1,2：5,6-二氢半乳糖醇（DAG）是一种双功能DNA靶向剂，目前正在II期临床试验中用于治疗替莫唑胺抗性胶质母细胞瘤（GBM）。在本研究中，我们调查了DAG单独或与普通化疗药物联合使用对GBM和前列腺癌（PCa）细胞的细胞毒性活性，并确定了DNA修复途径对DAG诱导的细胞毒性的影响。我们发现DAG产生了以RPA32，RAD51和γH2AX焦点修饰的复制依赖性DNA损伤。DAG诱导的细胞毒性不受MLH1，MSH2和DNA-PK表达的影响，但可通过敲低BRCA1来增强。在S期中，DAG在GBM，PCa和肺癌细胞中表现出与拓扑异构酶I（喜树碱和伊立替康）和拓扑异构酶II（依托泊苷）中毒的选择性协同作用，而未观察到多西他赛协同作用。重要的是，DAG联合伊立替康治疗可增强肿瘤反应并延长荷瘤小鼠的生存期。这项工作提供了对GBM和PCa细胞中DAG细胞毒性的机制性见解，并为在未来的临床试验中探索与拓扑异构酶I / II毒药联合治疗提供了合理的理由。
多形胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见，最具侵略性的原发性恶性脑肿瘤1。对于新诊断的GBM患者，当前的护理标准包括手术切除，伴有替莫唑胺烷基化剂（TMZ）的放疗以及之后的辅助TMZ治疗2。虽然这些治疗提高总生存期，几乎所有的患者经历TMZ性和肿瘤复发，因此GBM患者的预后仍然很差用的12-15个月的中位生存时间2，3。1,2：5,6-二氢半乳糖醇（DAG）是一种双功能DNA靶向剂，可引起N 7-鸟嘌呤烷基化和链间交联4。它是一种小的水溶性试剂，可以很容易地穿过血脑屏障5。最近，在GBM临床试验中已对DAG进行了测试，并显示了其单独或与放射疗法联合使用的活性6。然而，为了进一步改善临床上GBM治疗策略的结果，需要对DAG细胞毒性和细胞存活机制的详细了解。
前列腺癌（PCa）是北美男性中最常被诊断出的癌症，六分之一的男性在其一生中的某个时候患有PCa。PCa是继恶性肿瘤之后男性恶性肿瘤相关死亡率的第二大诱因7。PCa的治疗策略因癌症类型和等级，转移状态，患者年龄以及以前的治疗方法而异。通常通过主动监视，手术和放射疗法来控制局限性前列腺疾病。对于晚期或转移性PCa，除放射治疗外，通常还包括雄激素剥夺治疗8。然而，中位数为缓解14-30个月后，多数谁收到去势抵抗性前列腺癌（CRPC）雄激素剥夺治疗进展高危患者8，9，10。目前，紫杉烷类（多西他赛）加泼尼松是CRPC患者的一线化疗，但几乎所有CRPC患者在最终复发或之后不久紫杉类为基础的化疗11，12。因此，迫切需要新颖的治疗策略来克服耐药性挑战并提高CRPC患者的生存率。
拓扑异构酶是控制DNA超螺旋和缠结的核酶，它们在细胞中DNA复制，转录和基因组稳定性中起着至关重要的作用13。DNA拓扑异构酶有两种类型。拓扑异构酶I在DNA中产生单链断裂，拓扑异构酶II切断两条DNA链，以松弛超螺旋并解决染色质的拓扑问题。切割和解开后，这些酶重新结扎切割木片以重新建立完整的DNA结构14，15。
拓扑异构酶毒物是化学治疗剂的独特类别。他们阻断拓扑异构酶的连接功能，导致形成具有单，双链断裂（DNA双链断裂）稳定拓扑异构酶切割的DNA复合物，最终触发细胞凋亡和其他类型的细胞死亡的15，16。拓扑异构酶毒物在实体瘤的治疗中通常使用的，并显示根据肿瘤类型的各种功效17，18，19，20。拓扑异构酶II毒药米托蒽醌在1996年被FDA批准用于PCa的治疗，一些研究表明，拓扑异构酶II毒依托泊苷联合治疗CRPC患者的临床益处15，21，22。使用拓扑异构酶I毒药与复发性GBM患者的治疗贝伐单抗和/或TMZ联合伊立替康最近的临床试验证明适度的有效性和耐受性 23，24。
在本研究中，我们询问了DAG治疗后在GBM和PCa细胞中激活的DNA损伤应答途径，目的是发现潜在的联合治疗机会。通过此分析，我们随后调查了DAG与拓扑异构酶I毒物（喜树碱和伊立替康），拓扑异构酶II毒物（依托泊苷）和微管解聚抑制剂（多西他赛）联合使用时的细胞毒性活性。
以前已证明DAG对肺癌细胞具有细胞毒性作用25。为了研究DAG在GBM和PCa细胞中是否发挥相似的细胞毒性活性，我们测试了DAG的细胞毒性并确定了两个GBM和四个PCa细胞系中的半数抑制浓度（IC 50）值，其中PC-3-DR对多西他赛26。用10μMDAG处理GBM和PCa细胞72小时均引起可见的形态变化并降低细胞密度（图1a）。用不同浓度的DAG处理72小时的细胞活力分析显示，所有细胞系中浓度依赖性的存活率降低，且相应的IC 50值在低µm范围内（图1b，c）。总之，这些数据证明了DAG在GBM和PCa细胞系中的细胞毒活性。
