小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，被认为可以抵抗感染。弓形虫是一种机会感染，可导致严重的神经系统疾病。在这里我们报告说，在冈底虫感染时，与小胶质细胞相比，血源性巨噬细胞中的NF-κB和炎症细胞因子的转录转录信号均过高。有趣的是，IL-1α富含巨噬细胞中的小胶质细胞和IL-1β。我们发现缺少IL-1R1或IL-1α，但没有IL-1β的小鼠大脑中的寄生虫控制和免疫细胞浸润受损。此外，我们显示小胶质细胞，而不是外周骨髓细胞，离体释放IL-1α。最后，我们表明离体IL-1α释放是gasdermin-D依赖性的，而且gasdermin-D和caspase-1 / 11缺陷的小鼠在脑部炎症和寄生虫控制方面表现出不足。这些结果表明，小胶质细胞和巨噬细胞具有不同的传播炎症的能力，而在慢性弓形虫中 感染后，小胶质细胞可以释放警报蛋白IL-1α，促进神经炎症和寄生虫控制。
脑部感染在全世界范围内引起明显的发病率和死亡率。这些病原体中有许多以慢性潜伏形式存在于大脑中，需要持续的免疫压力以预防症状性疾病。作为常驻巨噬细胞，小胶质细胞通常被认为可以控制中枢神经系统感染，但在许多情况下，它们的具体作用仍知之甚少。一种CNS嗜病原体是弓形虫，真核寄生虫具有广泛的宿主范围，感染人类群体的大部分1，2，3，4，5。弓形虫建立慢性感染的encysting免疫特权器官，包括大脑在内的6，7。如果没有足够的免疫压力，这种疾病弓形虫脑炎的致命的神经表现可发生2，4，5。
在这种寄生虫的天然宿主小鼠中进行的研究阐明了免疫应答的许多方面，这些方面对于在慢性感染阶段维持对寄生虫的控制至关重要。全脑RNA测序表明，感染的小鼠与未感染的小鼠在基因表达上有所不同，并且表现出丰富的免疫和炎症相关途径8。脑驻留细胞如星形胶质细胞已被证明产生趋化因子和细胞因子在大脑中促进炎症和寄生虫控制，以及以能够在体外直接杀死寄生虫9，10，11，12，13，14，15，16。T细胞在感染过程中渗入脑，和T细胞来源的IFN-γ是慢性感染的控制至关重要17，18，19。IFN-γ作用于靶细胞以诱导抗寄生虫状态，并通过多种机制破坏寄生虫，包括将免疫相关的GTPases（IRG）和鸟苷酸结合蛋白（GBP）募集到寄生虫的液泡中，以及产生一氧化氮（NO）的20，21，22，23，24，25。大量单核细胞和源自单核细胞的巨噬细胞，是IFN-γ信号传导的目标人群21，被招募到脑实质，这些细胞也是保持寄生虫和宿主生存26的控制所必需的。尽管小胶质细胞与被感染的大脑中的这些细胞处于相同的环境，并具有活化的形态，但尚未完全阐明它们在慢性弓形虫感染中的作用。在培养系统中，涂有底漆的小胶质细胞已显示出极限寄生虫复制27，28，29。在体外和体内研究还表明，小胶质细胞和巨噬细胞浸润可以感染期间产生于脑趋化因子和细胞因子，并且还可以显示迁移行为9，14，30，31，32，33，34。仍在探索小胶质细胞和募集的巨噬细胞是否以类似的方式对脑部感染做出反应，我们使用的新工具使我们能够研究慢性感染过程中特定于大脑中的小胶质细胞或巨噬细胞的非重叠功能。
IL-1分子包括两种主要的细胞因子：IL-1α和IL-1β。IL-1α可以作为一种典型的警报蛋白，它是一种预先存储的分子，不需要进行处理，可以在细胞死亡或受损时释放出来，从而使其成为早期炎症的理想候选药物35。相比之下，IL-1β，首先产生作为前体形式，通过胱天蛋白酶-1需要裂解而具有生物学活性，使IL-1β依赖于炎性作为胱天蛋白酶-1激活的平台36，37。这两种细胞因子都通过相同的受体（IL-1R）（IL-1R1和IL-1RAcP的异二聚体）发出信号，并具有相似的亲和力38。它们还需要损失膜的完整性才能释放出来。Caspase介导的胃泌素分子裂解被鉴定为导致孔形成和IL-1释放的主要途径。
已经在体外以及在急性感染的啮齿动物模型中研究了IL-1β和炎性体途径在弓形虫感染中的作用。总之，这些研究表明了IL-1β作用，IL-18，IL-1R，NLRP1和/或炎性NLPR3传感器，炎性衔接蛋白ASC和炎性胱天蛋白酶-1和-11 39，40，41，42。但是，IL-1信号在慢性感染过程中在大脑中的作用尚未得到解决。
在这里，我们表明尽管它们在弓形虫期间存在于大脑的相同组织微环境中感染后，单核细胞衍生的巨噬细胞具有比脑驻留小胶质细胞更强的NF-κB信号。有趣的是，我们还发现这两种细胞类型在IL-1分子的表达中表现出差异。IL-1信号传导有助于寄生虫控制和免疫细胞向大脑的募集。我们发现IL-1R1表达主要在大脑中的血管系统上，并观察到感染期间IL-1依赖性血管系统的激活。IL-1信号传导的促炎作用是通过警报蛋白IL-1α而非IL-1β介导的。我们显示，小胶质细胞，而不是浸润性巨噬细胞，以感染依赖性和胃泌素D依赖性方式离体释放IL-1α。我们提出小胶质细胞在弓形虫期间的一种特定功能感染是释放警报蛋白IL-1α，以促进神经炎症和寄生虫控制。
刚地弓形虫感染导致强大，持续的脑部炎症，这是控制寄生虫所必需的。血液单核细胞已被证明对于感染期间宿主的存活很重要26。小神经胶质细胞也已经证明具有一些潜在的抗寄生虫功能27，28，29，30，31，但我们感兴趣的是调查是否小胶质执行从浸润巨噬细胞不同的具体的，非重叠的功能。我们实验室的先前工作已经观察到，在刚地弓形虫期间，血液来源的单核细胞和巨噬细胞会在大脑中表达高水平的一氧化氮生成酶iNOS 。感染，小胶质细胞缺乏这种抗寄生虫分子43。我们假设即使它们在相同的组织微环境中，小胶质细胞也无法像浸润巨噬细胞一样对感染做出反应。我们使用的CX3CR1 Cre-ERT2 × ZsGreen fl / stop / fl小鼠系先前已被描述为小胶质细胞报告基因系44。用他莫昔芬处理记者小鼠以诱导ZsGreen表达，并在他莫昔芬注射后休息4周，以确保外周表达CX3CR1的细胞的更新。我们在实验室中一直使用这种小鼠系来标记大脑中98％以上的小胶质细胞。血管周巨噬细胞也可以通过这种方法标记，但不能通过我们的分离方案纯化，如缺乏CD206 +细胞所证明。感染后，使用FACS进行梳理CD45 +细胞CD11b +的ZsGreen +小胶质细胞和ZsGreen的-从用于RNA测序分析（图感染小鼠的大脑血液来源的骨髓细胞 1A）。
