该Cre- 的loxP重组系统是基因操纵的有力工具。不过，也有与化学诱导Cre-广泛认可限制的loxP系统，以及紫外线和蓝光诱导系统具有光毒性和深部组织穿透容量小。在这里，我们开发了一个远红光诱导分裂Cre- 的loxP系统（FISC系统）基于细菌植物色素光遗传系统和split-Cre重组酶，仅通过利用远红光（FRL）就可以在体内进行基因组工程的光遗传学调控。FISC系统显示出低背景并且没有可检测的光细胞毒性，同时提供了有效的FRL诱导的DNA重组。我们的体内研究展示了FISC系统强大的器官穿透能力，在肝脏重组诱导方面明显优于两个基于蓝光的Cre系统。展示其强大的临床意义，我们使用腺相关病毒（AAV）交付成功部署了FISC系统。因此，FISC系统扩展了用于DNA重组的光遗传学工具箱，以在生命系统中实现时空控制的非侵入性基因组工程。
位点特异性DNA重组是用于基因组工程的强大技术，可操纵原核和真核生物染色体中的转基因。Cre重组酶，整合酶家族的一个位点特异性重组酶，催化2双称为34-bp的序列之间的同源DNA重组的loxP位点1，2，和可以被利用来诱导或有条件敲入和knock-沉默基因表达淘汰转基因模型。多功能的Cre- 的loxP重组系统已被广泛地用作位点特异性遗传操作工具来精确地操纵哺乳动物细胞和转基因动物的基因组的应用，如细胞命运映射3，4，基因组工程5，6，7，和疾病的治疗8，9由于它的简单性和效率1，2。先前的研究已经示出了如何基本Cre- loxP位技术可以用化学诱导型系统，例如四环素组合10，11，他莫昔芬12，13，和雷帕霉素14，以实现基因组工程的时间控制15。然而，与这些化学诱导Cre-挑战的loxP系统包括细胞毒性，泄漏，脱靶重组，以及有限的能力来控制系统以高时空分辨率的16，17，18。
光遗传学技术克服了化学诱导系统的这些限制，为神经科学研究和许多其他生命科学领域的研究提供了令人兴奋的机遇，使研究人员能够实现对基因的时空控制，包括在基于基因和细胞的治疗中的应用19，20，21，22。与化学试剂相比，光是时空控制基因表达的极佳诱导剂。有光诱导Cre- loxP序列基于UV系统23，24，25，但可以（通过直接破坏DNA例如）导致细胞毒性这些系统。还有两个可诱导蓝光的Cre-loxP重组系统，两者都依赖split-Cre重组酶概念。在CRY2-CIB1 split-Cre（CRY2-Cre）系统中，两个Cre片段成分融合到对蓝光敏感的植物感光体隐色素2（CRY2）或其结合域CIB1 26上。在PA-Cre系统中，两个Cre片段融合到正磁体（pMag）或负磁体（nMag）域27上。尽管已将这些系统用于时空控制体内的基因表达，但现在存在某些局限性，例如蓝光透过浑浊的人体组织的穿透力差，并且在活体小鼠中的诱导效率相对较低，因此需要较长的曝光时间，因此增加对细胞的光毒性作用。
替代感应能源可能是一个方法来帮助克服这些局限性，开发诱导Cre- 的loxP更适合在体内和临床应用的系统。波长较长的光源应具有更好的诱导能量，因为已知远红外光（FRL;> 700 nm）和近红外辐射（NIR;高达980 nm）可以更深入地穿透体内活体组织和器官28，29，30，31，32。尽管没有报道称这些低能光源触发了可诱导的Cre系统，但仍有几种对NIR响应的蛋白质-纳米粒子光遗传系统。这些系统基于掺杂镧系元素的上转换纳米粒子（UCNP），可将近红外激光（800或980 nm）的辐射转换为蓝光，从而激活蓝光响应性通道视紫红质2蛋白29或光，氧和电压（LOV2）蛋白33。这些较长波长诱导方法的显着局限性是需要将UCNPs引入生物系统，这会导致细胞毒性，并且是阻碍其在临床上广泛应用的主要障碍。细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的光活化是在小鼠的双光激发（810和880 nm）触发的耳廓表皮中完成的，这需要复杂的硬件34。
在这里，我们设计和建造一个远红光诱导分裂Cre- 的loxP基于分裂Cre重组酶系统（FISC系统）重组和我们以前验证FRL诱导P FRL光遗传学系统35。在我们的FISC系统中，Cre重组酶被分为两个片段，其N端Cre片段与Coh2结构域融合；这个CreN-Coh2融合蛋白被组成型表达。C末端的Cre片段融合至DocS结构域，并且该DocS-CreC融合蛋白的可诱导表达由FRL应答性启动子P FRLx驱动。在FRL照射下，基于Coh2和DocS域的强亲和力，将两个片段结合在一起时，即可重建Cre重组酶的活性36。此基因编码的FISC系统不需要化学或纳米粒子成分，显示出低背景泄漏，对小鼠没有明显的细胞毒性作用，并且可以通过精确的时空控制实现高重组效率。我们证明，FISC系统可用于在活体小鼠的内部器官中体内诱导有效的DNA重组，在这里它的性能明显优于上述两个基于蓝光的诱导DNA重组的系统。最后，我们展示了如何通过腺相关病毒（AAV）载体将FISC系统组件传递到小鼠器官，然后在用无创FRL LED灯照明后成功诱导DNA重组。因此，我们的研究显示了一种强大的工具，可以光遗传地操纵基因组工程，
寻求开发改进的光激活Cre- 的loxP系统，并与光毒性可以忽略不计，我们已经开发出一种FRL诱导Cre-深部组织渗透能力的loxP通过扩展我们以前基于bacteriophytochrome -光遗传学系统系统35，其中细菌感光BPHS可以转换当暴露于FRL 37时，细胞内鸟苷酸三磷酸变成环状二鸟苷酸单磷酸（c-di-GMP）。然后，c-di-GMP触发哺乳动物远红光依赖性反式激活因子（FRTA，p65-VP64-BldD）的二聚化，然后可以与其同源的合成光反应性启动子P FRLx结合以驱动转基因表达。基于Cre重组酶27的结构分析，我们通过在先前验证的残基CreN59 / CreC60 27处拆分Cre重组酶，构建了由远红光诱导的拆分Cre- loxP系统（FISC系统，图 1a）。此外，根据先前的研究，Cre重组酶的活性位点位于较大的C端结构域1中。因此，在我们的设计中，N端Cre片段与Coh2（CreN59-Coh2）域融合，并且融合蛋白由P hCMV组成型驱动。C端Cre片段与DocS（DocS-CreC60）结构域融合，并且该融合可以由FRL响应启动子P FRLx诱导表达。。在FRL照射下，融合片段DocS-CreC60被表达，它通过允许Cre片段融合的Coh2和DocS相互作用域异二聚化而恢复了Cre酶的催化活性。然后，重组的Cre可以切除两个loxP位点侧翼的DNA序列（图1b）。
