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优化的离体刺激可在大多数慢性乙型肝炎患者中鉴定多功能HBV特异性T细胞

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发表时间:2020-07-10 10:08作者:武汉新启迪生物Xinqidibio来源:www.qidibio.com

摘要

慢性乙型肝炎(CHB)期间的高抗原负担会导致功能受限的低频HBV特异性T细胞反应。但是,该观察基于有限的数据,因为低T细胞频率阻碍了有效的离体分析。我们采用了ELISpot分析法来克服这一障碍,以测量CHB患者的离体T细胞反应。我们修改了细胞数量和肽脉冲方法的关键变量,以改善离体检测HBV特异性T细胞的能力。我们在10/15疫苗接种对照和20/30 CHB患者中检测到IFN-γ反应,平均195和84 SFUs / 2×10 6PBMC。多分析物FluoroSpots改善了T细胞的功能特性。我们在所有测试的疫苗接种对照(n = 10)和CHB患者(n = 13)中检测到IFN-γ反应。在9/10的对照组和10/13的患者中可检测到IL-2反应。TNF-α的敏感性较低,仅在7/10个对照和7/13个患者中可检测到。抗原特异性分析表明,IFN-γ反应以聚合酶和核心为主,对包膜和X的反应较弱。在3/5的患者中发现了IL-2反应,并且同样指向聚合酶和核心。尽管它们的离体频率极低,但一部分HBV特异性T细胞是可检测到的,并且离体显示出多功能。

介绍

全球有超过2.5亿人患有慢性感染乙型肝炎病毒(HBV)1,这将导致超过70万名,每年死亡人数,是肝癌的主要危险因素23人们越来越认识到这个公共卫生问题,从而加快了对治疗慢性乙型肝炎(CHB)的新疗法的研究,其中许多疗法旨在恢复抗病毒免疫力以控制HBV感染。

由于T细胞在解决HBV感染中的关键作用,新的免疫治疗策略以T细胞为目标4经过长期抗病毒治疗后清除了慢性HBV感染的患者,其T细胞库具有与已解决个体相似的扩展能力5然而,在慢性乙型肝炎患者的病毒特异性T细胞应答在数量上是薄弱67低频一直是准确定义HBV特异性T细胞的体外表型和功能的主要障碍。为了克服低频,需要对常规免疫学测定法进行改造。四聚体富集将HBV特异性T细胞从数以千万计的细胞中抽出,这些细胞必须进行分析才能获得大量事件进行稳健的分析。这种适应于四聚体染色提高T细胞靶向不同HBV的离体的表型的认识抗原89

类似的障碍阻碍了我们对离体的HBV特异性T细胞功能的了解。无法始终如一地测量离体HBV特异性T细胞的功能已阻止了在抗病毒事件(如HBeAg丢失,HBsAg丢失和肝耀斑)中进行有意义的分析10缺乏功能性检测,也阻碍了我们的两个新的免疫效果的理解和现有疗法10111213认识到这一点,国际消除HBV联盟(ICE-HBV)呼吁开发更敏感的检测方法以体外测量HBV免疫力14

与四聚体富集策略相似,我们采用了常规的基于ELISpot的检测方法,以准确地离体测量病毒特异性T细胞功能。我们确定了已建立方法的两个主要弱点:(1)HBV特异性T细胞的低频频率低于常规ELISpots的检测下限以下;(2)对每种HBV蛋白使用单独的库将排除抗原特异性反应-即HBV核心抗原(HBcAg)特异性T细胞在HBV表面抗原(HBsAg)刺激的孔中不会被激活。我们的适应性检测在67%的CHB患者中检测了离体HBV特异性T细胞应答,使我们能够将功能性T细胞频率与不同的临床和病毒生物标志物相关联。89通过适应传统的ELISpot,我们为CHB患者提供了第一个可靠的直接离体的HBV特异性T细胞功能测定方法。该测定法将有助于确定病毒特异性T细胞功能作为HBV控制的免疫生物标志物的潜力。

