EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的临床特征表明预后较EBV阴性DLBCL差。目前，尚无有效的EBV阳性DLBCL药物。据报道，细胞因子白介素21（IL-21）在DLBCL细胞系中具有促凋亡作用，目前正在探索作为这种类型淋巴瘤的新治疗策略。但是，我们先前的研究表明，IL-21刺激EBV阳性DLBCL细胞系会导致增殖增加。在这里，对EBV阳性DLBCL的罕见临床样本与NOD / SCID小鼠异种移植模型的结合分析，证实了IL-21对EBV阳性DLBCL细胞增殖的影响。使用RNA测序 我们确定了IL-21处理后差异表达基因的模式，并使用蛋白质印迹法验证了蛋白质水平上关键基因的表达。我们发现IL-21上调宿主的表达MYC和AP-1（由相关的Jun和Fos家族蛋白组成）和STAT3磷酸化，以及病毒LMP-1蛋白的表达。已知这些蛋白质可促进G1 / S相转变，从而加速细胞周期进程。此外，在NOD / SCID小鼠异种移植模型实验中，我们发现IL-21治疗可增加EBV阳性DLBCL肿瘤中的葡萄糖摄取和血管生成。尽管需要更多样本来验证这些观察结果，但我们的研究再次证实了IL-21对EBV阳性DLBCL的不利影响，这对DLBCL的药物开发具有影响。
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）占成人非霍奇金淋巴瘤（NHL）的30％，是最常见的恶性淋巴瘤类型。爱泼斯坦巴尔病毒（EBV）阳性DLBCL是DLBCL的一个新定义的亚组，是指携带EBV 1的B细胞克隆的增殖。2008年世界卫生组织的分类包括“ EBV阳性的DLBCL老人”作为临时实体。然而，EBV阳性的DLBCL现在越来越多的年轻患者认可，比原先认为一个更广泛的形态特征和更好的生存结果，导致更换名称为“老年人EBV阳性的DLBCL”与“EB病毒阳性的DLBCL” 1。大致所有患者的本用EBV阳性DLBCL的10％2，3，4。EBV阳性DLBCL和EBV阴性DLBCL的临床特征有很大的不同，和EBV阳性DLBCL的预后较差 3，4，5，6，7，8。目前，尚无有效的EBV阳性DLBCL药物。
EBV与多种人类肿瘤有关9。EBV感染世界几乎所有地区的成年人，是人类最成功的病毒之一10。EBV使用不同的潜伏时间类型来驱动感染的B细胞从静止B细胞过渡到记忆细胞。由全套病毒潜伏期蛋白表达导致的III型潜伏期可以在体外被EBV感染的B细胞（条件性成淋巴细胞样细胞系，LCL）以及具有传染性单核细胞增多症或移植后淋巴细胞增生性疾病的一部分的患者中检测到（ PTLD）；而II型潜伏期（表达具有的LMP和EBER EBNA-1一起）中的经典霍奇金淋巴瘤中检测和PTLD的子集9，11。EBV阳性的DLBCL与PTLD 12具有相似的EBV潜伏期模式（II型或III型）。
多种细胞因子是已知的调制的EBV潜伏基因的表达9，13，14。IL-21诱导I型潜伏期伯基特淋巴瘤细胞系和条件性LCL 9中 LMP-1表达以及宿主STAT3的激活。这种常见的γ链细胞因子是CD4 + T细胞产生的有效的B细胞激活剂和浆细胞分化诱导剂15。用这种细胞因子治疗对EBV阳性淋巴瘤细胞系的影响似乎取决于EBV潜伏期程序的类型。具体而言，IL-21治疗I型潜伏期的Burkitt淋巴瘤细胞会抑制细胞增殖，而在III型潜伏期的LCL和Burkitt淋巴瘤细胞系中，它会诱导浆细胞分化9。同样，我们发现由IL-21在五个DLBCL衍生的细胞系中对EBV潜伏期基因表达的调节取决于EBV潜伏期程序的类型（I，II或III型） 13。这些观察结果可以解释为什么而IL-21已发现经由STAT3活化和c-Myc的表达，导致肿瘤消退，促进细胞凋亡的DLBCL细胞系和延长小鼠的存活 16，17，IL-21治疗EBV阳性DLBCL细胞的系导致细胞增殖增加 18。确实，当从这些细胞系中清除EBV基因组时，在IL-21治疗后观察到细胞增殖减少和凋亡增加 18。大量的临床数据表明，IL-21，如在肿瘤微环境的组成部分，是DLBCL患者的血清中通常存在和可能参与DLBCL的发病机制和疾病进展19，20，21，22。结合观察到IL-21已用于各种临床试验来治疗恶性肿瘤的观点，有必要进一步评估IL-21在非霍奇金淋巴瘤（NHL）领域的药理和生理作用） 治疗。
