小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，在神经元发育和神经退行性疾病中起着至关重要的作用。外周血造血组织中的小胶质前体在早期胚胎发生过程中定植在中枢神经系统中。然而，如何整合内源性信号和外源性信号来调节小胶质细胞的分化尚不清楚。在这项研究中，我们确定了大脑白质高强度易感基因，程序性细胞死亡蛋白11（PDCD11），作为调节小胶质细胞分化的重要因素。在斑马鱼中，pdcd11缺乏会阻止前体分化为成熟的脑小胶质细胞。虽然，炎性特征的巨噬细胞脑部集落增加了。受精后22小时，卵黄囊中的Pdcd11阳性细胞不同于巨噬细胞和嗜中性粒细胞。从机制上讲，PDCD11通过差异调节核因子-κB家族成员P65和c-Rel的功能，抑制P65介导的炎性细胞因子（如tnfα）的表达并增强c-Rel依赖的外观来发挥其生理作用。 tgfβ1。本研究提供了了解斑马鱼发育过程中小胶质细胞分化的新见解。
脑白质高信号（WMH），也称为白斑病，在老龄化人口中很常见，并且与认知功能障碍，中风和神经退行性疾病（包括阿尔茨海默氏病）的风险增加相关[ 1 ]。血管周围的炎症是在一个WMH突出的病理特征，并且WMH负担已与炎症的生物标记物的循环，包括高灵敏度C-反应蛋白和白细胞介素-6有关[ 2，3，4 ]。全基因组关联分析帮助确定了与WMH和发展[相关的许多风险相关的单核苷酸多态性（SNP），5，6，7 ]。中的SNPPDCD11已经表现出与WMH负担显著协会，但是他们的职能作用仍然不确定[ 5，7 ]。
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的先天免疫细胞，在胚胎早期发育期间进入大脑，并在白质病理学中发挥重要作用[ 8 ]。受其环境的影响，小胶质细胞呈现出不同的分子模式，从分泌促炎细胞因子的M1表型到炎症消退和组织修复的M2表型[ 9 ]。在斑马鱼的胚胎中，巨噬细胞在卵黄囊（YS）表达L-增塑蛋白的早期发育，并在受精（hpf）后约24 h散布在头状间充质中。之后，它们侵入大脑并分化为小胶质细胞，其特征在于L-增塑剂的表达降低和更高的神经营养脂质载体的表达，载脂蛋白E在约60 HPF [ 10，11 ]。因素，如集落刺激因子1受体（CSF1R）和神经细胞凋亡小胶质细胞调制前体的大脑中的[播种12，13 ]。但是，内源性信号和外源性信号如何在小胶质细胞分化中整合仍然未知。转化生长因子-β（TGF-β）家族成员对于先天和适应性免疫功能都是重要的细胞因子[ 14 ]。维持小胶质细胞特定的稳态基因签名是必需的。小胶质细胞中TGF-β受体的缺失导致小胶质细胞快速转化为炎性巨噬细胞表型[15，16 ]。尽管已经证明了脑源性TGF-β1在致病性条件下形成免疫应答中的重要性，但胚胎TGF-β1的起源，特别是诱导小胶质细胞分化的起源，仍然未知。
在这项研究中，斑马鱼模式生物的帮助下，我们证明了PDCD11，一个南国易感基因，有助于通过TGF-β1促进胚胎分化小胶质细胞。pdcd11突变体中的巨噬细胞显示出炎症基因的表达增加和小胶质细胞特征基因的上调受损。这种不平衡的巨噬细胞生成很可能是由不受控制的P65激活引起的，导致炎症基因上调并抑制了pdcd11缺乏下c-Rel依赖性Tgfβ1的表达。
Pdcd11在物种之间是高度保守的，并且主要具有两个功能域，包括N端核糖体和Coil（图 1a）。为了定义Pdcd11在胚胎发育中的作用，我们通过CRISPR-Cas9核酸酶在第四个外显子中生成了一个pdcd11突变体斑马鱼品系，其第7外显子缺失了7-bp（图 S1a）。靶向Pdcd11核糖体结构域的抗体证实了pdcd11突变体中功能域的完全丧失（图 1a）。核糖体合成的扰动常稳定和激活相关的P53细胞凋亡途径[基因17，18，19]。与其他报道的核糖体缺陷相似，在3个dpf pdcd11突变体中观察到了明显的发育迟缓和颅面畸形（图 1b）。不足为奇的是，P53途径基因被超活化（图 S1b中）和吖啶橙（AO）阳性死细胞也显著增加pdcd11缺陷的胚胎从HPF 22（图 S1C）。为了确定凋亡诱导在pdcd11突变体发育缺陷中的贡献，还产生了p53基因敲除背景下的pdcd11突变体[ 20 ]。P53耗竭有利地恢复了pdcd11突变体中的AO细胞数和P53通路基因（图 S1d，e）。但是，颅骨畸形，较短的体长和存活率仅得到部分恢复（图 S1f，g），这可能表明其他P53独立因素也有助于pdcd11突变体的病理。