结果

体外IFN-y ELISpot参数的优化

为了确定标准IFN-γELISpot方法在检测HBV特异性T细胞反应中的局限性,我们直接在健康接种的供体中离体测量了HBV特异性T细胞。商业HBV疫苗由明矾中的HBV表面抗原(HBsAg)组成。因此,接种疫苗的供体中应存在包膜(HBsAg)特异的CD4 T细胞。所有接种疫苗的供体均具有确定的抗HBs滴度(未显示)。解冻接种的供者PBMC(n = 10),并休息过夜。将PBMC一式三份以2×10 5个细胞/孔接种在不含血清的Aim-V中,并用覆盖每个HBV蛋白的单个合成重叠肽(OLP)池刺激:1个核心(C),1个X,2个包膜(Env ),4种聚合酶(Pol),并在5%CO 2中于37°C孵育持续24小时。如果一式三份孔的平均值超过10个SFU,则响应为阳性,并且是DMSO对照孔的平均值的两倍。(图检测到HBV特异性T细胞应答使用标准的方法来IFN-γ酶联免疫斑点法分析中仅接种供体的4/10看到   1名 ;补充图阿S1A)。此外,积极回应的程度很低,在三个回应者中不到60个斑点。如预期的那样,应答是针对HBV包膜蛋白的。因此,即使使用预期具有HBV抗原特异性应答的接种疫苗的供体,我们也很难在离体检测高于阳性临界值的HBV特异性T细胞。

图1
图1

优化和改进离体ELISpot分析。A用各自的OLP池以5μg/ mL /肽刺激2×10 5疫苗接种的供体PBMC(n = 10)一式三份B)将1-5×10 6接种的供体PBMC(n = 13)铺板,并同时以10 µg / mL /肽与所有OLP库一起脉冲。计算信噪比。C)用10、5和1 µg / mL / OLP刺激2×10 6接种的供体PBMC(n = 7)。D对每种HBV抗原,以OLP池(8)以5 µg / mL /肽脉冲接种2×10 6接种的供体PBMC(n = 10)。虚线表示各自的正阈值。

我们假设大多数接种疫苗的供体应具有HBV包膜特异性T细胞应答。但是,在2×10 5中有 10个SFUPBMC相当于0.005%(1:20,000)的外围频率。我们认为,这种低频率会阻止与IFN-γELISpot的当前迭代进行一致的检测。因此,我们将此问题作为T细胞频率的数学限制。此外,疫苗(信封)特异性T细胞可在八个肽库中的任何一个之间分裂,这意味着一部分将不会受到刺激,因此不会被检测到。这个实际问题进一步阻碍了HBV特异性应答的检测。因此,我们预测,同时接种更多的PBMC和使用所有HBV OLP池进行搏动将显着改善总HBV特异性T细胞反应的检测,并克服低T细胞频率的数学局限性。