FISC系统的示意图。Cre重组酶分为两个片段：由组成型启动子（P hCMV）与Coh2 融合的CreN59（残基1–59）和由远红光（FRL，730 nm）驱动与DocS融合的CreC60（残基60–343）。诱导型启动子（P FRLx）。在FRL照射后，光感受器BphS被激活以将细胞内鸟苷酸三磷酸酯（GTP）转化为环状二鸟苷酸单磷酸酯（c-di-GMP）。胞质c-di-GMP产生诱导远红光依赖性反式激活因子FRTA（p65-VP64-BldD）与其合成启动子P FRLx结合驱动DocS-CreC60表达。因此，一旦两个Cre片段基于各自的Coh2和DocS融合结构域的亲和力相互作用而组装，就可以恢复Cre重组酶的催化活性，从而能够切除位于loxP位点两侧的DNA序列。b示意图描述了FISC系统中使用的构建体的遗传结构。pA，聚腺苷酸化信号；YhjH，细菌c-di-GMP磷酸二酯酶；DocS，来自C. thermocellum的 dockerin S 与Coh2复合；L 1-11，从1至11的不同接头（补充表 1），Coh 2，来自热纤梭菌的锚定蛋白；氧磷，特定的Cre重组酶结合位点；STOP，一种含有pA的终止子，可防止转录；GOI，感兴趣的基因。c示意图，描述了FRL诱导型启动子P FRLx的不同遗传结构。3 * whiG，三个拷贝的BldD特异性结合序列；P hCMVmin，P hCMV的最小版本; P min，最小的真核启动子；TATA，只有TATA框的最小的真核启动子。d示意图描述了使用哺乳动物细胞进行FISC实验程序的时间表。e优化CreN59-Coh2表达和光诱导性P FRLd的不同转染量驱动的DocS-CreC60表达式。将HEK-293（6×10 4）细胞与pXY137（P hCMV -p65-VP64-BldD-pA :: P hCMV -BphS-P2A-YhjH-pA，100 ng），pGY125（P hCMV - loxP -STOP ）共转染- loxP位 -SEAP-PA 200纳克），pXY110（P 的hCMV -CreN59-L0-COH2-NES-PA）和pXY133（P FRLd -NLS-DOCS-L0-CreC60-PA）从5至100在比纳克的1：1（重量/重量），然后照射用于与FRL 6小时（1.5毫瓦厘米-2每天一次2天，730纳米）。首次照射后48小时，分析培养上清液中SEAP的表达情况（n = 3个独立实验）。F优化CreN59和Coh2域之间以及CreC60和DocS域之间的不同连接子（L1-L11）。将每孔6×10 4个 HEK-293细胞与pXY137（100 ng），pGY125（200 ng）和Docs-CreC60和Coh2-CreN59共转染，并使用不同的连接子组合（10 ng / 10 ng）（补充表 2）; 如e中所述对它们进行照明，然后在第一次照明后48小时内分析的培养上清液中进行SEAP表达（n = 3个独立实验）。（e，f）中的橙色框表示效果最佳。Ë，˚F数据代表平均值±SD。该图的源数据在源数据文件中可用。
我们最初使用人类胚胎肾细胞（HEK-293）在FRL照射下测试CreN59 / CreC60对的重组效率，并发现该组合具有较高的诱导水平[如通过分析分泌的人胎盘碱性磷酸酶（SEAP）表达来评估]在FRL照明下；然而，它在黑暗条件下也具有很强的背景活性（补充图 1）。为了降低背景活性，我们因此构建了三种不同的FRL反应性嵌合启动子变体（P FRLx）（图1c），并测试了用于驱动DocS-CreC60表达的不同启动子构型，并优化了不同数量的编码CreC60融合片段的质粒。在多个测试的启动子中，我们发现在TATA启动子（P FRLd）的控制下表达DocS-CreC60 导致响应FRL照射的光诱导重组效率（图 1d和补充图 2）。
我们还发现，将HEK-293细胞与四个质粒共转染可实现最高重组效率：FRL反应性传感器pXY137（P hCMV -p65-VP64-BldD-pA :: P hCMV -BphS-P2A-YhjH-pA ，100 ng），FRL诱导的CreC60表达载体pXY133（P FRLd -NLS-DocS-L0-CreC60-pA，10 ng），CreN59表达载体pXY110（P hCMV -CreN59-L0-Coh2-NES-pA， 10 ng）和Cre依赖性SEAP报告基因pGY125（P hCMV - loxP -STOP- loxP -SEAP-pA，200 ng）。这种组合导致在FRL照射下诱导24.9倍的DNA重组效率（图 1e））。为了使用该系统获得强大的DNA重组效率，我们接下来设计了不同的接头，并优化了CreN59与Coh2之间以及CreC60与DocS之间的接头氨基酸序列，以避免可能阻碍活性结构重构的主要位阻14，27。我们比较了这些接头的不同组合，发现其中一种组合（L9 / L9）在FRL照射下产生最高的折叠诱导（50.9倍诱导）（图 1f，补充图 3和表 1和2）。
