×TgAD小鼠的小胶质细胞G, n=5-7)。平均±扫描电镜显示,每个符号为一只老鼠。门控策略如图所示。9B. *p < 0.05; ***p < 0.001 in one-way ANOVA (AC, G)或未配对t试验(F).

接下来,我们试图测试Eoad的进展是否也可以被治疗性B细胞在疾病开始时的失活或耗竭所控制。为验证这一思想,3×TgAD小鼠(60~70周龄,雌性)腹腔注射抗CD 20/B 220抗体(使循环中的B细胞枯竭)2个月。对照组用同型配型IgG治疗.抗CD 20/B 220 Ab在循环中有效地耗尽了B细胞(补充图)。5A)。与对照组相比,抗CD 20/B 220 Ab处理的3×TgAD小鼠OFA活性呈上升趋势。p=0.07,30分钟,n=5,补充图。5B)。然而,治疗后AD小鼠的Aβ斑块数量明显减少(p < 0.05, Fig. 4E、F,但不影响大型(>50m)的数量。2)Iba 1+海马小胶质细胞(附图)5C)。为了解这一差异,我们在60~70周龄3×tgAD小鼠群中重复抗CD 20/b 220 Ab治疗2个月。n然后用流式细胞仪对脑灌注后的小胶质细胞因子进行检测。如上所述,在3×tgAD-bko小鼠中,B细胞耗竭可显著逆转转化生长因子β的下降。+和干扰素γ+3×TgAD小鼠的小胶质细胞几乎达到WT小鼠的水平(包括频率和数量),p < 0.05, Fig. 4C,G和补充图。5D,E)而不影响IL1β+小胶质细胞在3×TgAD和WT小鼠中均有较高的表达(附图)。5F).

为了验证这些结果,我们使用了第三只小鼠的EoAD模型,5×FAD小鼠在40周龄时出现了更具侵略性的AD病理,这是由于5个家族AD突变的加性效应造成的Aβ斑块的巨大负担。41。在这个模型中,其他人将AD的进展与潜在有益的B1A细胞的频率降低联系在一起。42。然而,我们的5×FAD小鼠队列中的B细胞,包括B1A和B1B细胞(在数量和频率上)并没有表现出与对照年龄匹配的幼鼠相比的减少(补充图)。6A,B)。5×FAD小鼠的B细胞和B1细胞似乎被激活,因为它们显著上调了4-1BBL(附图4-1BBL)的表达。6C,D)。脾细胞IC细胞因子染色显示B细胞IL 10、β和γ明显升高(附图)。6E)。为检测激活B细胞的耗竭是否也能改善AD,采用5×FAD小鼠(35~47周龄,雌性)。注射抗CD 20/B 220抗体或对照IgG(n=7-12),2个月。然后在OFA中评估小鼠的探索性行为和焦虑。对照IgG处理5×FAD小鼠的探索性行为明显低于WT小白鼠,而B细胞缺失小鼠则相反。F(2,25)=5.25,p=0.013;wt vs 5×fadp=0.03,5×FAD+IgG vs 5×FAD+αCD 20p=0.02,图1。5A)。为了证实这一结果,我们对这些小鼠海马中的Aβ斑块和激活的小胶质细胞进行了定量分析。与IgG治疗相比,5×FAD小鼠B细胞减少了A型β斑块的数量(图1)。5B、C)和大型iba 1+小胶质细胞5D)。我们在一组年龄相配的雌性5×FAD和WT小鼠上重复了2个月的B细胞耗竭实验。n(5~12),用流式细胞术对生理盐水脑灌注后的小胶质细胞进行评价。转化生长因子β与3×tgAD和APP/PS1小鼠相似+和IL 10+5×FAD小鼠脑内小胶质细胞较WT小鼠明显减少(P<0.05)。p < 0.001, Fig. 5 E、F)。B细胞耗竭逆转转化生长因子β的下降+和IL 10+5×FAD小鼠的小胶质细胞。5 E、F)。与其他模型一样,这种治疗不会降低海马IL1β。+小胶质细胞(附图)7A,B),大概是为了支持β牌的清除。43。总之,我们的结论是,B细胞的耗竭可以延缓AD的进展,即使在疾病开始时也是如此。

