在含有木材，葡萄糖和木材加葡萄糖作为碳源的浸没液体培养物中，研究了平菇侧核mkPC9和mkPC15以及交配双核体dkN001 的分泌组复杂性和木质纤维素降解能力。研究表明，这种白色腐烂的担子菌攻击植物细胞壁的所有成分。平菇分泌多种糖苷水解酶，碳水化合物酯酶和多糖裂解酶，尤其是在木材是唯一碳源的情况下。木材的存在增加了分泌组的复杂性，而葡萄糖则减少了纤维素，半纤维素和果胶降解所涉及的酶的分泌。相反，葡萄糖的存在不影响氧化还原酶或蛋白酶的分泌，这表明葡萄糖对纤维素分解酶的分泌具有特异性。对单核和双核的分泌组的比较表明，分泌组的复杂性与菌株的核组成无关。
木质纤维素是地球上主要的有机碳库，可以成为生产生物燃料（纤维素）的起始分子和用于生物精炼或合成新化学品（半纤维素和木质素）的平台化合物的来源。在自然界中，木质纤维素循环所涉及的生物学机制的理解对于使用这种生物资源的工业过程设计至关重要。
木质素合成是植物从水生环境适应陆生环境的关键步骤。水生植物是具有木质化组织（木质部）的陆地植物，可在整个植物中传导水和矿物质，从而能够高效运输并扩大植物的尺寸。木质素使原本可渗透的（由于亲水性多糖）木质部细胞壁防水并提供结构刚性，这对于植物达到高度至关重要，该高度为维管植物提供了获得阳光1的竞争优势。此外，由于其分子结构，木质素是一种顽强的聚合物，其中不同的苯丙酸酯单元形成一个复杂的三维网络，该网络由各种醚键和碳-碳键连接2 可以形成一层抵御病原体和天敌的保护层。
木质素是植物中第二大主要碳汇（仅次于纤维素）。它占生物圈1中产生的有机碳的30％，是煤3的主要前体。除了一些细菌和少数子囊菌（炭角菌属和炭团），主木质素降解剂生物体是白腐伞菌，这已经在石炭纪发挥自木质化的化合物的起效在木质纤维素的碳循环中起关键作用3，4。居住在木材中的姬菇科动物可以分泌多种酶，并且能够适应几乎所有陆地生态系统。有两种不同的降解木质纤维素的方法：白腐真菌先降解木质素，然后降解纤维素，而褐腐真菌在主要降解纤维素的同时，引起较少的木质素改变。此外，一些中间物种具有两种腐烂类型5的特征。平菇是一种白腐真菌，它降解木质素的程度比其他白腐真菌高6。
由细胞或生物体在给定时间分泌的一组蛋白质定义为分泌组7。这些蛋白质可以释放到培养基中，保持附着在膜或细胞壁上，并且是完整的膜蛋白质。除其他功能外，真菌还使用分泌的酶作为从环境中获取营养的工具，因此，蛋白质的分泌对于真菌而言是至关重要的生物学过程。分泌组依赖于真菌8的生态位，并随着外部条件的变化而变化，以改善真菌的生长。
木质纤维素由三种主要化合物组成：木质素，纤维素和半纤维素。白腐真菌侧耳侧耳的木材腐烂机制以植物细胞壁的所有这些成分为目标。许多分泌的酶已在CAZy数据库9中进行分类，并且仍在发现此过程中涉及的新酶，例如被分类为裂解多糖单加氧酶（LPMO）的辅助蛋白A9，AA11，AA14 10和AA16 11。因为它们对多糖的活性已经显示出是通过一种新型的氧化机制发生的12。此外，在P. ostreatus中发现，在木质纤维素降解过程中许多转录上调的基因属于未知功能的蛋白质13。
担子菌降解木质纤维素的策略具有另一个复杂度：该过程中涉及的酶可以是具有基因特异性调控作用的多基因家族的成员14。例如，白色腐烂担子菌P. ostreatus的基因组编码21个糖苷水解酶家族5（GH5，纤维素酶和其他酶活性）基因，而棕色腐烂担子菌Postia胎盘素编码12，白色腐烂Phanerochaete chrysosporium编码19个GH5基因。3。此外，真菌可以按照与木质纤维素降解的阶段相对应的时间顺序调节这些酶的表达和分泌。褐腐真菌胎盘分解木质素分两个步骤：首先，产生活性氧以攻击木质化合物，其次，分泌酶以水解纤维素化合物15中的多糖。另一方面，关于时间和数量16表达的酶，白腐之间存在更大的木质素分解变异性。一个基因的表达涉及几个过程，包括转录，翻译和信使RNA和蛋白质，和转录组学，蛋白质组学，和酶活性数据的营业额并不总是相关的17，18。因此，蛋白质组学分析是验证这些酶是否对复杂的木质纤维素底物起作用的关键步骤。