将 M059K和PC-3细胞在完全培养基中加入或不加入 10μMDAG的溶液处理72小时。显示了代表性的明场图像，比例尺代表100μm。b，c用不同浓度的DAG（0，50 nM，100 nM，500）处理两个GBM（M059K和M059J）和四个PCa（PC-3，LNCaP，DU-145和PC-3-DR）细胞系在96孔培养板中培养72小时（nM，1μM，2.5μM，5μM，10μM，25μM，50μM，100μM和200μM）。处理后，进行结晶紫测定并测定IC 50通过使用GraphPad Prism 6将S型剂量响应曲线拟合到数据来计算每个细胞系的DAG值。曲线上的数据表示为平均值±标准差。对每个细胞系进行三个单独的实验。
接下来，我们在流式细胞仪检测DAG处理后的碘化丙啶（PI）染色的M059K和PC-3细胞中的细胞周期进程。首先通过24小时血清饥饿块使细胞在G 0 / G 1细胞周期阶段同步。此后，通过添加具有或不具有5μMDAG的完全培养基，然后通过流式细胞仪分析，将细胞从G 0 / G 1嵌段中释放出来。与在完全培养基中培养后以正常细胞周期模式发展的未处理细胞相比，DAG处理的细胞在添加血清后19小时开始表现出强烈的时间依赖性S / G 2期细胞周期阻滞（图2a，b），表明DAG介导的细胞毒性取决于这些细胞中的DNA复制。由于细胞周期蛋白A仅在S和G 2细胞周期第27期表达，并且磷酸组蛋白H2AX（ɣH2AX）被广泛用作DNA DSB 28的替代标记，因此我们接下来使用免疫荧光（IF）染色检查了细胞周期蛋白A2和ɣH2AX的表达。在完全培养基中进行或不进行DAG脉冲处理（50μMDAG 1小时）的血清饥饿PC-3细胞。PC-3细胞在DAG脉冲处理后表现出强烈的细胞周期蛋白A2（绿色）和ɣH2AX（红色）表达，随后在不使用药物的情况下恢复24小时（DAG 1小时+ WO 24小时）（图2c）。）。DAG处理后，经过24 h洗脱（DAG 1 h + WO 24 h），细胞周期蛋白A2 + /ɣH2AX+细胞数量显着增加（图2d），表明DAG诱导的DNA DSB 在这些细胞的S / G 2细胞周期阶段细胞。中性彗星试验证实了这一点，该试验检测了在PC-3和M059K细胞中DAG脉冲处理，24小时冲洗或连续处理48小时后产生的大量DSB（图2e，f；补充图S1）。）。为了进一步证实我们的观察结果，在有血清或无血清的培养基中使用不同浓度的DAG进行了细胞存活分析。在PC-3和M059K细胞中，血清剥夺阻止了细胞进入S期，从而使细胞摆脱了DAG诱导的细胞毒性作用（图2g，h）。总之，这些数据证实DAG诱导的DNA链间交联导致癌细胞中复制依赖性DNA损伤。
a，b血清饥饿（ST持续24 h）的M059K和PC-3细胞在有或无5μMDAG的完全培养基中处理指定的时间。然后按照“材料和方法”中所述使用PI染色收集细胞进行细胞周期分析。显示了来自两个单独实验的代表性流式细胞术直方图，以及在G 0 / G 1，S和G 2 / M期的相应细胞群百分比。c PC-3电池以G 0 / G 1同步在完全培养基中用50μMDAG处理1小时之前，先进行24小时血清饥饿治疗。处理后，除去DAG，并将细胞继续在完全培养基中孵育另外24小时（DAG 1小时+ WO 24小时）。WO代表冲刷。之后，将细胞固定，透化并用抗细胞周期蛋白A2（绿色）和抗ɣH2AX（红色）抗体免疫染色。有代表性的IF图像来自两个独立的实验。比例尺代表10μm。d根据c中的每个实验条件，我们检查了100-120个细胞，并计算出细胞周期蛋白A2- /ɣH2AX-（双阴性）和细胞周期蛋白A2 + /ɣH2AX+（双阳性）的细胞百分比。相应的统计分析示出了显着性（** p ≤0.01; *** p ≤0.001）。将 PC-3和M059K细胞分别用20μMDAG处理48 h或50μMDAG处理1 h（在静止的细胞中经过24 h血清饥饿），然后在无药物的完全培养基中孵育24 h（DAG 1 h + WO） 24小时）。通过中性彗星测定法分析了DSB，并显示了代表性图像。比例尺代表50μm。˚F从50-100的细胞在每个实验条件下尾矩Ê通过使用ImageJ进行分析（OpenComet）软件和示出了显着性比较对于未处理的细胞（** p ≤0.01; **** p ≤0.0001）。克，ħ将PC-3或M059K细胞接种在96孔板中，并在缺乏血清的培养基或完全培养基中培养24小时。然后用不同浓度的DAG处理细胞72小时，然后进行结晶紫测定。与未治疗条件相比的细胞存活率显示为平均值±标准偏差。
