我们调查了肌酸（CRE）和牛磺酸（TAU）混合物对果蝇和小鼠模型在应激诱导的抑郁行为行为和生物标志物的抗抑郁作用。在果蝇中施用CRE / TAU混合物后在模型中，测量了由振动，运动，攀爬活动和生存率引起的抑郁症状态。正常压力（NS）组的运动较对照组（CON）减少。CRE / TAU治疗组的运动（特别是0.15 / 0.5％）恢复到CON水平。在慢性轻度应激诱导的抑郁小鼠模型中证实了CRE / TAU混合物的抗抑郁作用。在行为评估中，CRE / TAU组的运动和蔗糖偏爱增加到与阳性对照组相似的水平。海马儿茶酚胺和血清素水平明显增加。NS组应激相关激素（促肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素释放激素）和炎性因子（IL-1β，IL-6和TNF-α）增加，但在CRE / TAU治疗组中显着降低。在CRE / TAU处理中，磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）/ Akt，磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）/ ERK和脑源性神经营养因子（BDNF）的脑信号蛋白表达比显着增加组。这些结果表明，CRE / TAU诱导的抗抑郁作用与脊椎动物模型中通过Akt和ERK / BDNF途径介导的行为模式增加和应激激素和细胞因子的下调相关。
抑郁症通常被认为会使人的精神状态或体育活动丧失能力，根据世界卫生组织（WHO）的报道，抑郁症被归类为现代社会中最危险的疾病之一，其患病率占世界人口的15％至25％1，2。抑郁症的病因尚不清楚。然而，生物，遗传和社会心理因素被认为的相互影响3，4。
目前，大多数抑郁症患者都使用合成药物治疗，包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI），5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂，三环类抗抑郁药，去甲肾上腺素和多巴胺再摄取阻滞剂以及单胺氧化酶抑制剂5。然而，这些化学合成类抗抑郁药具有低反应性和回收率和具有副作用，例如疲劳，睡眠障碍，认知障碍，和性功能障碍6，7。因此，由于对药用植物和含食品成分的天然抗抑郁药的需求增加，最近进行了一些研究。
在抑郁症肌酸的重要生理作用（CRE）已被证实在一些临床研究中8，9，10。据报道，严重抑郁症患者的大脑中磷酸肌酸减少8。特别是，CRE补充剂可改善患有创伤后应激障碍，抑郁症，纤维肌痛9和抗治疗性抑郁症10的人的情绪。但是，由于担心与CRE补充剂相关的理论副作用，包括肾脏，肌肉和热功能障碍，痉挛和胃肠道不适，11，我们选择了CRE量最低的混合物。此外，牛磺酸（TAU），2-氨基乙烷磺酸（C 2 H 7 NO 3 S）是中枢神经系统中最丰富的游离氨基酸之一，包括下丘脑神经胶质细胞12，并且在小鼠中表现出抗焦虑作用和大鼠通过充当通过γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸受体的抑制性神经递质13，14。在这些抑郁模型中，TAU的增加可能在大脑中发挥有效作用。
在这项研究中，我们调查了具有抗抑郁作用的CRE和TAU的活性，并确认了其作用机理。首先，通过果蝇的果蝇试验，通过振动应力选择了CRE和TAU的最佳组合比，它们比单独使用时更具有协同作用。然后，用CRE，TAU和CRE / TAU混合物处理诱导的慢性轻度应激（CMS）的BALB / c小鼠，并通过行为和生物标记分析评估其抗抑郁作用和机制。这些发现将提供有关CRE / TAU混合物缓解抑郁症有效性的见解。
与对照（CON）组a的两个时区（白天和黑夜）相比，放射线图显示CRE / TAU混合物在压力条件下有效调节果蝇的昼夜节律（图 1 A）。相较于CON组，表现出正应力（NS）组白天活性下降（图 1个 B; F（12637）= 6.237，η 2 p = 0.742），增加夜间活动（图 1 ℃; F（ 12637）= 3.909，η 2 p = 0.643）。与NS组相比，TAU（0.05，0.10％）组的日间活动显着增加（p <0.016和p 分别<0.046）；然而，高浓度的TAU（0.40％）倾向于显着降低 白天活动（vs. CON组，p <0.002）和夜间活动（vs. NS组，p <0.003）。因此，将CRE和TAU的最大浓度设定为0.20％，并且以1∶3、1∶1和3∶1的比例向果蝇提供混合培养基。在接受了CRE和TAU治疗的组中，与压力相结合，白天和夜间的活动恢复到了与CON组相比可比的CRE和TAU组更可比的水平。
肌酸（CRE），牛磺酸（TAU）以及CRE和TAU的混合物对振动应激果蝇的运动能力的影响。（A）无应力果蝇（对照）（n = 50）和暴露于振动应力（正应力）（n = 50）的果蝇以及CRE，TAU或CRE / TAU混合物比例（ n = 50）。以每分钟计数来测量活性，然后将30分钟内的所有活性合并并计算3天。每个动作图上方的条表示白天（白色）和夜晚（黑色）h。（B）白天主观活动和（C）夜间活动。结果表示为每组的平均值±平均值的标准误（SEM）。** p 与对照组相比<0.01； 相对于正常压力组，† p <0.05和†† p <0.01（ANOVA，然后进行事后Tukey检验）。