木质纤维素丰富且可再生，这是液态燃料19候选来源的两个必要特征。但是，结晶纤维素核的高度有序的结构使该分子通过化学或生物过程的水解成为挑战。纤维素片的疏水面使纤维素具有抗酸水解的能力，链间氢键使纤维素对酶水解具有顽固性20。如上所述，半纤维素和木质素形成复杂的基质，木质素具有高度的顽强性。当前，已对1500多种可用的真菌基因组进行了测序，其中475种来自担子菌（JGI Mycocosm，2020年2月）21。在这些真菌，白腐担子菌被视为一种性能优良，环境友好的替代品用于克服植物生物量的不顺应的热化学处理，即使采用这种替代酶处理的高成本22。为了降低成本并使木质纤维素乙醇成为液体燃料的现实替代品，有必要对真菌降解木质纤维素的机理有更深入的了解。牡蛎蘑菇P. ostreatus是第三大耕种的食用蘑菇和优先的木质素降解剂6。这些特征使这种真菌对于潜在的生物燃料生产以及激发对哪种酶P. ostreatus的分析感兴趣。 使用木质纤维素作为碳源时会分泌。
担子菌（例如P. ostreatus）为研究其生物学中枢过程的遗传控制提供了无与伦比的可能性。具有生殖能力和子实体的菌丝体是严格的双核细胞，其中每个细胞都包含两个相容的核。通过对原核生物菌株进行原生质体改造，有可能在不同的单核生物菌株中恢复两个核中的每个核，从而通过这种方式，可以研究每个核对单核体（即每个核中的一个）对过程遗传控制的贡献。核在给定的细胞质中）和双链体。与其他真核生物的二倍体状况相比，这种类型的研究还可以阐明原核生物生活方式的某些方面。
平菇侧耳 dkN001是一种商业菌株，能够产生大量具有极佳感官特性的蘑菇。晶核存在于两份分离和两个单核菌株（称为protoclones mkPC9和mkPC15）制作22，其在交配，重构dkN001。mkPC15和mkPC9的基因组已经被测序，并且广泛研究5，13，23。基因组序列为我们提供了预测可以分泌的编码蛋白的机会（生物信息学分泌组13），然后再执行更昂贵，更复杂的分泌组分析。但是，生物信息学（基因组中存在的完整预测分泌蛋白的完整集合）与体外分泌组（在特定培养条件下，通过特定细胞组在木质纤维素降解的精确步骤中使用的实际酶组）之间的相关性，和/或在给定的时间）需要通过蛋白质组学的分泌组分析来建立。这两个单核菌株不同的表现与他们之间在水下文化的双核体，以及编码针对分泌蛋白质的基因的转录也不同，这取决于核条件和文化的类型12。
在这项研究中，我们使用LC-MS 分析了使用杨树（Populus alba）芯片（木材，W），补充葡萄糖（WG）或葡萄糖（G）作为碳源的木材在水下摇动培养中生长的P. ostreatus的分泌组。 / MS来鉴定平整毕赤酵母用于适应这些培养基的蛋白质。这是在体外进行比较分析分泌物第一平菇测序单核protoclones mkPC15和mkPC9其各自含有两个核存在于双核体dkN001的之一5，23，24。
这些实验的目的是阐明木材和葡萄糖（纤维素生物降解的最终产物）对蛋白质分泌的调节，并确定真菌的单核和双核条件对分泌组谱的影响。我们认为G培养物是基础条件，W培养物中检测到的蛋白质被认为是由木材诱导的，而WG培养物中回收的蛋白质被认为是由木材诱导的，但对葡萄糖的抑制不敏感。
在这项工作中，我们分析了在14天大的振荡培养中进行的单核细胞株mkPC9和mkPC15和dikaryon dkN001（包含mkPC9和mkPC15中存在的核）的上清液（蛋白质组）中回收的蛋白质，木材（W），葡萄糖（G）或木材和葡萄糖（WG）作为碳源。在这些实验条件下，培养14天后葡萄糖没有耗尽（补充表S1）。在9个分泌蛋白组中鉴定出790种蛋白质，这些蛋白显示至少2个正向匹配的肽和1％FDR（三种菌株，三种培养条件，从培养上清液中获得的9种分泌蛋白组中的每三个都有重复）。在不同的培养条件下，如果检测到相同的蛋白质，则检测到的不同蛋白质数量为432；此外，该数目还包括相同基因的等位基因产生的蛋白质，等位基因蛋白质被定义为满足等位基因标准的蛋白质。通过双向BLAST测定，与80％的蛋白质序列具有80％的相似性。在dkN001样品中发现了154个等位基因蛋白质对（检测到77个等位基因对），S2）。如果相同蛋白质的等位基因仅计数一次，则在研究的9个分泌组中鉴定出278种不同蛋白质（补充表S2）。