最近的一份报告强调了IL-21在DLBCL中令人印象深刻的临床前抗肿瘤活性和临床发展价值，但忽略了EBV在DLBCL 23中的重要影响。我们先前发现，IL-21在EBV阳性DLBCL细胞系Farage 18上诱导细胞增殖而不是凋亡。在获得了有价值的EBV阳性DLBCL的临床主要样本后，我们使用RNA-seq从少量的生物材料中生成了大量的生物信息，克服了细胞数量不足的困难。这项研究是结合IL-21处理的EBV阳性DLBCL原代细胞和细胞系的深入RNA序列分析。此外，通过比较EBV阳性和EBV阴性细胞系与EBV阳性临床样品之间的共性和差异，我们旨在确定IL-21促进EBV阳性DLBCL细胞增殖的机制。我们通过MYC下游的细胞周期调节子的表达和激活，预测了IL-21诱导的增殖的关键信号通路EBV阳性DLBCL中的AP-1和AP-1。原代细胞和EBV阳性DLBCL细胞系Farage的Western印迹结果证实了在蛋白质表达水平上IL-21特异性上调c-Jun，cyclin D2，cyclin E1表达和Rb磷酸化的预测。为了探索IL-21在体内促进EBV阳性DLBCL细胞增殖的作用，我们进行了一系列实验，并评估了IL-21在EBV阳性DLBCL异种移植肿瘤实验中的体内功效。
这项工作成功地结合了干湿实验室研究。在NGS分析中，我们不仅结合了已公开的公开数据，而且还为EBV阳性DLBCL提供了有价值的，新颖的NGS数据（包括来自罕见临床样本的数据）。我们希望这项工作将有助于进一步研究微环境在EBV阳性DLBCL中的作用，并为在NHL治疗中正确使用IL-21提供指导。
为了证实我们先前在EBV阳性DLBCL细胞系Farage上发现IL-21诱导细胞增殖而非凋亡的发现，我们从EBV阳性DLBCL的临床样本中收集了原代细胞（称为“患者1”）。IL-21治疗48小时后，我们观察到这些细胞的凋亡明显减少（图 1a），而在先前报道的相似条件下，EBV阴性DLBCL原发性肿瘤的凋亡明显增加（16）。此外，IL-21促进了原代细胞和EBV阳性DLBCL细胞系Farage的活力，但降低了EBV阴性DLBCL细胞系MC116的活力（图 1）。b）。接受/不接受IL-21治疗后48小时，EBV阳性DLBCL细胞的总细胞数显着增加，表明两种情况下的细胞增殖。使用EBV潜伏期基因转录本的RNA序列分析，我们发现EBV阳性DLBCL原代细胞表达了全套EBV潜伏期基因（指示III型潜伏期），与Farage细胞相似（图 1 d）。C1orf43和CHMP2A充当管家基因2。IL-21处理后，如RNA-seq分析和western印迹所示，在患者来源的细胞中，协调浆细胞分化的Blimp-1的表达和病毒蛋白LMP-1的表达上调（图 1）。c，e），STAT3的磷酸化也被上调（图 1 e）。这些结果是作为我们先前IL-21处理后在EBV阳性DLBCL细胞系Farage描述的相同的13，18。的RNA-SEQ分析，与我们以前报道的Western印迹结果相结合13，18表明，这些关键基因的表达与调控是Farage细胞和原代细胞（图类似 1的c-e）中，这证实我们的发现在使用主要样本的细胞系。
暴露于IL-21后EBV阳性DLBCL细胞的凋亡，生存力和基因表达的分析。（a）将来自EBV阳性DLBCL临床样品（标记为Patient-1）的原代细胞用IL-21（100 ng / mL，持续48 h）处理或不进行处理。样品用抗Annexin V抗体染色以通过流式细胞仪测量细胞凋亡。实验一式三份进行，并显示了一个代表性样品。从3个重复样品中收集了流式细胞仪数据的统计分析。（b）在用IL-21治疗48小时后，通过赤藓红B评估了EBV阳性和EBV阴性DLBCL细胞的活力。a和b中的数据表示为平均值±SEM（n = 3）；两尾t检验，** P <0.01，* P <0.05。（c）用指示的抗体探测指示的DLBCL细胞裂解物。β-肌动蛋白作为负载对照。（d）热图显示了基因表达中EBV潜伏期基因的Z得分归一化log2-（FPKM + 1）。C1orf43和CHMP2A用作管家基因对照。从3个样品重复样本中收集RNA-seq数据。（e）在Farage细胞和原代细胞中选择的基因的RNA-seq分析。与未处理的IL-21对照相比，蓝色表示表达降低，而红色表示表达升高。日志2来自RNA序列分析的-（FPKM + 1）数据显示为平均值±SEM（n = 3）。d和e中的统计分析是使用基于FDR的q值进行的；* q ＜0.01。