一个表示PDCD11的两个主要功能结构域示意图：N-末端核糖体结构域（1-1407）和C端螺旋结构域（一四○八年至1871年）。b 3 dpf WT和pdcd11突变体的总体形态。c qPCR证实了22个hpf pdcd11突变体中无法激活的炎性通路基因，包括tnfa，il1b和il6，这些突变体无法通过组合的p53突变得以恢复。d – e IL6和il1b在带有p53的WT或pdcd11突变体的脑中表达WISH在52 hpf突变或未检查。f WISH分析24 hpf WT和pdcd11突变体胚胎中l-plastin，mfap4和csf1ra的表达。红色箭头表示大脑中的csf1ra阳性细胞。g通过WISH评估载脂蛋白和中性红染色的3 dpf WT和pdcd11突变体的小胶质细胞发育。h在3个dpf WT和pdcd11突变体中L-plastin和mfap4表达模式。我在大脑和尾部造血组织的巨噬细胞的形态（CHT）使用TG（检查MPEG1：GFP ）转基因品系。白色箭头表示在pdcd11突变体中发现的空泡巨噬细胞。j与野生型对照相比，来自60个hpf pdcd11突变体的分选巨噬细胞Tg（mpeg1：GFP）中tnfa mRNA表达增加。k qPCR检查22 hpf WT和pdcd11突变体中巨噬细胞相关基因cxcr3.1和cxcr3.2的表达。l WISH分析了22个hpf WT和pdcd11突变体中cxcr3.1和cxcr3.2的表达。位于d右下角的数字–h，l代表表现出阳性表型的斑马鱼胚胎数量与所检查胚胎总数的对比。比例尺：100μm。黑色水平线表示平均值±平均值标准误差（SEM）。显示了三个独立实验的平均值±SEM。* P <0.05；** P <0.01；*** P <0.001（学生t检验）。
有趣的是，与血管周炎在WMH中的突出病理特征相一致，我们发现与炎症反应相关的基因（如il6，il1b和tnfa）显着增加，否则无法通过联合p53突变得以恢复（图 1c）。 。使用全量原位杂交（WISH），检测到52个hpf pdcd11突变体的大脑中炎症基因表达明显增加，而p53突变也无法恢复（图 1d，e）。
早在22 hpf ，pdcd11突变体中的炎症基因表达就升高了。此时，巨噬细胞和中性粒细胞是斑马鱼中鉴定出的两种主要的免疫相关炎症细胞。巨噬细胞在大约24 hpf时开始在头间质中迁移。与野生型胚胎相比，通过mfap4或泛白细胞标志物l-plastin染色显示，pdcd11缺乏症诱导了脑组织巨噬细胞的增加和更早的积累（图 1f）。此时，mpo阳性白细胞的分布模式保持不变（图 S2a）。先前的研究表明，凋亡性神经元死亡驱动视神经皮质中小胶质细胞前体的定植[ 21 ]。因此，我们推测高级的巨噬细胞迁移可能被增加的神经凋亡信号所刺激。然而，组合的p53突变未能恢复pdcd11突变体大脑中增加的巨噬细胞蓄积，而蓄积实际上在加剧（图 S2b）。有趣的是，从非特异性巨噬细胞标记的表达，不同csf1ra，这是以前证明是所需的[小胶质细胞前体的迁移和增殖13，22 ]，被相反地降低pdcd11突变体（图 1f）。一致地，通过载脂蛋白或中性红染色显示，成熟的小胶质细胞是大脑中组织内的巨噬细胞，在3个dpf pdcd11突变体中完全不存在（图 1g）。此时，在pdcd11突变体的大脑中大量染色了mfap4或l-plastin的巨噬细胞，具有明显扩大和空泡的形态，这也已用巨噬细胞转基因品系Tg（mpeg1：GFP）证实（图 1h，i）。巨噬细胞获得特定的功能表型，其通过炎症基因产物的分泌及其形态出现而得以表现。我们发现，tnfa是斑马鱼中M1巨噬细胞公认的标志物[ 23 ]的表达在从60 hpf pdcd11缺陷型胚胎中分选出来的巨噬细胞中明显增加了（图 1j）。在硬骨鱼中，cxcr3.1和cxcr3.2巨噬细胞分别显示出向M1和M2的功能极化[ 24 ]。我们发现，在22个HPF pdcd11突变，cxcr3.1表达深刻地增加，而中cxcr3.2与野生型对照相比降低（图 1k，1）。
与具有p53突变的炎症基因恢复失败相似，仅抑制凋亡不能恢复在pdcd11突变体胚胎中观察到的巨噬细胞生成异常（图 S2c，d）。此外，在22hpf的pdcd11突变体中未检测到髓系祖细胞增殖或凋亡的明显异常（图 S2e–h）。
小胶质细胞的分化需要逐步激活的内在转录因子和环境诱导因子，例如Tgfβ1。通过比较22 hpf WT和pdcd11突变体之间携带的RNA-seq数据，我们注意到在22 hpf pdcd11突变体胚胎中，人TGFB1的同源物tgfb1a mRNA 显着降低（表 S1）。通过qPCR和蛋白质印迹证实了该发现（图 2a，b）。使用WISH，我们发现，tgfb1a是高度细胞在22 HPF表示在YS，在类似于Pdcd11的位置，并且该表达tgfb1a明显具有降低pdcd11缺乏（图 2c）。否则，人类TGFB1的另一个直系同源基因tgfb1b的表达在22 hpf时低表达，而pdcd11耗尽则未检测到差异（图 S2i ，j）。