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双重DNA参与和RPA反向调节CMG解旋酶的DNA解旋速率

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发表时间：2020-07-27 16:15作者：武汉新启迪生物Xinqidibio来源：www.qidibio.com

双重DNA参与和RPA反向调节CMG解旋酶的DNA解旋速率

环形解旋酶可在所有生物体的染色体复制过程中解开DNA。复制解旋酶通常比其体内复制叉速率解链双链DNA慢一个数量级。然而，由复制解旋酶引起的缓慢的DNA解旋速率的起因以及其他复制组分增加解旋酶速度的机制尚不清楚。在这里，我们证明了真核CMG解旋酶与模板DNA在复制叉处的结合会削弱其解旋酶活性，这可以通过单链DNA结合蛋白RPA与排除的DNA链的结合来缓解。有趣的是，我们发现，当由于与亲本双链体的相互作用而停滞时，DNA重新压缩诱导的解旋酶回溯会重新建立高效的解旋酶-叉子结合，强调了在解旋酶作用中可塑性的重要性。我们的工作为通过复制解旋酶进行相对较慢的双链体展开提供了机械基础，并解释了与排除的DNA链相互作用的复制子组分如何刺激分叉速率。

介绍

所有细胞都利用一种环状解旋酶，该酶在染色体复制过程中将DNA双螺旋的两条链分开。复制解旋酶在细菌噬菌体T7中形成同六聚体复合物，例如gp4，在细菌中形成DnaB，在猿猴病毒40（SV40）中形成大T抗原，在牛乳头瘤病毒中形成E1解旋酶，并在古细菌1中形成微染色体维持（MCM）。同源六聚体性质的唯一已知例外是真核复制性DNA解旋酶，其包含含有六个不同但高度相关的AAA + ATPase的Mcm2-7马达。在G1期，Mcm2-7中环被加载到双链DNA为双六聚体2，3，4，5。在S期解旋酶激活时发生在其中心信道成单链（ss）DNA和CDC45 GINS，和从环绕双链（DS）Mcm2-7中的随后重塑的结合6，7，8。通过ATP水解，Cdc45 / Mcm2-7 / GINS（CMG）复合物沿着前导模板在3'-5'方向移位，并在复制叉6上解开DNA 。除了其在DNA解链中的作用外，复制解旋酶还充当枢纽，在自身周围组织其他复制因子，从而组装了复制体。

CMG首先是通过纯化果蝇胚胎提取物9的复合物进行生化分离。重组果蝇，酵母和人类CMG复合物后显示出在含有ATP依赖的方式Y形叉结构（叉DNA）退绕的DNA底物10，11，12。当在叉上解开DNA时，分离的CMG可以自由地绕过滞链模板上的蛋白质障碍，这表明该链在易位7时被排除在解旋酶中央通道之外。因此，CMG的功能通过空间排阻，一种机制，通过所有已知的复制解旋酶共享6，13，14，15，16。

使用单分子磁镊子，我们先前发现个别果蝇 CMG络合物表现出前向和同时退绕的dsDNA向后运动17，类似于E1和T7 GP4解旋酶15，18，19。此外，解旋酶通常进入长寿命的暂停状态，导致平均解链速率为每秒0.1–0.5个碱基对（bp s -1），这比在体内观察到的真核复制叉速率慢大约两个数量级20，21。但是，最近使用酵母CMG进行的单分子研究表明解旋酶在5–10 bp s -1 22上在ssDNA上易位。单分子轨迹通过其他可复制解旋酶如DNAB和GP4建议的dsDNA开卷期间解旋酶暂停是这些酶的一般性质18，23。然而，尚不清楚为什么复制解旋酶在叉处移动时经常停止，以及整个复制体如何实现更高的速度。

DNA的通过退绕速率大肠杆菌当与它们相应的复制聚合酶接合DNAB和T7 GP4基本上增强24，25，这表明叉进展在真核生物中的速率还可以取决于DNA合成。同样，CMG与前导链聚合酶的解偶联会导致在体外纯化的酵母系统中叉子减慢26。因此，当DNA合成受到抑制时，非洲爪蟾卵提取物中的解旋酶速度降低了5-10倍[ 27]。但是，这种CMG易位率的降低不足以解释分离的CMG 17在DNA解链中所见的低约100倍的速率。因此，除了聚合酶外，其他与复制体相关的因子对于增加解旋酶解链DNA的速率可能也是必不可少的。有趣的是，在CMG驱动的DNA解旋过程中，ssDNA结合蛋白RPA的单分子可视化表明果蝇 CMG 在叉子7处以8 bp s -1的平均速率前进。该结果表明，RPA与解链DNA的结合提高了CMG的易位率。RPA引起的速率增加的一种可能解释是RPA与CMG后面的易位链以及解旋酶回溯的伴随障碍有关。此外，RPA与排除链的结合可能会阻止DNA在解旋酶之前的重新退火，从而提高解链速率。最后，RPA结合还可通过改变CMG与排除链的相互作用来影响解旋酶活性。

通过复制解旋酶通过其与排除链的相互作用来控制DNA解链已在不同生物中得到证实。尽管有人提出将置换链包裹在古细菌MCM周围以增加其解旋酶活性28，但DnaB与置换链通过其外表面的相互作用会不利地影响DNA的解链29。虽然尚不清楚CMG是否通过其外表面上的特定残基与滞后链模板接触，但被排除的链的存在对于CMG解开dsDNA至关重要。值得注意的是，通过CMG解开合成DNA底物不仅依赖于3'ssDNA尾巴与CMG结合的可用性，还依赖于5'突出端的存在。上缺少5部分地双重化DNA一旦符合双重化区域'侧翼，CMG结合的3'单链DNA，随后滑动到双链DNA 11，30。同样，T7 GP4，DNAB，并从上的ssDNA与dsDNA易位，而不会遇到的冲水β-双链DNA结时退绕模板古细菌MCM转移14，31，32，33。在双链DNA上这种非生产性的易位很可能是这些马达的中心孔足够大以容纳dsDNA的结果。