视频跟踪的分析指标为移动的距离（图 2 A; F（12637）= 28.369，η 2 p = 0.909），速度（图 2 B; F（12637）= 26.261，η 2 p = 0.924） ，移动（图 2 ℃; F（12637）= 41.703，η 2 p = 0.951），不动（图 2 d; F（12637）= 21.890，η 2 p = 0.910），和迁移率（图 2 è; F（12637）= 34.016，η 2 p = 0.940）。与CON组相比，NS组的所有指标均显着下降，但指标没有变化（图 2，p <0.001）。CRE组（0.05％，0.10％和0.15％）显示出移动，速度，移动和移动性随浓度的增加；值得注意的是，与NS组相比，CRE 0.15％和CRE 0.20％组的上述指标显着增加（p <0.05）。TAU组在低浓度（从0.05％到0.20％）时表现出距离移动，速度，移动和迁移率增加，而在高浓度（0.40％）时下降。相比之下，在CRE / TAU混合组（0.05 / 0.15％，0.1 / 0.1％和0.15 / 0.05％）中，与NS组相比，运动距离，速度，运动和迁移率显着增加（p <0.001）。因此，CRE / TAU混合物引起行为改变和果蝇 与单独使用CRE或TAU进行治疗相比，它们的活性更高，表明恢复到与CON组相似的水平。
肌酸（CRE），牛磺酸（TAU）以及CRE和TAU的混合物对振动应激果蝇的行为模式的影响。使用Noldus EthoVision-XT系统在无压力组，压力组，CRE治疗组（0.05、0.10、0.15和0.20％），TAU治疗组（0.05、0.10、0.20和0.40）上对实验蝇进行了分析％）和CRE / TAU混合物处理组（0.05 / 0.15、0.10 / 0.10和0.15 / 0.05％）的振动应力。 与对照组相比 ，* p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001； 相对于正常压力组 ，† p <0.05，†† p <0.01和††† p <0.001（ANOVA，然后进行事后Tukey检验）。
在主观白天，比被显著降低CON组的NS组的爬坡能力（图 3 A; F（12637）= 47.769，η 2 p = 0.880，p <0.001）。此外，CRE组（0.05％，0.1％和0.15％），TAU组（0.05％）和CRE / TAU混合组（0.15 / 0.05％，0.10 / 0.10％，0.05 / 0.15％）的攀爬能力与NS组相比有显着增加（p <0.001）。与此相反，在主观夜间，当与该CON组相比NS组的爬坡能力下降，但没有观察到差异显著（图 3 B; F（12637）= 16.105，η 2 p = 0.680，p = 0.833）。与NS组相比，CRE 0.15％和TAU 0.05％组的主观夜间攀爬能力有所提高，但无显着差异。但是，在CRE / TAU混合物组（0.15 / 0.05％）中观察到了显着增加（p = 0.046）。总之，在应激诱导的果蝇果蝇模型中，与仅使用CRE和TAU相比，使用CRE / TAU混合物可产生更有效的抗抑郁活性。在TAU的情况下，高浓度治疗组的抗抑郁活性较低，特别是在TAU 0.15％组中，治疗6天后存活率降低了39％（补充图 1）。）。因此，我们在CRE / TAU混合物组中选择具有低TAU浓度和高抗抑郁活性的3：1比例（CRE / TAU 0.15 / 0.05％），然后在小鼠模型中确认了抗抑郁作用。
肌酸（CRE），牛磺酸（TAU）以及CRE和TAU的混合物对振动应激果蝇的攀爬活性的影响。实验分析了非压力组，压力组，CRE治疗组（0.05、0.10、0.15和0.20％），TAU治疗组（A）在白天主观白天和B在夜间的攀爬能力。0.05、0.10、0.20和0.40％），以及CRE / TAU混合物处理组（0.05 / 0.15、0.10 / 0.10和0.15 / 0.05％）具有振动应力。结果表示为每组的平均值±平均值的标准误（SEM）。 与对照组相比 ，* p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001；† p <0.05且 相对于正常压力组，††† p <0.001（方差分析，然后进行事后图基检验）。
CON组的体重在整个实验期间都增加了，而NS组在CMS 5周后与CON组相比有显着下降（补充表2； F（5,42）= 8.984，η 2 p = 0.517，p <0.001）。氟西汀（10 mg / kg）给药（FLU）组作为阳性对照，显示出与CON组相似的结果，并且体重在实验期间有所增加。与NS组相比，CRE和TAU组在第5周体重显着增加（p <0.024和p 分别<0.049）。相反，CRE / TAU组的体重增加与FLU组相似，与NS组相比，体重显着增加（p <0.002）。