此外，使用免疫荧光测定法揭示了Pdcd11表达细胞中特别富集的Tgfβ1（图 2d）。在小神经胶质细胞小鼠TGFβ1诱导的签名基因进行了研究[ 25，26 ]。支持pdcd11介导小胶质细胞Tgfβ1激活的作用，从缺乏pdcd11的 Tg（mpeg1：GFP）系中分选出来的脑巨噬细胞显示Tgfβ1刺激的基因表达降低，包括与野生型胚胎相比，sall1a，tgfbr1a和tgfbr1b以及Tgfβ1抑制的基因如tlr5a和ctsl.1的表达增加（图 2e）。的仰角csf1b和减少ctsba在小神经胶质细胞也通过WISH（图验证 2F）。确认的重要性tgfb1a在有助于小胶质细胞耗竭减少pdcd11突变体，tgfb1a过表达恢复前体和成熟的小胶质细胞数pdcd11突变体（图 2G-我）。然而，这种挽救受到了LY364947，TGFβR-I抑制剂的添加或在mpeg1启动子控制下过表达抑制性辅因子smad7的同时抑制巨噬细胞中Tgfβ活化的影响，这暗示了Pdcd11衍生的Tgfβ在调节巨噬细胞发育中的重要性（图 2h–j）。
qPCR（a），western blot（b）和WISH（c）检查22 hpf斑马鱼中tgfb1a或Tgfβ1 的表达水平。d免疫荧光评估22 hpf斑马鱼胚胎中Pdcd11和Tgfβ1表达。白色箭头表示在YS上发现的共表达信号。e与使用Tg（mpeg1：GFP）转基因株的 WT对照相比，从60个hpf pdcd11突变体的大脑中分选出来的巨噬细胞中Tgfβ1调控的基因表达的变化倍数。f。表达csf1b和ctsba在60 HPF WT和pdcd11WISH的突变体。红色箭头表示阳性细胞。g斑马鱼tgfb1a mRNA过表达对WT和pdcd11突变体中csf1ra表达的影响。的效果tgfb1a mRNA或组合MPEG1从动Smad7的过表达对小胶质细胞标记物apoeb（ħ）或中性红染色（我在WT和）pdcd11突变体。Ĵ LY364947除上的效果apoeb在WT和表达pdcd11突变体tgfb1a mRNA过度表达。位于号码右下角的数字f – j代表表现出阳性表型的斑马鱼胚胎数量与所检查胚胎总数的对比。比例尺：100μm。显示了三个独立实验的平均值±SEM。* P <0.05（学生t检验）。
除了大的N端核糖体结构域（Rib），Pdcd11还包含C末端线圈结构域（Coil），其功能尚未定义（图 3a）。为了研究分子机制，我们首先过度表达了Rib和Coil。尽管Rib的过表达忠实地恢复了P53途径的基因，但巨噬细胞生成和炎症途径活化的干扰只能通过pdcd11突变体中的Coil过度表达来逆转（图 3b，c和S3a–c）。短C-末端片段（TER）据说可以与P65（图相互作用 3A）时，NF-κB家族之一[构件27，28]。NF-κB信号通路参与调节组织的免疫稳态。在正常情况下，P65被抑制蛋白IkappB保留在细胞质中，可用于蛋白酶体降解途径，从而避免了不受控制的炎症激活。刺激后，P65在536丝氨酸残基处通过磷酸化进行翻译后修饰，从而避免了与IκB的相互作用。然后，P65可以转运到细胞核中以激活下游信号通路。我们发现536-丝氨酸磷酸化的P65在pdcd11突变体中明显增加（图 3d）。线圈或末端片段Ter的体外过表达有效地减少了核536丝氨酸磷酸化的P65（图 3e））。有趣的是，我们发现，在体外转染的P65和线圈主要在细胞质中或在核仁，其具有降低的P65转录活性[相关共定位29，30 ]（图 3F）。然后通过蛋白质印迹法分别检测具有线圈过度表达的细胞质和核P65含量。Coil转染的增加明显增加了P65细胞质的含量，同时相应地降低了核P65水平（图 3g）。此外，pdcd11突变体中增加的536丝氨酸磷酸化的P65 通过Coil或Ter结构域的过表达而得以恢复，但不能通过Rib结构域的过表达来恢复（图 3h）。）。为了确定线圈的拯救作用是否依赖于其抑制P65活化的能力，使用了两种NF-κB抑制剂BMS-345541和BAY 11-7821 [ 31 ]。用BMS-345541或BAY 11-7821处理可减少536丝氨酸磷酸化的P65，并且在pdcd11突变体中，炎症基因和巨噬细胞也恢复了正常状态（图 3i和S3d，e）。维持小胶质细胞稳态需要正确调节的炎性体级联反应[ 32 ]。但是，BMS-345541或BAY 11-7821处理无法挽救小胶质细胞数量或TGFβ1水平（图 3j，k），表明线圈可能会利用其他P65独立机制来调节小胶质细胞的生成。