为了验证IL-21是否在体内加速EBV阳性DLBCL细胞增殖，我们通过皮下接种Farage细胞建立了EBV阳性DLBCL的NOD / SCID小鼠异种移植模型，并在一次IL-21（10μg）处理后测量了肿瘤的生长每天连续7天。虽然有在荷瘤小鼠（图的体重没有差异显著 2 a）所示，在用IL-21处理的小鼠的肿瘤增殖增加（图 2 B，C）。通过比较测量开始后28天获得的肿瘤的大小和重量进一步证实了这一点（图 2 d，e）。为了测量肿瘤面积并评估肿瘤的葡萄糖摄取，用18用IL-21连续治疗三周后，F-FDG micro-PET / CT出现（图 2 f，g）。在用IL-21治疗的组中观察到较大的信号区域，证实了这些小鼠中更好的肿瘤生长。此外，与对照组相比，IL-21注射组的肿瘤标准摄取量增加了17％，表明更高的肿瘤葡萄糖摄取率。
在NOD / SCID小鼠异种移植模型中，原位注射IL-21可促进EBV阳性DLBCL肿瘤的生长。（a – c）肿瘤面积达到25 mm 2后，连续7天每天一次用PBS（对照）或IL-21（10μg）对携带Farage细胞皮下异种移植物的小鼠（n = 4）进行治疗。每天测量小鼠体重和肿瘤体积。每组的肿瘤体积显示为平均值±SEM（n = 4）。（d）肿瘤植入后28天，从PBS治疗的对照组和IL-21治疗的组中分离出肿瘤。（e）在植入后28天测量肿瘤的平均重量。（f，g）18的体内micro-PET / CT研究F-FDG吸收。使用标准吸收值对放射性信号进行定量。条形图中的值表示为平均值±SEM。
接下来，我们分析了IL-21治疗对血管生成的影响。与IL-21治疗Farage细胞后诱导诱导的VEGFA和VEGFB的体外基因表达数据一致，在体内我们观察到了肿瘤血管生成的促进（图 3 a，b）。在对三种代表性肿瘤进行切片后，将抗CD31（内皮标记）抗体用于染色。IL-21组的切片显示CD31微血管染色密度显着增加（图 3 c，d）。这些发现可能解释了肿瘤周围皮下血管的增加。
IL-21治疗可促进NOD / SCID小鼠异种移植模型中的血管生成。（a）在NOD / SCID小鼠模型中观察到表皮血管。用PBS处理的小鼠显示为对照组。每组显示了来自不同小鼠的三个代表性图像。（b）在IL-21 / PBS处理后2天的法拉第中血管生成基因VEGFA和VEGFB的差异表达分析。数据显示为平均值±SEM（n = 3）。（c在用抗CD31（内皮标记）抗体染色后，通过ImageJ对每组三只代表性NOD / SCID小鼠的肿瘤组织中的CD31表达进行定量。数据代表代表性部分中的平均蛋白质水平和标准偏差。两尾t检验，* P <0.05。（d）用H＆E和CD31特异性抗体染色的NOD / SCID小鼠石蜡包埋的肿瘤的免疫组织化学切片。显示了每组中不同小鼠的三个代表性部分。比例尺代表100μm。
先前的结果表明，IL-21治疗EBV阳性DLBCL原代细胞和来自Farage细胞系的细胞具有相似的作用。为了研究在IL-21暴露后这是否反映了两种细胞中相似的基因表达调控，我们分析了IL-21暴露48小时前后两种细胞的总体基因表达。的MA曲线图表明IL-21治疗的上调1512首1566个基因中分别Farage和原代细胞，表达，和下调的1830首1573个基因（图表达式 4的a，b）。为了鉴定淋巴瘤相关基因，我们使用PALM-IST（文献挖掘的途径组装-一种信息搜索工具）进行了实时文献分析24。我们以淋巴瘤为主要关键字，在PubMed数据库中扫描了61,835条文章摘要，并生成了疾病相关基因（DAG）库（补充表S1）。基于DAG库，我们对Farage和Primary细胞组中每个独立样品的每个差异表达基因（DEG）的倍数变化进行了层次聚类分析。结果表明，IL-21在Farage细胞和原代细胞中显示出类似的DAG调控。具体而言，在Farage DAG和原代细胞的80.2％的IL-21的治疗（图之后也有类似的监管趋势 4 ℃）。
