通过比较去核和细胞分裂，已经阐明了参与成红细胞终末分化的分子机制。尽管已经报道了成红细胞去核和胞质分裂之间的各种相似性和差异，但是控制去核的机制仍不清楚。我们先前曾报道，动力蛋白和微管组织中心介导了人类成红细胞中细胞核的极化。此外，在成红细胞的去核过程中注意到F-肌动蛋白的积累。因此，在去核过程中，调节动力蛋白或肌动蛋白的信号转导途径中的上游效应子，例如细胞分裂控制蛋白42同源物（Cdc42），可能至关重要。我们在这里研究了Cdc42抑制剂CASIN的作用，在集落形成单位类红细胞（CFU-Es）和成熟的成红细胞中的胞质分裂和去核（第10天）。CASIN以剂量依赖的方式阻断了CFU-Es的增殖及其去核。Dynein在未经处理的CFU-Es的细胞质中呈岛状分布，但以点的形式集中在细胞核附近，并与CASIN处理的细胞中的γ-微管蛋白共定位。CASIN阻止了F-肌动蛋白在CFU-E和第10天细胞中的积累。这些结果表明，Cdc42在成纤维细胞的终末分化过程中通过与动力蛋白和肌动蛋白丝组织的关系在胞质分裂，核极化和核挤压中起重要作用。Dynein在未经处理的CFU-Es的细胞质中呈岛状分布，但以点的形式集中在细胞核附近，并与CASIN处理的细胞中的γ-微管蛋白共定位。CASIN阻止了F-肌动蛋白在CFU-E和第10天细胞中的积累。这些结果表明，Cdc42在成纤维细胞的终末分化过程中通过与动力蛋白和肌动蛋白丝组织的关系在胞质分裂，核极化和核挤压中起重要作用。Dynein在未经处理的CFU-Es的细胞质中呈岛状分布，但以点的形式集中在细胞核附近，并与CASIN处理的细胞中的γ-微管蛋白共定位。CASIN阻止了F-肌动蛋白在CFU-E和第10天细胞中的积累。这些结果表明，Cdc42在成纤维细胞的终末分化过程中通过与动力蛋白和肌动蛋白丝组织的关系在胞质分裂，核极化和核挤压中起重要作用。
哺乳动物的成红细胞在终末分化过程中会挤出细胞核。经过多次细胞分裂，红细胞祖细胞增殖停止，然后冷凝，两极分化，和挤出核1，2。Koury等。先前报道了成纤维细胞去核过程中丝状肌动蛋白（F-actin）的积累3，随后的研究调查了成纤维细胞去核与细胞分裂之间的关系。尽管成红细胞去核和胞质分裂有许多相似之处，但也发现了许多差异。
我们以前曾报道过，动力蛋白和微管组织中心（MTOCs）是促红细胞形成细胞中有丝分裂纺锤体形成和有丝分裂过程中染色体分离的关键分子1。我们还证明了动力蛋白抑制抑制了核极化，从而阻止了去核1。选择分裂位点后，发生F-肌动蛋白的局部积累。我们证明了在人类成红细胞中的犁沟由非肌肉肌球蛋白IIB和肌动蛋白2组成。膜运输和膜融合到分割站点最终导致子细胞的物理分离4，5。已经显示出许多关键的信号转导效应子，包括磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）6，主要通过磷酸化事件在去核过程中起作用。虽然这些结果强烈支持理事细胞极性，动力蛋白的积累，和肌动蛋白丝的通过哺乳动物透明的相关formin（MDIA）2重组的信号转导系统，所涉及的信号转导途径还没有被鉴定1，7。人红细胞的终末分化期间，动力蛋白丝的积累和肌动蛋白丝的重组这两个事件是通过一种或多种信号转导途径调节的。
移位核后部的F-肌动蛋白结构对于核的挤出至关重要，在去核和胞质分裂之间是不同的。促红细胞中的F-肌动蛋白结构富含原代调节蛋白1和非肌肉肌球蛋白IIB，并挤出细胞核8。Wolwer等。先前报道核挤压需要通过钙调蛋白和肌球蛋白轻链激酶途径的细胞内钙信号转导，类似于胞质分裂。然而，与胞质分裂9相比，成红细胞需要细胞内钙的吸收才能去核。还比较了成红细胞去核和不对称细胞分裂。红细胞去核不需要非对称细胞分裂调节剂10。此外，组蛋白脱乙酰基酶，蛋白酶体调节剂，丝裂原活化的蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶被鉴定为参与使用一种新型化学筛选方法11的成红细胞去核的分子。尽管F-肌动蛋白和非肌球蛋白IIB参与了成红细胞的去核，但去核和胞质分裂并非同一现象。