在真核细胞中，有两种主要途径可促进DNA中DSB的修复，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK），一种核丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对于NHEJ修复活性是必不可少的29。DNA-PK由两个主要成分组成，一个环状的Ku 70/80异二聚体和一个460-kD DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PK CS）30。源自同一肿瘤标本的两种人GBM细胞系M059K和M059J显示不同的DNA-PK活性。尽管M059K细胞表达正常水平的DNA-PK，具有NHEJ能力，并且对辐射具有抵抗力，但M059J细胞缺乏DNA-PK，具有NHEJ缺陷，对辐射更敏感31，32岁。因此，这两个细胞系通常被用作模型系统用于研究参与NHEJ 33，34，35。为了研究NHEJ途径是否可能有助于修复DAG诱导的DNA DSB，我们评估了DAG在M059K和M059J细胞中的细胞毒性作用。这两个细胞系之间的细胞存活率相当（图1b），这表明NHEJ途径对于应付DAG诱导的DNA损伤不是必需的。
在肺癌中，DAG诱导的DNA DSB主要通过HR通路25修复。为了确定HR在GBM和PCa细胞中DAG诱导的DNA损伤的修复中是否也起作用，我们进行了蛋白质印迹分析，以检查PC-3和M059K细胞在DAG处理后，HR通路中涉及的DNA DSB传感器和效应子。始终如一的是，DAG脉冲处理随后在完全培养基中恢复20–24 h，在PC-3和M059K细胞中诱导了关键的HR介质的磷酸化，包括共济失调的毛细血管扩张突变激酶（ATM），Chk1，Chk2和RPA32（图。图3a）36，37，38，39。ɣH2AX表达的增加再次证实了DAG处理后DNA DSB的存在（图3a）。为了进一步证实这一机制，通过共聚焦显微镜检查了PC-3细胞是否将主要的HR修复蛋白（包括BRCA1，RPA32和Rad51 39）募集到DAG处理诱导的ɣH2AX病灶中，然后在24小时内不暴露药物的情况下进行了恢复（图。3b）。在BRCA1，RPA32，Rad51和ɣH2AX病灶之间检测到共定位具有统计学意义（图3c）。正如我们的数据表明，HR修复途径参与了对DAG的DNA损伤反应，我们预测缺乏HR的GBM和PCa细胞将对DAG治疗高度敏感。为了研究这一点，我们撞倒BRCA1，在HR途径的关键组成部分40，41，和重估敏感性DAG。在PC-3和M059K细胞中使用三种不重叠的siRNA进行BRCA1敲低显着提高了对DAG处理的敏感性（图3d，e）。这些结果表明，HR参与了GBM和PCa细胞中DAG诱导的DNA DSB的解析。
一个 PC-3和M059K细胞在g同步0 / G 1相血清饥饿24小时。将静止细胞用50μMDAG处理1 h，然后冲洗，并在完全培养基中再孵育0、20、24或48 h。然后通过来自三个独立实验的蛋白质印迹分析细胞裂解液的HR介体。b静态PC-3细胞用50μMDAG处理1 h，然后在无药物的情况下孵育24 h。通过细胞骨架缓冲液对细胞进行预提取，固定，透化，并用相应的抗体探测指定的蛋白质。从三个独立的实验中显示了代表性的共焦图像。比例尺代表5μm。c PC-3（80–150个细胞），来自b为病灶阳性细胞与统计分析进行定量（** p ≤0.01; *** p ≤0.001）。d，ê PC-3或M059K细胞使用非重叠的BRCA1靶向的siRNA（B1通过瞬时转染敲BRCA1下来，siBRCA1-2; B2，siBRCA1-14; B3，siBRCA1-25; B4，siBRCA1-15;或B5，siBRCA1-17）。阴性对照siRNA（C）也包括在内。转染24小时后，将细胞用不同浓度的DAG（0、100 nM，500 nM，1μM，1.5μM，2.5μM，5μM，10μM，25μM，50μM，100μM和200μM）处理）5天，然后进行结晶紫测定。IC 50被使用GraphPad Prism 6.数据计算在控制DAG的值或BRCA1敲除细胞被呈现为平均值±标准偏差从具有统计学意义的三个独立实验（* p ≤0.05; ** p ≤0.01）。在平行的蛋白质印迹分析中证实了BRCA1敲低。f从两对同基因的大肠癌细胞系中提取细胞裂解液。Western印迹分析表明，来自三个独立实验的MLH1和MSH2分别在HCT116-PS-MLH1和LoVo-PS-MSH2细胞中表达。G用不同浓度的DAG处理两对同基因的大肠癌细胞3天，然后进行结晶紫测定。曲线中的数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。