此外，我们进一步测试了CreN59 / CreC60对的催化能力，以切除由各种loxP突变体（包括lox2722，lox66，lox71，lox72，JTZ17，JTZ17 / JT15，JT15）以及原始的（非突变的）侧翼的报告序列。）loxP（补充图 4a）。具体而言，我们构建了侧翼为各种loxP突变体的SEAP报道分子（floxed-STOP SEAP），发现CreN59 / CreC60对显示了原始loxP侧翼报道分子最高的DNA重组效率。观察到很少或几乎没有实质性诱导DNA重组loxP突变体侧翼的报道分子序列（补充图 4b）。这些改进和测试的结果是，我们开发了优化的特定FISC系统，该系统在FRL照明下可提供高效的DNA重组（50.9倍诱导）。
为了证明哺乳动物细胞中Cre活性的光活化调控，将HEK-293细胞与该FISC系统的质粒以及侧翼为loxP位点的荧光（EGFP）或荧光素酶报告基因共转染。这些实验证实，装备有我们的FISC系统的细胞在FRL照射下表现出高水平的重组，而在黑暗中保持较低的背景重组水平（图 2a，b和补充图 5）。接下来，我们表征了FISC介导的DNA重组的动力学，并发现FRL诱导后的重组既依赖于光照强度，又依赖于暴露时间（图 2c，d），而随着时间的推移没有明显的背景增加（补充图 6）。）。我们还证实，FISC系统可以激活多种具有不同性能的哺乳动物细胞系中的DNA重组（图 2e）。不同的细胞系之间的可变DNA重组效率可以归因于细胞特异性因素，如在转染效率，用如在以前的研究中也观察到的内源性细胞成分的差异的潜在相互作用35，38，39。此外，使用光掩模限制FRL暴露的空间模式的实验表明，FISC系统具有较高的空间分辨率性能（图 2f）。
一个酶Cre催化DNA重组用荧光成像和流动FISC系统流式细胞仪。将HEK-293细胞（6×10 4）与pXY137，pXY169（P hCMV -CreN59-L9-Coh2-NES-pA），pXY177（P FRLd -NLS-DocS-L9-CreC60-pA）和pDL78（ P 的hCMV - loxP位 -STOP- loxP位 -EGFP-PA）以10：1的比率：1：20（重量/重量/重量/重量），照明6小时与FRL（1.5毫瓦厘米-2，730纳米）每天持续2天，在第一次照射后48小时，通过荧光显微镜和流式细胞术观察报告蛋白EGFP的表达。来自n的代表性图片 = 5个生物学重复。比例尺250μm。图条代表n = 3个生物学重复的平均值±SD 。b使用荧光素酶测定法与FISC系统进行Cre催化的DNA重组。HEK-293细胞（6×10 4）与pXY137，pXY169，pXY177和pXY185共转染（P 和hCMV - loxP位 -STOP- loxP位萤光素酶-PA）以10：1的比率：1：20（w / w的/ w / w），按照（a）所述进行照明，并在第一次照明后48小时进行生物发光测量（n = 3个独立实验）。c评估依赖于照明强度的FISC系统活动。6×10 4将HEK-293细胞与pXY137，pXY169，pXY177和pGY125（SEAP报告质粒）以10：1：1：20（w / w / w / w）的比率共转染，并每天用FRL照射6小时，共2次在八种不同的光强度（0-5 mW cm -2）下的天数；在第一次照射后48小时对SEAP水平进行了分析（n = 3个独立实验）。橙色框标志着FISC系统介导的最高诱导倍数。d取决于暴露时间的FISC系统活动。用相同质粒比如（Ç），我们入射型转染的细胞与FRL（1.5毫瓦厘米-2，730纳米），用于不同的时间段（0-120小时）。在初始照射后120 h，在细胞培养上清液中分析SEAP表达（n = 3个独立实验）。橙色框标志着FISC系统介导的最高诱导倍数。Ë FISC诱导的多个哺乳动物细胞系中SEAP表达。如（c）中所述，共转染四种不同的哺乳动物细胞系并对其进行照明，并在第一次照明后48小时分析培养上清液中的SEAP表达（n = 3个独立实验）。f评估FISC介导的转基因表达的空间分辨率。将包含HEK-293细胞的单层细胞与pXY137，pXY169，pXY177和pDL78（EGFP报告质粒）以10：1：1：20（w / w / w / w）的比例共转染，并按照（一个），但通过具有6.5 mm狭缝的光罩（示意图，左），以及在第一次照射后48小时（右）基于荧光显微镜的EGFP表达相应模式的分析。来自n = 2个生物学重复的代表性图像。b – e数据代表平均值±SD。该图的源数据在源数据文件中可用。
接下来，我们评估了FRL（730 nm）或蓝光（460 nm）照明对哺乳动物细胞活力的影响。用pSEAP2-对照转染HEK-293细胞，然后用FRL或蓝光照射不同时间。SEAP表达表明FRL暴露导致可忽略的细胞毒性。然而，从蓝光处理观察到显着差异，其显着降低了细胞活力（补充图 7）。此外，我们没有观察到随着装备FISC系统的细胞的FRL暴露时间延长，细胞毒性显着增加（补充图 8），这表明系统成分的惰性。此外，我们比较了我们的FISC系统和两个现有的蓝光控制的Cre-系统之间的DNA重组效率loxP重组系统，包括CRY2-Cre 26和PA-Cre系统27（补充图 9）。我们的FISC系统比CRY2-Cre系统（11.6倍诱导）或PA-Cre系统（8.7倍诱导）产生更有效的DNA重组（46.7倍诱导）。这些体外结果表明急剧增加DNA重组效率，与我们的FRL的降低的细胞毒性的观察观察用蓝光曝光相比，一起强调我们FISC系统代表用于光诱导Cre-有吸引力的方法的loxP重组。
接下来，我们测试了FISC系统在FRL照射下是否可以在体内诱导DNA重组。在感染/注射小鼠之前，并寻求一个相对简单的系统，该系统包含很少的构建体以促进体内FISC系统的递送，我们开发了单个质粒的数个迭代，这些质粒将构建体连接到了两部分的Split-Cre产品中。为了克服在黑暗中表达泄漏和诱导能力降低的问题，我们针对两个split-Cre序列优化了启动子之间的距离（补充图 10）。我们最终获得了优化的串联分裂Cre向量pXY237（pA-CreC60-L9-DocS-NLS-P FRLd -Space3-P hCMV-CreN59-L9-Coh2-NES-P2A-ZeoR-pA），它成功地结合了两个Cre融合片段的构建体，从而保留了设计所需的组成型（CreN59-Coh2）和诱导型（DocS-CreC60）表达模式。