IL-21处理的EBV阳性DLBCL细胞中基因的差异表达分析和途径富集分析。（a，b）用IL-21（100ng / mL，48小时）处理或不处理EBV阳性DLBCL原代细胞和Farage细胞，并通过RNA-seq分析基因表达。MA图显示了来自Farage单元格和主单元格的数据的显示的A值（平均log2转换后的表达值）和M值（log2转换后的表达值的倍数变化）。红点表示上调的差异表达基因（DEG）（倍数变化> 1.5，q值<0.01）。蓝点表示被下调的DEG（倍数变化<-1.5，q值<0.01）。灰点表示未差异表达的基因。（c）在原代细胞和Farage细胞中差异表达的疾病相关基因（倍数变化> 1.5或<− 1.5，q值<0.01）的表达倍数变化数据的无监督分层聚类。每一组由三个合并的生物学重复组成。（d，e）在KEGG途径分析中富含差异表达基因（DEG）的最高级途径。颜色表示q值（高：白色，低：蓝色）。较低的q值表示富集度更高。点的大小反映了DEG的数量（点越大表示数量越大）。“富集因子”表示富集因子的值，它是前景值（DEG数）和背景值（基因总数）的商。值越大，浓缩越显着。方框中的文字表示原代细胞和Farage细胞中常见的排名最高的途径。
为了鉴定在EBV阳性DLBCL中受IL-21调节的最重要的信号通路，使用了phyper对所有DEG进行KEGG通路功能富集分析。IL-21处理后，Farage组和原代细胞组中的DEGs在细胞因子-细胞因子受体相互作用途径，趋化因子信号传导途径和JAK-STAT信号传导途径中高度富集（图 4 d，e）。另外，富含JAK-STAT信号传导途径的DEG显示出整体上调（补充图S2）。
为了确定IL-21诱导的EBV阳性DLBCL细胞增殖的主要效应器，我们应用了基于RNA测序的ABC / GCB调用方法，结合了相应的CRISPR筛选数据，以寻求更多提示25。该方法根据RNA-seq基因表达数据将DLBCL肿瘤分为活化B细胞样（ABC）和生发中心B细胞样（GCB）类型。ABC型DLBCL的患者的总生存率低于GCB型DLBCL的患者。在我们的研究中，基于RNA-seq数据特征，将Farage细胞分类为GCB DLBCL，将原代细胞分类为ABC DLBCL（图 5a）。IL-21治疗后两组的呼叫结果均保持不变。此外，六个DLBCL驱动基因25，即CD97B，MYC，BCL6，IRF4，TGFBR2和CD22，是差异在两种类型的细胞在IL-21的曝光（图表示 5 b）中。值得注意的是，IL-21在法拉格细胞和原代细胞中均显着上调了MYC（一种泛DLBCL（在所有DLBCL亚型中）对于细胞存活的重要基因）。
MYC在IL-21诱导的Farage细胞和原代细胞增殖中起关键作用。（a）RNA-seq基因表达分类器区分生发中心B细胞样（GCB）DLBCL，未分类（UC）DLBCL和活化B细胞样（ABC）DLBCL。通过分别平均ABC和GCB基因的z得分，计算每个样品的ABC和GCB特异性得分。（b）IL-21治疗后EBV阳性DLBCL中DLBCL遗传驱动子的基因表达谱。使用基于FDR的q值进行统计分析，显示的所有数据均显着，且q值<0.01。箭头指示IL-21治疗后两组中MYC的共同上调。（c）Cytoscape的MCODE插件用于基于STRING的网络分析中提取子网络，以用于Farage单元和主单元中的共DEG。从整个图片生成簇3，并通过禁用MCODE中的Fluff函数从簇3中提取核心模块。蓝色的节点表示参与细胞周期调控的基因（GO：0051726，FDR <0.0001），红色的节点表示参与有丝分裂细胞周期中G1 / S过渡的基因（GO：000082，FDR <0.0001）。箭头指示MYC在核心模块中的中心位置。PTM，翻译后修饰；TR，翻译规则。