TMZ通常用作一线化疗GBM患者2，42，但TMZ阻力仍然在诊所的关键挑战。TMZ是一种单官能烷基化剂，可通过O 6-甲基鸟嘌呤43诱导DNA损伤。O 6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）修复了这类DNA损伤，这是GBM治疗中TMZ耐药的主要机制，影响了大多数GBM患者44。当GBM单元中不存在MGMT时，O 6-甲基鸟嘌呤触发的碱基错配激活错配修复（MMR）途径。然而，在TMZ烷基化导致DNA链断裂并最终细胞死亡的MMR修复的重复故障45，46，47。因此，在MGMT阴性肿瘤，MMR不足变得用于治疗GBM TMZ电阻的二次机构47，48。此外，据报道，MMR缺乏症在许多其他恶性疾病（例如肺癌，膀胱癌，结直肠癌和卵巢癌）的治疗中也介导了铂耐药性49。先前的研究表明，DAG治疗对MGMT阳性和阴性GBM细胞均有效，这表明DAG可能能够规避MGMT介导的TMZ耐药性6。真核细胞包含几种负责MMR活性的蛋白质，其中MLH1和MSH2蛋白是不同异二聚体（MLH1-PMS2，MLH1-PMS1，MLH1-MLH3，MSH2-MSH6，MSH2-MSH3）的关键成分，这些蛋白质决定了底物的特异性和细胞功能50，51，52，53。为了研究DAG是否可以绕过TMZ耐药性，MMR的次级机制，我们生成了MLH1缺陷型HCT116-PS100092和MSH2缺陷型LoVo-PS100092细胞，以及它们的同基因MLH1缺陷型HCT116-PS-MLH1和MSH2缺陷型LoVo-PS -MSH2细胞分别通过慢病毒转导相应的MLH1和MSH2基因。蛋白质印迹分析证实了HCT116-PS-MLH1和LoVo-PS-MSH2细胞中MLH1和MSH2的表达（图3f）。用DAG处理72小时在这两对同基因细胞系中诱导了相当的毒性（图3g），提示MLH1和MSH2在DAG诱导的DNA损伤的修复中并不特别重要。总之，这些数据支持以下观点：HR是DAG诱导的链间交联激活的主要DNA修复机制，并促进DAG成为治疗HR缺乏症患者的候选化学疗法。
DAG 在细胞周期的S / G 2期诱导的细胞毒性提示DAG可能与其他机械上不重叠的S期靶向剂（例如拓扑异构酶毒物）协同作用。为了对此进行研究，我们用DAG联合依托泊苷，伊立替康或喜树碱处理了癌细胞。根据Chou–Talalay方法54，确定了组合指数（CI）值以评估每种组合的效果是协同作用还是累加作用。CI值<1表示协同作用；CI值= 1表示累加效果；CI值> 1表示拮抗作用54。在所示的摩尔比下，DAG和依托泊苷的联合处理显示，M059K细胞在ED60，ED75和ED90处的CI值分别为0.81、0.62和0.42。和在ED50，ED75，和0.58，0.48，和0.42，分别ED90，在PC-3细胞（表CI值1，2）。在所示的摩尔比下，DAG和伊立替康的联合处理显示，M059K细胞在ED50，ED75和ED90处的CI值分别为0.78、0.63和0.53。和在ED75，ED85，和0.78，0.59，和0.49，分别ED90，在PC-3细胞（表CI值1，2）。在指定的摩尔比下，DAG和喜树碱的组合在PC-3细胞中的ED75，ED90和ED95的CI值分别为0.68、0.59和0.54（表2））。此外，我们还在先前研究中使用的肺癌细胞系A549中测试了DAG与依托泊苷或喜树碱的联合治疗。实际上，在指示的细胞毒性作用（Fa）水平下，A549中的这些组合还显示出CI值＜1的协同作用（表3）。
基于我们的发现，DAG在细胞周期的S期起作用，我们预测DAG与在细胞周期的有丝分裂M期起作用的化学治疗剂（如紫杉烷）联合使用时，几乎没有协同作用。该假设的基本原理是，靶向M期的药物将阻止细胞进入发展DAG诱导的DNA损伤和细胞毒性所需的S期。紫杉烷与微管结合并阻止这些结构发生M相允许的解聚。因此，紫杉烷是一类有丝分裂抑制剂，在细胞周期的M期停滞的细胞生长55，56。为了检验我们的假设，我们在癌细胞中使用DAG和多西紫杉醇进行了联合治疗，然后确定CI值。数据证实在两种M059K和PC-3细胞系（表DAG和多西紫杉醇治疗的我们的假设（CI值> 1）1，2）。结合起来，这些数据表明将DAG治疗与S期特异性化疗药物联合使用的潜在益处，但不能与抑制细胞发展为S期的药物联合使用。
为了评估体内的联合作用，我们将PC-3肿瘤皮下植入裸鼠，并通过腹膜内注射DAG和/或伊立替康对其进行治疗。为了模拟在联合治疗方案中采用交替单药治疗的相关临床治疗方案，对小鼠分别用磷酸盐缓冲盐水（PBS；溶媒），DAG（2.5 mg / kg，第1、3、5天）治疗每周3周），伊立替康（25 mg / kg，第4天，每周一次，共6周）或DAG（第1、3、5天）联合伊立替康（第4天）。与仅使用任何一种药物进行治疗相比，DAG和伊立替康的组合可显着减少小鼠的肿瘤生长并改善其存活率，且无毒性迹象（图4a–c）。这些结果支持这样的想法，即在临床环境中与拓扑异构酶毒物联合治疗可能会增强DAG的治疗效果。
将 PC-3细胞接种到裸鼠的右胁腹，并按照“材料和方法”中所述用PBS，DAG，伊立替康或DAG加伊立替康进行处理。肿瘤体积表示为平均值±平均值的标准误。治疗有效性通过ANOVA分析肿瘤成长曲线（29天后）对各组的斜率进行比较评估（* p ≤0.05; *** p ≤0.001; **** p ≤0.0001）。b体重监测在四组小鼠的一个。Ç四组小鼠的存活率的Kaplan-Meier曲线一个。** p ≤0.01。