图5:B细胞的治疗性耗竭改善了5×FAD小鼠的AD症状。

OFA试验表明,B细胞耗竭可改善5×FAD小鼠的迟发性运动。A,在前5分钟内行驶的总距离)。B细胞耗竭减少海马Aβ斑块负担(B, C)。β斑块(绿色)、IBA 1的代表免疫荧光染色图像+小胶质细胞(红色)和dapi(青色)显示在B。在……里面CD并给出了β斑块和小胶质细胞定量的结果。D,大尺寸,5-20μm2)分别。AD结果被复制了两次,n7-12.脑小胶质细胞的流式细胞术评价(CD11b)+CD 45INT)发现B细胞耗竭增加了转化生长因子β的发生频率(%)。+ (E)和国际法10+ (F)5×FAD小鼠的小胶质细胞(n=10-12)。免疫荧光染色显示,B 220+与WT对照组相比,5×FAD脑实质中的B细胞明显增多,短暂的B细胞耗竭后B细胞丢失。G, n=9-12)。与WT对照组相比,5×FAD小鼠脑内IgG含量较高,B细胞瞬时耗竭也可逆转IgG水平。HI)。在……里面H,IgG是绿色的,Iba 1+小胶质细胞是红色的。脑IgG定量I (n=5-7)。平均±扫描电镜显示,每个符号为一只老鼠。门控策略如图所示。9B. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 in one-way ANOVA (A, E, F, I),Kruskal-Wallis试验(G),或未配对t试验(C, D).

然后我们想知道B细胞是否通过浸润大脑实质来促进AD。由于B细胞数量少(CD 45的<1%)+流式细胞分析中检测到的细胞不能区分位于薄壁组织内外的细胞,我们对灌注和冷冻保存的小鼠脑切片进行了免疫荧光染色。与对照年龄匹配的WT小鼠大脑不同,我们清楚地检测到5×FAD小鼠额叶皮质和海马组织中的B细胞明显增加(图1)。5G和补充图。7C-E)。重要的是,B细胞减少的5×FAD小鼠几乎完全失去了B细胞的增加。5G和补充图。7D,E),暗示细胞起源于循环。我们还对脑切片进行了IgG染色。而WT小鼠的脑内几乎没有免疫球蛋白(如图所示)。5H,i5×FAD小鼠海马实质内易检出大量IgG灶,常与小胶质细胞和A型β斑块共存。5H,i)。这种脑IgG的增加在B细胞缺乏的5×FAD小鼠中丢失(图1)。5H,i)。然而,这种耗竭并不影响总IgG水平,也不影响循环中Aβ特异性抗体的微量(补充图)。8A-C),暗示脑实质中的B细胞产生IgG,并可能促进AD。

讨论

综合起来,我们为B细胞的“黑暗”一面提供了违反直觉的证据--它们除了产生潜在有益的A型β斑块外,还会加重AD样症状的表现--减少免疫球蛋白。17,18,19,20,21和表达AD-改善细胞因子42。虽然缺乏RAG的APP和5×FAD小鼠的病情恶化与保护性B细胞和T细胞的丢失有关。16,21我们的数据显示,B细胞的基因丢失或AD发病时的短暂耗竭改善了三种不同模型小鼠的疾病症状。与最近的报告不同,AD的进展与5×FAD小鼠抗炎B1A细胞的减少有关。42PB、脾脏和CLN中B1A和B1B细胞的数量均未受影响(5×FAD小鼠,4、7、12个月)或上调(3×TgAD和APP/PS1小鼠)。然而,不管其数量如何,我们最近报道了B1A细胞的功能不是静止的,而是受炎症环境的控制。在老年宿主中,b1A细胞失去抗炎活性并具有致病功能,如成为4-1 bbl。+B1A细胞(称为4BL细胞),可诱导细胞溶解颗粒酶-B+CD8+T细胞促进胰岛素抵抗23,44。在一致的情况下,AD小鼠的B1细胞(以及某些模型中的B2细胞)也出现了炎症表型,因为它们上调了细胞因子的表达,如干扰素γ、IL6、α和IL 10,以及(或)上调TGFβ和4-1BBL的表达。虽然年龄相关的B细胞(CD 21)CD 23CD 19+)在衰老过程中,我们没有发现他们参与了我们三种类型的AD小鼠。