为了测试增加PBMC的数量是否能克服抗原特异性细胞的数学局限性,以及改变肽脉冲策略是否会增加可量化的SFU,我们用全部8种肽刺激了来自接种疫苗的供体(n = 10)的5×10 6 PBMC池。为了最大程度地减少PBMC在DMSO中的暴露,我们采用了一种肽刺激策略,以成功地从CHB患者体外扩增HBV特异性T细胞15使用这种策略,只有20%的PBMC暴露于肽和DMSO载体,而其余80%留在培养基中,直到在ELISpot板中合并(图   2 A)。然后将刺激的PBMC以2×10 5或4×10 5个细胞/孔接种。有效数10将6个单元格,两个4×10 5 单元格的孔和一个2×10 5个单元格的孔相加(5×10 6个单元格= 10个4×10 5 单元格的孔和5个2×10 5个单元格的孔)。将相等数量的DMSO处理的细胞铺板作为阴性对照。通过将HBV特异性斑点的数目除以仅用DMSO处理的阴性对照孔中的斑点数目,可以计算出信噪比(S:N)。我们观察到,当镀层≥2×10 6 PBMC 时,S:N比变得一致(图   1)。B)。然后,我们优化了用于脉动的HBV肽的浓度,以使响应最大化并使DMSO暴露最小化。用1、5和10 µg / mL / OLP或DMSO浓度分别为0.62%,3.10%和6.20%的PBMC(n = 7)脉冲,当以5 µg / mL / OLP脉冲时,S:N比达到峰值(图   1 C)。然后,我们使用优化的条件,通过接种供体中每个HBV OLP池的2×10 6 PBMC,重新评估抗原特异性应答我们在6/10个供体中观察到HBV特异性T细胞反应(图   1 D;补充图S1)B)。除了提高对6个捐献者的检出率外,某些捐献者中实际计数斑点的总数几乎增加了十倍。计数更多的细胞就无需像标准ELISpot分析中那样进行点计数外推,并减少了分析变异性。在两个对Env2库反应强烈的捐赠者(HD19和HD21)中,我们观察到对Pol3的反应较弱。为了确定这是否是交叉反应的结果,我们使用Env2肽将PBMC扩展了10天,并测试了对Env2和Pol3的反应。扩增的培养物对Env2肽反应强烈,对Pol3反应弱但阳性,表明交叉反应性(补充图S2一个)。最后,为了确认我们的刺激策略没有非特异性反应,我们测试了从未感染母亲那里收集的幼稚脐血样本(n = 5),没有发现特异性反应(补充图S2 B)。因此,通过优化ELISpot分析的变量,我们改善了HBV特异性T细胞的检测。

图2
图2

67%的慢性患者离体可检测到HBV特异性T细胞。A)优化的肽脉冲和ELIspot铺板策略的示意图。将相同的肽脉冲和铺板策略用于Fluorospot分析和单个OLP池刺激,以确定抗原特异性(即,图   1 D,6 B)。B用离体IFN-γELISpot测试的15个接种供体的绝对SFU和(C)S:N比。D30位CHB患者的绝对SFU和(E)S:N比。垂直虚线的左侧是无响应程序。右边是ELISpot阳性反应者。水平虚线表示正信噪比阈值为2。

接种疫苗的供体和CHB患者的离体IFN-γELISpot反应

用于肽脉冲,细胞浓度和抗原特异性的建立的关键参数后,我们应用了优化的体外酶联免疫斑点法(图   2 A)来测量在接种供体HBV特异性T细胞频率(N = 15)和CHB患者(n = 30 )。我们的队列包括慢性HBV的所有临床阶段(补充表S3)。图   2 B,d表明接种供体和患者CHB点形成每个条件单位(的SFU)的绝对数量。在所有受试者中,DMSO对照与未处理的细胞无显着差异(HD:p  = 0.7755,CHB:p  = 0.4966)。使用> 25 SFU的截止值和DMSO控制的两倍,总计2×10 6在PBMC中,我们在10/15接种疫苗的供体和20/30 CHB患者中检测到阳性反应(图   2 C,E)。在接种疫苗的供体(67%)和CHB患者(67%)中观察到应答者的比例相等后,我们假设我们达到了IFN-γELISpot分析的特异性极限。这些数据证实,我们采用的适应性IFN-γELISpot策略使我们能够测量大多数CHB患者的离体HBV特异性T细胞频率,这在研究或临床研究中均未得到证实。

体外离体ELISpot结果的验证

由于许多CHB患者显示S:N比接近我们确定的阳性截止阈值,因此我们试图确定离体测定的一致性。我们对3位接种疫苗的供体进行了每两周一次的抽血,并观察到其绝对SFU与每个时间点不同(数据未显示)。但是,信噪比在很大程度上保持一致;多次测试时,阴性反应的供体仍为阴性,阳性反应的供体仍为阳性(图   3 A)。然后,我们计算了每个人的S:N比率的变异系数(CoV):22.91%(HD04),25.07%(HD17),27.51%(HD21);平均为25.16%。这些数据表明,S:N比值的变化大于25%可以认为是功能性HBV特异性T细胞反应的变化。