为了鉴定参与IL-21诱导的细胞增殖的分子网络，我们使用来自Farage细胞和原代细胞的功能差异表达数据进行了STRING网络分析。我们获得了包含350个基因和683条边的分子相互作用网络（补充图S3e，补充表S2）。为了分析子模块，我们使用了Cytoscape（v3.5.1）的MCODE插件（v1.4.2）从整个分子相互作用网络（补充图S3 b–d）中提取了子网络，并切断了节点连通性。大于3。基于功能富集分析的结果（补充表S3 – S6），我们发现聚类1（补充图1）。S3d，补充表S4）和簇2（补充图S3c，补充表S5）主要参与感染和免疫调节，而簇3（补充图S3b，补充表S6）主要涉及细胞死亡和细胞周期。为了获得IL-21诱导的细胞增殖的核心分子相互作用模块，我们通过禁用MCODE中的Fluff函数从簇3中提取了一个由25个基因和73个边缘组成的子网（图 5）。C）。形成该核心模块的基因在细胞周期调节和有丝分裂细胞周期G1 / S过渡的生物学过程中显着丰富，并且在KEGG细胞周期途径中显着丰富（表1，补充表S7）。此子网模块从分子相互作用的角度描述了IL-21对EBV阳性DLBCL中细胞周期进程的调节作用。我们从该子网模块中发现，MYC在细胞周期调控方面在模块中占据中心位置。
为了确认RNA-seq和网络分析的结果，我们从RNA-seq数据中提取了差异表达结果，并使用蛋白质印迹法评估了蛋白质水平上基因表达的变化（图 6a，b）。我们发现，与它在Farage细胞的作用，c-Myc的，c-Jun的，c-fos，细胞周期蛋白D2和细胞周期蛋白在原代细胞E1蛋白表达（图的IL-21诱导的上调一致 6 b）中。细胞周期蛋白D和E的亚型特异性DEG分析证实，原代细胞和Farage中只有IL-21显着调节细胞周期蛋白D2和细胞周期蛋白E1（补充图S4））。由于这些细胞周期蛋白与细胞周期中的限制性（R）点转变高度相关，因此我们进一步检查了Rb的磷酸化状态，Rb是细胞分裂的负调节剂，其磷酸化与细胞周期进入有关。IL-21处理后，我们在两种细胞Farage和初级细胞（图观察到增加的Rb磷酸 6 b）中。相对蛋白水平类似于从RNA-SEQ分析（图的差异表达的结果 6的a，b）。与此相反，在EBV阴性DLBCL细胞系MC116，IL-21不诱导上调的c-Jun，细胞周期蛋白D2的，和细胞周期蛋白E1（图 6 b）和磷酸化Rb蛋白的水平没有明显增加，检测在MC116细胞中（图 6b）。因此，我们提出了一个由IL-21在EBV阳性DLBCL中进行生长调节的假想模型，其中IL-21信号导致STAT3磷酸化并诱导LMP-1表达形成正向自动调节环，从而放大了Myc和AP的信号-1（由相关的Jun和Fos家族蛋白形成的同源异源二聚体组成）转录（图 7a）。c-Myc和AP-1的结果的增加的细胞周期蛋白D2和细胞周期蛋白E1的表达的活化（图 7 b）中，促进R点过渡，并最终导致Rb的过度磷酸化从而加速的细胞周期进展（图 7 c）所示。
IL-21促进EBV阳性DLBCL细胞中G1 / S相变标记的表达，而不促进EBV阴性DLBCL细胞中的G1 / S相变。（a）与未处理细胞中的表达相比，对用IL-21（100 ng / mL处理48小时）的Farage细胞和原代细胞中核心分子模块中关键基因的RNA-seq数据进行差异基因表达分析。基因表达的log2倍变化显示为平均值±SEM（n = 3）。使用基于FDR的q值进行统计分析，显示的所有数据均显着，且q值<0.01。（b用指示的抗体探测指示的DLBCL细胞裂解物。GAPDH被用作装载对照。MC116细胞系用作EBV阴性DLBCL比较组。相应地指出了每种蛋白质的暴露时间。
EBV阳性DLBCL细胞中IL-21促进G1 / S相变的假设工作模型。提出了一种工作模型，其中IL-21刺激增强STAT3磷酸化，随后刺激LMP-1表达，并建立正反馈回路，从而导致c-Myc和AP-1表达上调。c-Myc和AP-1通过上调细胞周期蛋白D2和细胞周期蛋白E1促进限制性酶切点的转变，从而促进Rb的过度磷酸化，从而促进细胞周期进程。
在当前的工作中，我们证实了先前使用EBV阳性的主要临床样本和体内NOD / SCID小鼠异种移植模型在EBV阳性的DLBCL 18中IL-21诱导的增殖的观察结果。这些结果不同于先前使用MC116（EBV阴性DLBCL 16）进行的小鼠研究中观察到的肿瘤消退。
