PCR核酸扩增技术
通过大肠埃希菌繁殖而增殖重组质粒,也是扩增核酸的手段。但在试管中有效扩增DNA的方法,是在90年代才开展起来的多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便,在我国发展很快。目前,PCR技术结合分子生物学实验技术(如逆转录反应杂交技术等)开发了许多PCR新技术(reverse transcriptase PCR;PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP;巢式PCR(二次PCR);热启动PCR等)。RT-PCR用于RNA分析;PCR-SSCP分辨率高,可用于点突变分析;二次PCR特异性好,灵敏度高;热启动PCR可提高特异性。 PCR技术原理是在了解DNA一级结构基础上设计引物(primer或sense,人工合成),DNA多聚酶可识别并结合引物,以单链DNA为模板,dNTP 为底物,合成其互补链。通过反复变性,反复合成互补链的过程,达到DNA扩增的目的。人的DNA扩增引物长度多为20个核甘酸。
将反应物和Marker点样于凝胶一起电泳,紫外光下观察结果,拍照保存结果。反应物也可用于印迹(杂交)实验、多态分析、探针制备等。
注意事项:①DNA样品纯度高,Taq酶(和Klenow酶)有逆转录酶活性,DNA和RNA不能混在一起。
②设计的引物分子内(特别3′端)和引物,1,2分子间不形成双链。选择性好,不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G+C含量为40%-60%。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误,一般在200μmol/L,有人建议40-50μmol/L。④KCl>75mmol/L对酶有抑制作用。Mg2+浓度过高,NDA不易变性,>10mmol/L可抑制酶活性40%-50%。⑤多聚酶:Taq多聚酶从嗜热菌分离得到(1989年,在此以前1985年利用Klenow 酶因不耐热每经过一次热变性要补加一次酶),现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH8.3~8.8(室温8.3-8.4),反应温度75-80℃,95℃以上失活明显。无3′→5′校读活性,对SDS敏感(<0.01%活性也受到抑制,加吐温-20可抵制SDS抑制=。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm-5℃,但实际上与引物一级结构序列有关,设计不当可造成非特异性退火,而造成非特异扩增,此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多,增加次数可提高灵敏度,但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高,被检样品极易被污染,样品纯化,扩增,检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃,处理。
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