最近的一份rna-seq报告显示AD小鼠大脑中存在成熟的B细胞。4我们的数据表明AD增加了大脑中的B细胞,增加了它们在大脑皮层和海马组织中的IgG,这些细胞常与Aβ斑块和活化的小胶质细胞共同定位。中风后多发性硬化症和认知功能障碍45,46,47脑中的B细胞可能产生免疫球蛋白和促炎因子,加重AD促进的神经炎症。首先,将IgG从循环转移到大脑是一个低效的过程,因为只有0.0017%的静脉注射免疫球蛋白到达WT和AD小鼠的海马。48。第二,符合AD患者血脑屏障部位合成免疫球蛋白的推测能力。495×FAD小鼠B细胞的短暂耗竭使脑B细胞和IgG显著下降,而不影响血清中Aβ特异性和非特异性抗体水平。虽然免疫球蛋白被认为能激活和促进小胶质细胞对β斑块的摄取21认为脑脊液中的A-β-IgG复合物对AD患者的认知状态有负面影响。50。我们的数据还表明,B细胞的丢失,从而IgG,在大脑中,显着地延缓了AD的发展。虽然这一过程的机制是一个不同的研究主题,但我们认为脑IgG(或其免疫复合物)单独或与B细胞因子协同作用会加重AD的神经炎症。为了做到这一点,脑IgG大概是以长期应激的水坝(和其他脑细胞)为目标的。4通过它们上调的fc受体和补体51,52,53,最近发现多发性硬化症患者大脑中的髓鞘-IgG免疫复合物,这种复合物破坏了人类小胶质细胞对微生物刺激的免疫耐受,并通过fcγRI和fcγria引起有害的神经炎症。54。这反过来又导致转化生长因子β的下调。+小胶质细胞,即静息的M0小胶质细胞存活率降低和β空斑清除3,40,55。阿尔茨海默病小鼠近期的脑组织rna-seq结果中也发现DAM中转化生长因子β的表达下降,成熟B细胞信号的增加。4。相反,B细胞的丢失增加了转化生长因子β+小胶质细胞表达下调TREM 2, Clec7a,和伊特加克斯在海马区,即用小胶质细胞替代DAM,以消除A-β寡聚体和其他神经毒性碎片8,9,10减少AD小鼠的A型β斑块和改善行为障碍。我们很容易推测B细胞同样参与人类的Eoad,因为轻度AD患者的病情严重程度与双重负记忆CCR 6的积累有关。+循环中的B细胞56。此外,老年人累积致病4-1 bbl。+肿瘤坏死因子α+诱导抗原特异性CD8的B细胞+T细胞促进胰岛素抵抗22,23,两个与AD相关的事件57,58。因此,我们建议B细胞的失活对AD患者也有好处,就像治疗性B细胞切除,即使在AD发病时也能逆转AD在小鼠中的表现。

方法

小鼠

国家老龄问题研究所的ACUC委员会(ASP 321-LMBI-2022)根据“实验室动物的护理和使用指南”(NIH出版物第86-23期,1985年)批准了这些动物议定书,并准许其进行动物实验。AD转基因小鼠(5周至80周龄,雌性)在国家老龄研究所(NIA)饲养、老化,并被安置在相同的、无病原体的环境中。雌性C57BL/6J小鼠(股票#000664)购自杰克逊实验室(巴尔港,ME)和3×tgAD小鼠(三重转基因与家族AD,B6;129-PSEN 1相关的人类基因)。Tm1MpmTG(APPswe,TUP301L)1 LFA/Mmjax)24,25、APP/PS1小鼠(B6.Cg-TG(APPswe,PSEN1DE9)85Dbo/J)16,5×FAD小鼠表达突变人APP和PSEN 1基因(B6.Cg-TG;APPSwFilon,PSEN 1*M146L*L286V)21和JHT小鼠(B6.129P2-IgH-JTm1Cgn/J),由于免疫球蛋白J在循环中不发育功能性B细胞H位点缺失26,在马里兰州巴尔的摩的NIA饲养和维护。如以前所报告的那样,短暂的B细胞耗竭是进行的。22,59小鼠腹腔注射抗CD 20抗体(克隆5D2,Genetech,100μg/鼠)和抗-B 220 Ab(150μg/鼠,TIB-146,BioXcell),3~6次腹腔注射2~3个月。