a – d 杀死慢性感染的CX 3 CR 1 Cre-ERT2 × ZsGreen fl / stop / fl小鼠，收集大脑并进行流式细胞术处理（n = 4只小鼠）。样品在BD晓月运行，门控活/汗衫/ CD45 + / CD11b的+从ZsGreen的+和ZsGreen的-种群控和排序。对分选的细胞群体进行RNA测序。一个实验装置。b进行差异丰度测试，并将结果绘制在R中，以绘制火山图，显示小胶质细胞和巨噬细胞种群之间差异表达的基因。示例基因标记为红色，对应于绿色点。c生成了与小胶质细胞相比在巨噬细胞中统计学上过度表达的GO术语，并使用R绘制了感兴趣的显着富集途径的选择。d根据感兴趣程度选择了两个细胞群之间差异显着表达的基因，并使用完整样本的欧几里得距离矩阵的-link聚类。e–l慢性感染的CX 3 CR 1的大脑切片的代表性图像Cre-ERT2 × ZsGreen fl / stop / fl小鼠。实验进行了两次。ZsGreen以绿色（e，f，j，l）表示，并对部分染色Iba1（绿色，g，h ;灰色，i，k），RelA（e，g红色），Rel（f，h红色）， IL-1β（i，j红色）和IL-1α（k，l红色）。比例尺指示30μm。
差异表达基因的分析表明，这两个细胞群彼此清楚地分离，证实了它们是根本上不同的细胞类型（图 1b）。与巨噬细胞相比，通路富集分析显示出小胶质细胞缺乏明显的炎症特征（图 1c），并且我们进一步显示了差异表达的基因选择，显示了巨噬细胞群体中与炎症相关的基因的明显富集（图 1d）。有趣的是，NF-κB信号似乎是区分巨噬细胞和小胶质细胞的一个因素（图 1c，d）。NF-κB基因表达的差异可以为小胶质细胞和巨噬细胞之间的功能差异及其对感染的反应能力提供基础。我们在蛋白质水平上对此进行了验证，表明在受感染的小胶质细胞报告基因小鼠的大脑切片中，ZsGreen +小胶质细胞均不存在RelA和Rel （图1e，f），但这些分子存在于ZsGreen -Iba1 +巨噬细胞中（图1e，f）。 。 1克，H）。这表明小胶质细胞身份的某些方面可能会抑制感染过程中某些炎症信号的上调，包括强烈的NF-κB反应。
观察到IL-1细胞因子在这些群体之间的分离不同。IL-1α在小胶质细胞中富集，而IL-1β在巨噬细胞中富集（图 1d）。这表明这两种细胞类型可能具有不同的装备来传播先天性炎症信号。在被感染的小胶质细胞报告基因小鼠的切片中，蛋白质水平上证实了pro-IL-1β的小胶质细胞表达的缺乏，该蛋白位于ZsGreen - Iba1 +细胞中（图 1i，j）。IL-1α通常位于Iba1 +细胞（图 1k）中，包括在ZsGreen +小胶质细胞中（图 1l））。使用流式细胞仪分析在野生型和小胶质细胞报告基因小鼠中进一步证实了这些结果。IL-1α蛋白在感染前存在于大脑中，在小胶质细胞中存在，如ZsGreen +或CD11b + CD45 int所定义（补充图 1a，b，d）。在慢性感染，它是由两个表达ZsGreen的+小胶质细胞和ZsGreen的-髓样细胞（补充图 1B）也通过限定的CD11b + CD45 INT和CD45 。在（补充图 1F）。在未感染的大脑中未检测到IL-1β，但在慢性时则存在于大脑中刚地弓形虫感染（补充图 1bf）。在慢性感染，亲IL-1β并没有因ZsGreen的显著表达+细胞，但宁可见于ZsGreen的-髓样细胞（补充图 1C）也被定义为的CD11b + CD45 喜细胞（补充图 1克）。这也是显而易见的是，虽然ZsGreen的-血液-衍生的骨髓细胞可同时表达IL-1α和亲IL-1β，很少的ZsGreen +小胶质细胞是双阳性（补充图 1D）。这些数据表明小胶质细胞和巨噬细胞可能在IL-1反应中发挥不同的作用。因此，我们旨在调查IL-1应答在弓形虫感染中的潜在重要性。
为了确定IL-1信号在慢性弓形虫感染中是否起作用，我们感染了缺少IL-1受体（IL-1R1）的小鼠，该受体被IL-1α和IL-1β结合。感染（pi）后的六周，IL-1R1 KO小鼠的脑部寄生虫囊肿负担增加（图 2a）。寄生虫负担的增加通常是由于免疫反应受损所致。的确，IL-1R1 KO小鼠在慢性感染期间大脑单核细胞/巨噬细胞谱系的CD11b + CD45 hi细胞数量也减少了（图 2b，f，g）。小胶质细胞通常表达CD45的中间水平，而不是血液来源的髓样细胞表达的高水平，因此我们使用该标记作为代理通过流式细胞术定义这些人群45。我们定义为单核细胞浸润细胞/巨噬细胞也Ly6G - ，的CD11c - ，和的Ly6C +。浸润的髓样细胞是重要的抗寄生分子一氧化氮的重要产生者，因此我们评估了它们的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达。与WT小鼠相比，IL-1R1 KO小鼠的大脑中iNOS的表达显着降低（图 2c，h，i），这在炎症的局部区域特别可见（图 2j，k）。值得注意的是，尽管CD4 +和CD8 + T细胞有所减少（图 2d，e），但iNOS表达降低似乎不是由于脑内T细胞区室产生的IFN-γ减少所致。组之间没有变化（补充图 2a，b）。总之，这些数据表明中枢神经系统免疫反应在IL-1R1 KO小鼠中受到影响，并具有明显的缺陷，特别是在髓样反应中。
WT C57B6 / J或IL-1R1 KO小鼠腹膜内感染了弓形虫 Me49株的10个囊肿。收获6周的pi脑并匀浆。通过在光学显微镜上计数脑匀浆中的囊肿来确定每个大脑的囊肿负担。显示了来自五个实验的配对平均值，并使用随机分组方差分析（两种方法）进行了统计。p = 0.048（n = 35只小鼠）b–i处理来自同一只小鼠的大脑以实现单细胞悬浮并通过流式细胞仪进行分析。数据来自四个实验；使用随机分组方差分析（双向）进行统计。（n ＝ 33只小鼠）。b血液衍生的髓样细胞定义为细胞CD11b + CD45 喜，细胞在单峰预门控/活/ CD45 + / CD11c的- ，p = 2.07×10 -7，代表流动曲线示于（˚F，克）。Ç iNOS的数目+细胞每脑计算，上单峰预门控/活/ CD45 + / CD11c的- / CD11b的+ CD45 喜，p = 3.99×10 -7，代表流动曲线示于（ħ，我） 。d，计算出 CD8 +（p = 0.015）和CD4 +（p = 0.035）T细胞数，并在单重态/活体/ CD3 +上进行了门控。j，k在WT（j）和IL-1R1 KO（k）小鼠的慢性感染脑中的炎症灶区域的代表性共聚焦图像。比例尺指示50μm。源数据（a – e）作为源数据文件提供。