图 1显示了每个菌株鉴定的蛋白质数量和培养条件的维恩图。从dkN001培养上清液中总共回收了136种不同的蛋白质，从mkPC9中回收了152种，从mkPC15中回收了207种。该结果表明，双核病状态与大量不同蛋白质的分泌无关，并且蛋白质分泌不是累加的遗传特征。
维恩图显示使用木（W），糖（G）或木和糖（WG）作为碳源培养的三种菌株（dkN001，mkPC9和mkPC15）中鉴定出的蛋白质数量。图中的数字表示每种菌株和条件中鉴定出的独特蛋白质的数量。
如果我们假设在每个分泌基因组中鉴定出的不同蛋白质的数量反映了其复杂性，则结果表明，三种菌株中W的分泌基因组复杂性高于G（W和G的dkN001中分别为103和50种不同的蛋白质；在mkPC9中分别为88与80，在mkPC15中为147与111）。这些结果表明，W是P. ostreatus分泌组复杂性的诱导剂。此外，WG培养物中葡萄糖的存在与三种菌株（分别在dkN001，mkPC9和mkPC15中鉴定的58、40和115种不同蛋白质）的分泌组复杂性降低相关。该结果表明，G可以抑制W文化中全球分泌组复杂性。Parenti等。25与本文报道的结果一致，已经显示了被麦草提取物污染的水的诱导剂对P. ostreatus漆酶生产和活性的影响。此外，针对mkPC9 26中碳分解代谢物阻遏的转录调节因子CRE1的敲除和过表达研究与葡萄糖对观察到的复杂性的影响相一致。
在先前的研究中，Alfaro等人。图13显示，在mkPC9和mkPC15中分别编码被生物信息学预测分泌的蛋白质的基因数目（bioinfosecretome）相似（分别为538和554），其中超过90％的基因被转录，并且mkPC9的生物信息秘密转录组转录态势。 mkPC15在静态中相似，但在摇动培养中却不相似。在通过摇动培养进行的这项研究中，mkPC9和mkPC15的分泌组复杂度在一致性方面显着不同（mkPC9与mkPC15在W中鉴定出88种相对于147种不同的蛋白质，在G中鉴定为80对111种，在WG中鉴定为40对115种）。与以前发布的结果。但是，令人惊讶的是，与快速增长的菌株mkPC9和dkN001相比，慢增长的菌株mkPC15显示出更为复杂的分泌组。
木材是分泌大量特定蛋白质的碳源（dkN001，mkPC9和mkPC15分别为57、55和43）。相反，在G培养物中检测到的碳源特异性蛋白的数量则较少，尤其是在dkN001中。如果我们考虑碳源特异性蛋白的数量作为适应碳源能力的指标，那么这些结果表明，单核型菌株对两种碳源都具有相似的适应能力，而双核型菌株则更适合复合物。 W的碳源要比基底的G高。
在生长缓慢的菌株mkPC15中观察到较高的分泌组复杂性与其分泌组特异性降低有关。在dkN001和mkPC9中检测到的碳源特异性蛋白质分别代表了在这些菌株中鉴定出的蛋白质的64％和72％。然而，在PC15中，碳源特异性蛋白的数量仅占该菌株中鉴定出的蛋白的45％。
使用不同的数据库（JGI，Interpro，Pfam和Gene Ontology）分别对LC-MS / MS实验中鉴定的蛋白质进行注释，并手动将其分为9个功能组：糖基水解酶（GH），功能未知的蛋白质，氧化还原酶，细胞内蛋白质，蛋白酶，酯酶/脂肪酶，非酶蛋白质，裂解酶，其他酶（补充表S2）。
图 2显示GH，功能未知的蛋白，氧化还原酶，细胞内蛋白和蛋白酶是最代表的组，占分泌组中鉴定的蛋白的75％以上。排除仅代表最小数量的infoinforetretome 13的细胞内蛋白质组，这四个主要的蛋白质组对应于在生物信息秘密基因组中鉴定出的较大的可分泌蛋白质组。实验性分泌物组中大量细胞内蛋白质可能是由菌丝和操纵菌丝体时产生的细胞破裂引起的。另外，应该记住，在这项研究中仅分析了自由分泌到培养基中的蛋白质，而其他仍附着在细胞壁或细胞膜上的分泌蛋白质被丢弃了。同样，在不同培养条件下研究的bioinfosecretome及其转录组中，未知功能的蛋白质含量较高13比这里介绍的实验性分泌组 之所以会出现这种差异，是因为许多未知蛋白质的分子很小，这使得使用此处使用的LC-MS / MS策略检测它们变得更加困难。