然后，我们使用流体动力注射（尾静脉）以FISC系统的迭代瞬时转染野生型BALB / c小鼠，该FISC系统包含三个质粒：FRL响应传感器pXY137（150μg），串联的Cre-Cre连接载体pXY237（100微克）和酶Cre诱导型萤光素酶报道pXY185（P 和hCMV - loxP位 -STOP- loxP位萤光素酶-PA 100微克）。注射后八小时，将转染小鼠的腹部暴露于FRL（20 mW cm -2，730 nm）。与仅注射荧光素酶报告质粒pXY185或FISC成分但留在黑暗中的对照小鼠相比，生物发光成像数据的定量分析显示，接受12 h FRL照射的注射小鼠表现出明显更高的荧光素酶活性（图。 3a，b）。
一个示意图显示光诱导DNA重组活性的小鼠中的实验程序。b使用体内生物发光成像将FISC系统与CRY2-Cre和PA-Cre系统进行比较。用包含三个质粒的FISC系统迭代向BALB / c小鼠进行瞬态流体动力注射（尾静脉）[pXY137 / pXY237（pA-CreC60-DocS-NLS-P FRLd -Space3-P hCMV -CreN59-Coh2-P2A- ZeoR-pA）/ pXY185（荧光素酶报告质粒）的比例为1.5：1：1（w / w / w）]或CRY2-Cre或PA-Cre系统或仅荧光素酶报告质粒pXY185作为对照。在注射后8小时，将小鼠用FRL（20毫瓦厘米照亮-2，730纳米）或蓝色光（BL，20毫瓦厘米-2460 nm）照射12小时（开启15分钟，关闭15分钟，交替）或保持在黑暗中，然后在光照后12小时成像。c（b）中显示的BALB / c小鼠的生物发光测量（对照：n = 3，FISC系统：n = 4，CRY2-Cre和PA-Cre：n =5。数据表示平均值±SEM）。有关每个光遗传学系统的遗传成分的详细说明，请参见补充表 4。该图的源数据在源数据文件中可用。
我们还比较了FISC系统和CRY2-Cre和PA-Cre系统的体内DNA重组效率。小鼠用FRL（20毫瓦厘米照亮-2，730纳米）或蓝色光（20毫瓦厘米-2，460纳米）12小时（15分钟，15分钟关闭）开始在8小时后高压注射。引人注目的是，用FRL照射配备FISC的小鼠会导致荧光素酶活性增加约54倍，而带有CRY2-Cre或PA-Cre系统组分的小鼠在蓝光照射下观察到的最大增加仅比荧光素酶高约三倍。黑暗对照动物的本底水平（图 3b， C）。考虑到已知的FRL能力但蓝光能量无法穿透动物组织，这不足为奇。因此，除了确定我们的FISC系统可以有效地诱导体内DNA重组外，这些结果还突出了FISC系统的内在物理特性，使其在整个动物水平上都优于基于蓝光的生理学研究系统。
为了验证FISC系统可用于基因组基因座的DNA重组，我们使用流体动力学注射将FISC系统的两个质粒迭代引入tdTomato转基因（Gt（ROSA）26Sor tm14（CAG-tdTomato）Hze）小鼠，其中Cre报告基因等位基因设计为具有loxP侧翼STOP盒，可阻止CAG启动子驱动的红色荧光蛋白变体（tdTomato）的转录。在存在Cre重组酶的情况下，会切割终止盒，从而导致报告基因tdTomato表达。具体而言，将pXY137（150μg）和pXY237（100μg）质粒通过尾静脉注射递送到tdTomato转基因小鼠中（补充图 11a），注射后8 h，将小鼠暴露于FRL（20 mW cm-2，730纳米）12小时（15分钟，15分钟断，交替）。用FRL照射的小鼠的分离的肝脏表现出强烈的tdTomato表达信号，这种信号在注射FISC的黑暗对照小鼠中不明显（补充图 11b-d）。与此相反，与蓝色光控系统平行实验后的蓝色光照明（20毫瓦厘米仅表现tdTomato表达的弱诱导-2，460纳米）（补充图 11B，C）。定量分析显示，在FRL照射的小鼠的分离的肝脏中，tdTomato信号强度有明显的诱导作用，而CRY2-Cre和PA-Cre小鼠未观察到明显的诱导作用（补充图 11c）。）。这些结果支持我们的FISC系统能够通过使用外部FRL的无创照射触发体内基因组位点的DNA重组。
我们使用tdTomato转基因小鼠的腿部肌肉电穿孔实验，进一步证实了FISC系统的体内FRL诱导DNA重组酶活性。小鼠的胫骨后肌肉共40微克质粒为FISC系统或蓝色光控系统中的电穿孔，随后用照明FRL（20毫瓦厘米-2，730纳米）或蓝色光（20毫瓦厘米-2，460纳米）12小时（15分钟，15分钟断）每天2天（补充图 12A）。qRT-PCR和Western blot分析（补充图 12b，c）均显示与电穿孔的黑暗对照组小鼠相比，配备FISC的小鼠的FRL照明诱导tdTomato信号显着增加。对于肌肉组织中的任一蓝光控制系统，未观察到tdTomato信号强度的显着增加。
AAV的往往是生物学研究，并在临床基因治疗的首选载体，由于其低免疫原性的潜力，并从宿主基因组整合其降低致癌风险40，41。最近，已经报道了红光激活的AAV传递平台用于哺乳动物细胞中基因表达的光遗传激活42。。为了使我们的FISC系统有可能在将来用于疾病的临床治疗中，我们验证了通过AAV载体将我们的FISC系统传递到tdTomato转基因小鼠中的能力。由于AAV载体包装尺寸的限制，我们将FISC系统部署在三个单独的病毒载体中：组成性表达的光敏模块BphS，组成性表达的CreN59-Coh2片段，组成性表达的杂交反式激活因子p65-VP64-BldD和FRL诱导的Docs-CreC60片段（图 4a）。然后，我们通过尾静脉注射转导了tdTomato转基因小鼠这三种AAV的混合物（图 4b，c）。我们评估了这种AAV介导的FISC系统是否可用于在tdTomato转基因小鼠中诱导FRL依赖性体内DNA重组。