一示意图示出了由核糖体（罗纹，1-1407 AA），线圈（1408年至1871年AA），和终端（TER，1742年至1871年AA）结构域的PDCD11的不同结构域。b具有Rib或Coil域mRNA过度表达的pdcd11突变体对apoeb阳性小胶质细胞的抢救作用。红色箭头表示载脂蛋白阳性细胞。比例尺：100μm。Ç炎性基因表达的定量PCR评估pdcd11与PDCD11过表达的肋或螺旋结构域的突变体。d蛋白质印迹检测22 hpf WT和pdcd11突变体中536丝氨酸修饰的P65表达。Ë在HEK293T细胞中用Coil或Ter过度表达检测核P65 536含量的蛋白质印迹。f免疫荧光分析显示了用N端Flag融合螺旋和P65-GFP共转染的细胞的表达模式。白色箭头表示在细胞质或核仁中共定位的Coil和P65。比例尺：20μm。g三个独立实验的代表性图片，显示了增加Coil转染对核/细胞质P65含量的影响。h三个独立实验的代表性图片，显示了带有线圈结构域（Coil），末端结构域（Ter）或核糖体结构域（Rib）mRNA过表达的WT和pdcd11突变体中的P65 536水平。一世在用NF-κB抑制剂处理的pdcd11突变体中，表达mfap4的巨噬细胞的出现。比例尺：50μm。Ĵ NF-κB抑制剂对救援效果apoeb在正的小胶质细胞pdcd11突变体。比例尺：100μm。k三个独立实验的代表图像，显示了在22个hpf pdcd11突变体中添加Cog域（Coil），末端域（Ter），核糖体域（Rib）mRNA或NF-κB抑制剂对Tgfβ1水平的拯救作用。位于b的右上角和i，j的右下角的数字代表表现出阳性表型的斑马鱼胚胎数量与受检胚胎总数的对比。显示了三个独立实验的平均值±SEM。ns不显着，* P <0.05；** P <0.01；*** P <0.001（学生t检验）。
有趣的是，虽然Coil过表达恢复了pdcd11突变体中的巨噬细胞外观和炎症基因，但在Huc启动子下的泛神经元细胞中Coil过表达（也称为胚胎致死，视觉异常，神经元特异性RNA结合）均未检测到相似的功效。蛋白质3，elavl3）[ 33 ]或巨噬细胞受mpeg1启动子控制[ 34 ]（图 S3c，f）。
利用具有荧光蛋白的NF-κB识别序列驱动的转基因斑马鱼来研究斑马鱼中NF-κB的活性[ 35 ]。在该转基因品系的帮助下，我们惊奇地发现，尽管PDCD11抑制了P65的活化，但NF-κB仍在22 hpf的YS上表达Pdcd11的细胞中被活化（图 4a）。与胞质Coil表达的细胞相比，具有核Coil表达的细胞在NF-κB识别序列的控制下易于激活EGFP（图 4b和S4a）。在NF-κB家族的五个成员中，P65，c-Rel和Rel-B带有转录激活域（TAD），该域与NF-κB识别序列结合并激活下游基因的表达[ 36，37 ]。这些发现促使我们推测，NF-κB结合元件的这种激活依赖于NF-κB家族其他成员的转录活性。实际上，与P65不同，Coil与c-Rel和P105共定位在细胞核中，Coil过表达促进了c-Rel的核保留（图 4c-e和S4b，c）。荧光素酶测定显示线圈共表达增强了c-Rel激活NF-κB结合元件的能力（图 4f）。证实减少的核c-Rel / P105在导致pdcd11突变体的小胶质细胞缺乏中的重要性，我们发现c-Rel和p105的共表达恢复了小胶质细胞的数量，这是由apoeb所显示的或中性红染色（图 4g，h）。当抑制性smad7在巨噬细胞中共表达时，这些抢救作用受到很大影响，表明c-Rel / P105在TGFβ信号传导上游起作用（图 4g，h）。一致地，Tgfβ1的表达水平也随着c-Rel和p105 mRNA的过度表达而增加（图 4i，j）。黄嘌呤衍生物己酮可可碱（PTXF）的注射可选择性降解c-Rel [ 38 ]，也减少了野生型胚胎中的小胶质细胞数量。减少也可以通过注射tgfb1a mRNA 恢复（图 4k）。在先前的研究中，染色质免疫沉淀结合微阵列技术（ChIP / Chip）检查了有丝分裂原刺激的T细胞Rel / NF-kappa-B揭示了TGFB1启动子区域中潜在的Rel /NF-κB识别基序[ 39 ]。为了进一步确定Coil和c-Rel 对TGFB1的调控作用，使用荧光素酶报告基因检测了HEK293细胞。线圈共表达增强了c-Rel刺激TGFB1启动子的能力。这种增强被组合的M1和M2 c-Rel结合位点突变所消除（图 4l）。这些结果表明线圈和c-Rel促进早期斑马鱼胚胎中的tgfb1 e表达。