在这项研究中，我们试图解决CMG与叉处DNA的相互作用如何调节其解旋酶活性以及RPA刺激真核复制解旋酶DNA解旋速率的机制。

结果

通过CMG直接可视化RPA促成的放卷

我们先前通过使用全内反射荧光（TIRF）显微镜7证明了CMG驱动的表面固定化2.7-kb dsDNA底物通过EGFP标记RPA（EGFP-RPA）的积累而展开。为了更直接地评估CMG使DNA解链的能力和速率，我们检查了荧光标记的CMG复合物在含有叉端的10 kb线性dsDNA分子上的易位性（图 1a）。DNA分子在叉形末端拴在玻璃表面，在另一末端拴在微球上。叉子的3'尾部包含一个40 nt的polyT ssDNA（dT 40），用于CMG结合，并带有一个Cy3荧光团以跟随易位链的位置（图 1a）。将DNA固定在表面上后在图1b）中，将荧光CMG（CMG LD655）吸入流通池中，并在ATPγS存在下孵育。随后，将流道中的CMG-ATPγS混合物换成含有ATP和EGFP-RPA的溶液（图 1c）。在没有缓冲液流过流通池的情况下进行了近TIRF成像。我们观察到EGFP-RPA最初在拉伸的DNA的叉状末端结合，然后向着微球束缚的末端以线性束的形式生长（图 1d，左侧面板）。由EGFP-RPA结合的前导模板被压实，并显示为在叉处移动的衍射受限斑点。当省略了包含ATPγS的缓冲液中的CMG或随后的RPA补充溶液中的ATP时，我们没有检测到线性EGFP-RPA片段，这表明我们正在观察CMG依赖的叉的展开。大约25％的RPA道包含标记的CMG在叉处易位（图1d，中间图）。标记的CMG分子相对较低的比例很可能是由于荧光团的低效缀合或随后的光漂白。Cy3标记的易位链与预期的亮EGFP-RPA点共定位（图 1d，右侧面板）。通过CMG，许多10-kb DNA分子以4.5±1.6 bp s -1（平均±SD）的平均速率完全解链（图 1e）。大多数分子没有完全解开，可能由于CMG遇到拉伸DNA上的缺口而被打断。在某些分子上，RPA涂层的前导链模板的未缠绕区域与拉伸的落后链模板分离（补充图 1a）或沿着（补充图1b）扩散。我们将这些观察结果归因于CMG在前导模板上遇到缺口。标记的CMG在碰到前导链切口时总是从DNA上解离，这表明解旋酶从易位链的游离5'末端流出（补充图。 1a，b）。在其他情况下，部分解链的拉伸DNA断裂，这表明CMG在落后链模板上碰到了一个缺口（补充图 1c）。尽管退绕的落后链模板立即移动到了表面束缚点，但退绕的领先链模板和CMG移向了微球体（补充图 1c）。在我们先前的研究7中，我们使用了未拉伸的DNA分子并仅根据EGFP信号强度的水平来测量退绕速率。因此，将CMG遇到缺口的任何事件都记为解开整个DNA的分数，这可能导致解开速率的高估（8.2 bps -1而不是4.5 bp s -1）。在一起，我们的结果清楚地表明，当RPA可用时，单个CMG解旋酶可以以与解旋酶22的ssDNA易位率相匹配的速率解开数千个dsDNA碱基对。

RPA可提高CMG解开DNA的速度

与在RPA存在下通过单分子荧光成像测量的结果相比，仅通过CMG 17进行的双链解绕速度非常低（0.1-0.5 bp s -1）（图 1）。因此，必须在RPA的刺激下将dsDNA展开的CMG的易位速度提高一个数量级。因为这些测量是在不同条件下使用两种不同的实验方法完成的，所以我们使用单个试验比较了有和无RPA时叉处CMG移位的速率。我们检查了叉DNA底物在集合水平上的CMG解旋酶活性，该底物在5'落后链臂dT 40上包含10个重复的GGCA序列d（GGCA）10重复。3'臂和dsDNA的236 bp（图 2a）。首先将CMG与叉子底物在ATPγS存在下孵育，以使其与3'尾巴结合。d（GGCA）10序列折叠成二级发夹状结构，并阻止CMG结合至该链34。我们证实，在没有CMG的情况下，仅RPA不会解开该DNA底物（图 2a，泳道2）。CMG结合后，将ATP添加到反应中以触发解旋酶易位。当RPA与ATP同时添加时，我们观察到底物以CMG依赖性方式显着展开（图 2a，第4道）。相反，当从反应中省略RPA时，未检测到退绕（图 2a）。，泳道3），最有可能是由于解旋酶后面的互补链重新退火所致。为了克服这一限制，我们生成了一个相似的叉子底物，该底物在252 bp双链体的下游包含Cy5标记的寡核苷酸。Cy5标记的链包含ad（GGCA）10 5'尾和与易位链的28-nt互补序列（图 2b）。因此，CMG应该置换Cy5修饰的链，即使它可以在252 bp dsDNA内转位，即使DNA在前进的解旋酶之后倒带也是如此。为了测量CMG易位的动力学，在添加ATP之后的不同时间将反应淬灭。当RPA与ATP一起添加时，CMG迅速置换了Cy5标记的链（图 2c）。）。为了量化依赖CMG的退绕，校正了仅靠RPA置换的Cy5修饰链的数据（补充图 2a）。即使没有RPA（图2d），CMG也会在很大程度上取代Cy5修饰的链（图 2d），表明236 bp双链叉上链分离的缺乏（图 2a）是由于追随解旋酶的DNA复绕。解开28 bp的双链体区域取决于CMG与上游3'dT 40 ssDNA尾部的结合（补充图 2b），表明解旋酶在置换Cy5修饰的链之前通过252 bp的双链体易位。在存在RPA的情况下，CMG以观察到的k速率解链所有280 bp（252 bp + 28 bp）。obs = 1.31±0.11 min -1（图 2e，实线），导致DNA展开速率为6.1±0.5 bp s -1（280 bp× k obs），与单分子测量非常吻合（图。 1）。相反，仅CMG以k obs = 0.048±0.003 min -1的速率置换Cy5修饰的链，表明DNA的解链速率为0.22±0.01 bp s -1（图 2f，实线），与用磁镊测量的线性退绕率17。因此，此处描述的基于凝胶的解旋酶测定表明，RPA与单分子研究一致，将叉处CMG的转运速率提高了一个数量级。重要的是，由于在没有RPA的情况下展开长双链DNA时，DNA在解旋酶后面重新退火（图 2a，c），因此由于防止了解旋酶回溯，RPA不可能刺激解旋酶速度。

前叉的双重啮合阻碍了CMG解旋酶的活性

我们的磁性镊子测量结果表明，分离的CMG解开DNA的缓慢特性是由于解旋酶频繁进入长寿命的暂停状态17。我们希望确定这些暂停事件的起源。鉴于CMG具有环绕dsDNA的能力，我们考虑了以下可能性：沿着前导模板转运时，解旋酶可能会在叉交叉处与亲本双链体相互作用，成为非通路相互作用。据报道，由于T7 gp4与叉形DNA底物上的亲本dsDNA相互作用，抑制了解旋酶活性33。另外，在双工叉DNA的排除增强链DNAB解旋酶活性已被归因于在解旋酶在叉环绕亲双链体DNA的概率下降14，35。为了支持该模型，通过点突变来限制DnaB的中央通道导致了叉子DNA的解脱水平升高36。同样，在释放dsDNA的同时，CMG可能会经常滑入叉状叉状结构，以捕获其中央通道中的双链DNA片段，并可能进入非转运状态。基于此模型，双链体的形成（从而加强和扩大叉状DNA的置换臂）应通过阻止在叉形交界处环绕双链DNA的解旋酶环来刺激DNA释放，如DnaB 14所示。在先前的工作中，我们在5'滞链臂7上使用了带有d（GGCA）10的叉形基板。由于此序列折叠成二级结构，因此可能会阻止CMG在叉形连接处部分包围亲本双链体。我们发现用dT 40代替5'尾部的d（GGCA）10导致CMG解链DNA减少两倍（补充图 3a），这与预测叉叉处的双链体结合会损害CMG易位的预测相符。我们使用基于荧光的单周转动力学展开实验7更详细地测试了该模型。此测定中使用的fork DNA模板包含28 bp的双链DNA，即dT 40单链（Fork ssLag）或双链滞后臂（Fork dsLag）的前导臂和22 nt长（图 3a和补充图 3b）。用前导链模板的5'末端的Cy5和互补链上的BHQ2淬灭剂修饰叉状底物，使链分离导致荧光增加（图 3a）。为了检测单周解开动力学，将CMG在ATPγS存在的情况下预先结合到货叉上，然后将ATP与竞争性寡核苷酸一起添加以螯合游离的CMG（补充图 3c）。我们确认荧光的增加取决于CMG的预结合以及随后在28 bp的双链叉上添加ATP（补充图 3d）。重要的是，Fork dsLag的荧光增强程度高于Fork ssLag（图 3b），表明与我们的假设相符的展开程度更高。为确保此效果并非归因于解旋酶结合两种底物的效率差异，首先将CMG与Fork ssLag结合，然后在存在与落后链尾互补的其他寡核苷酸（Comp LagTail）的情况下触发ATP 释放。。Comp LagTail的添加ATP的作用足以提高叉的解开水平（补充图 3e），这表明双链5'尾部刺激CMG解旋酶活性，而不是适当的叉结合。但是，我们不能排除CMG在与ATPγS结合到前叉基质上时环绕其中央通道的3'-和5'-ssDNA尾巴的可能性，并且添加Comp LagTail可以配置CMG从解旋酶中排除5'尾巴毛孔。