重要的是，这些差异仅限于感染部位，因为IL-1R1 KO小鼠脾脏中任何免疫细胞区室均没有缺陷（补充图 2c-h）。实际上，脾脏中的T细胞和巨噬细胞反应略有升高。IL-1R1 KO小鼠的免疫缺陷也对慢性感染具有特异性，因为在感染期间（12 dpi）较早分析的IL-1R1 KO小鼠与腹膜腔或腹膜中的WT相比，单核细胞/巨噬细胞或T细胞群体无缺陷。脾脏（补充图 3a，b）。此时，如果在IL-1R1 KO小鼠中血清中的IFN-γ水平升高，则表明该反应并未受到损害（补充图 3c）。）。在IL-1R1 KO小鼠的感染初期，唯一检测到的免疫缺陷是募集到腹膜腔的嗜中性粒细胞减少（补充图 3a）。总之，这些结果表明，缺乏IL-1R1的小鼠大脑中血液免疫细胞的反应受损，导致寄生虫负担增加。这表明在慢性弓形虫感染过程中，IL-1信号传导可促进大脑中的免疫反应。
我们已经确定了IL-1信号传导在促进大脑对慢性弓形虫感染的免疫反应中的作用，我们希望确定大脑中哪些细胞可以在大脑环境中对IL-1做出反应。我们对来自慢性感染小鼠的大脑切片上的IL-1R1进行了免疫组织化学染色。我们发现，IL-1R1主要在脑血管中表达，层粘连蛋白染色突出了血管的基底膜（图 3a，b）。有趣的是，在整个血管（图3a，b）或所有血管（图3b）上都看不到表达 。 ）。这表明内皮细胞之间存在一定程度的异质性，并且可能反映了它们对IL-1的反应能力。我们通过IHC（补充图4a）和流式细胞仪（补充图 4b，c）在CD31 +细胞 上特异性检测了IL-1R1表达。为了测试在这种感染中是否需要IL-1R1的内皮表达，我们首先评估了放射敏感性（造血细胞）和放射抵抗性（非造血细胞）细胞的潜在作用。为此，我们用IL-1R1 KO小鼠创建了骨髓嵌合体。我们致命地照射WT和IL-1R1 KO小鼠，然后从WT或IL-1R1 KO小鼠中静脉转移骨髓细胞。在感染弓形虫之前，我们需要进行6周的复原，我们在感染后4周进行了分析（图 3c）。我们发现接受WT骨髓的IL-1R1 KO接受者比接受WT或IL-1R1 KO骨髓的WT接受者具有更高的脑囊肿负担（图 3d）。与此相一致，IL-1R1 KO受体小鼠，无论其骨髓来源如何，与WT受体相比，在大脑中的总白细胞数量均减少了（图 3e）。综上所述，这些数据表明，对寄生虫的宿主控制需要在抗辐射细胞群上表达IL-1R1，这与我们的假设有关，即相关表达在脑内皮细胞上的假设是一致的。
a，b将来自慢性感染的C57B6 / J WT小鼠的脑切片，并用DAPI（蓝色）和层粘连蛋白（红色）和IL-1R1（绿色）抗体染色，显示实质性血管。致命地照射c – eWT（CD45.1）和IL-1R1 KO（CD45.2）小鼠，然后用WT或IL-1R1 KO小鼠的骨髓重建。允许小鼠重建6周，然后腹腔感染弓形虫 Me49株的10个囊肿腹腔感染。处死pi小鼠4周，收集其大脑进行分析。（n ＝ 39只小鼠）。d将大脑匀浆并通过光学显微镜对囊肿计数。Ë处理大脑进行流式细胞术，并计算白细胞总数。在单重态/活细胞上对细胞进行预门控。d，e数据来自两个实验，使用随机块方差分析（两种方法）进行统计。数据表示为平均值±SEM。f WT和IL-1R1 KO小鼠腹腔感染弓形虫 Me49株10个囊肿。注射后第6周，处死小鼠，将大脑匀浆，提取RNA，并进行qPCR分析。来自2（Ccl2）或3（Icam1，Vcam1）实验的数据; 使用随机块方差分析（两种方法）执行统计。数据表示为平均值±SEM。（n = 26只小鼠ICAM1和VCAM1，Ñ = 16只小鼠中Ccl2）。g – j将来自慢性感染的WT和IL-1R1 KO小鼠的大脑切片，并对其进行ICAM-1（g，h）或VCAM-1（i，j）染色。显示了血管的代表性图像。g，h比例尺为50μm，i，j比例尺为60μm。
在慢性弓形虫感染期间，免疫细胞不断渗透到大脑中对于保持对寄生虫的控制是必要的。与其他组织一样，使细胞成功渗透到大脑的第一步是与表达激活的内皮的血管粘附分子以及趋化因子相互作用。实际上，与幼稚状态相比，慢性刚地弓形虫感染期间脑内皮被激活，这可以通过脑内皮细胞上ICAM-1和VCAM-1分子表达的增加来看出（补充图 5a-d）。我们的数据显示，与未处于幼稚状态的细胞相比，表达IL-1R1的内皮细胞表达ICAM-1的程度更高（补充图 5e）。），并且IL-1R1 +内皮细胞也在受感染的组织中表达VCAM-1（补充图 5f）。
我们在模型中研究了这些分子对IL-1信号的依赖性，发现它们的表达部分依赖于IL-1信号。用来自慢性感染小鼠的全脑匀浆评估，IL-1R1 KO小鼠大脑中Icam1，Vcam1和Ccl2的 mRNA表达下降（图 3f）。为了更具体地解决对中枢神经系统脉管系统的影响，我们检查了在使用IHC进行慢性感染期间，WT和IL-1R1 KO小鼠脑切片中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达（图 3g–j）。代表性图像显示，与WT相比，IL-1R1 KO小鼠大脑中ICAM-1和VCAM-1反应性明显降低（图 3g–j）。总之，这些数据表明，在慢性弓形虫感染中，脑中血管粘附分子和潜在趋化因子的表达增加部分取决于IL-1信号传导。粘附分子表达的调节可能是IL-1在慢性弓形虫感染过程中促进免疫细胞向大脑渗透的一种机制。
为了确定ICAM-1和VCAM-1在慢性弓形虫感染期间募集浸润单核细胞的重要性，我们使用抗体治疗在体内阻断其配体（分别为LFA-1和VLA-4）。我们用α-LFA-1和α-VLA-4阻断抗体的组合治疗了慢性感染的WT小鼠，总共进行了两种治疗。治疗5天后，与对照小鼠相比，接受阻断抗体的小鼠从大脑中分离出来的浸润性髓样细胞数量减少（补充图 5g）。具体而言，我们观察到Ly6C hi人群存在缺陷（补充图 5h），表示血液来源的单核细胞缺乏。单核细胞进入的减少转化为大脑中更少的iNOS +细胞（补充图 5i）。这些数据表明，与ICAM-1和VCAM-1的相互作用对于慢性感染期间单核细胞浸润进入大脑是必需的，并且IL-1信号传导促进了这些粘附分子的表达。