Tg（NF-κB：mCherry）转基因株系中Pdcd11表达的 IF分析。白色箭头表示在22 hpf下YS上的共定位细胞。比例尺：100μm。b含有NF-κB识别基序驱动的GFP和Flag-Coil的质粒的体外转染。白色箭头表示具有细胞核表达的细胞显示NF-κB活化。比例尺：20μm。代表性图像显示了用Flag-Coil和c-Rel（c）或P105（d）共转染的细胞。白色箭头表示具有核表达的Coil和c-Rel（c）或P105（d）的细胞。比例尺：20μm。Ë。蛋白质印迹显示了增加Coil转染对核/细胞质c-Rel含量的影响。f卷和c-Rel转染对由NF-κB结合位点驱动的萤光素酶活性的影响。通过apoeb（g）或用c-rel和p105 mRNA或结合mpeg1启动子驱动的smad7质粒注射的中性红染色（h）检查WT和pdcd11突变体中的小胶质细胞数量。比例尺：100μm。qPCR（i）和Western blot（j）评估22 hpf WT和pdcd11突变体中的tgfb1a或Tgfβ1水平。c-Rel和p105 mRNA过表达。k具有c-Rel抑制（PTXF）或组合的tgfb1a mRNA互补作用的胚胎中的小胶质细胞数量。比例尺：100μm。l报告基因检测，显示了Coil和c-Rel转染对TGFB1启动子的调节。TGFB1 WT启动子，包含三个c-Rel结合位点（5'-ccGGGGcacccccc-3'，对TSS为-761 bp; 5'-ggGGGGacgccccgt-3'，对TSS为-776 bp; 5'-aaGGGAcccccctcg-3'，-1019 bp（TSS）。三个结合基序分别被突变并命名为M1（5'-ccAAAAcacccccc-3'，-TSS为-761 bp），M2（5'-ggAAAAacgccccgt-3'，TSS为-776 bp），M3（5'-aaAAACcccccccctcg -3'，到TSS的-1019 bp）。位于号码右下角的数字g，h，k代表表现出阳性表型的斑马鱼胚胎数量与所检查胚胎总数的对比。显示了三个独立实验的平均值±SEM。ns不显着，* P <0.05；** P <0.01；*** P <0.001（学生t检验）。
由于P65和c-Rel在结构上相似，并且都具有N末端Rel同源结构域（RHD）和C末端TAD结构域，因此研究PDCD11如何区分两者是很有意义的（图 5a）。Co-IP检查显示P65和c-Rel均可与PDCD11的Coil域相互作用（图 5b，c）。Coil域进一步分为Coil-coil和Ter片段，与P65和c-Rel表现出不同的相互作用方式。由于P65和c-Rel的RHD结构域与PDCD11的Coil-coil区域相互作用，因此如P65所观察到的那样，Ter片段未能与c-Rel的TAD域结合（图 5d–g）。该结果之所以合理是因为，由于NF-κB家族成员的RHD域相似，因此它们的TAD域却截然不同。Ter与P65的TAD结构域的相互作用可能覆盖了P65转录激活所需的磷酸化位点。仅仅过度表达Ter片段就可以抑制pdcd11突变体中的P65激活，否则Coil-coil片段的过度表达就不能做到（图 5h）。证实Ter片段在抑制P65活化中的重要性，该片段的过表达也抑制了P65核易位（图 5i）。因此，TAD结构域和PDCD11之间的差异相互作用可能会导致PDCD11对P65和c-Rel的不同调节模式（图7）。 5j）。
一个示意图显示人P65，的c-Rel和PDCD11螺旋的结构域结构。b P65-GFP与Flag-Coil之间相互作用的免疫沉淀（IP）分析。c -Rel-GFP和Flag-Coil之间相互作用的IP分析。d IP分析PDCD11的螺旋线圈片段与P65的RHD域或TAD域之间的相互作用。È PDCD11与RHD域或P65的TAD域的终端（TER）片段之间的相互作用的IP测定。˚F PDCD11治疗与c-Rel的的RHD域或TAD域线圈线圈片段之间的相互作用的IP测定。GIP分析PDCD11的末端（Ter）片段与c-Rel的RHD域或TAD域之间的相互作用。h Western印迹法检测22CDF pdcd11突变体中过表达的螺旋，螺旋-螺旋和PDCD11末端对P65 ser536表达的影响。我西方机器人展示在293T细胞核/细胞质P65含量的增加泰尔转染的效果。Ĵ示意图显示PDCD11介导的c-Rel和P65调控的工作模型。正常情况下，一方面，PDCD11（黄色）的Ter片段结合并掩盖了P65（粉红色）的磷酸化位点，这是其核易位和转录激活所必需的；另一方面，PDCD11的螺旋线圈与c-Rel的RHD结构域之间仅有的相互作用反而会促进c-Rel（绿色）核保留，从而激活TGFβ1表达，从而促使巨噬细胞向具有“ M2”特性的小胶质细胞分化。 。但是，PDCD11缺乏的细胞显示P65核易位增加，这倾向于导致激活炎症相关基因，例如IL-1，IL-6和TNFα。。这些细胞因子然后促进“ M1”巨噬细胞分化。