细胞分裂控制蛋白42同源物（Cdc42）是Ras超家族的Ras同源物（Rho）鸟苷三磷酸酶（GTPase）家族的成员，并响应于各种细胞外刺激，起二进制分子开关作用，在三磷酸鸟苷之间循环（GTP）和鸟苷二磷酸（GDP）绑定的活跃状态12。Cdc42通过几种效应蛋白调节肌动蛋白细胞骨架和微管组装的形成，例如含IQ模体的GTPase活化蛋白（IQGAP），p21活化激酶（PAK），可能是分区缺陷型（Par）3 / Par6复杂，威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白同系物（WASP）/神经-WASP（N-WASP）13，14，15。这些调节器在细胞极化，分裂和运动13中起作用。丰岛等。和三岛等。还表明，PI3K的通过Cdc42的活化需要dynactin，一个动力蛋白结合分子的积累，在HeLa细胞中的细胞极化16，17。总而言之，这些发现表明调节动力蛋白的信号转导途径中的上游效应子，例如小的GTPase Cdc42，在人类成红细胞的终末分化中至关重要。
mDia2是mDia家族的成员，是主要的功能性效应分子，受体细胞18中的Cdc42调控。渡边等。已经表明，mDia2在哺乳动物细胞胞质分裂中必不可少，并且mDia2诱导的F-肌动蛋白形成收缩环的支架，然后在分裂细胞19的中心保持其位置。此外，Ji等。结果表明，mDia2通过影响小鼠成红细胞7中收缩性放线菌素环的形成在去核中起重要作用7。这些发现表明，Cdc42调节由mDia2介导的人类成红细胞的去核。然而，渡边等。报道称，mDia2缺陷型成红细胞可能被摘除20。
尽管对目标分子进行功能分析的基本策略是击倒目标分子的基因表达，但困难在于将干扰小RNA（siRNA）和/或某些表达载体转化为原代培养细胞，例如成红细胞。特异性抑制剂通常在研究中使用的目标分子的功能1，2，21。的高度特异性的抑制物Ç DC42 一个 ctivity- 小号 pecific 在抑制因子，CASIN，2 - [（2,3,4,9-四氢-6-苯基-1- ħ咔唑-1-基）氨基]乙醇最近成立22。
本研究的结果表明，Cdc42在人类成红细胞的终末分化过程中通过调节动力蛋白和肌动蛋白丝的组织在胞质分裂和去核中起着至关重要的作用。
我们检查了人类CFU-E和成红细胞中Cdc42的表达。关于蛋白水平，所述免疫印迹分析清楚地表明，Cdc42的在人CFU-ES和成红血细胞恒定表达，那的Cdc42的归一化蛋白质水平终末分化（图中在有核红细胞增加 1 A）。α微管蛋白的表达，用来作为归一化标准的，终末分化（图中下降 1 A）。对于相同数目的细胞，成红细胞的分化程度变小，蛋白质总体上减少23。我们还检查了GAPDH作为标准化的标准；然而，获得的结果类似于α-微管蛋白（数据未显示）。原始免疫印迹显示在SI图S1中。实时PCR分析显示，直到第11天，Cdc42相对mRNA水平保持不变。在第13天，Cdc42相对mRNA水平增加（图 1B）。
Cdc42在终末分化过程中在CFU-Es和成红细胞中的表达。在指定的时间点收获CFU-E和成红细胞，并提取出来进行免疫印迹或实时PCR分析。（A）Cdc42表达的免疫印迹分析。α-管蛋白表达用作对照。显示了3个独立实验的代表结果。第7天对比第13天，* P <0.05。（B）Cdc42的实时PCR分析。将28S rRNA用作对照。将所有值标准化为第7天的值。数据显示为3个独立实验的平均值±SD。第7天对比第13天，* P <0.05。