在所有样品中鉴定出的蛋白质的功能分类。
图 3显示了从生长在含有木质纤维素（木材）或葡萄糖作为碳源的液体培养基上的三种菌株（mkPC15，mkPC9和dkN001）上清液中回收的分泌蛋白的功能分类。考虑到三个菌株中鉴定出的所有蛋白质，GH是W培养物中发现的最大蛋白质组，而当培养物中存在葡萄糖（G和WG）时，这些酶的丰度较低。这种差异表明，培养基中葡萄糖的存在会对平菇（P. ostreatus）中的 GH分泌产生负面影响。。此行为是特定于酶组的，因为它不同于氧化还原酶（在三种菌株和条件下其存在相似）和功能未知的蛋白质组（其存在似乎不受存在的影响）不同葡萄糖。
在含有葡萄糖（G），木材（W）或葡萄糖加木材（WG）作为碳源的液体摇动培养基中培养的双核N001和单核PC9和PC15分泌蛋白中鉴定的蛋白质的功能分类。大小与鉴定的蛋白质数量成正比。
mkPC15菌株显示出与mkPC9或dkN001不同的分泌蛋白谱（图 3）。在该菌株中，GH分泌组的复杂性受葡萄糖的影响较小（请参见补充表S3中的数据））比mkPC9或dkN001菌株中的高。该菌株中功能未知的蛋白质数量也比mkPC9和dkN001高。在固态木材降解实验中，dkN001和mkPC9在小麦秸秆上的生长速度相同，但mkPC15不能在这种木质纤维素上定殖。与针对山毛榉木材的EN113测试（欧洲标准EN 113，1996）相比，dkN001和mkPC9分别降解了木材干重生物量的19％和12％，而mkPC15没有在木块上定居并显示降解<1％ （数据未显示）。这些结果表明，mkPC15的木材降解能力低可能是由于其较差的生长能力，而不是其木材降解酶的分泌较低。在这种情况下，与使用mkPC9和dkN001回收的W mkPC15上清液相比，在W mkPC15上清液中回收的细胞内蛋白数量更高，这可能是该菌株在使用复杂底物生长时条件较弱的另一个症状。这些结果表明了降解植物生物质相关底物的不同能力，如先前在其他真菌中所述，指出了菌株选择对生物技术应用的重要性27。
鉴定出88种不同的分泌GH，可以进一步分为35个不同的CAZy家族。GH7（可能的还原性纤维二糖水解酶，12种蛋白质），GH5（内切葡聚糖酶，7种蛋白质），AA9（铜依赖性裂解性多糖单加氧酶，LPMO，7种蛋白质），GH28（多聚半乳糖醛酸酶，5种蛋白质），GH16（内切葡聚糖酶和其他酶活性）在图28中，四种蛋白质）和GH43（阿拉伯呋喃糖苷酶，四种蛋白质）代表最多（补充表S2）。GH7和AA9酶是在P. ostreatus基因组中发现的最大GH家族之一（mkPC15基因组中分别有16和29个基因模型）。此外，AA9 LPMO基因家族在该菌株在其他不同培养条件下进行的转录组分析中高表达13。
纤维素降解需要在这里分析的分泌组中发现的三个GH组的联合作用：内切葡聚糖酶（七个GH5，两个GH12和一个GH45），纤维二糖水解酶（两个GH6和12 GH7）和β-葡萄糖苷酶（三个GH3）（补充表S2）。GH5内切葡聚糖酶具有不同的酶活性，包括β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶9。仅当W为碳源时，才在dkN001培养物中回收这些蛋白质。然而，在两个单核中，在G文化中也发现了该家族的某些成员，这可能与这些酶的广泛活性范围有关（见下文）。LPMO（AA9）被提议在结晶纤维素中打开接入点，以使纤维素酶大量降解大分子29。仅在含W的培养物中鉴定出7种LPMO蛋白，表明这些酶被W诱导并抑制了G（补充表S2）。）。回收的所有GH7纤维二糖水解酶也仅在含W的培养物中（W和WG）发现，而在G培养物中却不存在，并且在WG培养中其丰度大大降低。