DNA链间交联使细胞停滞在复制叉处，并防止双链分离，最终导致DSB 57。DAG诱导的DSB触发复制依赖性S / G 2期细胞周期停滞并激活癌细胞中HR DNA损伤修复途径。DNA损伤触发多种激酶的激活，包括磷酸肌醇3激酶相关的蛋白激酶家族成员ATM，ATR和DNA-PKcs 58。当DNA复制受阻时，尽管ATR激酶被单链DNA包被的RPA蛋白激活，但ATM被招募并主要通过Mre11-Rad50-Nbs1（MRN）传感器复合物的结合对DSB做出反应59。激活的ATM和ATR激酶触发了细胞中两个主要细胞周期检查点途径的编排，从而导致Chk2和Chk1激活。在ATM激酶下游有大量的局部底物和效应物，例如p53，H2AX，MRN复合物和Chk2激酶，共同参与控制细胞周期进程，基因转录和细胞凋亡60。激活的ATR触发多个目标（例如RPA32和Chk1 61）的磷酸化。另外，电离辐射诱导的Chk1的ATM依赖性活化丝氨酸317和丝氨酸345 62，63。在这种情况下，我们表明DAG治疗诱导ATM-Chk2和ATR-Chk1途径的激活。ATR-Chk1级联的激活可能是由于暴露单链DNA（ssDNA）的复制叉的失速，或归因于DAG诱导的DSB修复过程中末端切除产生的ssDNA。因此，在某些情况下，ATM-Chk2和ATR-Chk1介导的DNA损伤信号传导途径可能重叠。
两种或更多种用于癌症治疗的治疗剂的组合是临床中经常且成功使用的策略。与传统的单一疗法相比，联合疗法具有重要的优势。与来自联合疗法的协同或相加的抑制作用，肿瘤的靶向可以显著改善64，65，66。在这项研究中，DAG在癌细胞中显示了与拓扑异构酶毒物的协同作用。HR缺乏会增加癌细胞对DAG治疗的敏感性。PARP抑制剂在HR-缺陷的肿瘤，例如与BRCA突变相关的那些也显示活性67，68。因此，进一步探索将DAG与PARP抑制剂联合用于HR缺乏型癌症的治疗策略可能很有趣。同时，在组合方案中通常可以使用较低剂量的每种单独的药物，这可以降低治疗期间和治疗后不良反应的风险。相比于单疗法，联合治疗是药物抗性，因为较低的剂量，较少的治疗周期，和/或在癌症患者中，针对不同的信号传导途径的较不敏感64，69，70，71，72。在消除疾病复发发挥关键作用的癌症干细胞。此外，联合疗法也表现出优越性73，74，75。最近的一项研究表明，DAG在耐TMZ的GBM细胞和癌干细胞中均具有细胞毒活性76。TMZ是大多使N A DNA烷基化剂7 -鸟嘌呤甲基化，随后的其他靶向位点ö 6 -鸟嘌呤和O 3 -腺嘌呤在DNA 43，77。将O 6 -甲基鸟嘌呤病变治疗TMZ是高度细胞毒性的细胞，但可以通过本MGMT在大多数GBM肿瘤，在GBM患者的主要原因TMZ电阻一项所述的蛋白质被修复78，79。先前已证明DAG克服了GBM 6中 MGMT介导的抗性。本研究补充说，DAG似乎还规避了与MMR相关的耐药机制，即次生TMZ耐药机制。因此，DAG可能被证明是耐TMZ的GBM患者的理想治疗药物。此外，我们证明了PC-3细胞中DAG具有类似的细胞毒性作用和DAG的作用机理，这是雄激素非依赖性PCa 80的常用模型。因此，我们的数据表明使用DAG单独或与拓扑异构酶毒药联合使用可延迟或逆转PCa的发展的潜在益处。总之，我们的工作描述了GBM和PCa细胞对DAG治疗的反应，并为在未来的临床试验中探索与拓扑异构酶I / II毒药的联合疗法提供了合理的理由。
在补充有10％胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，11995065，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国）中培养人PCa细胞系PC-3和DU-145。在补充有10％FBS的Rosewell Park Memorial Institute 1640培养基（11875093，Thermo Fisher Scientific）中培养LNCaP细胞系。在具有10％FBS的DMEM / F-12培养基（11330032，Thermo Fisher Scientific）中培养人GBM细胞系M059K和M059J。HEK-293T（人上皮胚胎肾）细胞系购自Takara Bio USA Inc.（632180，美国加利福尼亚州山景城），并保存在DMEM加10％FBS中。人结直肠癌细胞系HCT116和LoVo购自ATCC（CCL-247和CCL-229，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。