为了排除改进叉子dsLag的解链是DNA模板而非CMG解旋酶的固有特征的可能性，我们分析了大T抗原和NS3（3'–5'解旋酶）对相同叉子底物的解链动力学。尽管提出了大的T抗原六聚体以在复制起点37处包围dsDNA，但是运动域内的解旋酶中心通道比dsDNA的横截面窄。结果，大的T抗原可以解开缺少5'-ssDNA襟翼的部分双链DNA底物38。因为大的T抗原应该不太容易在叉子上滑到双链DNA上，所以与CMG相比，通过双叉的5'尾巴进行双螺旋来刺激解旋酶活性预计不会那么明显。一致的是，当用CMG展开时，叉dsLag的荧光增强比叉ssLag的荧光增强10倍，而在大底T抗原催化的两种底物展开时，此变化仅为1.5倍（图 3c，e）。该结果表明复制性解旋酶通过叉处的双链DNA相互作用对DNA解链的调控与其在dsDNA上易位的能力有关。为了进一步测试我们的模型，我们测量由NS3从丙型肝炎病毒，缺乏中央孔如在复制解旋酶中发现的单体解旋退绕叉DNA的39，40。如预期的那样，当叉的5'尾部被双工化时，未检测到NS3解旋酶活性的改善（图 3d，e）。在一起，我们的数据有力地表明，双链叉DNA的落后链臂的双链通过阻止解旋酶孔围绕叉链的双链DNA来刺激CMG解旋酶活性。

CMG驱动的叉式收卷机的单分子分析

为了独立地验证图3中所示的基于荧光的集成实验的结果，我们设计了一种单分子测定法，以直接监测CMG展开的DNA。为此，将在置换链的5'端带有Atto647N荧光团的叉子DNA固定在微流体流通池的玻璃表面上（图 4a））。将CMG在ATPγS存在下引入，并使其与表面束缚的叉子DNA的3'尾结合。随后，将ATP抽入流通池以开始展开，同时使用TIRF显微镜对Atto647N标记的链进行成像。根据置换链解离时荧光信号的损失来评估叉子底物的展开，置换链仅通过生物素修饰的易位链与表面偶联。校正光致漂白后（补充图 4），我们发现CMG解开了表面固定DNA的20–30％（图 4a，c，ssLag叉））。为了检查双叉的落后链臂是否会改变解链效率，我们在CMG结合之前将互补寡核苷酸退火至固定叉DNA的5'ssDNA尾部。加入ATP后，将60-70％的Fork dsLag退绕（图 4b，c，Fork dsLag）。因此，DNA展开的单分子可视化证实了双链叉DNA的落后链尾双链体对CMG解旋酶活性具有深远的刺激作用。

RPA与排除链的结合促进DNA解链

在真核复制叉处，前导链是在CMG之后合成的，而落后链的复制是通过冈崎片段的不连续合成进行的。虽然叉叉连接附近的滞后链模板在叉叉进行过程中仍为单链，但它被单链结合蛋白复制蛋白A（RPA）结合，这可能阻止CMG在其中心孔中部分环绕被排除的链。该模型可以解释如何RPA加快双链DNA通过CMG（图退绕 1和2）7，17。我们使用荧光猝灭剂标记的DNA展开试验测试了RPA与排除链的结合是否可以刺激CMG展开叉子DNA的能力。在将CMG与ATPγS结合到叉子DNA上之后，在添加ATP之前，先添加RPA以结合叉子的5'尾巴。一旦解绕开始，捕获寡核苷酸也包含在ATP中，以隔离过量的CMG和RPA与DNA的结合。添加25 nM RPA会导致Fork ssLag上的荧光信号提高三倍（图 5a）。在此RPA浓度下，放卷严格取决于CMG（补充图 5a）。至关重要的是，RPA不会增加CMG 对dsLag叉的退绕（图 5b）。），证实RPA与Fork ssLag的落后链臂的结合是观察到的刺激的原因。这些结果表明，RPA与滞后链模板的结合通过阻碍解旋酶与叉形交点处亲本双链体的结合而增强了CMG解旋酶的活性，从而提供了有关RPA如何加速CMG驱动的DNA退绕的机制的见解。

滞后链霉亲和素可增强CMG解旋酶活性

我们的研究结果表明，当单链时，叉状联系附近的排除链对CMG的叉解开具有抑制作用。尽管观察到的抑制的一个可能原因是置换的链部分被解旋酶中心孔包埋，但另一个考虑因素是置换的链与CMG外表面的相互作用。如果CMG的外部不利的滞后链模板之间的物理接触影响解旋酶的活性，如建议DNAB 29互补寡核苷酸的杂交或RPA与叉底物的落后链臂的结合可能会通过破坏这种相互作用来刺激DNA解链。为了确定CMG解旋酶活性的抑制作用是否源于它与解链酶通过解旋酶外部残基的相互作用，我们设计了一个在ssDNA-dsDNA接点的一个滞后链臂上包含一个生物素的叉子DNA底物。尽管在此位置与生物素结合的抗生蛋白链菌素不应阻止CMG的外表面与滞后链臂相互作用，但有望防止解旋酶环包围排除的链。将链霉亲和素添加到5'尾巴上用生物素修饰的叉子DNA中可增强CMG解旋酶活性（图 5c））类似于双链5'尾部观察到的水平（图 3b）。在非生物素化的叉子基质上添加抗生蛋白链菌素没有影响（补充图 5b，c），表明抗生蛋白链菌素通过结合至叉子模板的5'尾部促进了CMG驱动的叉子的退绕。总之，我们的数据表明CMG在通过其中心孔与落后链模板结合时会暂停，并且这种非生产性解旋酶-前叉的排列可通过蛋白质与落后链模板的结合来避免。

DNA重退火可以使CMG从双链体结合状态释放出来

可以想象的是，当复制叉附近的落后链模板没有被RPA等蛋白质占据时，CMG偶尔会在复制叉上停滞在复制叉上。要恢复DNA解绕，解旋酶必须退出此暂停状态。作为CMG表现在DNA开卷偏置随机游走17，我们的理由是，解旋酶应该能够向后并恢复移动到链排斥模式，如果由于环绕双链DNA的短道暂停。为了研究CMG是否可以退出双链结合模式，我们允许解旋酶首先进入由28 bp dsDNA组成的图3（Fork ssLag）所用的叉子基质中的捕获状态。为此，CMG首先绑定到Fork ssLagATPγS引起的，随后其易位由ATP触发。当在之前（图6a，Comp LagTail →ATP，蓝色）或与ATP（补充图3e）一起添加仅与叉的单链5'尾互补的寡核苷酸时（Comp LagTail），或者与ATP一起添加（补充图3e）。与缺乏Comp LagTail的反应相比增加了。令人惊讶的是，当在ATP后2分钟引入时，Comp LagTail不会刺激DNA解开（图 6a，ATP→Comp LagTail，红色），这表明一旦CMG与叉状联系处的双链DNA结合，解旋酶就会永久性停止，无法从亲本dsDNA撤回或脱离。由于CMG的反向运动是由磁性镊子测量中的DNA重新压缩推断出来的[ 17]，因此我们设想可能需要在CMG之前进行叉状重新退火以将解旋酶向后推以退出暂停状态。在这种情况下，当CMG在图6a中使用的叉子基板上添加ATP后与亲本双链体接合时，由于两个非互补ssDNA尾部不退火，因此它无法退出此暂停状态。结果，在ATP之后充分添加Comp LagTail不能挽救展开（图 6a，ATP→Comp LagTail，红色）。