IL-1α和IL-1β均与IL-1R1结合并通过IL-1R1发出信号。在IL-1信号传导在慢性弓形虫感染期间促进大脑中的髓样反应中发挥了作用后，鉴于IL-1α和IL-1β，我们试图确定这种作用是由这两种细胞因子中的一种还是两种介导的。由受感染的大脑中不同的髓样细胞群体表达。为了解决这个问题，我们感染了缺乏IL-1α或IL-1β的小鼠，并分析了慢性感染阶段的细胞免疫反应和寄生虫负担。感染后六周，IL-1αKO小鼠的寄生虫负担比野生型增加，这是通过qPCR分析来自脑匀浆的寄生虫DNA所测得的（图 4a））。然而，IL-1βKO小鼠与WT相比，寄生虫负担没有变化（图 4a）。这表明，出乎意料的是，IL-1α参与了慢性感染过程中对寄生虫的控制，而IL-1β则没有。
WT C57B6 / J，IL-1αKO和IL-1βKO腹腔内感染了弓形虫Me49菌株的10个囊肿。收获6周的pi大脑并进行分析。从大脑匀浆中分离出基因组DNA，并使用实时qPCR对寄生虫DNA进行定量。数据来自两个实验；使用随机块方差分析（两种方法）执行统计。数据表示为平均值±SEM。（n ＝ 20只小鼠）对于WT对IL- 1αKO p＝ 0.0259，对于IL-1αKO对IL- 1βKO p＝ 0.0198。b，c来自WT（b）和IL-1αKO（c的脑切片）进行H＆E染色，并显示代表性图像。箭头指示免疫细胞簇。比例尺指示100μm（以相同放大倍数拍摄的图像）。d – k处理大脑以获得单细胞悬液，并通过流式细胞仪进行分析。来自4或5个编译实验的成对平均值，使用随机分组ANOVA（双向）进行统计。d，h CD11b + CD45 hi定义的人脑血液来源的骨髓细胞。细胞预控开启汗衫/现场/ CD45 + / CD11c的- 。（n ＝ 32只小鼠）。d p ＝ 0.039。E，I iNOS的+每个脑细胞进行定量，在汗衫/现场/ CD45预控+ / CD11c的- / CD11b的+ CD45 喜。（n ＝ 32只小鼠）。e p ＝ 0.045。对f，g，j – k CD8 +和CD4 + T细胞进行定量，并在单重态/活体/ CD3 +上进行预门控。f p = 0.033。（f，g，n ＝ 37只小鼠；j，k，n ＝ 40只小鼠）。源数据（d– k）作为源数据文件提供。
从H＆E染色的大脑切片中的免疫细胞簇可以看出，与WT相比，IL-1αKO小鼠表现出更少的炎症局灶性区域（图 4b，c）。我们还发现，与WT相比，IL-1αKO小鼠与IL-1R1 KO小鼠一样，浸润到大脑的外周单核细胞/巨噬细胞数量减少，而iNOS表达细胞的数量减少（图 4d，e）。它们在大脑中的CD8 + T细胞数量也减少了（图 4f，g）。另一方面，IL-1βKO小鼠在慢性感染过程中浸润到大脑的外周髓样细胞数量或这些在多次实验中表达iNOS的细胞数量与WT无差异（图 4h，i），这与这些小鼠的寄生虫负担无变化是一致的。IL-1βKO小鼠的T细胞浸润也没有缺陷（图 4j，k）。总之，这些结果表明，IL-1信号传导在慢性弓形虫感染期间促进脑部免疫反应的作用是由IL-1α而非IL-1β介导的。
我们的结果证明了IL-1α在慢性弓形虫感染中的作用。我们还显示，与巨噬细胞相比，受感染的大脑中的小胶质细胞富含IL-1α，尽管这两种人群均表达。因此，我们旨在确定该模型中哪种细胞类型释放IL-1α。用PLX5622处理12天以消除小胶质细胞的未感染小鼠丧失了大脑中几乎所有的Il1a mRNA表达（图 5a），这与检测纯真小鼠小胶质细胞中IL-1α的流式细胞仪和免疫组化数据一致（补充图 1a，b， d）。为了检查感染期间IL-1α的释放，我们首先建立了一种测定离体离体脑细胞IL-1α释放的方法。从脑匀浆中产生单细胞悬液，洗涤脑单核细胞并在完全培养基中铺板18小时，并收集上清液用于ELISA分析。使用这种方法，我们发现从小鼠脑中分离出的细胞确实可以以依赖感染的方式释放IL-1α（图 5b）。应当指出，感染动物的脾细胞未释放可检测的IL-1α。然后，我们用我们的小胶质细胞记者模型FACS排序的ZsGreen +小胶质细胞和ZsGreen的-来自感染小鼠的骨髓细胞。铺平相等数量的小胶质细胞和外周髓细胞，并收集上清液以测量IL-1α释放。我们观察到这些人群的差异非常明显。纯化的小胶质细胞离体释放IL-1α，而纯化的单核细胞/巨噬细胞释放的细胞因子数量可忽略不计（图 5c）。我们显示，由于血液来源的细胞实际上释放了更多的LDH（图5d），因此IL-1α释放的这种差异似乎并不是由于小胶质细胞的整体死亡增加所致 。我们还显示，当用甘氨酸处理保留膜完整性时，IL-1α释放受到抑制（图 5e），离体脑单个核细胞离体的总可能IL-1α释放（图 5f））。综上所述，这些发现表明感染小鼠的小胶质细胞具有释放IL-1α的能力，这可能表明小胶质细胞和巨噬细胞可能经历不同类型的细胞死亡。
在处死前，将未感染的小鼠喂饲对照食物或含有PLX5622的食物12天。RT-qPCR检测全脑匀浆中IL-1α 的 mRNA水平。（ 每组n = 2只小鼠）数据以平均值表示。b收获WT小鼠的pi大脑6周，并将其加工成单细胞悬液。将细胞铺在96孔板中，并在37℃下孵育过夜。然后通过ELISA测量IL-1α释放。（n ＝每组3只小鼠，p ＝ 0.0001）数据以平均值±SEM表示。c，d慢性感染的CX 3 CR 1 Cre-ERT2 × ZsGreen fl / stop / fl处死小鼠，收获大脑并进行流式细胞术处理。样品在BD晓月运行，门控活/汗衫/ CD45 + / CD11b的+从ZsGreen的+和ZsGreen的-种群控和排序。合并来自6只小鼠的细胞。将相同数量的每个细胞群体铺板并在37℃下孵育过夜。收集上清液并通过ELISA分析IL-1α（c， 每组n孔7孔，p = 9.76×10 -9）和LDH（d，n =每组3孔，p <0.0001）（绘制为吸光度） 490–680 nm）。对于c显示了两个实验的结果。数据表示为平均值±SEM。e，f按照（b）进行测定，部分孔用甘氨酸处理以终止膜通透性（e， 每组n = 4孔，p <0.0001）或含triton的裂解缓冲液以显示可能的总释放（f，n = 7孔）。数据表示为平均值±SEM。使用两尾学生的T检验（a，b，d，e）或随机分组方差分析（双向）（c）进行统计。