HCT116与10％FBS一起在McCoy的5 A培养基（30-2007，ATCC）中培养。LoVo保持在F-12K培养基（30-2004，ATCC）中，再加上10％的FBS。还在补充有10％FBS的DMEM中培养A549细胞。将细胞系保持在含5％CO的潮湿气氛中2在37°C并常规检测支原体。从液氮中解冻后，细胞恢复了两次传代，然后用于实验。DAG由DelMar Pharmaceuticals，Inc.（加拿大温哥华和美国加利福尼亚州门洛帕克）提供。依托泊苷，伊立替康，喜树碱和多西他赛购自Selleck Chemicals（美国德克萨斯州休斯顿）。PI溶液（1 mg / ml）和戊二醛溶液（I级，在H 2 O中为50％）购自MilliporeSigma（加拿大奥克维尔）。使用以下配方制备Sorenson溶液：9 mg柠檬酸三钠，195 ml 0.1 N HCl，500 ml 90％乙醇和305 ml蒸馏水。
将细胞接种在96孔培养板上，并在37℃下孵育过夜。然后将细胞用不同浓度的DAG处理72小时，然后在1％戊二醛溶液中固定5分钟。固定后，将细胞用蒸馏水洗涤3次，并用0.1％结晶紫溶液染色10分钟。然后，将细胞用蒸馏水轻轻冲洗，以从培养板上除去未染色的结晶紫色染料。空气干燥后，板上剩余的结晶紫染料完全溶解在Sorenson溶液中，并在BioTek Gen5微孔板读数器上测量560 nm波长的吸光度。确定与未处理的细胞相比处理后的存活细胞的百分比。
在完全培养基中用5μMDAG处理之前，通过24小时血清饥饿使细胞同步另外1、4、19、24、44和49 h。处理后，将细胞用胰蛋白酶消化并以1000 rpm离心5分钟。洗涤细胞沉淀并将其重悬于冷PBS中，然后在4℃下在70％乙醇中固定过夜。固定后，将细胞在4°C下以1500 rpm离心10分钟，并用冷PBS洗涤一次。然后，将细胞沉淀重悬于500μlPI溶液中，该溶液包含PBS中的50μg/ ml PI，100μg/ ml RNase A和0.05％Triton X-100，并在黑暗中于37°C孵育40分钟。之后，将细胞洗涤并重悬于500μl冷PBS中，并用40μm细胞过滤器过滤，然后使用流式细胞仪（FACS Canto II）检测DNA含量。G 0的细胞群体直方图使用FlowJo软件分析/ G 1，S和G 2 / M细胞周期阶段。平行地，包括未处理的细胞作为对照。
用指定的条件用或不用DAG处理后，收集细胞并以1×10 5重悬冷PBS（不含Ca ++和Mg ++）中的细胞数/ ml。按照制造商的规程，使用Trevigen CometAssay试剂盒（4252-040-K，Trevigen，Gaithersburg，MD，美国）进行中性彗星测定。将细胞与熔融的LMAgarose（在37°C下）以1:10（v / v）的比例混合，然后将200–400个细胞扩散到CometSlide的每个样本区域。将载玻片在黑暗中保持10分钟以进行胶凝，然后在4°C的裂解液中孵育过夜。之后，将载玻片在中性电泳缓冲液中于4°C在25 V下电泳45分钟，然后在室温下于DNA沉淀溶液中孵育30分钟。然后将玻片在70％乙醇中干燥30分钟，然后风干。SYBR Gold用于在黑暗中将载玻片染色30分钟。用水冲洗并风干后，用Zeiss AxioObserver显微镜观察玻片，并使用ImageJ（OpenComet）软件进行分析。尾矩表示为平均值±标准偏差。
用补充有PhosSTOP磷酸酶抑制剂和cOmplete蛋白酶抑制剂（MilliporeSigma，Oakville，Canada）的EBC缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，120 mM NaCl，1％NP-40，和1 mM乙二胺四乙酸; EDTA）裂解细胞。 。将细胞裂解物在4°C下以13,500 rpm离心15分钟。然后，按照生产商的说明，使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（23225，Thermo Fisher Scientific）测定蛋白质浓度。蛋白质在4-15％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（4561084，加拿大密西沙加的BioRad Laboratories Ltd.）上分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在含吐温20（TBST）的tris缓冲盐水中用5％牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时后，将膜与相应的一抗在4°C下孵育过夜。