为了研究CMG是否可以由于DNA再退火而退出双链结合模式，我们测量了其在含有60 bp dsDNA和d（GGCA）10 5'尾巴的叉子底物上的解旋酶活性，以防止解旋酶进入ss附近的暂停状态。 -dsDNA连接（补充图 3a）。在此底物上存在相对较长的dsDNA，使得CMG可能在展开60 bp的双链体区段时进入上述停滞状态。但是，如果DNA复性可以使CMG从双链结合模式中释放出来，则60 bp区域内的解旋酶暂停不应是永久性的，因为解旋酶前面的两条互补链可以重新退火（图 6b））。在该测定中，我们在ATP之前或之后仅在亲本双链体区域（Comp LagParent）内添加了与排除链互补的32-nt寡核苷酸。当包含在ATP之前时，Comp LagParent增强了CMG的解链作用（图 6b，Comp LagParent →ATP，蓝色），这表明解旋酶与dsDNA结合在60 bp亲本双链体中并在解链过程中停滞。令人惊讶的是，即使在ATP后20分钟引入Comp LagParent，CMG介导的该底物的退绕也得以迅速恢复（图 6b，ATP→Comp LagParent，红色）。为了确定这种刺激是否是由于解旋酶后面的未缠绕DNA链再杂交的抑制，我们测试了与亲本双链体中的前导链模板互补的寡核苷酸（Comp LeadParent）对展开的影响。Comp LeadParent的 DNA解链增加明显低于Comp LagParent（补充图 6），表明Comp LagParent增加了解旋酶活性不能仅将其归因于CMG之后抑制fork DNA的再退火。总之，这些数据与以下观点一致：如果亲本双链体侵入CMG中央通道，则在解旋酶之前对DNA进行重新退火可以通过促进向后移位而使CMG从这种非活性的叉子结合模式中解放出来。

CMG绕过滞链DPC而不会停顿

CMG在叉形DNA上的低温EM结构表现出一小段dsDNA，被Mcm2-7的N末端锌指（ZF）突起包围（41-43）。提出了移位的滞后链模板的可能出口路线由MCM ZF突起之间的空腔中形成42，43。如果在展开过程中移位的链条通过MCM ZF域之间的狭窄开口退出，则CMG在与该链条上的笨重障碍碰撞时会暂停。我们先前证明，尽管甲基转移酶与落后链模板交联可减慢CMG的DNA解链速度，但共价滞后链链霉亲和素嵌段并不会改变CMG动力学7。这两种类型的DNA-蛋白质交联（DPC）之间有两个主要区别。首先，甲基转移酶与两条DNA链相互作用并增加了双链DNA的稳定性，因此阻碍了CMG易位7。第二，尽管甲基转移酶直接交联至碱基，但是链霉亲和素通过柔性接头连接至DNA。因此，在连接链抗生蛋白链菌素屏障处没有CMG减慢可能是由于接头通过MCM ZF域之间的狭窄通道逃逸。为了测试这种可能性，我们使用5-甲酰基（5FC）修改以形成缺乏DNA和链霉抗之间的连接体一个DPC 44，45（图 7a中）。我们在60 bp亲本双链体的中间的滞后链模板上生成了一个包含单个5fC-链霉亲和素交联的叉状底物（补充图 7）。我们使用基于荧光的单周转动力学退绕测定法测量了退绕动力学，如图3所示。重要的是，我们发现含有5fC-链霉亲和素交联键的叉子DNA被CMG解链的效率和非加合物底物一样快（图 7b）。）。该结果表明，在退绕过程中，滞后链模板不太可能通过Mcm2-7的N端区域中的紧密间隙排出。再加上我们的数据表明CMG的双链体结合会严重降低DNA解链过程中的速度，我们更喜欢这样一种模型，其中CMG通过MCM ZF结构域环绕亲本双链体与叉子结合，反映了停滞的解旋酶。因此，在果蝇 CMG /叉子DNA结构中观察到相对于MCM N端区域的父母双链体有多种不同构象，表明解旋酶43在双链体结合中具有可塑性。

讨论区

在这里，为了揭示分离的CMG解旋酶活性差的根源，我们研究了解旋酶解链的DNA如何通过其与复制叉的相互作用来调控。我们发现CMG与ss-dsDNA叉子连接处的相互作用可能导致解旋酶失速，这可能是由于亲本双链体在解旋酶中央通道内的部分夹带所致，这解释了在解开叉子时CMG的移位非常慢（图 8a）。

类似于CMG，由T7 GP4和双工开卷大肠杆菌 DNAB，可以在双链DNA易位，是通过它们与在叉路口双链DNA的相互作用阻碍了14，33，35。DNA发夹通过T4 gp41的，T7 GP4，和退绕的测量大肠杆菌 DNAB用单分子的磁性和光学镊子表明，这些复制解旋退绕的dsDNA 5-10倍慢与他们的ssDNA移位率相比19，23，47。同样，尽管CMG以0.1–0.5 bp s -1的速率解链dsDNA （17），但它以5–10 nts -1的平均速率转移到ssDNA上22 ，差异超过10倍。大的T抗原是另一种环状复制解旋酶，解链dsDNA的速度仅比其在ssDNA 48上易位的速度慢两倍。尽管大的T抗原在遇到齐平的ss-dsDNA连接后不会滑落到dsDNA上，但在叉形连接处它仍可能与亲本双链体相互作用。这个想法与我们的观察结果相符，即双链叉DNA的落后链臂可刺激T抗原解旋酶活性，尽管程度要比CMG小得多（图 3）。）。在一起，我们的结果支持一个模型，在该模型中，由于亲代双链体结合导致的DNA解旋抑制是复制性解旋酶之间的共同特征，并表明解旋酶在叉子处减慢的可能性与它们沿dsDNA转运的能力有关。

gp4解旋酶与T7复制体中的前导链聚合酶偶联将解旋酶中心通道轴垂直于亲本DNA 49定位。该观察结果与以下预测相符，即前导链聚合酶通过阻止解旋酶与双链体DNA的结合来刺激gp4释放DNA。我们推测，与聚合酶24偶联后，DnaB中的分叉速率更快可能是通过相同的机制。与噬菌体和细菌不同，在真核生物中，前导链聚合酶（聚合酶ε（Polε））位于解旋酶后面。因此，前导链合成不会阻止CMG侵入亲本DNA。相反，Polε与CMG后面的DNA结合可能会进一步导致叉子暂停，因为CMG回溯似乎对于挽救解旋酶从双链结合构象中恢复至关重要（图 6），这可能解释了CMG在Pol中的蛋白质壁垒处暂停ε依赖方式50。