注射后2周，我们每天以20 mW cm -2的强度照亮小鼠12小时（打开15分钟，关闭15分钟，交替进行），持续2天。初始照明后一周，荧光成像表明，暴露于FRL的小鼠比转导的黑暗对照小鼠表现出17.7倍的增加（图 4d，e）。此外，我们在源自FRL照射的小鼠的分离肝脏中观察到更高的tdTomato信号（图 4f）。对离体肝脏的分析显示增加了20.4倍（图 4g））与转导的深色对照小鼠相比。类似地，对分离的肝组织进行的qRT-PCR和Western blot分析（图 4h，i）显示，与转染的黑暗对照组小鼠相比，用三种FISC AAV载体转导的小鼠的FRL照射诱导tdTomato信号明显增加。这种FRL诱导的tdTomato表达的增加也通过肝脏切片的荧光显微镜成像得到证实（图 4j）。结论是，这些结果表明，与其他两种体内递送方法（流体动力注射和电穿孔）相比，AAV药物FISC系统表现出非常有效的性能（补充表 3），这在不久的将来将为临床治疗提供潜在的途径。
图1为描述FISC DNA重组系统的AAV载体的遗传构型的示意图。b转基因Cre-tdTomato报告基因小鼠的工作原理示意图，其中可通过Cre重组酶切除loxP侧翼的STOP盒，以表达Cre报告基因（tdTomato）。c小鼠FISC介导的DNA重组活性实验程序的示意图。d AAV转导的报告基因小鼠（n = 3小鼠/组）中tdTomato荧光的代表性图像。e（d）中显示的tdTomato表达的荧光测量（n = 3只小鼠/组）。F（d）（n = 3小鼠/组）中显示的是从AAV转导的小鼠分离的肝脏组织中的tdTomato荧光的代表性图像。比例尺，1厘米。g（f）中显示的生物发光tdTomato表达（n = 3只小鼠/组）。ħ，我的qRT-PCR（ħ）和Western印迹（我）在（示出分离的肝组织tdTomato的分析˚F）（ñ = 3只小鼠/组）。蛋白质印迹图像代表了来自两个独立实验的三只小鼠。Ĵ（f）中显示了转基因Cre-tdTomato报告基因小鼠肝脏切片的代表性荧光图像（n = 5个生物学重复，比例尺，250μm）。（e，g，h）中的数据表示平均值±SEM。该图的源数据在源数据文件中可用。
光遗传学工具已经彻底改变了细胞活性和功能的研究，将提供先前无法想象的时空分辨率的研究人员22，34，43，44，45，46。目前，对于Cre-现有光诱导技术的loxP重组系统都基于紫外光或蓝色光被开发出来，这两者必须深入渗透到组织中非常小的身体能力47。此外，此类系统受到副作用的限制，例如光毒性，有害的炎症和体内低重组效率27。在本研究中，我们证明了远红外光诱导的分裂Cre- loxP系统（FISC系统）的成功开发，该系统不仅可以在各种哺乳动物细胞系中而且可以以光依赖的方式有效地控制DNA重组。在小鼠中。重要的是，我们显示FISC系统具有最小的深色背景，但具有非常强的可诱导DNA重组效率（在暴露于FRL后HEK-293细胞中诱导率高达121.7倍）。我们还证明了FISC介导的DNA重组活性的光强度和光持续时间依赖性调节，并证明可以通过例如使用光掩模限制暴露于FRL照射的区域来控制重组活性。
需要重点强调的是，FISC系统基于FRL照明，因此与基于光波长较短的光诱导基因表达系统相比，它具有多个优势：鉴于其能量大大降低，FRL的细胞毒性比蓝色或紫外线小。此外，FRL能够深入地渗透到组织中，因此它提供了研究人员（和潜在的临床医生）的基因诱导和无细胞内信号的能力扰动经由化学诱导型Cre-面临的loxP重组系统14，48，49，50。这项工作中介绍的经过遗传编码的FISC系统非常易于设置并适用于体内应用。FISC系统方法的未来迭代可能会扩展到最初的概念验证水动力注射演示之外，从而有可能实现针对高分辨率研究的极端组织或什至细胞类型的特定部署，而无需进行侵入式或化学操作即可实现条件表达动物感兴趣的基因
重要的是，我们关于FISC系统组件可以通过AAV传递以实现动物中有效DNA重组的论证表明，我们的FRL诱导系统如何适用于潜在的多种应用，例如创造和有条件地激活敲入和敲除生物时空控制良好。因此，FISC系统可适用于多个领域的有效基因操作，例如不同细胞类型和生物中的基因缺失，以研究基因功能。
尽管FISC系统介导了强大的DNA重组效率，但在便利性或翻译角度方面仍有改进的空间。由于AAV载体的包装尺寸有限，我们必须将FISC系统部署在三个单独的AAV病毒载体中以进行体内递送。这显然是将来进一步进行分子生物学研究或转化研究的障碍。一个理想的解决方案是开发一种结构更小，结构更紧凑的设备，以确保体内有效递送。
总体上，所描述的FISC系统应该提供一种改进的系统，该系统可以以时空方式精确控制靶标单细胞或整个生物体中的基因组工程，并具有深度渗透的能力并显着降低了毒性和侵袭性。我们希望我们FRL诱导Cre- 的loxP系统铺平了道路更广泛的应用，包括在组织移植光控制，创造敲入和基因敲除生物，并指定干细胞命运和诱导多能性的潜力时空时尚。
补充表4和5中提供了用于该研究的质粒和引物， 并且通过DNA测序（Genewiz Inc.，苏州，中国）证实了该序列。补充文件中提供了本研究中使用的最重要的遗传模块的详细DNA序列信息。根据制造商的说明（Seamless Assembly Cloning kit； Obio Technology Inc .；目录号BACR（C）20144001），通过Gibson组装法构建了一些质粒。