实验5周后，对动物实施安乐死，并立即测量肾脏，脾脏，肝脏，心脏，总脑和海马的重量（补充表3）。两组之间的肾脏，脾脏，心脏和海马的重量没有显着差异。相反，相比于CON组，NS组中，在肝脏重量显著下降（F（5,42）= 14.459，η 2 p = 0.633，p <0.002），和流感，CRE，TAU，以及CRE / TAU组的体重增加与CON组相似（p <0.001）。
首先在使小鼠经受CMS之后，然后在将样品与CMS一起口服给药之后，进行蔗糖偏爱测试。在第一测试中，所有的蔗糖偏好强调基团，除CON组，倾向于降低（图 4 A; F（5,42）= 5.151，η 2 p = 0.811）。在第二个试验中，NS组的蔗糖偏好显著降低相比于CON组时（F（5,42）= 24.658，η 2 p = 0.954，p <0.001）。相反，与NS组相比，在FLU和CRE / TAU组中，蔗糖偏爱显着增加（分别为p <0.001和p <0.002），与CON组相似。
肌酸，牛磺酸以及肌酸和牛磺酸的混合物对慢性轻度应激小鼠行为的影响。经过五周的慢性轻度应激治疗后，所有小鼠组均进行了行为评估测试，包括（A）蔗糖偏爱测试和（B，C）强迫游泳测试。CON：非应激组（对照组），NS：应激组（正常应激），FLU：氟西汀治疗10 mg / kg（阳性对照组），CRE：7.5 mg / kg肌酸，TAU：2.5 mg / kg牛磺酸，CRE / TAU：7.5 mg / kg的肌酸和2.5 mg / kg的牛磺酸混合物。结果表示为每组的平均值±平均值的标准误（SEM）（n = 8）。 与对照组相比，* p <0.05和** p <0.01。† p 与正常压力组相比 ， <0.05，†† p <0.01和††† p <0.001（ANOVA，然后进行事后Tukey检验）。
FST进行了5分钟，并测量了不动和第一次不动的潜伏期。不动的NS组显著增加（图 4 B; F（5,42）= 5.650，η 2 p = 0.042，p <0.001）与CON组中进行比较。FLU和CRE / TAU组的固定性明显低于NS组（分别为p <0.003和p <0.018）。与NS组相比，CRE和TAU组的固定时间减少了，但无显着差异。此外，NS组中的等待时间减少显著当与CON组（图中进行比较。 4 ℃; F（5,42）= 6.327，η 2 p = 0.043，p <0.001）。相反，与NS组相比，所有组的潜伏期均增加。值得注意的是，与NS组相比，FLU和CRE / TAU组的潜伏期显着增加（分别为p <0.007和p <0.016）。
OFT中确定的指标包括移动时间，移动距离，中心区域的频率，中心区域的累积持续时间和总穿越。在移动时间的情况下（图 5 A; F（5,42）= 3.612，η 2 p = 0.301）和移动的距离（图 5 B; F（5,42）= 2.797，η 2 p = 0.250 ），与CON组相比，NS组表现出显着下降（分别为p <0.016和p <0.018）。但是，与NS组相比，在FLU和CRE / TAU组中，运动时间显着增加（p <0.016和p 分别<0.020），并且移动的距离增加了，但没有显着差异。此外，对于频率（图 5 ℃; F（5,42）= 7.460，η 2 p = 0.470）和累积持续时间（图 5 d; F（5,42）= 3.721，η 2 p = 0.312）在中心区，NS组与CON组相比有显着下降（p <0.001和p 分别<0.030）。与NS组相比，FLU，CRE和TAU组在中心区域的频率和累积持续时间增加，但差异不显着。此外，与NS组相比，CRE / TAU组在中心区域的频率和累积持续时间显着增加（分别为p <0.001和p <0.035）。相反地，图 5个 E显示CMS，CRE以及TAU不诱导任何显著变化与在旷场中的水平行走CON组相比（F（5,42）= 1.283，η 2 p = 0.133）。
肌酸，牛磺酸以及肌酸和牛磺酸的混合物对慢性轻度应激小鼠运动能力的影响。经过五周的慢性轻度慢性应激治疗后，所有小鼠组均进行了行为评估测试，包括（A – E）野外测试和（F – H）尾部悬吊测试。CON：非应激组（对照组），NS：应激组（正常应激），FLU：氟西汀治疗10 mg / kg（阳性对照组），CRE：7.5 mg / kg肌酸，TAU：2.5 mg / kg牛磺酸，CRE / TAU：7.5 mg / kg的肌酸和2.5 mg / kg的牛磺酸混合物。结果表示为每组的平均值±平均值的标准误（SEM）（n = 8）。* p <0.05，** p <0.01和*** p 与对照组相比<0.001； 相对于正常压力组 ，† p <0.05，†† p <0.01和††† p <0.001（ANOVA，然后进行事后Tukey检验）。