我们证明RPA绑定到叉DNA的滞后链臂可防止解旋酶与叉连接附近的亲本双链体结合（图 8b）。因此，我们建议RPA绑定到滞后链模板对于正确的复制叉进展至关重要。因此，我们表明，单个CMG复合物可以在RPA存在下以与ssDNA 22上CMG的速度相似的速度连续解开数千个碱基对的DNA 。因为RPA可以沿着ssDNA 51扩散，所以我们设想溶液中的新RPA不需要立即与解旋酶附近的新兴滞链模板结合，以支持解链。我们注意到大肠杆菌单链结合蛋白也加快了CMG驱动的双链解开17。因此，像RPA一样，其他复制因子（例如聚合酶α-primase，Mcm10和AND-1（Ctf4））也可以通过阻止解旋酶与亲本双链体相互作用来促进DNA解旋。在没有RPA的情况下，CMG无法驱动大量的DNA解旋将对细胞有益。具体而言，在RPA耗尽的条件下，MCM孔的N端区域捕获亲本双链体将导致解旋酶减慢并阻止未保护的ssDNA的积累。当由于与亲本dsDNA的结合而停滞时，我们建议对亲本双链体进行重新退火将使CMG向后移动并恢复DNA的解链（图 8a）。）。真核复制解旋酶向后移动的可塑性对于在复制叉反转52期间将复制体保持在适当位置可能特别重要，这样复制叉就可以重新启动而无需将新的解旋酶加载到DNA上，而S阶段53抑制了复制。此外，5'–3'解旋酶还可能通过作用于复制叉处的排除链来帮助挽救双链体结合的CMG。被提议在CMG中打开门的Mcm10也可以促进双螺旋DNA从解旋酶中央通道22的置换。

目前尚不清楚最近CMG结构在复杂的叉DNA的MCM ZF域内表现出的dsDNA是否表示在活动叉展开状态或暂停状态中的解螺旋酶41，43。因为CMG在RPA的帮助下可以更有效地解链dsDNA，所以在RPA存在下解链双链DNA时，CMG的高分辨率结构应进一步阐明解旋酶如何与真核复制体中的DNA结合。

果蝇 CMG在RPA存在下的DNA解链速率（4.5 bps -1，图 1）仍然比果蝇中的平均细胞复制叉速率（〜43 bps -1）低一个数量级54。观察，当CMG从前导链合成脱开退绕速率降低26，27指示POL ε增加复制叉率。在酵母中，MRC1-TOF1-CSM3络合物（Claspin的-天时-Tipin在后生动物）被报告以进一步增强叉速度46，55。通过该POL的分子机制ε和Mrc1-Tof1-Csm3加快叉子进展尚不清楚。在没有DNA合成的情况下，测试这些因素是否可以刺激CMG释放DNA至关重要。

方法

DNA底物

补充表 1列出了用于制备各种DNA底物的寡核苷酸（寡核苷酸）列表和相应的图号。寡核苷酸序列可以在补充表2中找到。

为了制备叉子DNA底物，将补充表1和2中所列的寡聚物（最终10 µM）在STE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl，1 mM乙二胺四乙酸； EDTA）中混合，加热至85°C，使其缓慢冷却至室温。必要时，将DNA底物与T4 DNA连接酶（NEB）连接起来以密封切口。除非另有说明，否则将所得产物在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上分离并通过电洗脱纯化。使用3.5 kDa MWCO透析管（Spectra / Por，Spectrum Labs）在1x Tris /硼酸盐/ EDTA缓冲液中进行电洗脱。

通过在Cy5-dCTP（GE Healthcare）存在下使用引物Oligo-2和Oligo-3对pHY10 56的314 bp片段进行PCR扩增，制备了包含236 bp双链体和内部Cy5的叉状DNA（图 2a）。使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR反应，用NcoI消化，并在2％琼脂糖凝胶上分离。使用凝胶提取试剂盒（Qiagen）纯化所得的具有5'-CATG-3'突出端的211bp片段，将其连接至通过Oligo-4和Oligo-5退火产生的短叉的10倍过量。在8％PAGE上分离最终产物，并通过电洗脱纯化。用下游28-bp双链体和3'-Cy5修饰链制备252-bp双链体叉（图 2b），使用引物Oligo-2和Oligo-17 PCR扩增pHY10的314 bp片段。用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化反应后，将底物用Nco I和Hin dIII（NEB）切割，在2％琼脂糖上分离后纯化，并连接至退火的寡核苷酸，并从8％PAGE纯化。而的Nco I-消化的末端被连接到寡-4 /寡-5，欣 DIII处理端被连接到寡-15 /寡16 /寡Cy5-6。最终反应在2.5％琼脂糖上分离，并使用电洗脱纯化。使用完全相同的方案制备缺少40nt 3'polyT尾巴的底物（补充图 2），只是用Oligo-18代替了Oligo-5。

为了制备5fC-链霉亲和素交联的叉子底物（图 7），将1 nmol 5fC修饰的寡核苷酸（Oligo-5fC）与1 mg链霉亲和素（Sigma）在100 µl磷酸盐缓冲液（PBS）中于55°C孵育10分钟。 4小时，然后在37°C下放置12小时。在1x TBE中的8％PAGE上分离DNA。切取对应于链霉亲和素交联的寡核苷酸的条带（反应的1-2％），通过电洗脱纯化，退火并连接至补充表1中所列的其他寡核苷酸。在8％PAGE上分离后，再次通过电洗脱纯化链霉亲和素交联的叉子。

通过ApaI（NEB）处理λDNA，可生成用于单分子分析（图1）的10kb线性DNA 分叉。使用Monarch凝胶提取试剂盒（NEB）从0.5％琼脂糖凝胶中纯化ApaI切割的λDNA的10 kb片段。我们在3'dT 40上产生了包含5'生物素和Cy3的前叉末端通过对Oligo-Bio-4和Oligo-Cy3-1进行退火，可得到一个与10 kbλ-ApaI片段一端互补的12 nt ssDNA。为了用地高辛配基标记10 kb DNA的另一端，在存在地高辛配基11-dUTP（Roche）的情况下，用引物Oligo-1和Oligo-8从pUC19载体中扩增了一个0.5 kb的片段。然后将地高辛配基修饰的PCR底物用ApaI消化，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。随后，将2–3 µg 10 kb DNA与10倍摩尔过量的Cy3生物素标记的叉子底物和洋地黄毒苷修饰的PCR模板混合，并与T4 DNA连接酶连接。将反应混合物与15 µg链霉亲和素混合以附着到叉子的生物素末端，在1x TBE中的0.5％琼脂糖上分离，并通过电洗脱纯化。

蛋白质表达和纯化

果蝇 CMG

果蝇 CMG表达，并纯化，如前所述7，10。将每个包含果蝇 CMG 单个亚基的pFastBac1（pFB）载体转化到DH10Bac 大肠杆菌感受态细胞（Thermo Fisher）中以生成杆粒。Mcm3亚基包含用于纯化的N端Flag标签。将Sf21细胞（10 6 / ml）用于初始转染（P1期），并在随后的病毒扩增阶段中使用Sf-900TM III SFM昆虫细胞培养基（Invitrogen / Gibco）制备P2储备液。在所有病毒扩增阶段，将细胞在27°C孵育，同时以120 rpm摇动。为了进一步扩增病毒原种（P3期），使用100 ml Sf9细胞培养物（0.5×10 5/ ml）的Graces培养基中，每个亚基均补充了10％的胎牛血清，并用0.5 ml P2病毒感染，并在500 ml锥形无菌烧瓶（Corning）中孵育〜100小时。每个亚基共用200 ml P3病毒感染4 L的Hi5细胞（10 6 / ml），感染复数（MOI）为5。使用无菌的2 L滚瓶将Hi5细胞分成500 ml等份试样（康宁）。48小时后，以4500× g离心收集细胞。首先用补充有5 mM MgCl 2的 PBS洗涤细胞沉淀，重悬于200 ml Buffer C-Res（25 mM HEPES pH 7.5，1 mM EDTA，1 mM EGTA，0.02％Tween-20，10％甘油，15 mM KCl ，2毫米MgCl 2，2 mMβ-ME（2-巯基乙醇），PI片）（每1 L Hi5细胞培养物中含50 ml缓冲液），并在干冰上以10 ml等分试样冷冻。细胞沉淀保存在-80°C。