我们研究了抑制Cdc42对人CFU-Es增殖和分化的影响。CFU-ES的增殖通过在浓度依赖的方式（图中CASIN处理降低了 2 A）。25μMCASIN完全抑制了成红细胞的增殖，而作为对照的DMSO处理的细胞则没有。Cdc42的基因和蛋白质表达水平在有或没有CASIN培养48小时的细胞中均没有显着改变（数据未显示）。然后，我们评估了CASIN对CFU-Es细胞周期模式的影响。将细胞与CASIN再孵育24小时后，细胞周期分析表明，CASIN将G2 / M期的细胞分数降低至明显小于DMSO的分数（分别为9.5±0.6％，12.7±1.6％）（图。 2 B）。在48小时时，经CASIN处理的细胞大于对照细胞（图 2 C）。在使用针对CD71（转铁蛋白受体）和GPA的抗体的FACS分析中，表达这些类红细胞特异性标记的细胞比例并未因CASIN处理而改变。观察CASIN处理的细胞具有在右上角累积为用DMSO处理的细胞（图相比的细胞群 2 d）。CD71表达水平之前显示在人红细胞终末分化过程中被减小24，25。有趣的是，在DMSO处理的细胞中CD71的表达下降，而在CASIN处理的细胞中CD71的表达却没有下降，这与在0 h细胞中CD71的表达相似（图 2）。E）。这些结果表明，CASIN对Cdc42的抑制阻断了CFU-E的增殖和分化。
CASIN抑制Cdc42对CFU-E增殖的影响。（A）第7天CFU-E（1×10 5）在不同浓度的CASIN（5、15或25 µM）或不存在（DMSO）的情况下培养，并在第24和48 h收获除了CASIN。数据显示为3个独立实验的平均值±SD。DMSO vs. 25 µM CASIN，* P <0.05和** P <0.01。（B）在不存在CASIN（DMSO）（红色线）或存在25μMCASIN（蓝色线）的情况下培养24小时后第8天CFU-E的细胞周期分析。来自3个独立实验的代表性结果显示为平均值±SD。DMSO vs. 25 µM CASIN，* P <0.05。（C）在不存在CASIN（DMSO）或存在25 µM CASIN的情况下，将第7天的CFU-E培养长达48小时。细胞用May–Grünwald–Giemsa试剂染色。棒20μm （D）CASIN抑制Cdc42对CFU-Es中CD71和GPA表达的影响。在25 µM CASIN存在或不存在（DMSO）的情况下培养第7天CFU-E（1×10 5），并在加入CASIN 48小时后收获。数据显示为3个独立实验的平均值±SD。（E）在有25 µM CASIN（蓝线）或不存在（DMSO，红线）的情况下培养第7天CFU-Es（黑线），并在加入CASIN 48小时后收获。“细胞（％）”是指CD71表达峰为100的相对细胞数。数据显示为3次独立实验的平均值±SD。
我们检查了Cdc42抑制对成红细胞去核的影响。通过CASIN处理，以浓度依赖的方式降低了成核细胞的去核比例（图 3A）。然后，我们评估了CASIN对终末分化过程中成红细胞中细胞周期模式的影响。将细胞与CASIN再孵育24小时后，细胞周期分析显示，在CASIN存在下，所有相均未改变（图 3B）。25μMCASIN完全抑制了人类成红细胞的去核，而DMSO处理的细胞则没有（图 3 C）。Cdc42的基因和蛋白质表达水平在有或没有CASIN培养48小时的细胞中均没有显着变化（数据未显示）。
CASIN抑制Cdc42对去核率的影响。（A）在不同浓度的CASIN（5、15或25 µM）或不存在（DMSO）的情况下培养第10天的成红细胞（1×10 5），并在第24、48和72小时后收获加入CASIN。数据显示为3个独立实验的平均值±SD。DMSO与25 µM CASIN的比较，** P <0.01和*** P <0.001。（B）在不存在CASIN（DMSO）（红色线）或存在25μMCASIN（蓝色线）的情况下培养24小时后第11天成红细胞的细胞周期分析。来自3个独立实验的代表性结果表示为平均值±SD。（C）在没有CASIN（DMSO）或存在25 µM CASIN的情况下，将第10天的成红细胞培养长达72小时。细胞用May–Grünwald–Giemsa试剂染色。棒20μm （D）CASIN抑制Cdc42对成红细胞中CD71和GPA表达的影响。在不同浓度的25 µM CASIN或不存在（DMSO）的情况下培养第10天的成红细胞（1×10 5），并在加入CASIN 72小时后收获。数据显示为3个独立实验的平均值±SD。（E）CASIN抑制Cdc42对成红细胞CD71表达的影响。在有25 µM CASIN（蓝线）或没有它的情况下（DMSO，红线）培养第10天的成红细胞（黑线），并在加入CASIN 72小时后收获。“细胞（％）”是指CD71表达峰为100的相对细胞数。数据显示为3次独立实验的平均值±SD。