人胚肾细胞（HEK-293，ATCC：CRL-1573），人宫颈腺癌细胞（HeLa，ATCC：CCL-2），HEK-293衍生的Hana3A细胞经过工程化，可组成型表达RTP1，RTP2，REEP1和G 将αoλϕ和端粒酶永生化的人间充质干细胞（hMSC-TERT）在含有5％CO 2的潮湿气氛中于37°C在含有Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM，Gibco；目录号31600-083）中培养。 10％（v / v）的胎牛血清（FBS，AusGeneX Industries；目录号FBSSA500-S）和1％（v / v）的青霉素/链霉素溶液（Beyotime，中国；目录号ST488）。所有细胞系均已定期检测是否存在支原体和细菌污染。所有细胞系均以优化的基于聚乙烯亚胺（PEI）的方案转染。简而言之，将6×10 4个细胞每孔接种在24孔细胞培养板上，并培养16小时。随后将细胞与50 µL 3：1 PEI：DNA混合物（w / w）（聚乙烯亚胺，MW 40,000，ddH 2 O中的1 mg mL -1储备溶液； Polysciences;目录号24765 ）孵育6小时。 ）含有0.32μg的FISC系统总质粒DNA。转染后二十四小时，将细胞通过FRL LED每天照射6小时2天（1.5毫瓦厘米-2，730纳米，晶元，台湾，中国）。用Countess II自动细胞计数器（Life Technologies）确定细胞数目和活力。
在1×10 4的HEK-293在96孔板中细胞与FRL（1.5毫瓦cm的照射-2，730 nm）或BL（1.5毫瓦厘米-2，460 nm）的24小时和细胞活力进行测定使用细胞计数试剂盒8（Beyotime，中国；目录号C0037）根据制造商的规程使用。通过使用高度水溶性的四唑盐WST-8 [2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺基苯基）-2H来测定细胞抑制或增殖-四唑鎓，一种钠盐]，在电子介体存在下还原生成水溶性甲for染料。与10 µL CCK8在37°C下温育2小时后，用Synergy H1酶标仪（BioTek Instruments Inc.）在450 nm处读数。
将6×10 4个 HEK-293细胞铺在24孔板中，培养16小时。随后将细胞与50 µL含有0.32 µg（FISC系统的总质粒量）质粒DNA的3：1 PEI：DNA混合物（w / w）孵育6小时。转染后24 h，将细胞照射不同的时间（0至120 h）或不同的光强度（0–5 mW cm -2）使用定制的4×6 FRL LED阵列（730 nm，Epistar，中国台湾）。根据制造商的使用说明书，使用光功率计（Q8230，Advantest，日本）在730nm的波长处测定光强度。在第一次照射后48小时对培养基中的SEAP表达进行定量。在第一次照射后48小时通过流式细胞仪定量EGFP表达。
使用测定培养物上清液中的人胎盘SEAP的表达p -基于-nitrophenylphosphate吸光度的时间过程测定51。简言之，将120微升底物溶液[100μL2×SEAP缓冲器含有20mM高精氨酸，1毫摩尔MgCl 2，21％（体积/体积）二乙醇胺，pH值9.8，和含有120mM 20μL底物溶液p -nitrophenylphosphate]加到80 µL热灭活（65°C，30分钟）的细胞培养上清液。使用具有Gen5软件（版本：2.04）的Synergy H1杂交多模式酶标仪（BioTek Instruments，Inc。）测量405 nm处的吸光度随时间变化。从光吸收的时间依赖性增加的斜率计算SEAP表达的定量。
根据制造商的说明书（Beyotime，中国；目录号RG005）测定荧光素酶活性水平。将HEK-293细胞以6×10 4细胞/孔接种在24孔板中，并于第二天用编码pXY137（P hCMV -p65-VP64-BldD-pA :: P hCMV -BphS-P2A-YhjH- pA，100 ng），pXY169（P hCMV -CreN59-L9-Coh2-NES-pA，10 ng），pXY177（P FRLd -NLS-DocS-L9-CreC60-pA，10 ng）和pXY185（P hCMV - loxP -STOP- loxP位萤光素酶-PA 200纳克）。转染后24小时，将培养板用FRL（1.5 mW cm -2（730 nm），每天2天。然后用200μl细胞裂解液处理，将细胞以13,800× g离心 5分钟，并收集上清液。将100μl萤光素添加到100μl上清液中，并使用Synergy H1杂交多模式酶标仪（BioTek Instruments，Inc.）检测信号。
在6×10铺板HEK-293细胞4细胞在24孔板/孔转染次日用编码pXY137（100毫微克），pXY169（10纳克），pXY177（10毫微克）和pDL78（P质粒的hCMV - loxP -STOP- loxP -EGFP-pA）。在转染后24小时，将培养板照射用于与FRL（1.5毫瓦厘米6小时-2，730纳米）的每一天2天。然后通过胰蛋白酶消化收集细胞，并在PBS中洗涤3次。每个样品收集了大约10,000个事件，并使用Becton Dickinson LSRFortessa TM进行了分析。用于EGFP [488 nm激光，505 nm长通滤光片，530/30发射滤光片（通带以530 nm为中心；通带宽度为30 nm）]的流式细胞仪（BD Biosciences）。使用FlowJo软件（版本7.6）分析数据。使用加权EGFP 52确定FISC系统介导的DNA重组效率。门控转染的HEK-293细胞群中EGFP荧光强度超过10 2个任意荧光单位阈值的细胞。加权EGFP是门控细胞百分比乘以其中值荧光的值，该值与荧光强度和细胞数量相关。
EGFP表达细胞的荧光图像是用装有495/535 nm（B / G）的Olympus数码相机（Olympus DP71，Olympus，日本）的倒置荧光显微镜（Olympus IX71，TH4-200，Olympus，日本）进行的。 / R）激发/发射滤光片组，并使用480 nm激发滤光片和535 nm发射滤光片获取EGFP信号的图像。