通过使用分级聚类的RNA-seq分析，我们发现IL-21处理后原代细胞和Farage细胞中DEG的调控方向相似。这种相似性表明，Farage细胞是研究III型潜伏期EBV阳性DLBCL的合适研究工具。我们还进行了原代细胞和Farage细胞的联合分析参照DLBCL亚型调用模型25和相应CRISPR筛选由戴夫实验室提出的数据25，26。在这里，与ABC / GCB分类相关的基因被用于将样本分类为亚组，RNAseqSubtypeScore 25被相应地应用。该分数表示ABC和GCB之间的计算特征值之差。我们的结果表明，无监督的分层聚类不能区分经IL-21处理的细胞和未经IL-21处理的细胞（图 5a）。有趣的是，根据基于ABC / GCB分类的CRISPR癌基因靶标25，我们的结果表明，MYC是唯一在原代细胞和Farage细胞中均被IL-21上调的DLBCL必需基因（图 5a，b）。基于MYC在细胞增殖中的作用，我们假设MYC在IL-21诱导的EBV阳性DLBCL细胞增殖中起关键作用。使用生物信息学方法，我们提取了Farage细胞和原代细胞中co-DEG的核心子网络。功能富集分析表明参与有丝分裂细胞周期（表的调节中子网1），与MYC在芯模块（图的中心 5 ℃）。
MYC充当B细胞的主要转录中心多个网络27，28。它是STAT3转录因子的一个已知的靶29，30，31和以前的出版物已经确定的Myc的几个靶基因32，33，34。Myc的直接和间接地激活的细胞周期蛋白D2和细胞周期蛋白E，以促进R点过渡表达32，35，36，37，38，39。D型细胞周期蛋白的水平主要由细胞外信号控制40，与CDK4 / 6一起，负责诱导Rb磷酸化。一旦细胞通过R点，其余的细胞周期蛋白（包括E型细胞周期蛋白）就会以预先编程的方式起作用，直到M期结束，并且不再对细胞外信号作出反应。值得注意的是，尽管IL-21引起MC116细胞中c-Myc的上调，但它并未引起c-Jun，cyclin D2或cyclin E1的上调，并且在IL时未观察到磷酸化的Rb蛋白水平的显着增加。 -21治疗。这种模式表明，IL-21在调节EBV阳性DLBCL和EBV阴性DLBCL的增殖中的作用存在显着差异。
IL-21对B细胞命运的影响取决于它们的活化状态和发育阶段。在一些血液系统恶性肿瘤中，例如多发性骨髓瘤，霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤，IL-21可以诱导肿瘤性B细胞的增殖23。尽管IL-21对分离的正常人B细胞没有促有丝分裂作用，但它显着诱导了与抗CD40单克隆抗体共同刺激的B细胞的增殖41。已有证据表明，EBV编码的一种癌蛋白LMP-1模仿了B淋巴细胞反应中的组成性激活CD40信号42因此，IL-21可能通过类似的机制诱导EBV阳性DLBCL细胞增殖。也有报道说，具有高LMP-1表达的细胞是EBV阳性DLBCL 43不良药物反应的原因。将这些结果与我们以前的观察结果相结合，我们假设在EBV阳性DLBCL细胞中诱导的LMP-1可能是增殖的关键因素。
LMP-1导致的JAK / STAT的激活信号通路44，是EBV阳性B细胞的增殖和存活的关键13，18。有证据表明，激活的STAT3充当LMP-1 L1-TR启动子45的激活剂，因为STAT3本身可以被LMP-1 44激活，所以它会形成一个正向自调控环。我们的研究结果表明，在Farage细胞和患者来源的原代细胞中，IL-21治疗后STAT3磷酸化以及LMP-1表达显着增加。LMP-1信号已显示对人B细胞46的G1 / S过渡有重要影响，LMP-1通过Myc上调特异性诱导有丝分裂B细胞活化47。
重要的是，LMP-1还通过Jun / AP-1家族成员47诱导有丝分裂B细胞活化。IL-21处理后，EBV阳性DLBCL细胞系和原代细胞中c-Jun和c-Fos的mRNA和蛋白水平显着增加。已知的是，Jun和其它AP-1家族成员的转录迅速和瞬时通过促进有丝分裂原诱导的细胞周期进程的许多外部信号刺激38，48。此外，有证据表明，AP-1阻滞抑制Rb磷酸化，降低细胞周期G1期（D和E周期蛋白）中主要细胞周期蛋白的表达，并降低CDK2和CDK4的活性37。总体而言，这些迹象表明在EBV阴性DLBCL细胞和EBV阳性DLBCL细胞中，IL-21信号转导的不同结果均显示出MYC上调，这最有可能是由于LMP-1的存在/缺乏。