在使用针对CD71和GPA的抗体的FACS分析中，表达这些类红细胞特异性标记的细胞比例并未因CASIN处理而改变（图 3 D）。此外，CD71的表达在这两种DMSO-和CASIN处理的细胞（图降至 3 E）。这些结果表明，从第10天起，CASIN对Cdc42的抑制作用阻止了成红细胞的去核，但没有分化。
然后，我们研究了CASIN对经历终末分化的成核细胞中核定位的影响。将第10天的细胞与CASIN一起孵育24小时后，与DMSO处理的细胞相比，定中心的，极化的和其他比率明显增加。相反，CASIN处理的细胞中网织红细胞的比例低于DMSO处理的细胞中网织红细胞的比例（图 4）。该结果表明，CASIN对Cdc42的抑制在终末分化期间阻止了人成红细胞的核的极化和挤出。
CASIN抑制Cdc42对细胞极化率的影响。在有或没有CASIN的情况下培养第10天的成红细胞（1×10 5），并在加入CASIN后24小时收获。“ 方法 ” 中解释了“居中”，“极化”，“其他”和“网织红细胞”。数据显示为3个独立实验的平均值±SD（N = 300）。DMSO vs. 25 µM CASIN，* P <0.05和** P <0.01。
在CFU-Es（第8天细胞）中，Cdc42位于收缩性放线菌素环旁边（图 5A）。但是，在与CASIN一起孵育24小时的细胞中，Cdc42并未定位在特定的收缩性肌动球蛋白环点上，因此未形成该环（图 5A）。在第11天的细胞中，类似于CFU-Es，Cdc42位于F-肌动蛋白的积聚旁边（图 5 B）。此外，去核后，Cdc42位于网织红细胞内部。但是，在与CASIN再孵育24小时的细胞中，Cdc42并未定位在细胞核附近，并且F-肌动蛋白也没有积累（图 5B）。
Cdc42和F-肌动蛋白在有或没有CASIN处理的CFU-E和成红细胞中的分布。共聚焦显微镜（A）CFU-Es（第8天细胞）和（B）红细胞（day11细胞）被Cdc42（红色），鬼笔环肽（绿色）和DAPI（蓝色）染色，以及差分干涉对比显微图像（DIC）显示。这些是整个共焦堆栈。DMSO和25 µM CASIN分别代表第7天或第10天的细胞，在不使用25 µM CASIN的情况下处理24小时。棒20 µm。
在小鼠成红细胞中，mDia2通过影响收缩性肌动球蛋白环7的形成在去核中起重要作用。我们还检查了mDia2在CFU-Es或成红细胞中的定位。在第8天的细胞中，mDia2位于分裂细胞中的细胞膜附近的细胞质中和间期细胞的核中（图 6A）。在与CASIN再孵育24小时的细胞中，有丝分裂期细胞数量很少，而且mDia2也位于细胞核内（图 6A）。在第11天的细胞中，无论使用CASIN进行何种处理，mDia2都位于细胞核内（图 6）。B）。这些结果表明，Cdc42参与了成色细胞中收缩性肌动球蛋白环的形成，而mDia2作为Cdc42的下游效应子与成色细胞的增殖有关，而mDia2似乎与去核无关。
接受或不接受CASIN处理的CFU-E和成红细胞中mDia2和F-肌动蛋白的分布。显示了用mDia2（红色），鬼笔环肽（绿色），DAPI（蓝色）和DIC染色的（A）CFU-Es（第8天细胞）和（B）成红细胞（第11 天细胞）的共聚焦显微镜。这些是整个共焦堆栈。DMSO和25 µM CASIN分别代表第7天或第10天的细胞，在不使用25 µM CASIN的情况下处理24小时。棒20 µm。
在CFU-Es中，γ-微管蛋白位于细胞中心，而动力蛋白在未经处理的CFU-Es的细胞质中呈岛状分布。但是，在经CASIN处理的细胞中，动力蛋白以点状分布在细胞核附近，并与γ-微管蛋白共定位（图 7A）。在第11天的细胞中，动力蛋白与第8天的细胞相似，在细胞质中呈岛状分布。在另一方面，在CASIN处理的细胞，动力蛋白被定位于一个点图案细胞核附近，并用γ-微管蛋白（图被共定位 7 B）。这些结果表明，Cdc42调节成红细胞中动力蛋白的运动。