将HEK-293细胞以每培养皿3.5×10 6个细胞接种到10cm培养皿中。培养18小时后，将细胞转染3：1比例的PEI / DNA混合物（w / w），其中包含16μg（FISC系统的总质粒量）质粒DNA。在转染后24小时，将培养皿每天照射6小时由FRL（1.5毫瓦厘米-2的光掩模由铝箔制成：有狭缝图案（6.5毫米狭缝的宽度），730纳米）。照明后48小时使用Clinx成像设备（ChemiScope 4300Pro，Clinx，中国上海）拍摄荧光图像。
根据制造商的说明，使用RNAiso Plus试剂盒（Takara，大连，中国；目录号9108）收获组织样品以进行总RNA分离。使用PrimeScript RT试剂盒将总共500 ng RNA反转录为cDNA，并根据制造商的规程用gDNA橡皮擦（中国大连宝库市；目录编号RR047）处理以去除基因组DNA。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（Takara，中国大连；目录号RR420）在实时PCR仪（QuantStudio 3，美国Thermo Fisher Scientific Inc.）上进行实时PCR，以检测靶基因。 。PCR使用以下参数：95°C持续10分钟，然后在95°C持续30 s，55°C持续30 s，72°C持续30 s进行40个循环，最后延伸至72°C 10分钟 使用标准ΔΔCt方法将结果表示为相对mRNA量。看家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）被用作内源性对照以使表达正常化。引物序列如下：GAPDH有义5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'；GAPDH反义5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'; tdTomato感5'-GACACCAAGCTGGACATCAC-3'; tdTomato反义5'-ACCTTGAAGCGCATGAACTC-3'。
组织样品在含有1 mM苯基甲磺酰氟（PMSF）的RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1 mM EDTA pH 8.0，1％NP-40）中裂解。 。将混合物在冰上研磨成匀浆，并以16,200× g离心收集上清液 在4°C下放置15分钟。使用二辛可宁酸测定试剂盒（Beyotime，中国；目录号P0012S）确定样品中蛋白质的浓度。将裂解液与上样缓冲液混合并煮沸10分钟。等量的蛋白质（30微克）在10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（美国马里波利市；目录号IPVH00010）。在室温下，用TBST缓冲液（50 mM Tris，1.37 mM NaCl，2.7 mM KCl，0.05％Tween 20，pH 8.0）中的5％脱脂牛奶封闭膜1小时。然后将膜与抗tdTomato一抗（1：500，GenScript，中国；目录号A00682）或抗GAPDH一抗（1：1000，Beyotime，中国；目录号AF1186）于4℃孵育过夜。 ℃。用TBST缓冲液洗涤3次后，然后将膜与二抗（Alexa Fluor790山羊抗兔，1：5000稀释，Jackson ImmunoResearch）在室温下孵育1小时。用TBST缓冲液洗涤3次后，使用荧光Western blot成像系统（LI-COR Odyssey Clx，美国）观察膜。
产生了AAV（血清型2/8）用于体内基因的传递53。简而言之，将包装质粒（pRC-2 / 8），纯化的辅助质粒（pHelper）和转移质粒（包含目标盒）以1：1：1（w / w / w）的比例混合，然后转染到HEK- 使用PEI将293FT细胞接种在15厘米的培养皿中（8×10 6个细胞/培养皿）。转染后72小时，收获细胞并重悬于3ml裂解缓冲液（20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl）中，然后冷冻和融化3次。加入MgCl 2（终浓度，1 mM）和苯并酶（终浓度，50 U ml -1）后，将细胞裂解混合物在37°C下孵育40分钟，并在4000× g下离心 10分钟以收集上清液。将上清液加至碘克沙醇梯度溶液中，并在350,000× g下于4°C 离心 2 h。分离出40％的碘克沙醇级分，用PBS洗涤，并使用Amicon Ultra 15离心过滤器设备100 K（Millipore，贝德福德，马萨诸塞州）浓缩至最终体积100-200μL。使用定量PCR滴定纯化的AAV。
将雄性BALB / c野生型小鼠（6周龄，ECNU实验动物中心）随机分为八组。给小鼠流体动力学注射编码FISC系统[pXY137（P hCMV -p65-VP64-BldD-pA :: P hCMV -BphS-P2A-YhjH-pA，150μg），pXY237（pA-CreC60-L9- DOCS-NLS-P FRLd -Space3-P 的hCMV -CreN59-L9-COH2-NES-P2A-ZeoR-PA 100微克），pXY185（P 和hCMV - loxP位 -STOP- loxP位萤光素酶-PA 100微克）]或蓝光控制的CRY2-Cre系统[pXY240（P hCMV-CIB1-L12-CreC106-IRES-CRY2-L12-CreN104-pA，pXY185，100μg]或PA-Cre系统（PA-Cre质粒，67 µg； pXY185，100 µg），具有相同的摩尔浓度通过尾静脉或仅荧光素酶报道质粒pXY185（100 µg）的Cre浓度作为对照。DNA混合物溶液的注射体积为每小鼠体重（g）100μL。注射8小时后，将小鼠用远光理疗灯（E27，Phillips）或蓝色LED照明12小时（20 mW cm -2；打开15分钟，关闭15分钟，交替进行），然后将每只小鼠腹膜内注射100 mM萤光素底物溶液（SYNCHEM; CAS NO：115144-35-9）。荧光素注射后三分钟，使用IVIS Lumina II体内成像系统（Perkin Elmer，美国）获得了小鼠的生物发光图像。辐射度（p sec -1厘米-2 SR -1使用Living图像分别计算关注区域（ROI的区域）值）® 4.3.1软件。