然后，将膜用TBST洗涤3次，每次10分钟，并与辣根过氧化物酶缀合的第二抗小鼠或抗兔抗体（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA）在室温下孵育1小时。之后，将膜用TBST洗涤3次，每次10分钟，并根据制造商的说明使用SuperSignal West Femto最大灵敏度底物（34095，Thermo Fisher Scientific）检测发光信号。使用了以下一级抗体：H2AX（Ser139）（2577，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）; H2AX（ab11175，Abcam，Toronto，Canada）; 磷酸ATM（Ser1981）（美国宾夕法尼亚州利默里克，Rockland Immunochemicals，Inc.，200-301-400，美国）；ATM（2873，信元信令技术）；磷酸-RPA32（Ser33）（A300–246A，Bethyl Laboratories，美国德克萨斯州蒙哥马利）；RPA32（ab2175，Abcam）; phospho-Chk1（Ser345）（2348，细胞信号技术）; phospho-Chk1（Ser317）（12302，细胞信号技术）; 磷酸-Chk2（Thr68）（2661，细胞信号技术）; BRCA1（NB100–404，美国，百年纪念，Novus Biologicals，美国）；MLH1（4256，信元信令技术）; MSH2（2017，细胞信号技术）; 和GAPDH（5174，Cell Signaling Technology）。从三个独立的实验中显示了代表性图像。
将细胞播种并在24孔培养板的完全培养基中的玻璃盖玻片上孵育16-20小时。血清剥夺24小时后，将同步细胞用或不用50μMDAG处理1小时，然后洗去药物并在完全培养基中再孵育24小时。然后将细胞用PBS洗涤一次，并在室温下用PBS中的4％多聚甲醛固定30分钟。为了共聚焦显微镜检测DNA损伤灶，按照以下配方在4°C下将细胞与细胞骨架缓冲液预孵育5分钟：25 mM HEPES，pH 7.4、50 mM NaCl，1 mM EDTA，3 mM MgCl 2，300 mM蔗糖和0.5％Triton X-100。然后，在室温下用PBS中的4％低聚甲醛固定细胞30分钟。固定后，将细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟，并用含0.5％Triton X-100的PBS渗透20分钟。再用PBS洗涤3次并在室温下用PBS中的3％BSA封闭1小时后，将细胞与指定的一抗在4°C下孵育过夜。然后，将细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟，并在室温下与荧光团标记的二抗孵育1小时。再用PBS洗涤三遍后，将带有细胞的盖玻片用Vectashield封固剂（含4'，6-二mid基-2-苯基吲哚）封固。图像通过Zeiss AxioObserver显微镜和共聚焦LSM-780显微镜捕获，并通过LSM-ZEN软件进行分析。使用了以下抗体：H2AX（2577，细胞信号技术）; 2H2AX（05-636，MilliporeSigma，Oakville，Canada）; cyclin A2（ab16726，Abcam）; BRCA1（ab16780，Abcam）; Rad51（H8349，圣克鲁斯生物技术）; RPA32（ab2175，Abcam）; 驴子抗兔Alexa-Fluor 594（A21207，Thermo Fisher Scientific）; 驴子抗兔Alexa-Fluor 488（A21206，Thermo Fisher Scientific）; 驴子抗小鼠Alexa-Fluor 594（A21203，Thermo Fisher Scientific）; 和驴子抗小鼠Alexa-Fluor 488（A21202，Thermo Fisher Scientific）。代表性的中频和共聚焦显微图像来自三个独立的实验。Abcam）；驴子抗兔Alexa-Fluor 594（A21207，Thermo Fisher Scientific）; 驴子抗兔Alexa-Fluor 488（A21206，Thermo Fisher Scientific）; 驴子抗小鼠Alexa-Fluor 594（A21203，Thermo Fisher Scientific）; 和驴子抗小鼠Alexa-Fluor 488（A21202，Thermo Fisher Scientific）。代表性的中频和共聚焦显微图像来自三个独立的实验。Abcam）；驴子抗兔Alexa-Fluor 594（A21207，Thermo Fisher Scientific）; 驴子抗兔Alexa-Fluor 488（A21206，Thermo Fisher Scientific）; 驴子抗小鼠Alexa-Fluor 594（A21203，Thermo Fisher Scientific）; 和驴子抗小鼠Alexa-Fluor 488（A21202，Thermo Fisher Scientific）。代表性的中频和共聚焦显微图像来自三个独立的实验。