通过WISH，我们发现，除了在神经元上皮中的明显表达信号之外，还从7个痛点阶段（ss）检测到YS上的散布细胞（图 6a）。在32 hpf时，pdcd11阳性细胞积聚在心包腔中，即所有血细胞的流入部位（图 6a）。在斑马鱼中，表达Pu.1的髓样祖细胞在5 ss出现在前外侧板中胚层（ALPM）内，然后迁移到延髓血岛（RBI）上并移到YS上。然后将细胞分化为巨噬细胞和嗜中性粒细胞，然后从大约24 hpf的种子播种大脑。通过使用斑马鱼Tg（Pu.1：GFP）转基因品系，我们发现在ALPM区域10-ss时，Pdcd11在Pu.1-GFP阳性细胞的一个子集中被激活（图 6b）。但是，这种共表达模式在22 hpf时降低，此后仍然不存在，提示稍后沉默Pu.1表达（图 6b）。还分别使用Tg（mpeg1：GFP）和Tg（mpo：GFP）转基因品系检查了Pdcd11在巨噬细胞和嗜中性粒细胞中的表达。Mpeg1阳性巨噬细胞似乎在32 hpf下被位于脑下方心包腔中的Pdcd11阳性细胞紧密包围，但未检测到共定位（图 6c）。同样，未检测到Pdcd11与mpo阳性中性粒细胞之间的共定位（图 S4d）。有趣的是，在pu.1缺失的胚胎中，虽然pdcd11在神经元上皮中的表达保持不变，但在心包腔中的表达消失了，这意味着在YS上观察到的散布的pdcd11表达细胞是Pu.1依赖性的（图。 6d）。为了验证pdcd11的表达模式，将斑马鱼pdcd11翻译起始位点上游的1.86 kb基因组区域克隆到包含EGFP的转座子载体中。所述pdcd11（图上YS启动子驱动的表达GFP的细胞中强烈与内源性Pdcd11在免疫荧光测定共定位在24 HPF 6e中）。在1.86 kb pdcd11启动子的控制下，线圈的过表达逆转了pdcd11突变体中的巨噬细胞失衡，炎性巨噬细胞数量减少，小胶质细胞数量增加（图 6f，g）。在神经元（Huc），巨噬细胞（Mpeg1）或嗜中性粒细胞（Mpo）特异性启动子的控制下，过表达Coil的过表达的胚胎未观察到这种拯救作用（图 6g）。总的来说，这些结果表明，散布的表达Pdcd11的细胞可能是Pu.1阳性祖细胞的衍生物，但它们不同于先前鉴定的嗜中性粒细胞或巨噬细胞。
对 7-ss，22 hpf和32; hpf的斑马鱼中pdcd11表达的 WISH评估。红色箭头指示YS和心包腔上的pdcd11信号。b Tg（pu.1：GFP）斑马鱼中Pdcd11的免疫荧光染色。红色箭头表示在YS上以10-ss共定位的Pdcd11和Pu.1表达细胞。c免疫荧光染色检测Pdcd11在22 hpf和32 hpf Tg（mpeg1：GFP）斑马鱼中的表达。d 希望检查pu.1缺陷胚胎中pdcd11的表达。红色虚线表示pdcd11在大脑下方的心包腔表达。È通过驱动GFP之间的共表达的IF评估pdcd11启动子和内源性Pdcd11。白色箭头指示22 hpf YS上的共定位信号。f在具有pdcd11启动子驱动的Coil过表达的52 hpf脑中mfap4-阳性巨噬细胞的表达模式。g在不同的启动子（包括Huc，mpeg1，mpo和pdcd11）下过表达线圈的apoeb阳性小胶质细胞的救援作用。位于图6f左下角的数字 g代表表现出阳性表型的斑马鱼胚胎数量与受检胚胎总数的对比。比例尺：100μm。
通过磁共振成像检查的WMH已被用于描述与认知功能障碍，中风损伤，脑小血管疾病和神经退行性疾病相关的WM变化[ 40 ]。胶质血管单位的关键细胞成分包括星形胶质细胞，少突胶质细胞，周细胞和小胶质细胞。有人建议，该WM内的小胶质细胞等在血脑屏障和清除碎屑[监视相关联的功能41，42 ]。在这项研究中，借助斑马鱼模型生物，我们发现pdcd11缺乏WMH易感性基因导致大脑中成熟的小胶质细胞完全丧失。在小鼠中，借助体内谱系追踪，发现成年小胶质细胞起源于胚胎第8天之前出现的原始髓样祖细胞[ 43 ]。然而，与斑马鱼一样，存在多个小胶质细胞波，它们来自不同的造血前体[ 44]。]。尽管已鉴定出小鼠和斑马鱼的原始和成年小胶质细胞的个体发育不同，但EMP祖细胞向小胶质细胞分化的潜在调控因子仍然不确定。TGF-β家族成员是维持小胶质细胞特异性稳态基因签名所需的细胞因子。在小神经胶质细胞的TGF-β受体的缺失导致朝向炎性巨噬细胞的表型[小胶质细胞的快速转换15，16 ]。携带突变的TGFB1的小鼠表现出急性消耗综合症，然后死亡[ 45 ]。最突出的病灶是特定器官的组织坏死和多灶性混合炎性细胞浸润到众多器官中[ 46]]。尽管在炎症过程中积累了在神经系统中局部表达TGF-β1的证据，但驱动小胶质细胞分化的TGF-β1的细胞来源尚不清楚。Pdcd11缺陷的胚胎表现出脑坏死和器官炎症细胞浸润，这与TGFB1突变的小鼠观察到的非常相似。此外，YS上表达Pdcd11的细胞与TGF-β1阳性细胞在YS上22 hpf共定位。随着pdcd11的消耗，TGF-β1的mRNA和蛋白水平均显着降低。重要的是，在pdcd11启动子的控制下，TGF-β1的过表达忠实地恢复了pdcd11中的小胶质细胞数量突变体。因此，我们的观察结果支持以下观点：在斑马鱼的早期发育过程中，表达Pdcd11的细胞可能是诱导小胶质细胞成熟的主要TGF-β1来源之一。