此外，GH7酶在dkN001中尤其占主导地位（在W培养物中检测到的前十种蛋白质中有五种），并且在mkPC9和mkPC15 W培养物中分泌的蛋白质也更为丰富。所有这些数据都支持GH7酶的产生是由木材增强的，而部分地是由葡萄糖抑制的。与之前的家族相反，GH3β-葡萄糖苷酶（三种不同的蛋白质）仅在使用G作为碳源的mkPC15培养物中回收。尽管鉴定出的GH3蛋白数量很少，但有趣的是，建议用于GH5蛋白的酶促活性之一是β-葡萄糖苷酶，并从GH3家族成员的G培养物中回收了这种酶。总之，最初的纤维素降解所涉及的酶的分泌似乎受到W的刺激而被G的存在部分抑制。相反，β-葡萄糖苷酶的分泌似乎是独立的。
半纤维素是由木聚糖，葡糖醛酸聚糖，阿拉伯木聚糖，葡甘露聚糖和木葡聚糖以及几种单糖形成的复杂聚合物，其需要真菌中广泛的半纤维素分解酶。在这项工作中鉴定出27个GH半纤维素酶，并将其分为十个CAZy家族（GH5，GH10，GH11，GH27，GH30，GH31，GH35，GH44，GH74和GH115，补充表S2）。根据纤维素分解酶的分泌，半纤维素酶主要存在于W培养物中。大多数半纤维素酶（19种中有12种）仅在W和/或WG培养中发现，而在G培养中则没有，这表明大多数这些酶的产生都受到木材的促进，而部分被葡萄糖抑制（补充表S3））。碳水化合物酯酶（CE），尤其是乙酰木聚糖酯酶，也参与半纤维素的降解。回收了九种CE蛋白，这些蛋白可以分为五个家族（CE1，CE4，CE12，CE15和CE16）。如前述实施例，仅从含有W的培养物中回收了8个CE，而从含有G作为唯一碳源的培养物中仅回收了1个CE。与纤维素酶的情况一样，此处报道的数据表明半纤维素酶的分泌受W诱导，被G部分抑制。
然而，在α-半乳糖苷酶（GH27，裂解与甘露聚糖相连的半乳糖残基）和β-半乳糖苷酶（GH35，在某些半纤维素中裂解D-半乳糖残基）的情况下，观察到了不同的行为。两种酶家族均独立于碳源从所有培养物中回收。有趣的是，GH27的酶家族还表明α- Ñ在-acetylgalactosaminidase活性黑曲霉，这表明该家族的成员可以在比半纤维素降解的其它过程涉及30，31。
在植物的原代细胞壁中，嵌入纤维素网络的基质由果胶组成，果胶是富含半乳糖醛酸的多糖的高度水合的网络。多糖裂解酶（PLs）是降解这些成分的主要酶。的平菇分泌蛋白质包含PL1，3，4和8倍的酶家族，其主要是果胶酸和鼠李裂合酶。与纤维素酶和半纤维素酶的情况一样，虽然WG培养液的丰度较低，但在W培养液中PL的含量较高（补充表S2）。）。PL1和PL3（果胶酸裂解酶）和PL4（鼠李糖半乳糖醛酸酶）被确定为W培养物中分泌最丰富的蛋白质。GH16、28、62、78、79、88和105以及CE 8、12也参与了果胶降解，并在P. ostreatus分泌组中鉴定出。
分泌组中鉴定出的第二大组蛋白质是由功能未知的蛋白质形成的。本节对58种蛋白质进行了分类，其中包括24种，回收了两个等位基因。编码具有未知功能的蛋白质的基因代表的bioinfosecretome 37％平菇，和它们占编码用于靶向用于其它参考培养条件分泌蛋白质的基因的转录的50％以上13。在这里研究的分泌组中，未知蛋白质占回收的总蛋白质的21％。这些蛋白质没有显示碳源依赖性模式（补充表S3），并且对于其中大多数而言，这两个等位基因是从dkN001中回收的。在dkN001中没有表达任何原核生物特异性蛋白，但在mkPC9和/或mkPC15中没有表达。但是，仅在单核中发现了34种蛋白质（占该蛋白质组的58.6％），而在dkN001中则没有。此外，仅从mkPC15中回收了23种单核生物特异蛋白。该值代表该研究中鉴定的mkPC15分泌组的11％。