除非另有说明，所有纯化步骤均在4°C下进行。将冷冻的细胞沉淀物在温水中解冻，并使用细胞匀浆器（Wheaton，40 ml Dounce Tissue Grinder）在冰上裂解60-70次。通过24,000× g离心去除细胞碎片 10分钟。收集上清液，并与用缓冲液C（25 mM HEPES pH 7.5，1 mM EDTA，1 mM EGTA，0.02％Tween-20，10％甘油，1 mM二硫苏糖醇; DTT）平衡的M2琼脂糖Flag珠（Sigma Aldrich）孵育。）2.5小时。通过与补充了200 µg / ml的缓冲液C-100（25 mM HEPES pH 7.5、1 mM EDTA，1 mM EGTA，0.02％Tween-20、10％甘油，100 mM KCl，1 mM DTT）孵育，从微珠上洗脱CMG。在室温下将15ml肽（DYKDDDDK）处理15分钟。将洗脱液通过用缓冲液C-100平衡的1 ml HiTrap SPFF色谱柱（GE Healthcare）。使用5 / 50GL MonoQ色谱柱（GE Healthcare）用100–550 mM KCl梯度分离CMG。合并含有CMG的级分，稀释至150 mM KCl，并加载到用缓冲液C-150（25 mM HEPES pH 7.5、1 mM EDTA，1 mM EGTA，10％甘油，150 mM KCl，1 mM DTT）浓缩样品。将150–550 mM KCl的梯度洗脱到CMG上。合并含有CMG的级分，并用CMG透析缓冲液（25mM HEPES pH 7.5、50mM乙酸钠，10mM乙酸镁，10％甘油，1mM DTT）透析2小时。

为了制备荧光标记的CMG构建体，将定点诱变（QuikChange，安捷伦）应用于pFB-Mcm3载体以插入TEV裂解位点（ENLYFQG），然后在Mcm3的N端Flag标签下游插入四个Gly残基随后的Sortase介导的标记。如前所述表达并纯化了构建体，并进行了少许修饰。从5 / 50GL MonoQ色谱柱中收集后，将1 ml样品与50μlTEV蛋白酶（1 mg / ml，EZCut TEV蛋白酶，Biovision）混合，并在4°C下用Buffer C-100透析过夜。用TEV处理的样品补充了50μM肽NH 2 -CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH，在半胱氨酸残基上标记了LD655-MAL（Lumidyne Technologies），10μg/ ml分选酶和5 mM CaCl 2，并在4°C下孵育30分钟。通过在缓冲液C-100中通过凝胶过滤（Superdex 200增加10/300 GL）分离样品来除去游离肽。将标记的构建体浓缩在MonoQ PC 1.6 / 5GL上，并如上所述进行透析。

分选酶

C末端6xHis标记的分选酶的基于pET29的表达载体A五突变体（Sortase P94R / D160N / D165A / K190E / K196T）57从David Liu博士（哈佛大学）获得。用表达载体转化的大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞在含50μg/ ml卡那霉素的溶菌性肉汤（LB）中于37°C生长，直到OD = 0.5-0.8，然后用0.4 mM异丙基β- D- 1- 诱导硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在30°C下放置3小时。细胞通过离心收集并重新悬浮在分选酶裂解缓冲液（50mM的Tris pH值8.0，300mM NaCl的，1毫摩尔MgCl 2，2个单位/ ml DNA酶I（NEB），260 nM的抑肽酶，1.2μM亮抑酶肽，1mM苯甲磺酰氟）。超声裂解细胞后，将细胞以7500× g离心 20分钟。上清液中加入10 mM咪唑，与Ni-NTA琼脂糖混合（每8毫升裂解液用分选酶裂解缓冲液预洗涤1毫升床体积），并在旋转振荡器上孵育1小时。将裂解物-的Ni-NTA混合物装入一个重力柱，并用分选酶的洗涤缓冲液（50毫摩尔Tris pH 8.0中，300mM NaCl的，1毫摩尔MgCl五个床体积洗涤两次2，20mM咪唑）。将蛋白质选自Ni-NTA珠在四轮洗脱，每个分选酶的洗脱缓冲液中的一个床体积（50毫摩尔Tris pH 8.0中，300mM NaCl的，1毫摩尔MgCl 2，250 mM咪唑）。合并含有分选酶的级分，并针对分选酶储存缓冲液（25 mM Tris pH 7.0、150 mM NaCl，10％甘油）进行透析。

大T抗原

重组SV40大T抗原使用杆状病毒表达系统制成，并如先前所述16使用单克隆抗体纯化。具有全长大T抗原的pFB被用于制造杆状病毒。使用MOI为0.1 的病毒（2×10 8 pfu / ml）感染维持在SF-900-III中的Sf21细胞72小时。将细胞沉淀重悬于10沉淀体积的L-Tag重悬浮缓冲液（20 mM Tris pH 9.0、300 mM NaCl，1 mM EDTA，10％甘油，0.5％NP-40、0.1 mM DTT）中，并在冰上孵育15分钟分钟。将该悬浮液以25,000× g离心 15分钟。总共添加0.5体积的L-Tag中和缓冲液（100mM Tris pH 6.8、300mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油，0.5％NP-40、0.1mM DTT）并混合。

使用小鼠单克隆抗体（PAb419）亲和纯化蛋白质。将抗体与PBS中的蛋白A Sepharose珠（5 mg / ml）偶联，在4°C旋转过夜孵育。用15 ml pH 9.0的0.1 M硼酸钠缓冲液洗涤珠，然后重悬于2 ml的相同缓冲液中。为了使抗体与珠子交联，将20 ml 12.5 mg / ml的pimelimidate二甲基亚氨酸酯（Sigma）与珠子混合，并在室温下旋转孵育1小时。通过将珠子在0.2 M pH 8.0的乙醇胺中孵育，淬灭偶合反应，在室温下旋转1小时。首先将悬浮在中和缓冲液中的大T抗原上样到仅用蛋白A柱上，并用L-Tag上样缓冲液（20 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl，1 mM EDTA，10％甘油，0.5％NP-40， 0.1 mM DTT）。然后将流通液上样到用L-Tag上样缓冲液平衡过的PAb419偶联柱上。用50 ml L-Tag上样缓冲液，然后50 ml L-Tag-wash缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，1 M NaCl，1 mM EDTA，10％甘油）洗涤色谱柱，然后用20 ml L- Tag-EG缓冲液（50 mM Tris，pH 8.5，500 mM NaCl，1 mM EDTA，10％甘油，10％乙二醇）。大T抗原用5–10 ml L-Tag洗脱缓冲液（50 mM Tris，pH 8.5，1 M NaCl，10 mM MgCl洗脱）洗脱。2、1 mM EDTA，10％甘油，55％乙二醇）透析过夜，进入L-Tag透析缓冲液（20 mM Tris pH 8.0、10 mM NaCl，1 mM EDTA，50％甘油，1 mM DTT）中。