使用Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（13778075，Thermo Fisher Scientific），按照制造商的操作规程，用对照siRNA或靶向BRCA1的siRNA转染PC-3或M059K细胞。转染24小时后，用胰蛋白酶消化细胞，然后将其接种在96孔板的完全培养基中。第二天，将转染的细胞用不同浓度的DAG处理5天，然后如前所述进行结晶紫测定。收集细胞裂解物，并通过蛋白质印迹分析蛋白质提取，以确认BRCA1敲低。所用的siRNA如下：C，siCon（462001，阴性对照培养基GC双链体，Invitrogen）。B1，siBRCA1-2（SI00096313，加拿大多伦多Qiagen）；B2，siBRCA1-14（SI02664361，恰根）；B3，siBRCA1-25（SI04381377，恰根）；B4，siBRCA1-15（SI02664368，恰根）；和B5，siBRCA1-17（SI03103975，
将人MLH1 cDNA（购自RC201607，OriGene Technologies，Rockville，MD，USA）或MSH2 cDNA（购自RC205848，OriGene Technologies）亚克隆到pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro载体（PS100092，OriGene Technologies ）使用SgfI和MluI限制性酶切位点构建PS-MLH1或PS-MSH2表达载体。通过慢病毒转导携带相应基因（PS-MLH1或PS-MSH2）的构建体，可以生成表达MLH1的同基因HCT116细胞系（HCT116-PS-MLH1）或表达MSH2的LoVo细胞系（LoVo-PS-MSH2）。PS100092被包括作为阴性对照。质粒pMD2.G和psPAX2是Didier Trono（12259和12260，Addgene，Watertown，MA，美国）提供的礼物，用于HEK-293T细胞中的慢病毒颗粒包装。慢病毒转导后，
如前所述，通过晶体破坏试验确定DAG，依托泊苷，伊立替康，喜树碱和多西他赛对细胞存活的细胞毒性作用。使用GraphPad Prism 6.0软件确定每种药物治疗72小时的IC 50值。之后，根据细胞对应的IC 50值，对细胞进行固定浓度的不同药物组合治疗（在PC-3细胞中，DAG：依托泊苷= 4.6：1，DAG：喜树碱= 250：1，DAG：伊立替康= 2.1：1，DAG：多西紫杉醇= 5.1：1;在M059K细胞中，DAG：依托泊苷= 2.5：1，DAG：伊立替康= 3.4：1，DAG：多西紫杉醇= 1.3：1;在A549细胞中，DAG：依托泊苷= 5.1： 1，DAG：喜树碱= 212：1）。不同的组合（例如，占IC 50的十分之一）在三到四个独立的实验中，使用一式三份的样品测试浓度（每种药物的IC 50的10倍浓度）。按照Chou–Talalay方法54和Calculsyn软件（Biosoft，版本2.0）计算每种组合的CI值，以定量确定两种药物相互作用的性质（CI <1，协同作用； CI = 1，可加性； CI> 1 ，对抗性）。
将雄性裸鼠（Nu / Nu）（6-7周大，杰克逊实验室）盲目分配到不同的笼子中，并保持在无病原体的标准条件下。所有实验程序均按照不列颠哥伦比亚大学机构动物护理委员会（IACC）批准的规程，道德规范和准则（A20-0046）进行。小鼠在右侧腹皮下注射100μlPC-3细胞悬液（在50％PBS和50％Matrigel中1×10 6个细胞；康宁，354234，美国马萨诸塞州图克斯伯里）。每周通过卡尺测量使用公式V ＝ π（长×宽×高）/ 6 来监测肿瘤体积。当肿瘤大小达到100–200 mm 3时，将小鼠随机分为四组（9-10只小鼠/组），并分别腹膜内注射PBS（媒介物），DAG（2.5 mg / kg，在第1、3、5天，每周3周），伊立替康（每周第4天每天25 mg / kg，共6周），或DAG与伊立替康联用。使用卡尺测量监测肿瘤的生长，当肿瘤达到人道终点（900-1000 mm 3或溃疡）时处死小鼠。
数据表示为三到四个独立实验的平均值±标准差。在指示的地方，进行了学生的t检验以计算p值的统计学意义。
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