尽管三个菌株在G和WG培养基中分泌的氧化还原酶的数量略高，但所有碳素培养物中均回收了29种不同的氧化还原蛋白，而与碳源无关（图 3，补充表S3）。这些酶的单核和双核的分泌方式没有观察到差异。分泌的氧化还原蛋白可以进一步分类为不同的家族，其中氨基酸组中的AA5，AA3和铜氧化还原蛋白含量更高。在本文分析的几乎所有培养基中都发现高浓度的铜自由基氧化酶（AA5）。乙二醛氧化酶，一种产生过氧化物的酶，是该CAZy家族研究最深入的代表32。连同葡萄糖-甲醇-胆碱芳基-醇氧化酶（包括在AA3家族中），这些酶可以为真菌木材腐烂提供细胞外过氧化氢，这是由II类过氧化物酶32进行的。AA5酶是真菌培养物中非常常见的酶，最近已报道其具有广泛的底物范围33，这解释了该CAZy家族在P. ostreatus分泌基因组中的普遍性。在所有菌株和培养条件下也发现了含铜氧还蛋白域的蛋白质。铜氧还蛋白参与分子间电子转移反应，并存在于漆酶和其他多铜氧化酶中，它们在其序列中含有三个这些结构域34。
已知属于该RedOx分类的几种酶，例如属于AA1和AA2 CAZy类的酶，具有降解或修饰木质素的能力。AA1酶是包括漆酶，亚铁氧化酶和多铜氧化酶的多铜氧化酶。AA2族包含II类木质素修饰过氧化物酶，包括锰过氧化物酶，通用过氧化物酶和木质素过氧化物酶。
漆酶（AA1_1）的检测值得特别提及，因为这些蛋白已在白腐真菌中广泛研究。在这些分析中，在基因组的12个基因中只有两个漆酶Lacc2（POXA3）和Lacc10（POXC）被鉴定出来（补充表S2）。从W和WG dkN001和mkPC9培养物中回收了Lacc2。Lacc10仅从含有W作为唯一碳源的dkN001和mkPC9中回收。在mkPC15培养物中未检测到漆酶。Castanera等。14和Alfaro等。13发现在小麦秸秆提取物引起的振荡培养中，Lacc2和Lacc10是漆酶活性的主要来源。Fernández-Fueyo等。35还确定了Lacc10是在麦草或杨木片上生长的mkPC9分泌蛋白组中最丰富的。在其他系统中，例如Phlebia radiata 36分泌组，无论碳源如何，都发现了漆酶，这表明除了木质素降解之外，漆酶在其他功能（从蘑菇发育到真菌/宿主相互作用和胁迫防御）中的重要性37。
纤维二糖脱氢酶CDH（AA8 / AA3_1）是最近发现的LPMO 29降解纤维素的途径中的关键酶。尽管没有煤层气，它仍能与纤维素表面结合并氧化纤维二糖38。存在于P. ostreatus基因组中的唯一基因具有用于分泌的信号肽，并且仅在含木材的培养基（W）中发现了相应的肽，这与其功能相符。
在P. ostreatus分泌基因组中已鉴定出P. ostreatus基因组中编码可溶性喹蛋白葡萄糖/山梨糖醇脱氢酶的独特基因的两个等位基因。在发现这些蛋白质对单糖的氧化活性之后，创建了一个新的CAZy家族（AA12）39。像CDH一样，AA12酶包含一个细胞色素结构域，可以将电子转移至LPMO 29以使纤维素降解，并且还具有一个CBM1域，该结构域可能与它们对不溶性纤维素的结合亲和力有关，表明在细胞外氧化降解中的作用类似于CDH纤维素39。
总之，这些发现突出了多糖与植物材料中木质素生物降解之间的联系。木质素降解的产物可以充当纤维素降解LPMO的电子供体，将整个木质纤维素真菌的降解过程联系在一起。
在分泌组（补充表S2）中鉴定出26种不同的蛋白酶，包括丝氨酸肽酶S8，S9，S10，S28，S33和S41和金属肽酶M28，M35，M36和M43。菌株dkN001和mkPC15比mkPC9分泌更多的蛋白酶（图 3）。在研究的单核体中（G培养物中较高），分泌的蛋白酶的数量似乎对碳源的反应与在双核体中（W中较高）的对碳源的反应不同（补充表S3）。蛋白酶在菌丝生长过程中的真菌细胞壁重组和降解中发挥作用，以回收必需营养素36。这些酶的主要功能可能是在氮有限的木材环境中分解有机物质蛋白质而获得氮。40。如 P. ostreatus 41和 P. radiata 36所示，分泌的蛋白酶还可在调节细胞外培养基中真菌酶的数量中发挥作用。
分泌组分析分析发现了五种cerato-platanin样蛋白。这些蛋白质之一存在于三种菌株和三种培养条件中。cerato-platanins是小的分泌的防御蛋白，其功能尚不完全清楚。一些作者将它们与在我们的分泌组分析中也检测到的弹性蛋白相关。Alfaro等。13还发现，cerato-platanins在摇动培养物中能被主动转录，尤其是通过mkPC15菌株。在这里，我们发现dkN001也是强有力的cerato-platanin生产商。