为了开始研究在慢性弓形虫感染期间炎性细胞死亡是否可以在大脑中释放IL-1α ，我们首先广泛研究了大脑中的细胞死亡。注射后第4周，对小鼠腹膜内（ip）注射碘化丙锭（PI）。PI注射后24小时，处死小鼠进行分析。在刚感染弓形虫的小鼠的大脑中观察到细胞中PI的摄取，这表明细胞死亡或严重的膜损伤，并出现在局灶区域（图 6a，b），表明在该区域中存在细胞死亡。慢性感染期间的大脑。
a，b慢性感染的C57B6 / J小鼠经腹腔注射20 mg / kg碘化丙啶。24小时后，处死小鼠并用共聚焦显微镜对大脑成像。显示了代表性图像。c，d用10个刚地弓形虫 Me49菌株的囊肿感染表达ASC-茶氨酸（c）或ASC-茶氨酸和CX3CR1-cre ERT2 ZsGreen（d）的小鼠。感染后4周，收集大脑，冷冻保存，染色和成像。箭头表示Iba1 +细胞（c）或ZsGreen +小胶质细胞（d）中的ASC聚集体。e–iWT和casp-1 / 11KO小鼠感染了弓形虫 Me49株的10个囊肿。收获6周的pi大脑并进行分析。显示了3–6个实验的成对平均值。È每个脑囊肿负担通过在光学显微镜计数在脑匀浆囊肿确定。（n ＝ 20只小鼠，p ＝ 0.034）。f通过流式细胞仪对浸润的髓样细胞群体进行定量。细胞预控开启汗衫/现场/ CD45 + / CD11c的- 。（n ＝ 51只小鼠，p ＝ 1.47×10 -4）。g iNOS +细胞群进行了量化，对汗衫细胞预门/现场/ CD45 + / CD11c的- / CD11b的+ / CD45 喜。（n ＝ 51只小鼠，p ＝ 0.0024）。ħ，我 CD8 +和CD4 + T细胞群进行定量，在活/单峰/ CD3细胞预门控+。h（n = 41只小鼠）。g（n ＝ 51只小鼠，p ＝ 7.47×10 -4）。j，k来自WT的脑切片（j）和caspase-1 / 11 KO（k）小鼠进行了H＆E染色，并显示了代表性图像。箭头指示寄生虫囊肿。使用随机块方差分析（双向）（e – i）进行统计。（a，b）中的比例尺为400μm，（d）中的比例尺为15μm，所有其他比例尺均为50μm。源数据（e – i）作为Sourcedata文件提供。
炎性活化已经牵连在体外和急性期间刚地弓形虫感染39，40，41，并且可能潜在地参与IL-1α的释放。IL-1α，如IL-1β，不规范地分泌，并且需要的细胞死亡或显著膜扰动被细胞外释放的46，47，48。IL-1α不需要由炎性体平台处理，但是，由于要释放IL-1α需要质膜的透化作用，因此炎性体介导的细胞死亡可能仍有助于其释放。寻找慢性感染弓形虫的小鼠大脑中炎症小体活化的证据，我们感染了ASC-citrine报告基因小鼠，其中包含与CARD（ASC）结合的炎症小体衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白与荧光蛋白citrine融合。炎性体激活后，报告基因显示标记的ASC呈斑点状聚集。在慢性弓形虫感染期间的大脑中，在Iba1 +小胶质细胞或巨噬细胞的炎症区域周围观察到ASC斑点（图 6c）。我们进一步将ASC-黄嘌呤小鼠系与小胶质细胞报道小鼠系杂交。感染后，观察到被感染的大脑小胶质细胞中含有ASC斑点（图 6d）。
为了进一步研究炎性体依赖性过程在慢性弓形虫感染中的作用，我们感染了caspase-1 / 11 KO小鼠。感染后六周，缺乏这些炎症性胱天蛋白酶的小鼠大脑中的寄生虫囊肿数量增加（图 6e），表明寄生虫控制能力受损。Caspase-1 / 11 KO小鼠在慢性感染期间大脑单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞数量也减少（图6f），与WT小鼠相比，表达iNOS的浸润性髓样细胞明显减少（图6f）。 。 6克）。这些小鼠还表现出CD4 + T细胞减少（图 6h，i）。除了增加总的囊肿负担外，与WT相比，caspase-1 / 11 KO小鼠还有更多的寄生虫囊肿簇（图 6j，k），这可能表明在寄生虫再激活区域缺乏对寄生虫的控制。总之，这些结果与在感染的IL-1R1 KO小鼠中观察到的结果相似，表明caspase-1 / 11活性对于弓形虫感染的宿主控制很重要。
我们的数据中的控制牵连的炎性依赖性过程弓形虫在脑，因此我们研究了gasdermin-d，pyroptosis的成孔执行的重要性37，49，50，51。我们利用gasdermin-D（gsdmd）KO小鼠来具体评估烧伤的重要性。在pi的6周内，gsdmd KO小鼠与WT相比，寄生虫囊肿负担显着增加（图 7a）。像IL-1R1 KO，IL-1αKO和caspase-1 / 11 KO小鼠一样，gsdmd KO小鼠也显示出渗透到大脑的免疫细胞数量减少（图 7b）。
a – c C57B6 / J和Gasdermin D KO小鼠腹腔内感染了弓形虫 Me49株的10个囊肿。注射后6周，处死小鼠并收获组织进行分析。显示了来自两个实验的数据（n = 18只小鼠）。通过在光学显微镜下计数脑匀浆中的囊肿，确定每个大脑的囊肿负担，p = 8.14×10 -4。b处理脑组织以进行流式细胞术分析，并对免疫细胞群体进行定量。先前所有人口都被关在了活/单身。CD4 +和CD8 +已在CD3 +上预选通T细胞；DCs在CD45 +细胞上预先选通；浸润的巨噬细胞/单核细胞（Mϕ）定义为CD11c - CD11b + CD45 hi；iNOS +细胞被门控在M +门内。从左到右的p值是：0.0017、0.0812、0.00048、0.0012和0.00022。c将来自WT和gsdmd KO小鼠的脑匀浆的单细胞悬液接种在96孔板中，并在37°C下孵育过夜。分离上清液并通过ELISA分析IL-1α，p ＝ 4.77×10 -4。d如（c）所示，用对照培养基或20μm坏死磺酰胺（NSA）接种WT小鼠的脑匀浆，p ＝ 8.05×10 -10。显示了来自两个实验的IL-1α释放（d）。（n ＝ 9只小鼠）数据以平均值±SEM表示。使用随机块方差分析（双向）进行统计。