在研究表达YS Pdcd11的细胞的性质时，我们发现这些细胞与最初鉴定的巨噬细胞和嗜中性粒细胞不同，但它们也源自表达Pu.1的祖细胞，需要Pu.1。NF-κB家族成员具有独特的生物学功能并控制不同靶基因的表达，表现为NF-κB/ Rel家族成员敲除小鼠之间独特的发育表型。的P65的不同的和相反的功能和的c-Rel调节的细胞功能，例如细胞增殖和凋亡，已揭示了几种不同的模式[ 47，48 ]。在P105和c-Rel双敲除小鼠中，外周T细胞群体正常发育，卵泡，边缘区和CD5 +腹膜B细胞数量均减少，表明这些细胞类型对P105和c-Rel的特殊要求[ 49 ]。据报道，新生小鼠大脑中的B1a细胞丰富，可通过调节少突胶质前体细胞的增殖和小胶质细胞的数量来促进少突胶质形成[ 50 ]。由于斑马鱼中B1a淋巴细胞的确定性标志物难以捉摸，因此其他模型生物（如小鼠）将来可能有助于我们了解Pdcd11阳性细胞。在研究mpeg1.1：GFP报告基因系的最新报告中，发现在巨噬细胞旁边，在大多数成年斑马鱼器官中，mpeg1.1报告基因标记了B淋巴细胞亚群，其中cd79a高度表达，ighm和ighd [ 51 ]。这也将有助于我们今后研究该转基因品系以研究Pdcd11阳性细胞的特性。
斑马鱼的维护和分期如先前所述[ 52 ]。斑马鱼的设施和研究已获得中国科学院上海生物科学研究所卫生科学研究所机构审查委员会的批准，并根据批准的指南进行了方法。在TG（PU.1：GFP） [ 53 ]，TG（MPEG1：GFP） [ 54 ]，TG（MPO：GFP） [ 55 ]，P53 zdf1 / zdf1突变体[ 20，56 ]，PU.1 Δ839斑马鱼线被使用。
对于CRISPR-Cas9介导的pdcd11基因敲除斑马鱼的产生，使用在线工具ZiFiT Targeter软件（http://zifit.partners.org）设计了靶向pdcd11外显子4（5′-GGTCTCCCGAGCGGCCTCGT-3′）的指导RNA（gRNA）/ ZiFiT），并通过将退火的寡核苷酸克隆到sgRNA表达载体中进行合成[ 57 ]。通过Bsrbi酶（NEB）切割筛选突变体品系，并通过Sanger测序确认。
使用mMACHINE Kit（Ambion）进行mRNA转录。为了在斑马鱼中启动子驱动的Coil或smad7表达，共注入30 ng /μl转座酶mRNA。
将PTXF（Abcam）注射（0.5 ng）进入单细胞期胚胎。BMS-345541（Selleckchem，10μM），BAY 11-7821（Selleckchem，10μM）和LY364947（Selleckchem，10μM）用于处理18 hpf的胚胎。
Tol2（NFκB：EGFP）质粒获自Addgene [ 35 ]。扩增了紧邻pdcd11 5'非翻译区的1.86-kb序列，并将其克隆到包含斑马鱼Tol2转座因子的修饰的pT2cfosGW载体中[ 35 ]。将得到的构建体与转座酶mRNA一起注射到单细胞期WT TU胚胎中[ 58 ]。全长PDCD11被克隆到载体pcDNA3.1中。将人PDCD11的C螺旋，C螺旋-螺旋和C-Ter域扩增并克隆到载体pCS2 +中。将全长人c-Rel，P65和P105克隆到pCS2 +在C端融合了GFP。从全长载体中扩增出c-Rel和P65的RHD和TAD结构域，并将其克隆到pCS2 +中。从斑马鱼cDNA中扩增出全长的斑马鱼tgfb1a，并将其克隆到pCS2 +载体中。通过替换载体Tol2（mpeg1：dendra2）（Addgene，51462）中的dendra，克隆了Mpeg1启动子驱动的C-coil和smad7 。通过用Tol2（mpx：Lifeact-Ruby）中的线圈替换Lifeact-Ruby（Cla1和Sal1）来克隆Tol2（mpx：Coil）（Addgene，45246）。Tol2（huc：Coil）也通过使用p5E-Huc（Addgene，72640）进行网关克隆而获得。
如先前所述[WISH ] 进行[ 59 ]。为探针L-丝束，csf1ra，和MPO如前所述[使用了10，60，61 ]。反义探针，包括il6，il1b，mfap4，apoeb，pdcd11，csf1a，ctsba，tgfb1a，tgfb1b，cxcr3.1和cxcr3.2从斑马鱼cDNA扩增的PCR产物中体外转录得到T7转录酶结合序列，并将T7转录酶结合序列添加到反向引物中。表S2中显示了使用的引物 。