NS3解旋酶

含有NS3的N-末端His-SUMO标记的解旋酶结构域的表达质粒（SUMO-NS3h）获自查尔斯·赖斯（Rockefeller University）。如前所述40表达NS3h并纯化。首先将NS3h质粒转化到Rosetta2（DE3）感受态细胞（Novagen）中。使细胞在补充有50 µg / ml卡那霉素和34 µg / ml氯霉素的LB中于37°C生长。在OD = 0.6时中断摇动，并且在诱导之前将培养物在4℃下保持30分钟。用0.4 mM IPTG诱导细胞，将其转移到16°C的培养箱中，并以240 rpm的速度振荡20小时。通过在7500× g离心10分钟收集细胞。将粒料保持在-80℃。

为纯化SUMO-NS3h，将细胞沉淀重悬于100 ml NS3裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.5、500 mM NaCl，1 mMβ-ME，10 mM咪唑，50 µg / ml溶菌酶，2.5 µg / ml）中。 RNase A），在冰上孵育20分钟。接下来，将细胞在4°C下搅拌30分钟，然后进行超声处理（开3秒钟，关10秒钟，20个循环）。通过24,000× g离心去除细胞碎片 30分钟。混合上清液，并与3ml Ni-NTA琼脂糖珠（Qiagen）一起孵育1小时。将该混合物转移至20ml一次性柱（Bio-Rad）中以收集珠。用NS3-洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.5、500 mM NaCl，20 mM咪唑，1 mMβ-ME）洗涤该柱。用NS3-洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.5，150 mM NaCl，250 mM咪唑，1 mMβ-ME）洗脱SUMO-NS3h。将洗脱液加载到用NS3缓冲液A（20 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl，1 mMβ-ME）平衡的5 ml HiTrap Q HP柱（GE Healthcare）上。使用100–500 mM NaCl梯度分离SUMO-NS3h。合并含有SUMO-NS3h的级分，并使用30 kDa MWCO旋转浓缩器（Vivaspin）浓缩至〜2.5 mg / ml。

为了切割SUMO标签，将SUMO-NS3h用NS3缓冲液D（20mM Tris-HCl pH 8.0，50mM NaCl，20％甘油，1mMβ-ME）稀释以获得100mM NaCl。将40单位的带有His标签的SUMO蛋白酶（Invitrogen）与1mg SUMO-NS3h混合，并在4℃下孵育3小时。然后将样品上样至1 ml HisTrap FF色谱柱（GE Healthcare）上，以去除裂解的SUMO标签和SUMO蛋白酶。收集含有裂解的NS3h的流通物，并使用旋转浓缩器（Vivaspin，30kDa MWCO）浓缩至0.25mg / ml。

人RPA

从Mauro Modesti（马赛癌症研究中心，CNRS）获得用于6xHis标记的非荧光和EGFP融合的人RPA的表达质粒。如先前所述进行两种RPA构建体的表达和纯化58。将质粒转化入Rosetta / pLysS感受态细胞（Novagen）。细胞在37°C下在补充有100 µg / ml氨苄青霉素和34 µg / ml氯霉素的LB培养基中生长。在OD = 0.5时，温度降至15°C，用1 mM IPTG诱导RPA表达，将细胞进一步孵育20小时。然后通过以3500× g离心30分钟收获细胞。除去上清液，并用PBS洗涤细胞沉淀。将粒料储存在-80℃。

为了纯化RPA，将细胞沉淀物在温水中解冻，并重悬于补充有EDTA-的RPA裂解缓冲液A（40 mM Tris-HCl pH 7.5、1 M NaCl，20％甘油，4 mMβ-ME，10 mM咪唑）中。免费的PI平板电脑。对悬浮的沉淀物进行超声处理（3秒，10秒关闭，20个循环）以破坏细胞，并通过以20,000× g的离心力去除细胞碎片 1小时。上清液通过0.45 µm注射器过滤器（Millipore）过滤，并加载到用RPA裂解缓冲液B（20 mM Tris-HCl pH 7.5、500 mM NaCl，2 mMβ-ME，20 m ％甘油，10mM咪唑，1mM DTT）。通过应用10–300 mM咪唑的线性梯度洗脱RPA。合并含有RPA的馏分，并使用3.5 kDa MWCO透析管（Generon）在RPA透析缓冲液A（20 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM KCl，0.5 mM EDTA，10％甘油，1 mM DTT）中透析过夜。当发生沉淀时，使用0.22 µm注射器过滤器（Millipore）过滤透析样品。将样品上样到用RPA透析缓冲液A平衡的HiTrap肝素柱（GE Healthcare）上。通过应用50–500 mM KCl梯度洗脱蛋白质。

基于凝胶的DNA展开分析

为了分析含有50 bp双链体区域的Cy5标记的叉子DNA的解链（补充图 3a），将3 nM DNA与50 nM CMG在CMG结合缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5、5 mM NaCl，10 mM镁）中孵育醋酸盐，5 mM DTT，0.1 mg / ml牛血清白蛋白）和0.1 mMATPγS在37°C下补充1-2小时，总体积为6μl。总共添加6μlATP混合物（补充了5 mM ATP的CMG结合缓冲液）以开始展开，并将样品在30°C下再温育10分钟。加入3μl终止缓冲液（0.5％SDS，20 mM EDTA）终止反应。为防止CMG结合的DNA聚集导致电泳过程中某些DNA滞留在孔中，终止缓冲液中包含25μM的40 nt polyT oligo（Oligo-6）。在1x TBE中的8％PAGE上分离反应。

为了测量内部经Cy5修饰的236 bp长的DNA底物的解链（图 2a），将5 nM叉底物与20 nM CMG在补充有0.1 mMATPγS的CMG结合缓冲液中于37°C孵育1至2小时。将ATP和RPA分别添加至终浓度2.5 mM和150 nM。在30°C下孵育1小时后，将反应用0.1％SDS终止，并在添加了0.1％SDS的1x TBE中的3％琼脂糖上分离。用252 bp的双链叉和下游Cy5修饰的链（图2b）进行DNA解链测定。当从含ATP的缓冲液中省略RPA时（图 2c）），分别以250 nM的最终浓度添加寡核苷酸Oligo-6（捕获游离的CMG）和Oligo-21（防止Cy5链重退火成长DNA）。将反应在30°C温育指定的时间，通过添加0.1％SDS淬灭。还向含RPA的反应终止溶液中添加Oligo-21（最终浓度为250 nM），以防止RPA解离后Cy5修饰的链重新退火。最终，在补充有0.1％SDS的1x TBE中的8％PAGE上分离DNA。为了量化在RPA存在下CMG依赖的退绕，校正了仅由RPA置换的Cy5修饰链的数据。

使用635 nm激光和Fujifilm LPR / R665滤光片在Fujifilm，SLA-5000扫描仪上对凝胶成像。带强度用ImageJ定量。

酶标仪上的实时DNA解链测量

总之，将5 nM Cy5 /淬灭剂双标记叉底物与CMG结合缓冲液中的50 nM CMG在0.1 mMATPγS存在下于37°C孵育1至2小时。为避免CMG和DNA与微孔板孔（Nunc 384浅孔板，黑色，264705）发生非特异性结合，将孔与补充了1 mg / ml牛血清白蛋白（BSA）的CMG结合缓冲液温育以预先封闭孔至少30分钟。总共将5 µl CMG-DNA混合物转移至孔中，并向其中添加15 µl ATP混合物（含有3.3 mM ATP的CMG结合缓冲液），其中补充有1.5 µM 40-nt polyT oligo（Oligo-6）。反应。用大T抗原进行的展开试验基本相同，并且在DNA /解旋酶结合反应中含有0.1mg / ml大T抗原。对于使用NS3h的展开分析，2，将1％甘油，0.2％Triton X-100、1 mM DTT）在37°C下孵育1小时。总共将5 µl NS3h / DNA混合物转移到一个孔中，然后开始添加15 µl ATP混合物（在NS3-MOPS缓冲液中为3.3 mM ATP），其中添加了1.5 µM 40-nt polyT oligo（Oligo-6）。当测量包含28碱基对双链体（图叉DNA的退绕 3，5，和图6a），ATP混合物还补充有0.5μM的Oligo-13，以防止Cy5标记链与猝灭剂改性的链的再退火。用于包含28-bp双链体区域（图3e和6a）的叉子基质的 Comp LagTail是Oligo-12。Comp LagParent和Comp LeadParent在图 6b和补充图 6中使用的60 bp叉DNA分别是Oligo-20和Oligo 22。