为了直接评估细胞凋亡对IL-1α释放的贡献，从gsdmd KO小鼠中分离出脑单核细胞，并通过ELISA测定离体IL-1α的释放。与野生型小鼠相比，从gsdmd KO小鼠脑中分离出的细胞向上清液中释放的IL-1α明显更少，IL-1α释放减少了约70％（图 7c）。我们还利用了坏死磺酰胺（NSA），它已被证明是小鼠52中gsdmd的特异性抑制剂。从感染的WT小鼠分离的脑细胞在对照条件下进行离体IL-1α释放分析，或与20μMNSA孵育（图 7d）。令人惊讶的是，NSA抑制了离体IL-1α的释放，证实了该释放取决于gsdmd。综上所述，这些结果表明IL-1α以依赖gsdmd的方式从受感染的大脑细胞中释放出来，并促进了抗寄生虫免疫细胞向弓形虫感染的大脑中的浸润。
弓形虫建立慢性脑部感染在其宿主，因此需要长期的神经炎症4，5，53。关于这种寄生虫的免疫反应众所周知，但是在慢性感染阶段大脑中的小胶质细胞的功能仍被了解。早期研究使用表明，IFN-γ和在感染前LPS治疗抑制寄生虫复制鼠的培养系统和人的小胶质细胞27，28，29。然而，小胶质细胞特异功能的脑部感染理解受到阻碍的事实，小胶质细胞迅速失去自己的身份在文化54。而且，培养技术不能概括小胶质细胞感染其他细胞或大脑组织结构时的复杂相互作用。已经在小鼠中的研究表明，小胶质细胞和巨噬细胞浸润可产生趋化因子和细胞因子在感染9，14，30，31，32。但是，我们的小胶质细胞记者小鼠模型使我们能够在弓形虫的慢性感染过程中发现特异于小胶质细胞的功能，这不同于浸润的巨噬细胞。因此，我们旨在检查大脑中的小胶质细胞和巨噬细胞，以研究潜在的差异。
通过RNA-seq分析以及感染的脑组织染色，我们发现在脑浸润性单核细胞/巨噬细胞中存在NF-κB标记，而在同一环境中的小胶质细胞中却不存在。这两种细胞类型可能会暴露于大脑内的相同信号，这表明这些细胞的个体发育对其功能能力具有长期影响。定义小胶质细胞身份的转录因子（包括Sall1）可能正在塑造转录格局，抑制可能潜在地破坏脑部炎症的基因座55。我们认为这些差异是分工的证据，小胶质细胞和血液来源的巨噬细胞在感染弓形虫的过程中以不同的方式促进大脑炎症。尽管血液细胞显示出典型的炎症相关的NF-κB反应，但小胶质细胞可能更适合通过释放警报蛋白而不是通过上调可能损害局部组织的更广泛的程序来促进炎症。
我们发现alalinIL-1α在小胶质细胞中表达，尽管它们明显缺乏在浸润的髓样细胞中发现的IL-1β表达。这表明这两种细胞类型都可能能够参与IL-1反应，但本质上是不同的。重要的是，我们表明宿主的免疫力取决于IL-1α的活性，而不是IL-1β的活性，并且IL-1α是从小胶质细胞体外释放的，而不是从浸润的巨噬细胞释放的。通常，IL-1β比IL-1α受到更多研究，并且有讨论IL-1信号传导时涉及的历史。最近，IL-1α已被证明有助于某些炎症环境。已显示IL-1α会响应二氧化硅而引发无菌性肺部炎症56。最近，有人提出IL-1α而不是IL-1β驱动败血症病理学[ 57]。已经开始研究中枢神经系统中的IL-1α活性，它对脊髓损伤中显示的细胞因子具有有害作用58。IL-1β与某些感染模型有关，但先前尚未报道脑感染中IL-1α的活性。作为一种在基线时在大脑中表达的警报蛋白，IL-1α可以理想地放置，以在强烈的免疫浸润之前对由寄生虫引起的早期损害做出反应。
在这项工作中，我们还表明IL-1α可能会在脑血管上发出信号，从而促进免疫细胞的浸润。我们发现脑血管系统上的IL-1R1表达显示出镶嵌模式。这可能表明存在内皮细胞功能上不同的亚群，这些亚群能够响应不同的信号而被激活59。有在文献中有充分的证据支持在内皮细胞上的IL-1R1表达以及CNS脉管系统的对IL-1的响应60，61，62，63，64。然而，IL-1也已显示出对免疫细胞信号65，66，67。我们发现，在我们的模型中，IL-1R1在耐放射细胞上的表达很重要，这支持了内皮细胞作为相关的应答者，但是也有证据表明其他脑部驻留细胞可以对IL-1作出应答。有人提出，小胶质细胞IL-1R1的表达在消融后的自我更新中发挥作用68。小胶质细胞是部分抗辐射的，在辐射和繁殖后确实会发生一些周转。也有人建议IL-1可以作用于神经元，尽管应该指出的是，据报道神经元还表达一种独特形式的IL-1RAcP，它会影响下游信号传导69。目前还不清楚的星形胶质细胞是否表达IL-1R1，但星形胶质细胞在具有通过趋化因子产生影响免疫细胞浸润的能力大脑表示另一抗性无线电细胞群14，43。
浸润的免疫细胞表达前IL-1β，但在该模型中我们尚未检测到IL-1β的作用。我们还显示，即使它们表达IL-1α，它们也不会离体释放，这表明它们可能以免疫学上安静的方式死亡，例如细胞凋亡，而小胶质细胞可能会经历更炎性的细胞死亡形式，包括烧伤。如果这两种细胞确实经历了不同形式的细胞死亡，那么小胶质细胞如何激活gasdermin-D释放炎性因子将引起人们极大的兴趣。寄生虫再激活区域中的小胶质细胞有可能被感染，感觉到细胞质中的寄生虫产物，并死亡以消除这种寄生虫复制的利基。NLRP1和NLRP3都被证明能够识别弓形虫39，40，41，可能是小胶质细胞的候选传感器。AIM2可以识别DNA 70，因此，如果寄生虫DNA暴露于细胞质中，则可以被激活。但是，我们和其他人 6未能在慢性感染的小鼠中观察到小胶质细胞的直接感染。小胶质细胞迁移到寄生虫重新激活的位置可能会识别由宿主细胞死亡或破坏产生的产物（例如ATP），并经历会促进炎症的死亡。因此，在小胶质细胞中胃蛋白酶-D的胱天蛋白酶依赖性切割上游的传感器引起了极大的兴趣。
C57BL / 6（CD45.2）小鼠购自杰克逊实验室（Jackson Laboratory）或在我们的动物设施内无特定病原体的场所繁殖。用于骨髓嵌合体实验的B6.SJL-Ptprc a Pepc b / BoyCrCl（C57BL / 6 CD45.1）小鼠购自Charles River。Gsdmd -/-小鼠由J. Lukens提供。所有其他小鼠原本是从Jackson实验室购买的，然后保留在我们的动物设施内，包括：Il1a -/-（＃67031），Il1b -/-（＃034447），Il1r1 -/-（＃003245），Casp1 -/- Casp11 -/-（＃016621），ASC黄水晶（＃030744）和CX3CR1Cre-ERT2 × ZsGreen fl / stop / fl小鼠。对于CX3CR1 Cre-ERT2 × ZsGreen fl / stop / fl小鼠，CX3CR1 Cre-ERT2小鼠（＃020940）和Ai6小鼠（＃007906）从Jackson Laboratories购买并在我们的工厂内杂交。将所有小鼠饲养在无UVA特定的无病原体的设施中，光照/黑暗周期为12小时，环境温度为68至72°C，湿度为30至60％。对于所有实验，所有小鼠的年龄和性别均匹配。感染使用II型刚地弓形虫Me49株，在长期感染的瑞士韦伯斯特小鼠（Charles River Laboratories）中保持，并通过CBA / J小鼠（杰克逊实验室）进行实验性感染。对于实验性感染，将慢性感染（4-8周）的CBA / J小鼠的大脑匀浆以分离组织囊肿。然后给实验小鼠腹膜内注射10个Me49囊肿。所有程序均遵循弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会的规定并获得其批准。