接受或不接受CASIN处理的CFU-Es和成红细胞中γ-微管蛋白和动力蛋白的分布。显示了用γ-微管蛋白（红色），动力蛋白（绿色），DAPI（蓝色）和DIC染色的（A）CFU-Es（第8天细胞）和（B）成红细胞（第11 天细胞）的共聚焦显微镜。这些是整个共焦堆栈。DMSO和25 µM CASIN分别代表第7天或第10天的细胞，在不使用25 µM CASIN的情况下处理24小时。棒20 µm。
在本研究中，我们调查了人类分化末梢细胞中Cdc42的表达和定位。此外，CASIN对Cdc42活性的抑制作用阻止了CFU-Es的增殖和分化以及成红细胞的去核。一个关键的结果是，对Cdc42的抑制既阻止了细胞的极化，又阻止了人类成红细胞在终末分化过程中收缩环的形成。这些结果表明，Cdc42信号转导一直被用于人类成红细胞的成熟过程。
Yang等人的先前研究。证明Cdc42缺乏症会引起贫血和脾肿大，并伴有小鼠中爆发形成单位类胡萝卜素（BFU-Es）和CFU-Es减少26。他们的发现表明，Cdc42缺乏症会导致小鼠红细胞生成的早期受阻。目前的结果表明，Cdc42的抑制作用阻止了CFU-Es的增殖和分化。相反，据我们所知，Cdc42在红细胞生成后期的功能作用目前仍未知。我们的结果表明，对Cdc42的抑制在人成血红细胞的晚期损害了细胞核的极化和挤压，这表明Cdc42对人成血红细胞的dynein-tubulin系统和actin-myosin系统都起作用。
在本研究中，我们研究了抑制Cdc42对人成红细胞中动力蛋白定位的影响。Tuncay等。报道说，连接黏附分子-A（JAM-A）调节由Cdc42介导的动力蛋白定位，以控制上皮细胞有丝分裂期间平面纺锤体的方向27。他们的发现表明，JAM-A触发了Cdc42和PI3K的瞬时激活，在皮层产生了PtdIns（3,4,5）P3梯度，并在有丝分裂期间调节了皮质肌动蛋白细胞骨架的形成。当JAM-A被siRNA抑制时，与皮质中的动力蛋白定位形成复合物的动力蛋白减少，有丝分裂纺锤体的排列不正确，三维培养物中的上皮形态发生受到损害27。目前的结果表明，动力蛋白的定位从细胞质中的岛状分布变为点状的细胞核附近，并且通过抑制Cdc42在人CFU-E和成红细胞中与γ-微管蛋白共定位。这些结果与动力蛋白在皮质中的定位降低并且仅在JAM-A敲低细胞27中的MTOCs附近是一致的。总而言之，这些发现和当前结果暗示通过Cdc42进行的信号传导会阻止动力蛋白-动力蛋白复合物的运动，因此需要进一步的研究。
据我们所知，尚未检测人类红细胞生成过程中Cdc42的定位。这是第一个表征Cdc42在人类成红细胞中定位的研究。我们证实，Cdc42位于CFU-Es和成红细胞中F-肌动蛋白积累发生的位置。在体细胞中，胞质分裂过程中Cdc42的定位和活性尚未在动物细胞中进行详细研究28。先前的研究报道，RhoA与Cdc42相似，对于形成收缩性放线菌素环很重要。然而，这些发现是有争议的28。目前的结果表明，Cdc42在CFU-E和成红细胞中收缩性放线菌素环的形成中起着重要作用。
我们表明，在CFU-Es的细胞分裂过程中，mDia2的位置从细胞核改变为细胞质膜。这一结果是在协议使用人和小鼠细胞中获得的以前的研究结果29，30。此外，我们发现在成核细胞去核过程中，mDia2的定位在细胞核中保持不变。Ji等。证实小鼠mDia2 shRNA处理的细胞中去核的成红细胞百分比降低，并暗示mDia2参与去核7。另一方面，渡边等。证实了mDia2缺陷的小鼠红系细胞正常分化，尽管延迟了，但表现出失败的胞质分裂行为，在从成红细胞的后期分化过程中卵裂沟中F-肌动蛋白的积累减少了20。缺乏mDia2的小鼠成红细胞使它们的核去核。这些发现表明，由于红系分化过程中胞质分裂失败，因此抑制了小鼠红系细胞中的mDia2抑制了去核。目前的结果似乎支持了渡边的发现。另外，Cdc42的抑制改变了细胞分裂过程中CFU-Es中mDia2的定位，但没有改变成红细胞的去核。这些结果表明，mDia2作为Cdc42的下游分子至少与CFU-Es的增殖有关，但与成红细胞的去核无关。为了证实这一点，需要有关mDia2对人类成红细胞去核是否必不可少的进一步信息。对我们而言，在人类成红细胞中建立基因转移技术非常重要。