在TST，移动时间（图 5 F; F（5,42）= 4.365，η 2 p = 0.342）和迁移率（图 5 G; F（5,42）= 5.142，η 2 p = 0.380与CON组相比，NS组的）显着降低（分别为p <0.002和p <0.003）。与NS组相比，FLU组的迁移率显着提高（p <0.019）。与NS组相比，单独使用CRE或TAU治疗的组的移动时间和活动性增加，但无显着差异。相比之下，与NS组相比，CRE / TAU组报告其活动性显着增加（p <0.006）。相比于CON组中的NS组动时间显著增加（图 5 H; F（5,42）= 2.730，η 2 p = 0.245，p <0.026）。此外，与NS组相比，只有FLU组的不动时间显着减少（p <0.044）。
高效液相色谱法（HPLC）用于分析实验动物大脑中的儿茶酚胺（L-DOPA，多巴胺和肾上腺素）和5-羟色胺（5-HT）水平（表1）。肾上腺素水平低于所有组的定量限，无法测量。因此，L-DOPA的总和（F（5,42）= 16.806，η 2 p = 0.667）和5-HT（F（5,42）= 10.875，η 2 p = 0.565）的NS被显著降低与CON组相比（p <0.001）。与NS组相比，在所有样品处理组中，其含量均增加，但在CRE / TAU组中，其含量显着提高了约1.26倍（p <0.001）。特别是，多巴胺和5-HT水平分别为2.47±0.07和2.20±0.05 ng / mg组织，与NS组相比，CRE / TAU组显着增加（p <0.001）。
通过血清分析测量应激激素的水平，包括促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮。的NS组，相比于CON组中时ACTH水平显著增加（图 6 A; F（5,42）= 5.909，η 2 p = 0.552，p <0.005）。相比NS组，ACTH和皮质类固醇水平（图 6 B; F（5,42）= 3.501，η 2 p = 0.294）在所有组中下降; 尤其是，FLU和CRE / TAU组的ACTH水平显着降低（p <0.003），与CON水平相似。
肌酸，牛磺酸以及肌酸和牛磺酸的混合物对应激激素的影响，例如（A）促肾上腺皮质激素（ACTH）和（B）皮质酮，（C）促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）和细胞因子的mRNA表达（D）IL-1β，（E）IL-6和（F）TNF-α在慢性轻度应激小鼠中的分布 CON：非应激组（对照组），NS：应激组（正常应激），FLU：氟西汀治疗10 mg / kg（阳性对照组），CRE：7.5 mg / kg肌酸，TAU：2.5 mg / kg牛磺酸，CRE / TAU：7.5 mg / kg的肌酸和2.5 mg / kg的牛磺酸混合物。结果表示为每组的平均值±平均值的标准误（SEM）（n = 8）。* p 与对照组相比 ， <0.05，** p <0.01和*** p <0.001； 相对于正常压力组 ，† p <0.05，†† p <0.01和††† p <0.001（ANOVA，然后进行事后Tukey检验）。
因此，我们分析了CRH的基因表达，它刺激了垂体ACTH的分泌。与在ACTH水平的趋势观察到的，NS组中的CRH mRNA的表达水平显著当与那些CON组相比增加（图 6 ℃; F（5,42）= 6.793，η 2 p = 0.274，p <0.002）。FLU（p <0.003），CRE（p <0.001），TAU（p <0.005）和CRE / TAU组（p <0.001）与NS组相比显着降低，与CON组相似。特别是，与NS组相比，CRE / TAU组的CRH mRNA表达水平降低了2.75倍（p <0.001）。
血清中的炎性因子，IL-1β（图 6 d; F（5,42）= 5.821，η 2 p = 0.548），IL-6（图 6 Ë; F（5,42）= 8.321， η 2 p = 0.498），和TNF-α（图 6 F; F（5,42）= 8.045，η 2 p = 0.489）的NS组时与那些CON组（比较显著增加在水平p <分别为0.004，p <0.001和p <0.001）。在所有样品给药组中，细胞因子水平均相对于NS组降低。值得注意的是，FLU组（p <0.002和p <0.001）和CRE / TAU组的IL-1β和IL-6水平显着降低（ 与NS组相比，分别为p <0.007和p <0.002）。相反， 与NS组相比 ，除CRE组外（p <0.002），所有样品组的TNF-α水平均显着降低（p <0.001）。
2.10 CRE和TAU对CMS诱导的抑郁症小鼠的蛋白激酶B（Akt）和细胞外信号调节激酶（ERK）/环AMP响应元件结合蛋白（CREB）/脑源性神经营养因子（BDNF）途径的影响。
