单抗特性的鉴定-杂交瘤细胞的染色体分析

单抗特性的鉴定-杂交瘤细胞的染色体分析

单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。

对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。

检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下：

a. 在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代。

b. 秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最终浓度为0.1-0.4ug/ml（若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02-0.05ug/ml）；继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min 10分钟，弃上清。

c. 加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟。

d. 向悬液中加入新配制的固定液（甲醇与冰醋酸3：1混合）1ml，混匀，然后1000r/min 10分钟，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。

e. 加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min 10分钟，弃去上清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。

f. 取出离心管，1000r/min 5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。

g. 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。

h. 镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。