病理上，Cdc42的异常会导致一组临床表型异质，其特征在于可变的生长失调，面部畸形以及神经发育，免疫和血液学异常31。先前的研究报道血液学异常包括淋巴和血小板异常31。然而，据我们所知，尚未报道由Cdc42异常引起的红细胞异常，如贫血。在小鼠中，Cdc42缺乏症是贫血的致命症状26，在人类中也可能如此。
总之，我们在本文中证明了Cdc42在人类红细胞生成中很重要。此外，目前的结果表明，Cdc42在人类成红细胞的终末分化过程中，通过控制动力蛋白和肌动蛋白丝组织，在核极化和核挤压中都起着重要作用。
牛血清白蛋白（BSA），Iscove的改良Dulbecco培养基（IMDM）和碘化丙啶（PI）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。胎牛血清（FCS）来自HyClone Laboratories Inc.（犹他州洛根）。青霉素和链霉素来自Flow Laboratories。胰岛素来自和光纯药工业（日本大阪）。白介素3（IL-3）和干细胞因子（SCF）购自麒麟啤酒有限公司（日本东京）。促红细胞生成素（EPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）来自Chugai Pharmaceutical Co.（日本东京）。维生素B 12叶酸来自Eisai Co.，Ltd.（日本东京），叶酸来自武田制药有限公司（Takeda Pharmaceutical Co.，Ltd.（日本大阪））。Triton X-100来自和光纯药工业公司（日本大阪）。用于间接磁性标记的MACS微珠购自Miltenyi Biotec（德国Bergisch-Gladbach）。正常的小鼠和山羊血清以及兔免疫球蛋白购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）。表1列出了CASIN，2-[（（2,3,4,9-四氢-6-苯基-1 H-咔唑-1-基））和本研究中使用的抗体。
如前所述，从健康志愿者中纯化出G-CSF动员的人外周血CD34 +细胞，并保存在液氮中直至需要32。根据《赫尔辛基宣言》21，所有受试者均已获得秋田大学医学研究生院保护人类受试者委员会的事先批准，并已获得所有受试者的知情同意。为了产生红系祖细胞，CD34 +细胞被解冻并且如先前描述的用于培养物制备1，2，33。将细胞在IMDM中培养红系含有20个％FCS，10％热灭活的合并的人AB血清，1％BSA，10μg/ mL的胰岛素，中0.5微克/毫升维生素B 12，15微克/毫升叶酸，50nM的β -巯基乙醇，50 U / mL青霉素和50μg/ mL链霉素，并补充50 ng / mL IL-3、50 ng / mL SCF和2 IU / mL EPO。将细胞维持在37℃和5％CO 2的培养箱中。在培养的第7天（第7天），收获细胞并用含0.3％BSA的IMDM洗涤3次，并保存在4°C直至进一步使用。第7天的细胞的成熟阶段相似，CFU-ES的，如先前所报道的1，2，33。以下将第7天的细胞称为CFU-E。CFU-Es的等分试样在仅含EPO的红系培养基中培养，不含β-ME，SCF或IL-3以诱导分化，并补充或不加入CASIN 22。DMSO，CASIN的溶剂，用作对照。DMSO的最终浓度为0.025％，明显低于对人成红细胞2有毒的浓度。在不同时间点收集细胞，用含0.3％BSA的IMDM洗涤3次，重悬于含0.3％BSA的IMDM中，并保存在4°C下直至进一步使用。