在小鼠海马组织上进行了蛋白质印迹，以证实Akt和ERK / CREB / BDNF通路参与CRE和TAU的作用机制。（图 7A）。相较于CON组，NS组中，磷酸化的AKT（P-AKT）的对完整总Akt的比率的表达水平降低显著（图 7 B; F（5,42）= 4.186，η 2 p = 0.777，p <0.04）。NS组的p-Akt / Akt表达率高于所有样品处理组，但无显着差异。类似地，磷酸化ERK（P-ERK）的比例/ ERK表达显著的NS组相比，CON组时降低（图 7 ℃; F（5,42）= 10.293，η 2 p = 0.896，p <0.005），与NS组相比，CRE / TAU组显着增加（p <0.026），达到与FLU组相似的水平。然而，有磷酸化CREB（P-CREB）之间没有差异显著/实验组CREB蛋白的表达水平（图 7 d; F（5,42）= 1.075，η 2 p = 0.473）。与CON组相比，NS组中，BDNF的蛋白表达水平下降显著（图 7 E，F（5,42）= 13.421，η 2 p = 0.918，p <0.018）。与NS组相比，FLU组BDNF蛋白表达水平显着增加（p <0.019）。另外，与NS组相比，CRE和CRE / TAU组显示BDNF蛋白表达水平增加，但没有显着差异。
肌酸，牛磺酸以及肌酸和牛磺酸的混合物对慢性轻度应激小鼠海马信号蛋白表达的影响。（A）蛋白质印迹分析显示了Akt，ERK，CREB和BDNF的蛋白质水平。表示（B）p-Akt / Akt，（C）p-ERK / ERK，（D）p-CREB / CREB和（E的表达水平）BDNF / GAPDH信号蛋白在慢性轻度应激小鼠中的表达。CON：非应激组（对照组），NS：应激组（正常应激），FLU：氟西汀治疗10 mg / kg（阳性对照组），CRE：7.5 mg / kg肌酸，TAU：2.5 mg / kg牛磺酸，CRE / TAU：7.5 mg / kg的肌酸和2.5 mg / kg的牛磺酸混合物。结果表示为每组的平均值±平均值的标准误（SEM）（n = 8）。 与对照组相比，* p <0.05和** p <0.01； 相对于正常压力组，† p <0.05和†† p <0.01（ANOVA，然后进行事后Tukey检验）。
胍化合物CRE（N-氨基亚氨基甲基-N-甲基甘氨酸）是由甘氨酸，精氨酸和S-腺苷甲硫氨酸在肾脏，肝脏，胰腺和脑中合成的。但是，体内50％以上的CRE依赖于饮食摄入。CRE的肌肉系统中的作用是众所周知的，但越来越多的证据，它也有潜力用于治疗神经保护作用或减轻中枢神经系统疾病，包括抑郁症15，16。CRE是细胞质和线粒体CRE激酶的底物，在脑能量稳态中起关键作用17。此外，抑郁症和双相情感障碍患者的抑郁症严重程度与白质CRE浓度之间呈负相关18。根据一项研究表明在发生抑郁症患者脑线粒体异常，CRE可能特别适合于精神疾病19，20。此外，华润创业的口服摄入穿过血脑屏障增加脑CRE水平21，22，这可能有助于预测CRE补充的人类患者的神经系统疾病的潜在益处。
同时，TAU不是哺乳动物蛋白质的结构成分，而是发挥各种生理作用，包括作为抗氧化剂，渗透调节剂，膜稳定剂和神经递质。此外，在抑郁症的动物模型中，TAU表现出对由兴奋性氨基酸23诱导的毒性的神经保护作用，并且经常通过强迫游泳提高大脑皮层中TAU的水平24。在这些抑郁症模型中观察到的TAU水平升高可以在大脑中发挥有效作用。相反，研究表明，高水平的TAU会降低行为25。此外，OFTs证实接受急性注射或长期补充TAU的小鼠的运动能力。TAU的急性注射抑制了小鼠的运动活动，而长期补充则增加了运动能力26，这是由于抑制性GABA能系统的变化引起的大脑兴奋性增加27引起的。因此，我们旨在确定TAU与CRE协同作用的适当比例，以证明其具有抗抑郁作用。
在这项研究中，我们使用了果蝇模型，该模型因振动应力而具有抑郁症，并选择了CRE和TAU的最佳抗抑郁活性比。先前的研究表明，果蝇中的3 d振动应力降低了自发的行为活动并诱发了抑郁症样的模型28。因此，在振动诱发的果蝇模型的抑郁状态下，在CRE，TAU和CRE / TAU混合组中测量了行为变化，运动活动，攀登活动和生存率。结果，在CRE和TAU组中，由于振动应力而降低的果蝇的性能增强了，特别是在CRE / TAU组为3：1的情况下（图2和图3）。 1，2，和3）。
此外，根据以往的研究，在小鼠中导致的抑郁从CMS 29，30，31，我们证实了抑郁症效果和CRE和TAU混合物的作用机制。根据补充表2和3，患有CMS的小鼠表现出体重减轻，而在施用CRE / TAU后肝脏和海马体重恢复到显着水平。同样，一项研究表明，在进行CMS后，应激组小鼠体重减轻，氟西汀治疗组（阳性对照组）的体重恢复到正常水平29。
在凹陷的动物模型，所述蔗糖偏爱测试中，FST，OFT，和TST分别代表用于评估抗抑郁活性的行为分析索引32，33。蔗糖偏爱测试是对快感缺乏症的量度。正常小鼠通常比水更喜欢蔗糖水溶液。然而，此偏好在暴露于长期应激大鼠降低34，35，36。此外，与对照组相比，暴露于压力下FST的固定性显着增加29，并且压力组在OFT 30中心区域的时间缩短。类似地，在TST中，慢性压力会导致数量和不活动时间增加37。与先前的研究结果一致，我们确定降低的行为在CMS诱导的抑郁小鼠（图 4，5），并确认由于CRE或TAU摄取行为变化30，37，38。此外，CRE和TAU的组合可显着缓解抑郁症引起的行为改变。