在单个实验中，当在同一组织中评估多个参数时，将使用相同的样本（即，通过流式细胞术分析多个免疫细胞群时，将使用来自同一大脑样本的细胞）。带有流式细胞术数据的代表性IHC图像取自不同的大脑样本。
将脑组织置于完整的RPMI中，用剃须刀切碎，然后通过18号针头刺入。将30μL匀浆置于显微镜载玻片上，并盖上盖玻片。在明场DM 2000 LED显微镜（Leica Biosystems）上手动计数囊肿。
处死后立即用30mL冷的1X PBS灌注小鼠。收集大脑和脾脏，并放入冷的完全RPMI培养基（cRPMI）（10％FBS，1％青霉素/链霉素，1％丙酮酸钠，1％非必需氨基酸和0.1％2-ME）中。如果收集了腹腔灌洗液，则在灌注之前，用26号针头通过完整的腹膜注射5 mL的冷1X PBS，然后用22号针头取出。如果收集血清，则收集心脏血液并在4°C下凝结过夜以分离血清。
收获后，将大脑用剃须刀切碎，通过18号针头，然后在37°C下用0.227 mg / mL胶原酶/分散酶和50 U / mL DNase（Roche）酶消化45分钟。消化后，将脑匀浆通过70μm过滤器（Corning）并用cRPMI洗涤。为了从样品中去除髓磷脂，然后将过滤后的脑匀浆再悬浮于20 mL 40％Percoll中，并以650× g的速度离心 25分钟。抽吸髓磷脂，用cRPMI洗涤样品，然后重悬于cRPMI。将脾脏机械均质化，然后通过40μm过滤器（Corning）。样品用cRPMI洗涤，然后重悬于2 mL RBC裂解缓冲液（0.16 M NH 4Cl）2分钟。然后用cRPMI洗涤细胞，然后重悬。腹膜灌洗液用cRPMI洗涤，沉淀并重悬。
将腹膜灌洗液样品稀释至1×10 5细胞/ 200μL，将其添加至载玻片附件的上腔室（Simport）。使用Cytospin 4（Thermo Scientific）将样品旋转到载玻片上，然后进行H＆E染色。
将来自组织样品的单细胞悬液接种在96孔U型底板中。最初将细胞与50μLFc阻断剂（1μg/ mL 2.4G2 Ab（BioXCell），0.1％大鼠γ球蛋白（Jackson ImmunoResearch））在室温下孵育10分钟。然后将细胞用抗体和活/死染色剂在4°C下表面染色30分钟。表面染色后，将细胞用FACS缓冲液（1％PBS中的0.2％BSA和2 mM EDTA）洗涤，并用2％多聚甲醛（PFA）或固定/通透试剂盒（eBioscience）在4°C固定30分钟。然后将细胞渗透并在4°C下用任何细胞内标记物染色30分钟。然后洗涤样品，重悬于FACS缓冲液中，并在Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter）上运行。使用FlowJo软件v.10进行分析。使用的抗体克隆包括：CD31（390），CD45（30-F11），MHC-II（M5 / 114.15.2），NK1.1（PK136），CD19（1D3），CD3（17A2），CD4（GK1.5），CD11c（N418），CD11b（M1 / 70），Foxp3（FJK -16s）1：400，Ly6G（1A8），Ly6C（HK1.4），CD8a（53-6.7），IFN-γ（XMG1.2），NOS2（CXNFT）1：400，IL-1α（ALF-161 ）和前IL-1β（NJTEN3）。除非另有说明，否则所有抗体的稀释度均为1：200。
对于细胞分选，使用CX3CR1cre ERT2 × ZsGreen fl / stop / fl小鼠。表面染色后，在UVA流式细胞仪核心设施中的BD Aria上分析活细胞。根据ZsGreen的表达，将细胞分选到含血清的培养基中进行离体培养，或分选到Trizol中进行RNA测序。
为了评估IL-1的释放，将脑单细胞悬液接种在96孔板上的完全RPMI培养基中，无需额外刺激。然后将它们在37°C下孵育4小时至过夜（如图中所示）。对于gasdermin-D抑制测定，在孵育过程中将20μM坏死磺酰胺（NSA）添加到孔中。沉淀细胞并收集上清液用于分析。对于分选的细胞群体，将等量的小胶质细胞和巨噬细胞铺板进行分析。
将大约1/4的小鼠大脑放入装有1 mm氧化锆/二氧化硅珠（BioSpec）的打珠管（Sarstedt）中的1 mL TRIzol（Ambion）中。使用Mini-bead搅拌器（BioSpec）将组织匀浆30 s。根据制造商的说明（Ambion）提取RNA。高容量逆转录试剂盒（Applied Biosystems）用于cDNA合成。使用2X基于Taq的预混液（Bioline）和TaqMan基因表达分析（Applied Biosystems）进行qRT-PCR。反应在CFX384实时系统（Bio-Rad实验室）上进行。HPRT被用作所有反应的管家基因，相对表达计算为2 （-ΔΔCT）。引物测定购自ThermoFisher，包括Vcam1（Mm01320970_m1），Icam1（Mm00516023_m1），Ccl2（Mm00441242_m1）和Il1a（Mm00439620_m1）。