摇动培养中的白腐真菌P. ostreatu s的分泌组显示，木材诱导了参与纤维素和半纤维素降解的酶的分泌，并被葡萄糖抑制。这是一种选择性调节机制，因为其他酶系统（例如氧化还原酶（包括漆酶）和蛋白酶）不受碳源的影响。此外，在木材中存在时，分泌组的复杂性高于在葡萄糖中存在的组，并且这种复杂性似乎与双核病状况无关，而与每种菌株的遗传特征有关。
将P. ostreatus菌株dkN001（dikaryon），mkPC9和mkPC15（monokaryons）的培养物置于麦芽琼脂培养基（20 g / l麦芽提取物和15 g / l琼脂）中于黑暗中保存。将白杨切碎成大约1-5×0.5×1 mm的颗粒，并在80°C下干燥三天（水分含量为4.4％，水分含量为4.2％）。
使用三个直径为10毫米的一周龄琼脂培养物接种100毫升含SMY培养基（蔗糖10 g / l，麦芽提取物10 g / l，酵母提取物4 g / l）的液体预培养物。在下述条件下生长五天后，使用尼龙滤纸用无菌水将菌丝体洗涤一次，然后重悬于200 ml无菌水中。将菌丝体以8,000 rpm匀浆15 s（Ultraturrax T25，Janke＆Kunkel，IKA Labortechnik，德国施陶芬），将3 ml等分试样用作150 ml实验培养物的接种物。所有实验均在含有0.1 g / l Na 2 B 4 O 7 ·H 2 O，0.07 g / l ZnSO 4 ·7H 2 O，0.01 g / l CuSO的液体介质中进行。4 ·5H 2 O，为0.01g /升的MnSO 4 ·4H 2 O，为0.01g /升的FeSO 4 ·4H 2 O，和0.01克/升，（NH 4）6沫7 Ò 2 ·4H 2 O的培养根据每个实验的要求，向培养基中添加葡萄糖（4 g / l）和/或木材（4 g / l）。将所有培养物在黑暗中边摇动（130 rpm）边在24°C下孵育14天。
总蛋白浓度通过使用Pierce（Thermo Scientific，Bonn，Germany）的即用型Bradford试剂通过Coomassie Plus分析法进行测量。使用Ultrapure BSA（德国盖堡的GERBU Biochemicals）作为校准标准。在处理之前，将来自真菌培养上清液的新鲜样品以13,000 g离心10分钟。用纯水稀释溶解在电泳缓冲液中的浓缩蛋白质样品，以适合测量范围，并将缓冲液成分的浓度降低到低于蛋白质测定的干扰极限。
通过1号Whatman滤纸过滤，将含有细胞外蛋白的培养上清液与菌丝体分离，并在− 20°C下冷冻过夜。解冻样品后，通过在4°C下以13,000 g离心60分钟除去不溶的多糖，并再次冷冻上清液。合并来自八个平行培养物的经处理的上清液，并通过冷冻干燥浓缩蛋白质。
将冷冻干燥的样品溶于100 ml蒸馏水中，并以4,000 g离心30分钟。除去未溶解的碎屑后，将SDS，氯化钠和脱氧胆酸钠分别添加到样品中，最终浓度分别为1％（w / v），1 M和0.05％（w / v）42。加入三氯乙酸（TCA）和磷钨酸使沉淀的蛋白质沉淀43。第一步，从100％TCA储备溶液中添加TCA，该溶液在45.4 ml水中包含100 g TCA，以获得10％的最终TCA浓度。混合后，将样品置于冰上30分钟。此后，从10％（w / v）的水溶液中加入磷钨酸至终浓度为0.5％。将样品充分混合并在冰上放置过夜。通过以25,000 g离心30分钟收集沉淀的蛋白质，并通过随后用冰冷的20％Tris-缓冲液（50 mM，pH 7.5）的丙酮（体积/体积）洗涤除去沉淀剂。在大多数情况下，需要三个洗涤步骤才能从蛋白质沉淀中去除三氯乙酸44。最后，蛋白质样品用纯的，冰冷的丙酮洗涤，风干，然后保存在− 20°C进行进一步处理。将回收的蛋白质溶解在100 mM碳酸氢铵中，并使用考马斯试剂（Pierce，Germany）测定总蛋白质量。