组织与血液加工

用70μm细胞过滤器(BD Falcon,Bedford,MA)制备了脾细胞和CLN的单细胞悬液.用2mg/ml的肝素钠(Sigma)在试管内采血。用ACK缓冲液处理脾脏和血细胞悬液,去除红细胞。用GentleMACS™解离器(MiltenyiBiotec,MiltenyiBiotec,CA)对小鼠和大鼠(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)的成年脑解离试剂盒(MiltenyiBiotec)进行解离。

流式细胞术

抗体(Ab,见补充数据)4对小鼠CD 19、CD5、CD11b、CD 43、4-1BBL、IFNγ、IL1β、TGFβ、IL 10、IL 6、CD11b、CD 45及其同型对照抗体,均从Biolegend、eBioscience、BD生物科学和R&D系统购买。IC细胞因子染色:用50 ng/ml的PMA和500 ng/ml的离体霉素刺激1~2h,然后用10μ/l的莫能菌素或Bregeldin A(EBioscience)作用高尔基体停3~4h,然后按制造商的IC固定和渗透(EBioscience)指示进行染色。FACS染色用抗体浓度为1μg/10。6细胞。对FACS Canto II(BD)或CytoFLEX(贝克曼库尔特公司)的数据进行了分析。使用Flowjo软件(TreeStar,Inc.)或CytExpert软件(贝克曼库尔特公司)。

脑免疫荧光染色

用pbs灌流20~30 min。2取脑,用PBS冲洗,再用4%PFA固定脑半脑。24 h后,将脑转移到含30%蔗糖的PBS缓冲液中15 ml管中,持续2天,直至脑底下沉。然后,将大脑埋入OCT复合物中,冷冻在干冰上,在冷冻前保存在−80°C中。取30~30μm厚的海马冠状面,间隔240μm,取8组小鼠,每只小鼠2~6片进行免疫荧光染色。免疫荧光染色采用自由漂浮染色法:用PBS冲洗两次后,将脑片置于0.3M甘氨酸缓冲液中,室温下孵育30 min,RT用IF缓冲液(2%驴血清、2%BSA、0.1%TritonX-100)阻断并渗透30~60 min。脑片与从ABCAM购买的Abs或其同型对照免疫球蛋白孵育,在4°C下过夜,在RT下孵育15~60 min。用PBS冲洗3次后,脑片与ABCAM结合的第二抗体(驴抗鼠IgG H&L-Alexa Fluor 488;驴抗兔IgG H&L-Alexa Fluor 568;驴抗大鼠IgG H&L-Alexa Fluor 568;驴抗山羊IgG H&L-Alexa Fluor 647;)在RT上孵育2h,用PBS 3次冲洗后,用DAPI(Invitrogen)延长™金/钻石抗荧光染色液。在rt时,脑片与Iba 1抗体孵育2h,用pbs冲洗,再用Alexa Fluor 488标记F(ab‘)2-山羊抗鼠IgG抗体(CAT#A-11017)和驴抗兔IgG H&L荧光素568孵育。第一种抗体为纯化的抗β-淀粉样抗体、1-16抗体(克隆6E10,CAT#803002)、重组抗Iba 1抗体(CAT#ab178846)、小鼠IL1β/IL-1F2抗体(CAT#AF-401-NA)、抗CD45R抗体(CAT#ab64100)、ZO-1多聚抗体(CAT#40-2300)、小鼠和层粘连蛋白4抗体(CAT AF 3837)。

图像用蔡司LSM 710共焦显微镜拍摄,显微镜配有×20/0.8和×20计划-Apochromat干目标(Carl Zeiss)。对A型β斑块和小胶质细胞定量,3×TgAD模型下区,APP/PS1模型齿状回区,5×FAD模型海马区。对脑IL1β或IgG进行定量,对脑下区进行成像。脑B 220+B细胞定量,全脑观察及b 220图像。+B细胞被捕获。用ImageJ软件对所有图像进行量化。对A型β和小胶质细胞进行定量,取每只小鼠多达6层脑片,分别在海马下区(3×TgAD模型)、DG区(APP/PS1模型)或整个海马区(5×FAD模型)进行定量。简单地说,将单通道图像转换为8位图像,并在同一实验中对所有图像选择合适的阈值,然后用“分析粒子”函数来量化6E10斑块和iba 1的数目或面积。+小胶质细胞。小胶质细胞定量的典型图像显示在补充图中。第三代。B 220+B细胞定量,全脑区仔细观察,b 220图像。+获得B细胞,用ZO-1或层粘连蛋白A4染色或明亮视野区分B细胞的位置。