收集小鼠的脑并置于4％PFA中24小时。PFA固定后，将大脑移至30％蔗糖溶液中24小时，然后将其包埋在OCT中并在干冰上速冻。将样品保存在-20°C直到切割。切割后，将切片在室温下于含有0.1％triton，0.05％Tween 20和2％山羊或驴血清（Jackson ImmunoResearch）的1x PBS中封闭1小时。然后将切片与初级抗体在4°C下孵育过夜。然后将切片用PBS洗涤，并在室温下与次级Abs一起孵育1小时。然后洗涤切片，并在室温下用DAPI（Thermo Fisher Scientific）进行核染色5分钟。最后，将切片安装好，盖在Aquamount（莱纳实验室）上，盖上盖玻片（Thermo Fisher Scientific）。所有图像均使用Leica TCS SP8共聚焦显微镜系统捕获。使用ImageJ或Imaris软件分析图像。
所用的抗体包括：亲IL-1β（NJTEN3），iNOS的（产品＃PA5-16855）1：400，CD31（390），VCAM-1（429），ICAM-1（YN1 / 1.7.4），C -Rel（G-7），IL-1α（ALF-161）1：100，IL-1R1（cat＃AF771）1：100，p65（D14E12），Iba1（cat＃019-19741）1：1000和层粘连蛋白（产品编号CL54851AP-1）。除非另有说明，否则稀释度为1：200。
将小鼠的大脑浸入福尔马林中，然后送到UVA研究组织学核心，将其包埋在石蜡中，切片并用苏木精和曙红染色。然后将它们在明场DM 2000 LED显微镜（Leica Biosystems）上成像。
ELISA的样品是通过收集小鼠大脑并将其加工成单细胞悬液而获得的。然后将细胞铺板在96孔板中，并在37°C下孵育过夜或5 h（如图例所示）。然后收集上清液，并保存在-20°C下使用。根据制造商的说明对IL-1α（BioLegend 433401）和IL-1β（BioLegend 432601）以及IFN-γ进行ELISA。简而言之，将Immunolon 4HBX ELISA板（Thermo Fisher Scientific）在4°C下用捕获抗体包被过夜。然后洗涤板，并在室温下用含有BSA的缓冲液封闭1小时。洗涤后，添加标准品和样品，并在室温下孵育2小时。洗涤后，加入生物素化的检测抗体，并在室温下孵育1小时。洗涤板，并在室温下与抗生物素蛋白-HRP孵育30分钟。最后，将板洗涤并与ABTS过氧化物底物溶液（SouthernBiotech）一起温育15分钟或直到发生颜色变化。颜色改变后，立即使用Gen5 2.00软件在Epoch Biotek读板器上读取板。
在治疗方案的第1天和第3天，对慢性感染的小鼠（感染后第4周）分别以200μgip的抗LFA-1（Bio X Cell，克隆M17 / 4，目录号BE0006）和抗VLA-4进行腹腔注射（Bio X Cell，克隆PS / 2，目录号BE0071）阻断抗体或对照IgG。然后将其处死并在第5天进行分析。
慢性感染的小鼠（注射后4周）腹腔注射0.4毫克碘化丙啶。注射后24小时，处死小鼠，将其大脑固定PFA并通过共聚焦显微镜进行分析。
对于涉及小胶质细胞耗竭的研究，将成年小鼠喂饲对照食物或随意含PLX5622的食物12天。此时，收获大脑，如上所述提取RNA，并通过qPCR测量IL-1α表达。
在8周龄时，用1000 rad照射C57B6 / J和IL-1R1 KO小鼠。然后将从WT和IL-1R1 KO小鼠中分离出的骨髓细胞静脉内转移（通过眼眶后注射）到接受辐照的小鼠体内。辐射和复原后，使小鼠恢复6周，然后感染。感染后4周，处死小鼠并收集组织用于分析。
在修剪和过滤之前和之后，使用FastQC（v0.11.5）对原始FASTQ文件进行读取质量配置文件。通过Trimmomatic（v0.39）配对端设置为phred33质量评分，可以完成读取过滤和修整。根据四碱基滑动窗口对读数进行修整，其最低质量得分为15，最低领先和试验质量得分为3。最小片段长度设置为36。经过修剪和过滤的读数被映射到GENCODE M13基因组和转录本使用鲑鱼（v0.8.2）定量丰度。将定量的转录本丰度导入R编程环境，并通过Tximport（v1.4.0）转换为ENSEMBL基因丰度。所有预处理步骤均在Python版本2.7.14的Pypiper框架（v0.6.0）中执行。
使用R Bioconductor软件包DESeq2（v1.16.1）以预设的alpha值0.05进行差异表达测试。使用正态先验分布收缩Log2倍数变化值。在进行差异表达测试之前，将所有缺少重复项或计数低的结果从数据集中剔除。使用R包EnhancedVolcano（v1.2.0）可视化差异表达测试的结果，以显示相对于相应的log2倍数变化值的变换后的p值（-log10）。从DESeq2结果列表中显着差异表达的基因中手动选择所有标记的基因。
对于给定的成对比较，差异表达测试结果标记为“上调”或“下调”。将log2倍变化值大于0且BH调整后的p值低于0.05的所有基因指定为上调，并且log2倍变化值小于0且经BH调整后的p的所有基因均被上调。低于0.05的值指定为下调。使用AnnotationDbi（v1.46.0）将差异表达结果表的基因名称从小鼠ENSEMBL代码转换为基因符号。为了确定基因列表的功能概况，使用了R包clusterProfiler（v3.12.0）对基因本体联盟的所有层级上的生物过程中GO术语的过度表示应用了Fisher精确检验。针对差异分布测试中返回p值的所有基因组成的背景分布对列表进行了测试。重要的GO项的BH调整后的p值低于0.05。
从clusterProfiler程序包的结果输出中手动选择了GO术语，以使用pheatmap程序包（v1.0.12）进行绘图。每个GO词条特异的热图显示已对每个基因进行Z值归一化的rlog转换的丰度值。从clusterProfiler结果中选择显示的基因，以丰富生物过程中的GO术语。还使用clusterProfiler点图函数选择了显着丰富的GO项并进行了绘制。
使用不成对的Student T检验，在Prism软件中比较单个时间点的两组的统计分析。当合并来自多个实验的数据以显示感染之间的自然生物学差异时，使用R v.3.4.4软件执行了随机分组ANOVA。通过将实验组建模为固定效应，将日期建模为随机效应，设计该测试旨在评估实验组的效应，同时控制实验日期的任何效应。图例中显示了每个图所使用的测试。所有数据均使用Prism软件绘图。假设分布是正常的。所有图形均显示数据的平均值，或平均值以及各个值。误差线表示标准偏差。
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