此外，压力和抑郁指标包括单胺的水平，应激激素，炎症因子和神经生长因子39，40。单胺假说始于发现1950年代约有15％处方利血平的高血压患者表现出严重的抑郁症。在后来的研究中，利血平已被证明可以减少大脑突触中的单胺含量，从而导致抑郁41。尤其是由于突触中5-羟色胺和去甲肾上腺素的消耗而出现症状42。在先前的研究中，在急性应激和CMS后使用HPLC电化学检测法测量皮质和海马中的单胺水平。在这里，不可预测的慢性应激组的去甲肾上腺素，多巴胺和5-HT水平明显低于对照组[ 43]。同时，补充了TAU的组证明单胺含量增加至控制水平30。此外，这项研究的结果证实，在CRE / TAU混合液治疗组中，由于CMS而降低的单胺水平已恢复到与CON组相似的水平。仅使用CRE或TAU未观察到这种作用（表1）。
先前的研究表明，应力范式与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的激活之间存在关系。当人处于压力状态时，下丘脑将促肾上腺皮质激素释放因子分泌到垂体中，这导致垂体分泌ACTH，而ACTH继而又分泌皮质醇，糖皮质激素44。几项临床前研究表明，免疫系统的激活和抑郁可能是双向的。某些细胞因子诱导抑郁样在啮齿动物的症状和灵长类动物45，46，和长期应力改变了免疫系统的功能47在这项研究中，我们观察到在CMS诱导的抑郁症小鼠中血清ACTH，皮质酮，CRH和细胞因子的表达增加（图 6）。相反，CRE / TAU混合物可有效抑制抑郁症引起的压力和免疫反应。
使用海马动物组织进行的蛋白质印迹证实了测试混合物抗抑郁活性的机制。确认了BDNF，Akt，p-Akt，ERK，p-ERK，CREB和p-CREB的蛋白表达水平。最近，一些研究已经显示以下长期抗抑郁治疗在细胞内信号通路的变化48，49，50。大多数抗抑郁药通过激活Akt和ERK激活CREB，并最终增加BDNF的表达并缓解抑郁症51。BDNF属于神经生长因子家族，参与神经系统的发育。BDNF在神经细胞存活和分化，突触形成和细胞功能中起重要作用。据报道，脑中BDNF浓度与抗抑郁作用之间的关系已有报道48。Akt与神经元分化密切相关，激活的Akt保护细胞免受坏死并激活CREB 52。研究表明，抑郁症患者的大脑中ERK的表达和活性下降，氟西汀治疗可重新激活ERK 53。在这项研究中，我们观察到CRE / TAU治疗组中活化的Akt，ERK和BDNF的表达水平高于CRE或TAU组（图 7）。这项研究的结果显示出与先前有关TAU对海马中多个信号级联反应的影响类似的趋势。与正常大鼠相比，在经TAU处理的大鼠中，海马中p-ERK1 / ERK1，p-ERK2 / ERK2，p-Akt / Akt和p-CREB / CREB的蛋白质表达比例增加38。据报道，慢性肾上腺皮质激素给药引起的BDNF水平降低在CRE 54给药后增加。
这项研究证明了CRE / TAU在果蝇和啮齿动物模型中的抗抑郁作用。CRE / TAU通过增加单胺含量和下调应激激素和炎性细胞因子，有效地增强了应激诱发的抑郁模型中的行为，尤其是在动物模型中。CRE / TAU的这种抗抑郁作用可以通过Akt和ERK / BDNF途径介导信号蛋白的调节。单独使用CRE或TAU进行治疗显示出与使用CRE / TAU混合物相似的治疗效果。然而，CRE / TAU 3：1治疗组在低剂量时表现出最佳的抗抑郁作用。据我们所知，这是首次证明最佳比例的CRE / TAU具有抗抑郁作用的研究。
CRE和TAU购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）；盐酸氟西汀购自Fluka（密苏里州圣路易斯）。所有其他化学药品和仪器均购自Sigma-Aldrich。
D. melanogaster Canton-S菌株蝇是从布卢明顿畜牧中心（印第安纳大学，布卢明顿，美国，美国）获得的，并在标准培养基（水，玉米面，蔗糖，干酵母）上维持12/12小时的明暗循环，琼脂，对羟基苯甲酸甲酯和丙酸）放在恒温箱中（25°C，相对湿度60％）。在CO 2麻醉下收集雄蝇（2-5天大）以进行适当分析。评估每种浓度的CRE（范围为0.05–0.20％），TAU（范围为0.05–0.40％）和CRE / TAU混合物（0.05 / 0.20％，0.10 / 0.10％和0.15 / 0.05％）的运动活性和寿命将其加入蔗糖-琼脂培养基（5％蔗糖和2％琼脂）中，并暴露3–6 d。
振动应力处理在先前的实验模型22的基础上进行了部分修改。将蝇保持在单个玻璃管中（长60 mm；宽3 mm），并置于振动装置（Brὓel＆Kjoer，4810型）或培养箱（对照组）中。施加振动（300 Hz）20秒钟，然后暂停10秒钟，然后重复15分钟，然后恢复30分钟。整个周期每天进行12次，持续9 h，并且在一周中通过振动诱导应力，共持续3 d。