将转基因的Cre-tdTomato报告基因小鼠（6周大，雄性，来自ECNU实验动物中心的Gt（ROSA）26Sor tm14（CAG-tdTomato）Hze雄性小鼠）随机分为6组，每组三只。这些小鼠被动态注射了编码FISC系统[pXY137（P hCMV -p65-VP64-BldD-pA :: P hCMV -BphS-P2A-YhjH-pA，150 µg）和pXY237（pA-CreC60-L9- DocS-NLS-P FRLd -Space3-P hCMV -CreN59-L9-Coh2-NES-P2A-ZeoR-pA，100 µg）]或蓝光控制的CRY2-Cre系统[pXY240（P hCMV-CIB1-L12-CreC106-IRES-CRY2- L12-CreN104-pA]或PA-Cre体系（PA-Cre，67 µg）通过尾静脉具有相同的摩尔浓度。DNA混合物溶液的注射体积为每小鼠体重（g）100μL。注射8小时后，用远红光理疗灯（E27，菲利普斯）或蓝色LED照明小鼠12小时（20 mW cm -2）; 开启15分钟，关闭15分钟，交替进行）。对照小鼠保持在黑暗中。光照后五天，将小鼠用异氟烷麻醉并处死，并分离肝脏用于荧光成像或组织学分析。使用配备tdTomato滤光片组的IVIS Lumina II体内成像系统（Perkin Elmer，美国）检测到来自分离的肝脏的tdTomato信号。收集的荧光发射信号以落射荧光单位（平均计数）存储，并计算总计数的ROI。使用生活图像的所有图像进行分析，® 4.3.1软件。
为了将质粒电穿孔导入小鼠肌肉，将Gt（ROSA）26Sor tm14（CAG-tdTomato）Hze小鼠（雄性，6周龄）随机分为六组，每组五只。手术暴露小鼠胫后肌，并用共40 µg的FISC系统质粒（pXY137，20 µg; pXY237，20 µg）或蓝光控制的CRY2-Cre系统（pXY240，40 µg）电穿孔。 ）或PA-Cre系统（PA-Cre，40 µg）。使用TERESA-EPT-I药物输送装置（中国上海特雷莎医疗科技有限公司）以以下参数对肌肉进行电穿孔：60 V（电压），50 ms（脉冲宽度），1 HZ（频率）。电穿孔后二十四小时，用FRL或蓝光照射小鼠12 h（20 mW cm -2; 每天15分钟，关闭15分钟，交替进行2天，同时将对照小鼠置于黑暗中。第一次照射后48小时，处死每只小鼠，收集肌肉组织进行qRT-PCR和Western blot分析。
对于AAV介导的FISC系统实验，将Gt（ROSA）26Sor tm14（CAG-tdTomato）Hze小鼠（雄性8周大）随机分为两组，每组三只。这些小鼠用包含3种AAV载体的1 ml AAV病毒混合物的混合物进行转导：AAV-P hCMV -BphS-pA（2×10 11 vg），AAV-P hCMV -CreN59-L9-Coh2-pA（1×10 11 vg）和AAV-P hCMV -FRTA-pA-P FRLd -Docs-L9-CreC60-pA（2×10 11 vg）。注射两周后，以远红外光以20 mW cm -2的强度照亮小鼠每天12小时（开启15分钟，关闭15分钟，交替），持续2天。第一次照射后第7天，使用IVIS Lumina II体内成像系统（Perkin Elmer，美国）检测到来自分离肝脏的tdTomato信号。然后处死小鼠，分离肝脏用于qRT-PCR，蛋白质印迹和组织学分析。
新鲜的肝脏用冷PBS洗涤3次，以去除杂质，例如血液，然后在4％（w / v）低聚甲醛（PFA，Sangon Biotech;目录号30525-89-4）中固定2 h。 。切下约1 cm 3的组织块并将其包埋在最适切割温度的化合物（OCT，Leica；批号03803389）中。使用Cryostat切片机（Leica； CM1950，Crystal Cryostat）制备5 µm厚的肝脏切片，并用PBS冲洗。最后，将样品用4'，6-二mid基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma，CAS。28718-90-3）复染10分钟。在倒置荧光显微镜（Leica DMI8，Wetzlar，德国）上观察到内源基因tdTomato表达。
所有涉及动物的实验均按照ECNU动物保护和使用委员会批准的协议进行，并直接按照中华人民共和国科学技术部动物保护指南进行。该研究涉及的方案已得到ECNU动物护理和使用委员会的批准（协议ID：m20171203）。
所有数据均表示为三个独立实验的平均值±SD。对于动物实验，每个治疗组均由随机选择的小鼠组成（n = 3–5）。除非另有说明，否则统计学上的显着性由学生的t检验确定（两尾）。所有曲线拟合均使用Prism 5软件（5.01版，GraphPad Software Inc.）进行。结果被认为在P <0.05（*）时显着，在P <0.01（**）时非常显着，在P <0.001（***）时极显着。
与本文链接的《自然研究报告摘要》中提供了有关研究设计的更多信息 。
与这项研究相关的所有数据均在论文或《补充信息》中提供。图形的源数据和扫描的胶片图像作为源数据文件提供。可以通过材料转让协议获得与本文相关的所有遗传成分，并可向HY（hfye@bio.ecnu.edu.cn）索取。根据合理要求，作者可以提供任何其他相关数据。本文提供了源数据。
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