如前所述，用胰蛋白酶按照两个步骤消化蛋白质45。简而言之，使用测序级胰蛋白酶（Promega，曼海姆，德国）以1:40（w / w）的酶与底物比例消化每个实验中溶解在100 mM碳酸氢铵中的，包含约500μg蛋白质的等分试样（三个重复）。 ）在37°C下放置16小时。此后，样品中的蛋白质用1,4- DL-二硫苏糖醇（DTT）[5 mM）和三-（2-羧乙基）膦]（TCEP，5 mM）还原，并用碘乙酰胺（15 mM）烷基化。加入新量的胰蛋白酶（酶与底物的比例为1:50）后，将样品在58°C下再次消化60分钟46。消化的肽用C18 Sep-Pak柱（Waters，Milford MA）脱盐，并在真空离心机中干燥。将样品溶于20 mM甲酸铵（pH 10）中，并使用BCA蛋白试剂（Pierce，德国）用胰蛋白酶牛血清白蛋白（BSA）消化液校准，测定总肽量。
首先使用Reprosil Gold 3 µm C18色谱柱（150×2 mm； Maisch GmbH，德国Ammerbuch博士）在10 47的pH下将消化的肽分级。使用乙腈在20 mM甲酸铵（pH 10）中的线性梯度，分离在300μl甲酸铵中具有300μg肽的样品。收集25个馏分，在真空离心机中干燥，并保存在− 20°C。
使用电喷雾电离（ESI）装置连接到Esquire 3000离子阱质谱仪（Bruker-Daltonic，德国不来梅）的1100 HPLC（LC-MS / MS）进行肽分析。将25种收集到的肽级分中的每一种溶于10μl5％（vol / vol）甲酸中，并将每种样品4μl上样到装有3μmReprosil-Pur C18-AQ（Dr （德国Ammerbuch的Maisch GmbH）用98％的溶剂A（在水中的0.1％甲酸）和2％的溶剂B（在90％的乙腈中的0.1％甲酸）进行处理。在以2μl/ min等度洗脱20分钟后，使用溶剂B的梯度洗脱肽：5分钟内15％，90分钟内40％，5分钟内50％和5分钟内90％。
质谱仪设置为获取两个最丰富的前体离子的四个质谱平均值（200–1,500亩）和四个MS / MS光谱平均值（200–3,000亩）。动态排除设置为非单电荷前体离子，排除时间为1分钟。通过DataAnalysis（V. 3.0。Bruker Daltonic，不来梅，德国）提取MS / MS光谱，并使用Mascot（V. 2.4，Matrix Science，伦敦，英国）鉴定肽。目标数据库是从带注释的基因组构造平菇 mkPC15和mkPC9（https://genome.jgi.doe.gov/PleosPC15_2，https://genome.jgi.doe.gov/PleosPC9_1）和SwissProt数据库。相对于诱饵数据库，将肽鉴定值调整为1％的错误发现率（FDR）。所有搜索均以胰蛋白酶消化的形式进行，允许进行一次缺失切割，并固定半胱氨酸的氨基甲酰甲基化和蛋氨酸的可变氧化。MS和MS / MS质谱图的质量公差分别设置为1.4 Da和0.4 Da。从原始DAT文件中提取吉祥物结果，并将其传输到SQL数据库（Microsoft SQL Server 2005）。使用SQL查询来提取具有至少两个分数高于相应身份分数的肽的蛋白质。在补充表S2中，MUDPit得分是MASCOT程序给出的蛋白质得分；所有非重复肽的离子分数之和超过同源性阈值。如果有重复的肽段，则使用得分最高的肽段。emPAI值是通过使用emPAI算法48的MASCOT程序计算的。在SignalP列中，我们使用SignalP程序49注释是否存在要分泌的信号肽。
我们使用3,5-二硝基水杨酸（DNSA）方法测量真菌培养14天期间的葡萄糖消耗。在第0、3、6、9、12和14 50天对9种不同培养基中的每一种进行了3次生物学复制。
在当前研究期间生成和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。
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