此外，我们证明在IL-21处理后，在Farage细胞和原代细胞中，CCL22的表达显着降低，并且CXCL10的表达显着升高（补充图S5）。低CCL22表达和EBV的存在与DLBCL 49患者的生存率降低有关。CXCL10的高表达密切患者DLBCL和继发性中枢神经系统受累不良预后相关是高CXCL10组更频繁50，51。因此，在EBV阳性的DLBCL细胞系和原代细胞中，IL-21对CXCL10的上调和对CCL22的下调可能不利于DLBCL的预后。
缺乏足够的可用于功能研究的临床样本细胞数是阻碍对EBV阳性DLBCL进行研究的主要原因之一。NGS技术可以有效地解决此问题，该技术可以从有限的材料中产生大量的生物信息数据。在PubMed数据库中的文献分析中，我们使用淋巴瘤作为关键词来提取热点基因列表并建立与疾病相关的基因集，从而成功地扩展了我们对与疾病相关的转录调控信号的认识。通过网络分析和富集分析确定核心转录子网络后，我们使用湿实验室方法验证了预测结果。
我们的研究表明，EB-21阳性DLBCL患者不适当使用IL-21不仅可能无法达到治疗效果，而且可能导致DLBCL加速增殖。此外，这项工作表明IL-21作为肿瘤微环境的组成部分，也可能有助于EBV阳性DLBCL细胞的增殖。在药物开发中，关键调节剂（例如IL-21受体和LMP-1）作为EBV阳性DLBCL的治疗靶标可能很有价值，靶向这些调节剂的单克隆抗体或小分子拮抗剂可能对患者的生存有益。需要对当前研究中确定的关键监管节点进行进一步的功能研究，以确认我们的计算数据。尽管目前很难将大量样本资源整合到系统研究中，
EB病毒阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系Farage是好心汉娜本-Bassat博士（实验外科实验室，哈达萨大学医院，耶路撒冷）提供52。在补充有10％胎牛血清，50单位/ mL青霉素和50 g / mL链霉素的RPMI培养基中培养Farage和MC116（EBV阴性DLBCL细胞系）。由腹水产生的EBV阳性DLBCL原代细胞Patient-1维持在补充有20％胎牛血清，50单位/ mL青霉素和50 g / mL链霉素的RPMI培养基中。重组人IL-21购自Peprotech。
遵循的所有程序均符合道德标准并经南京医科大学附属第一医院，江苏省医院负责委员会批准（2017-SRFA-167）。原代细胞源自患者的腹水，并获得所有受试者的知情同意。用淋巴细胞分离培养基（Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd。）进行原代细胞的密度梯度分离。根据制造商的说明，使用BD IMag人类B淋巴细胞富集套装DM通过负选择进一步分离B淋巴细胞。简而言之，生物素化的人类B淋巴细胞富集鸡尾酒（成分51-9003033）由以下生物素化抗体组成：抗人CD3（克隆UCHT1），抗人CD41a（克隆HIP8），抗人CD43（克隆L60），和抗人CD235a（克隆GA-R2）。这些单克隆抗体识别在红细胞，血小板和外周血白细胞上表达的抗原，但不能识别B淋巴细胞上表达的抗原。BD IMag链霉亲和素颗粒Plus–DM（组分51-9000810）磁性颗粒（其表面共价结合了链霉亲和素）被用于B淋巴细胞分离。
根据制造商的说明，使用Invitrogen公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的Annexin V-FITC / PI细胞凋亡试剂盒通过流式细胞仪（BD Accuri C6）检测凋亡。
使用Erosthrosin B（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）对用IL-21（100 ng / mL）处理48 h的培养物进行排异分析来评估细胞的活力。处理后，将Farage和MC116的初始密度培养为6×10 4个 细胞/ mL ，将原代细胞Patient-1的初始密度培养为3×10 5个 细胞/ mL。