为了评估CRE，TAU和混合物对果蝇活性监测（DAM）系统（TriKinetics，Waltham，MA，USA）的总活性的抗抑郁作用。DAM系统分析了个别果蝇几天内的行为模式。果蝇在持续黑暗中在试管中适应3 d。适应后，诱发振动应力持续1 d，并记录接下来1 d的行为模式。使用Actogram J软件分析数据，并通过添加每天记录的总活动数55来计算睡眠参数。
为了进行视频跟踪和爬坡活动分析，成年雄蝇在连续3天的饮食中受到了振动应激。视频跟踪前两个小时，将果蝇分别放置在圆形舞台上（直径8毫米；高度0.1毫米），并稳定在黑暗阶段。适应后，将舞台上的苍蝇直接放在装有灯板的已安装数字摄像机的下面，然后进行5分钟的视频录制。使用Noldus EthoVision-XT系统（荷兰Noldus信息技术）对经过处理的果蝇进行运动分析。
为了测量爬升活动，将苍蝇在受到振动应力后转移到一个空的蝇瓶（25×100 mm）中。将蝇瓶划分为8个距离区域（从底部到顶部1-8厘米），并在底部轻拍，以刺激果蝇从底部迁移到瓶的每个区域。敲击1分钟后，计算了从底部爬升的苍蝇数量。在主观夜间和白天进行攀爬能力测定。每个测试重复10次，并在10分钟间隔后继续56。
为了评估存活率，将收集的成年雄蝇转移到装有样品培养基的小瓶中。每2天记录一次蝇的存活情况，持续6天；对记录的数据进行进一步分析，并作为存活率。
雄性BALB / c小鼠（4周龄，18-22 g）购自Orient Bio Inc.（韩国城南市）。将动物圈养在24±2°C和相对湿度为55％的笼子中，光照/黑暗周期为12 h，并随意提供标准饮食和水。动物的使用按照美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行，并得到高丽大学动物护理委员会的批准（KUIACUC-2018-20，韩国首尔）。将小鼠分为六个实验组（CON，NS，氟西汀，CRE，TAU和CRE / TAU组）。
基于先前所述的实验模型中的CMS方法部分修饰57，58。实验动物的压力源包括水和食物的缺乏，空瓶子的出现，白天和晚上周期的逆转，拥挤的住房，倾斜的盒子（45°），被褥清除和湿被褥。实验动物无法预测何时以及什么样的压力（补充表1））。在5周的实验中随机安排了压力源。在最初的2周中，仅将CMS应用于实验动物。然后，在接下来的3周内，对小鼠口服氟西汀（10 mg / kg），CRE（7.5 mg / kg），TAU（2.5 mg / kg）或CRE / TAU [7.5 / 2.5 mg / kg（3： 1比率）]和CMS应用程序。对照组在其他家笼中饲养，并自由供应水和食物，避免与压力较大的组接触。
使用蔗糖偏爱，强迫游泳，旷野和尾部悬挂测试进行行为分析。除蔗糖偏爱试验外，在CMS暴露和样品处理5周后进行分析。在两个时间点进行蔗糖偏爱测试：CMS暴露2周和CMS暴露5周以及样品处理后。
如Zhu等所述，进行蔗糖偏爱测试。58经过修改。测试前三天，通过提供1％蔗糖溶液（w / v）训练小鼠24小时以适应。在提供自来水24小时后，在测试前将水和食物禁食24小时。在试验当天，将单独笼子中的小鼠自由进入两个装有1％蔗糖溶液或水的瓶子。24小时后，记录蔗糖溶液的重量和消耗的自来水，并使用以下公式计算蔗糖的偏爱性：
强制游泳测试（FST）方法已基于先前的实验模型53进行了部分修改。迫使小鼠在透明的丙烯酸圆筒中游泳（高25cm，直径10cm，并在23±2℃下充满20cm水）。在最初的2分钟内使动物适应水中，并使用摄像机记录动物的行为5分钟。使用Noldus EthoVision-XT系统测量小鼠的固定时间。固定状态由最小的头部移动或不移动而浮动决定。
运动能力的评估采用开放式试验（OFT）；适应黑色丙烯酸笼（25×25×30 cm）3分钟后，记录小鼠的活动10分钟。使用Noldus EthoVision-XT系统测量中央隔室的频率和累积持续时间（15×15 cm），活动性和水平移动。
尾部悬挂测试（TST）在先前的实验模型59的基础上进行了部分修改。将实验小鼠的尾巴用胶带单独悬吊在水平上方桌面50 cm的黑匣子顶部（30×30×50 cm）。使小鼠适应颠倒姿势2分钟。适应后，使用Noldus EthoVision-XT系统测量固定时间5分钟。固定状态表示动物在颠倒的悬挂状态下已完全停止运动。
在TST之后，对小鼠进行快速安乐死，并收集了1 mL血液。将收集的血液在4°C下以15,000 rpm离心15分钟，然后分离上清液并保存在-80°C下直至分析。皮质酮水平是根据制造商的说明使用皮质酮ELISA试剂盒（LDN，美国）进行测量的。ACTH水平通过POMC ELISA试剂盒（Aviva Systems Biology，美国）测量，IL-1β水平通过IL-1β/ IL-1F2 ELISA试剂盒（R＆D SYSTEMS，美国）测量，IL-6水平通过IL-6 ELISA试剂盒（美国）测量。 BD Biosciences，美国）和TNF ELISA试剂盒（BD biosciences）获得的TNF-α水平。