可溶性Aβ的测定40/42

从pBS灌流小鼠脑中分离出大脑皮层和海马,并将其保存在−80°C中。通过修改先前发表的一种β肽纯化方法,纯化了可溶性和不溶性蛋白质组分。60。组织在TBS-Triton 1%(120 mm NaCl,50 mm Tris,pH 8.0,150 mg/ml(组织/缓冲液))中机械匀浆,包括蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1:100,P 2714,Sigma,St.Louis,MO),然后在冰上孵育30分钟,然后在17000×离心120分钟。g在4°C上清液中,取小鼠Aβ1-40和Aβ1-42的TBS-T-可溶性组分,保存在−2 0°C中,再将含有不溶性A-β的颗粒再悬浮于70%甲酸中,在冰中孵育30 min,然后在上述条件下离心。用1M Tris(pH=11,甲酸体积的20倍)对甲酸可溶性上清液进行分离和中和,并将其保存在−20°C中,用BCA法测定总蛋白浓度(CAT#23225,ThermoFisher Science,Waltham,MA)。TBS-S与甲酸可溶性水平Aβ1–40和一个β1–42用双抗体夹心ELISA法对96孔聚苯乙烯微板(655061,Greinbio-one,梦露,nc)进行皮层测定,用50μl的抗兔-N末端Aβ覆盖。1–14(b 2539,ABCAM,剑桥,英国)在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH=9.6)中浓度为5μg/ml,在4°C下孵育一夜,用PBS-T溶液(0.1%TritonX,PBS)冲洗4次,用2%BSA溶液阻断。组织匀浆各50μ,RT孵育60 min。然后在pbs-T中清洗5次平板,并加入以下检测抗体:抗-Aβ1–40抗体(ab20068,ABCAM,英国剑桥)稀释1:500或抗Aβ1–42抗体(05~831,微孢子,Billerica,MA)1:2500,RT孵育60 min。然后,用PBS-T洗涤5次,加入次级山羊抗鼠IgG HRP-结合抗体(115~035-003,过氧化物酶亲和素纯山羊抗小鼠,Jackson免疫研究,PA),稀释1:5000。用PBS-T和50μl的3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺底物(00-4201-56,阿菲美特里克斯eBioscience,圣迭戈,CA)冲洗5次。显色反应可持续3 min,加入2 mH的50μl即可停止显色反应。2所以4。用分光光度计测量了450 nm处的光密度。用已知浓度的重组Aβ测定标准曲线1–40和一个β1–42.

行为测试

在MWM试验中,我们使用了一个直径140厘米的浴缸,内有一个15×15厘米的方形平台,淹没在水面以下1厘米处。水保持在21±1°C,用白色油漆着色。小鼠每天进行四次试验,按随机顺序从四个指南针点(N、S、W、E)中释放出来。如果一只老鼠在60年代内没有找到隐藏的平台,它就被轻轻地引导到平台上。每次试验结束时,所有的老鼠都会在平台上呆上10秒钟,试着用毛巾,然后回到自己的笼子里。训练5天后,在上一次训练试验后24小时进行60年代的探针试验。平台被移除,老鼠被放置在离前平台位置最远的另一面墙上。在探测器试验后的第二天,老鼠被测试了四项实验,测试它们游到可见平台上的能力。用任意迷宫软件(Stoelting)对游泳进行分析。在开场实验中,将小鼠置于34×34×25 cm的白色丙烯酸室中,用架空摄像机记录60 min。因为试验的前几分钟对AD转基因小鼠最敏感30,我们重点分析了最初的5分钟。轨迹用任何迷宫软件进行分析。在所有行为实验中,使用任意迷宫软件进行分析。对于步态分析,小鼠被测试在一个固定速度的跑步机装置上(DigiGait;老鼠的特性)。小鼠习服1 min,5 cm/s跑1 min,休息1 min后,跑步机速度提高到15 cm/s,从腹式摄像机高速采集视频,由经验丰富的用户选择3~5s具有代表性的步态视频进行自动分析。


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