为了评估去核作用，使用Cytospin 3（Shandon Lipshaw Inc.，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）将细胞离心分离到载玻片上，并用May–Grünwald–Giemsa染色。去核被定义为将核排出到网织红细胞的外部。网状细胞仍与排出的细胞核或网状细胞与细胞核之间的细连接链接触，被认为是最新的去核细胞。在每个载玻片中计数包括红细胞和成红细胞的300个细胞后，使用公式[红细胞/（红细胞+成红细胞）]×100（％）计算去核分数。在每个时间点使用一式三份的培养物。基于使用0.2％台盼蓝染料排除率和存活率进行了评估1，2，33。
实时PCR是如前所述进行1，21。简而言之，使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国）从每个样品的2×10 5个培养细胞中提取总RNA 。使用PrimeScript 1st cDNA合成试剂盒（TAKARA Bio Inc.，滋贺，日本）对提取的RNA进行反转录。然后使用LightCycler 480 SYBR Green I Master（德国曼海姆罗氏应用科学公司）对所得的cDNA进行实时PCR。PCR引物序列：CDC42正向引物5'-CTGTCAAGTATGTGGAGTGTTCTGC-3'和反向引物5'-CTCTTCTTCGGTTCTGGAGGCT-3'；28S rRNA正向引物5'-TGGGTTTTAAGCAGGAGGGGTG-3'和反向引物5'-CCAGCTCACGTTCCCTATTA-3'。相对基因表达水平用28S rRNA基因标准化，如先前所述34。每个样品重复三次。
如先前的描述进行的免疫印迹分析1，2，21。表1列出了本研究中使用的一抗和二抗。ECL Select Western印迹检测试剂（英国白金汉郡GE Healthcare）用于显色。使用c-DiGit（LI-COR，内布拉斯加州，美国）定量免疫反应蛋白条带的强度。分析的蛋白的相对表达水平与α微管蛋白的表达进行归一化1，2，21。
如前所述1进行流式细胞术。简而言之，将从培养物中收集的细胞用含0.3％BSA的IMDM洗涤两次，并与针对人CD71（转铁蛋白受体）的藻红蛋白偶联的小鼠单克隆抗体（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，美国）和与荧光素异硫氰酸酯偶联的小鼠一起孵育人类GPA的单克隆抗体（美国加利福尼亚州圣塔克拉拉市的达科）。然后将细胞用含0.5％BSA的10 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4和0.15 M NaCl（磷酸盐缓冲盐水：PBS）洗涤两次，然后使用FACSCanto II（BD Biosciences）和FlowJo（BD Biosciences）进行分析。如先前所述进行细胞周期分布1，2。
根据细胞核是否位于细胞中心（居中）将细胞分类。球形细胞在一侧靠近质膜（极化）或靠近核（网织红细胞），含有一个浓缩的核。其他细胞类型，例如多核细胞和具有浓缩凋亡核的细胞，被归类为“其他”。如前所述1对细胞图像进行分类。如上所述计算每种细胞类型的分数。结果表示为3次独立实验的平均值，平均值±SD。
如上所述，使用共聚焦显微镜评估了Cdc42，F-肌动蛋白，动力蛋白，γ-微管蛋白，α-微管蛋白和mDia2的免疫化学分布。在存在或不存在25μMCASIN的情况下培养第7天或第10天细胞。
如先前所述进行常规免疫细胞化学染色1，2。荧光染色使用两个共焦激光扫描显微镜（LSM780，卡尔·蔡司显微镜系统，德国）进行成像，该显微镜配备100倍物镜和10倍相机镜头（卡尔·蔡司显微镜系统），放大倍数为3，如其他地方报道1。使用488 nm的氩激光激发Alexa 488的荧光染料。检测器狭缝配置为使通道之间的串扰最小，并使用ZEN2012 Ver 3.2（ZEISS）处理。
使用学生t检验对参数数据进行统计分析，并使用曼恩·惠特尼U检验对非参数数据进行统计分析。在所有分析中，P值<0.05被认为是显着的。
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