为了进行儿茶酚胺和5-羟色胺的分析，对小鼠实施安乐死，并迅速移出大脑，将其冷冻在液氮中，并保持在-80°C直至测定。将大脑在200μL的含3 mM半胱氨酸的0.2 M高氯酸中匀浆。离心匀浆（12,000× g，10分钟，4°C），将所得上清液在冰上放置5分钟，并通过HPLC荧光检测（Waters Alliance 2,695分离模块，美国马萨诸塞州米尔福德）进行分析描述60。使用YMC-Pack Pro C18色谱柱（250×4.6 mm，5μm）和乙酸盐缓冲液（pH 3.5，12 mM乙酸，0.26 mM Na 2）测量儿茶酚胺和血清素水平EDTA）–甲醇（86:14，v / v）作为流动相。流速为1.0mL / min。儿茶酚胺和5-羟色胺的检测使用天然荧光在279 nm激发和320 nm发射下实现。
对于CRH mRNA表达测定，在对实验动物实施安乐死后获得了大脑。根据制造商的规程，使用TRIzol（美国加利福尼亚州Invitrogen）从小鼠大脑中提取总RNA，而使用Direct-zol RNA Miniprep（美国加利福尼亚州ZYMO Research）提取基因组DNA。使用Super-Script III反转录酶（Invitrogen），以oligo d（T）为引物，对质量控制的RNA（1μg）进行反转录。使用Power TaqMan PCR Master Mix试剂盒（美国加利福尼亚州Applied Biosystems）对生成的cDNA进行qRT-PCR。循环条件为50°C 2分钟，95°C 10分钟，然后是95°C 15 s和60°C 1分钟的40个循环。使用Step-One-Plus软件2.0版（Applied Biosystems）进行定量分析61。内源管家基因GAPDH用于结果标准化。以下引物序列用于qRT-PCR：小鼠GAPDH（NM_008084.2），5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'（正向）和5'-GCGGCACGTCAGAT CCA-3'（反向）；小鼠CRH（NM_205769.2），5'-ACCAAGGGAGGAGAAGAGAGAGCG-3'（正向）和5'-GCTGCTCCGGCTGCAAGAAA-3'（反向）。
为了进行蛋白质印迹，将所有实验动物安乐死，并分离海马以分离蛋白质。使用BCA分析确定分离的蛋白质浓度。然后，将50μg蛋白质在4-15％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶（Bio-rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，美国）上电泳，转移至Immobilon-P（Millipore Corporation，Bedfrom，MA）聚偏二氟乙烯膜上，在5％牛血清白蛋白中封闭1小时，并在4°C下与抗Akt（Cell Signaling，＃9272，1：1000），抗p-Akt（Cell Signaling，＃9271，1： 1000），抗ERK1 / 2（Invitrogen，13-6200、1：1000），抗pERK1 / 2（细胞信号，＃9101、1：1000），抗CREB（细胞信号，＃9197、1：1000 ），抗pCREB（细胞信号，＃9,191，1：1,000），抗BDNF（细胞因子，710,306，1：1,000）或GAPDH（细胞信号，＃5174，1：1000）。膜用含0.1％Tween 20（TBST）的Tris缓冲盐水洗涤3次，并在25°C下与辣根过氧化物缀合的IgG二抗（Cell Signaling，＃5157，1：2000）孵育1小时。信号是在FluorChem E成像系统（Protein Simple，美国加利福尼亚）上使用ECL Prime（GE Healthcare Life Sciences，美国康涅狄格）开发的。凝胶记录和相对定量使用Image J软件进行。使用管家蛋白GAPDH控制凝胶上蛋白质的负载量 美国）在FluorChem E成像系统上（美国加利福尼亚的Protein Simple）。凝胶记录和相对定量使用Image J软件进行。使用管家蛋白GAPDH控制凝胶上蛋白质的负载量 美国）在FluorChem E成像系统上（美国加利福尼亚的Protein Simple）。凝胶记录和相对定量使用Image J软件进行。使用管家蛋白GAPDH控制凝胶上蛋白质的负载量62，63，64。
实验结果表示为平均值±平均值的标准误。组间的统计显着性差异是通过单因素方差分析确定的，然后使用社会科学统计软件包12.0版（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）。结果部分提供了每个带有效应值的部分平方平方估计的p值。
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