Cy5荧光强度记录在PHERAstar FS（BMG Labtech）上，激发和发射波长分别为640和680 nm。在25°C下以2次或5秒的间隔收集数据，每次闪烁10次/次。使用Prism 7将测量的信号归一化，并绘制为时间的函数。

单分子DNA解链测定

通过将双面胶带（TESA SE，TESA 4965）夹在盖有PEG和PEG-生物素（Laysan Bio）的盖玻片与无功能化玻璃载玻片之间，制成单分子测定中使用的微流控流通池。参考中有详细描述。59。

展开Atto647N标记的短叉基材

为了对Atto647N标记的叉子DNA进行单分子分析，首先通过使用注射器泵（哈佛仪器）将PBS中的0.2 mg / ml链霉抗生物素蛋白吸入微流室，并用链霉抗生物素蛋白包被盖玻片表面，然后孵育20分钟。用封闭缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM NaCl，2 mM EDTA，0.2 mg / ml BSA）充分洗涤流动室，以除去过量的链霉亲和素。信道用DNA稀释缓冲液（20mM的Tris-HCl pH为7.5，50mM NaCl中，2毫摩尔MgCl 2，2mM的EDTA，0.05毫克/毫升BSA）。随后，用10 pM Atto647N标记的叉子DNA（Fork ssLag将一端含有生物素的-TIRF）引入DNA稀释缓冲液中，孵育2–3分钟以与表面结合。用DNA稀释缓冲液洗涤流动通道以除去未结合的DNA分子。总之，40 nM的CMG在30μl的TIRF-CMG加载的缓冲液A（10mM的Tris-盐酸pH为7.5，12毫摩尔MgCl 2，15mM的氯化钠，10％甘油，0.8毫克/毫升BSA，12.5mM的DTT，0.3将mMATPγS）吸入室中，并孵育1小时。为了减少光致漂白，用Atto成像缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，12 mM MgCl 2，补充有0.3 mMATPγS的15 mM NaCl，10％甘油，0.8 mg / ml BSA，12.5 mM DTT，1％葡萄糖，0.02 mg / ml葡萄糖氧化酶（Sigma），0.04 mg / ml过氧化氢酶（Sigma）。使用647 nm激光以10秒的间隔对表面拴系的DNA成像。在含ATPγS的缓冲液中成像80秒后，通过将包含3.3 mM ATP的Atto成像缓冲液吸入通道，同时继续收集图像，开始展开。执行与叉开卷测定dsLag基板，固定叉后ssLag盖玻片表面上，50nM的寡聚12在DNA稀释缓冲液引入和温育10分钟。然后在引入CMG之前，用DNA稀释缓冲液洗涤流动池以去除多余的寡核苷酸。

展开10 kb长的DNA

将总共15 pM的叉端链霉亲和素上结合的10-kb DNA引入封闭缓冲液中，注入带有聚乙二醇（PEG）-生物素功能化玻璃表面的流通池中，并孵育1小时以进行表面结合。用封闭缓冲液洗涤流动池以除去游离DNA。引入抗-洋地黄毒苷-（抗-dig）包被的微球（在封闭缓冲液中为0.05％w / v）并温育1小时以与表面固定的DNA分子的自由地高辛原-修饰的末端结合。用封闭缓冲液洗涤流动池可去除多余的珠子。为了拉伸DNA并将抗-dig-缀合的珠子附着在表面上，在封闭缓冲液中以0.2 ml / min的速度抽取洋地黄毒苷修饰的抗生蛋白链菌素（dig-streptavidin，3 µg / ml）。通过用封闭缓冲液冲洗流动池将游离的dig-链霉亲和素冲洗掉。将补充有0.3 mMATPγS的CMG封闭缓冲液（含有0.8 mg / ml酪蛋白的CMG结合缓冲液（Sigma Aldrich））吸入流通池中并孵育10分钟。引入LD655标记的CMG（在补充有0.3mMATPγS的CMG封闭缓冲液中最终为15nM）并孵育1小时。为了除去游离的CMG并启动DNA解链，在含有3.3 mM ATP，1％葡萄糖，0.02 mg / ml葡萄糖氧化酶和0.04 mg / ml过氧化氢酶的CMG封闭缓冲液中提取20 nM EGFP-RPA。

抗地高辛配基微球的制备

总共用0.5 ml偶联缓冲液（乙酸钠pH 5.0）将100μl5％w / v的0.45μm直径的羧基官能化聚苯乙烯微球（Spherotech，CP-05-10）离心洗涤两次并重悬于0.8 ml耦合缓冲器。总共将0.2 mg多克隆抗-dig抗体（Roche，11333089001）和1 mg BSA溶解在0.2 ml偶联缓冲液中，并混合成羧化珠。将混合物在室温下在旋转器上温育3小时。通过离心连续三轮用1 ml PBS洗涤微球，去除多余的抗消化和BSA。将微球重悬于0.2 ml PBS中，并保存在4°C下。在引入流通池之前，将2μlanti-dig微球用100μl封闭缓冲液洗涤一次，重悬于100μl封闭缓冲液中，

链霉亲和素-地高辛配基的制备

总共将10mg抗生蛋白链菌素（Sigma）溶解在pH 8.2的碳酸氢钠中。将1 mg洋地黄毒苷-NHS（Sigma，55865）溶于100μl二甲基亚砜中，混合到链霉亲和素溶液中，并在室温旋转孵育3小时。通过使用离心浓缩器（Vivaspin，20 ml，30 kDa MWCO），每轮用10 ml PBS交换缓冲液5次，除去未结合的地高辛。最后将链霉亲和素-地高辛配基结合物浓缩至3 mg / ml，并保存在4°C下。

显微镜设置和图像采集

使用装有×100油镜的倒置显微镜（HP-Apo TIRF 100xH，NA = 1.49，Nikon）使用自动倒置显微镜（Ti-E，Nikon）在物镜类型TIRF构图中对固定化DNA分子进行的DNA展开分析成像并自动进行焦点。记录了Atto647N和LD655的荧光，激发波长为647 nm，而Cy3和EGFP分别用561 nm和488 nm激光照射。在Andor iXon 897背照式电子倍增CCD相机（Andor Technology）上以每帧100-200 ms的曝光量收集图像。

数据分析

使用NIS-Elements软件（Nikon）分析在单分子实验过程中收集的图像。首先将图像对齐，以校正阶段漂移随时间的影响。选择对应于在第一帧中观察到的高于定制阈值的Atto647-染料共轭DNA分子的亮点。测量每帧每个点的荧光强度，并输出以进行进一步分析。在Fork ssLag和Fork dsLag中观察到的报告放卷效率是通过将消失的分子（即完全解缠的分子）除以第一帧上存在的分子总数来测量的。通过EGFP-RPA片段的生长速率测量10 kb线性DNA底物上的DNA解链速率。