鼠EBV阳性DLBCL异种移植模型用于评估IL-21的体内作用。将六周大的雌性NOD / SCID小鼠体重16– 20 g（北京生命河实验动物技术有限公司，动物证书：SCXK Jing 2016-0006）皮下接种Farage细胞（1×10 7个细胞/ 200μL，PBS：Matrigel = 1：1）。小鼠的护理符合机构指南，并且每天监测它们的肿瘤生长。当肿瘤面积达到25 mm 2时，按照先前描述的方案16，每天用IL-21（10μg）或PBS连续7天对小鼠进行肿瘤内一次治疗16。使用两个最大的垂直轴，用标准卡尺测量肿瘤。每天评估荷瘤小鼠的体重减轻和肿瘤大小。
对带有异种移植物的禁食NOD / SCID小鼠进行18 F-FDG micro-PET / CT分析，该分析采用Inveon Multimodality系统（西门子，德国慕尼黑）进行。在通过尾静脉单次注射3.7 MBq 18 F-FDG 之前，先用异氟烷麻醉小鼠。施用示踪剂后四十分钟，将小鼠置于PET扫描仪床上，并在研究期间保持连续麻醉状态。标准化摄取值（SUV）的计算如下：每毫升组织体积的衰变校正活性（kBq）/ 每克体重53注射的18 F-FDG活性（kBq）。
将肿瘤组织固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中，然后切片，然后用苏木精-曙红（H＆E）和抗CD31抗体（GB11063-2，Servicebio）染色。使用ImageJ软件对阳性染色的区域进行定量，并以百分比表示。
RNA-seq过程在BGISEQ-500平台（北京基因组研究所）上进行。在下游分析之前，SOAPnuke（v1.5.2）删除了包含低质量读物，适配器污染的读物和含有大量未知碱基的读物的测序读物。使用Bowtie2（v2.2.5）54将纯净读段映射到参考转录本。使用RSEM（v1.2.12）55计算每个样品的基因表达。DEGseq算法用于识别差异表达基因（DEG）56。基因本体论（GO）的分类，功能富集分析，KEGG通路分类57，58，59和功能富集分析，对度的视角进行。
分子相互作用信息是从STRING 11.0在线数据库（https://string-db.org）60中获得的。选择可信度大于0.400的交互进行网络构建。Cytoscape软件（v3.5.1）中的分子复杂检测（MCODE）插件61用于使用大于3的节点连通性截止值将整个网络进一步分为模块（Haircut：已启用； Fluff：已启用；节点分数截止：0.2； K核心：2；最大深度：100），生成群集1-3（补充图S3）。通过禁用Fluff函数，该函数将核心群集扩展一个邻居外壳，我们根据上述参数通过群集3进一步提取了核心模块。
IL-21处理2天后，将细胞溶解在RIPA裂解缓冲液中。蛋白质样品在还原条件下通过SDS-PAGE分离，并转移到甲醇活化的PVDF膜上。在室温下用5％脱脂奶粉封闭膜2小时后，将膜与一抗在4°C下孵育过夜。在室温下与二抗孵育2小时后，免疫印迹带通过Immobilon Western化学发光HRP底物（Millipore，达姆施塔特，德国）可视化62。以下抗体被用作免疫印迹中的一抗：AC-15（小鼠抗人β-肌动蛋白； Sigma-Aldrich），3H2-E8（小鼠抗Epstein-Barr病毒Blimp-1，Novus）；0211（小鼠抗Epstein-Barr病毒EBNA-1，圣克鲁斯），CS.1-4（小鼠抗Epstein-Barr病毒LMP； DAKO），D84C12（兔抗c-Myc），124H6（小鼠抗人类Stat3），M9C6（小鼠抗人类Phospho-Stat3（Tyr705）），9F6（兔抗人类c-Fos），60A8（兔抗人类c-Jun），D52F9（兔抗人类细胞周期蛋白D2），来自Cell Signaling Technology的HE12（小鼠抗人Cyclin E1），4H1（小鼠抗人Rb）和9308（兔抗人Phospho-Rb（Ser807 / 811））。
使用GraphPad Prism 7进行除RNA-seq以外的所有统计分析。使用不成对的两尾学生t检验对各组之间的差异进行统计学显着性检验（* P <0.05； ** P <0.01； *** P <0.001； **** P <0.0001。）。虚假发现率（FDR）用于功能富集分析。q值用作差异表达分析的基于FDR的显着性度量63。
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