对于中性红染色，将在60 hpf和3 dpf下收集的斑马鱼幼虫在28.5°C下浸泡在中性红（Sigma-Aldrich，N6264; 2.5 mg / mL）中过夜。对于AO染色，将在22 hpf下回收的胚胎在10μg/ mL AO染色剂（Sigma-Aldrich）中在黑暗中溶解，在黑暗中孵育约30分钟。如前所述[ 62 ] 进行TUNEL染色。使用以下抗体进行pH3和免疫荧光染色：PDCD11（Sigma-Aldrich; HPA017924; 1：100）; pH3（Santa Cruz Biotechnology; 1：500），TGF-β1（Sigma-Aldrich，T0438; 25μg/ mL）
用DNAaseI（Ambion）处理后，使用Trizol试剂（Invitrogen，H10522）制备RNA，然后使用cDNA合成试剂盒（ABI）进行cDNA合成。实时PCR使用快速启动通用SYBR执行®绿色主Rox的探针（罗氏应用科学部，13800300）和的Mastercycler热循环仪仪（Eppendorf，22331）。引物总结在表 S2中。
如前所述[ 63 ] ，将指定发育阶段的斑马鱼胚胎脱黄质，并在与蛋白酶抑制剂混合的裂解缓冲液中匀浆。核蛋白通过NE-PER ™核和细胞质提取试剂（Thermo Fisher Scientific，78833）提取。对于co-IP分析，蛋白质在RIPA缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，10％甘油，5 mM MgCl 2中纯化）转染后48小时，加入0.5％NP40和Roche鸡尾酒蛋白酶抑制剂），并与抗c-Flag琼脂糖亲和凝胶抗体（Sigma-Aldrich，A220）混合。在4°C下孵育过夜后，收集磁珠进行蛋白质印迹。根据标准规程对样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹。使用的抗体是抗GFP（Sigma-Aldrich，G1544），抗Flag（Sigma-Aldrich，F7425），抗PDCD11（Sigma-Aldrich; HPA017924），抗P65 ser536（Cell Signaling Technology，3031），抗-α-微管蛋白（Sigma-Aldrich，T9026），抗β-肌动蛋白（Cell Signaling Technology，8457）和抗LaminB1（Cell Signaling Technology，13435）。
在5％CO 2的存在下于37°C的湿润培养箱中培养细胞。从ATCC获得的293T和Hela细胞在补充有10％胎牛血清，100 IU / mL青霉素和100μg/ mL链霉素（Gibco）的DMEM培养基中培养。通过STR分析验证细胞系的身份。常规对研究中使用的所有细胞进行支原体检测，并确认检测为阴性。对于细胞转染，根据制造商的说明书使用Effectene转染试剂（QIAGEN，1012829）。NF-κB结合基序驱动的荧光素酶报告基因和人类TGFB1（转录起始位点上游1.3kb）被使用。将C-Coil（150 ng）和/或c-Rel（150 ng）以及Renilla构建体（5 ng）转染进293 T细胞（24孔板中每孔融合度为60％–70％）和荧光素酶活性根据制造商的说明（Promega）进行评估。诱变在TGFB1启动子上进行（Invitrogen，A13282）
连接在60 hpf的Tg（mpeg1：EGFP）转基因胚胎，并在37°C下用0.5％胰蛋白酶（Gibco）消化15分钟，以分析小胶质细胞基因标记。受精后六十小时，斑马鱼的大脑在消化前被切断。以400× g离心 5分钟，用PBS洗涤两次，并通过40μm尼龙筛网过滤器后，使用MoFlo装置（DakoCytomation）对单细胞悬液进行荧光激活的细胞分选。EGFP阳性细胞用于下游qPCR测定。
如先前所述携带细胞IF。首先固定并封闭在盖玻片上生长至60％融合的细胞，然后与小鼠抗FLAG（Sigma-Aldrich，F7425）孵育。山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 594（Invitrogen）。
使用Olympus FV1000扫描共聚焦显微镜拍摄斑马鱼IF染色图像。用UPLSAPO 40倍或60倍物镜捕获共聚焦图像。使用具有UPLSAPO 60x物镜的Leika收集免疫染色的细胞图像。
分别收集了来自22 hpf WT和pdcd11突变体的总RNA，并进行了RNA-seq。上海新型生物信息学公司提供了深度测序服务。
对于进行的所有实验，将斑马鱼胚胎随机分配到每个组。根据表型变化评估实验结果。使用Student's t检验（双面）或对数秩检验进行统计分析。统计学意义被认为是P ＜0.05。
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