图3
图3

体外ELISpot的验证和进一步分析。A)从接种的供体(n = 3)每两周抽血的S∶N比显示出始终表明测定反应性。B)在每个供体/患者内比较平均斑点大小。显着性水平:** p  = 0.0020,* p  = 0.0488,*** p  = 0.0002(成对t检验);ns p  = 0.1250。C)SFU计数通过减去接种供体(n = 10)和CHB患者(n = 20)的DMSO背景SFU进行归一化。水平线表示每组的平均值。显着性水平:** p  = 0.0031(未配对t-测试)。

此外,我们通过比较图2 B,D中的对照和HBV特异性斑点大小来分析IFN-γ分泌/细胞   随着细胞产生更多的IFN-γ,斑点大小增加,这是T细胞功能性的间接度量。SFU大小进行平均并作图之间响应和非响应接种的供体和慢性乙型肝炎患者(图   3 B)。我们观察到,在接种供体(n = 10;p  = 0.0020)和CHB患者(n = 20;p  = 0.0002)中,用可检测到的ELISpot反应,用HBV肽脉冲的PBMC中的斑点大小显着大于DMSO对照有趣的是,接种疫苗的献血者与CHB患者之间的HBV-OLP斑点大小没有显着差异(p = 0.3974)。这表明,当提供最佳刺激时,来自CHB患者的T细胞产生的IFN-γ与来自接种供体的T细胞一样多。此外,我们观察到CHB患者中HBV OLP脉冲PBMC的斑点大小增加,这些斑点根据我们的ELISpot截止标准被视为阴性(p = 0.0488),表明我们可能低估了具有离体T细胞反应的CHB患者的数量。在观察到ELISpot阴性CHB患者的斑点大小增加后,我们尝试使用斑点大小截止值作为ELISpot分析中反应性的更准确度量。然而,尽管制定了一致的测定程序,我们发现从DMSO到HBV OLP的斑点大小变化在测定之间是可变的,并且与斑点计数无关(数据未显示)。因此,使用光点大小截止值并不能改善对阳性反应的确定。

然后,我们比较了可检测的ELISpot响应(图3 C)中接种的供体(n = 10)和CHB患者(n = 20)之间产生IFN-γ的细胞   数量,从而对功能性HBV-特定的T细胞 接种疫苗的供者PBMC平均195个SFU,大大超过了CHB患者PBMC所见的84个SFU的平均值(p = 0.0031)。这些数字等于接种供体的PBMC功能性离体频率为0.010%,CHB患者为0.004%。疫苗接种的供体尽管仅对预防性疫苗中所含的包膜蛋白有反应,但它们的应答性是HBV特异性T细胞的两倍多。相反,CHB患者对更大范围的HBV蛋白敏感,但仍然显示出较低的反应。综上所述,这些数据验证了优化测定的能力,可以在已知显示变异性的测定中提供一致的读数。

临床和病毒学参数不会影响HBV特异性T细胞离体频率

最近的文献表明,CHB疾病阶段按病毒载量,抗原载量和炎症的不同水平分类,不会显着改变HBV特异性T细胞的频率7但是,该结论基于离体检测不到20%的CHB患者的T细胞。由于我们研究中的样本量较小,我们将20例CHB患者的离体ELISpot阳性反应进行了分类,并将他们的IFN-γ斑点计数与各自的病毒学和临床参数进行了比较。我们根据PBMC分离时的年龄,性别,HBV DNA水平,治疗状态,HBsAg水平和ALT对应答的CHB患者进行了分类(图   4)。我们没有观察到总的离体T细胞频率随年龄的变化有显着差异(图   4)。一个; R 2  = 0.001)或性别(图   4 B)。我们没有观察到T细胞反应与病毒载量(图   4 C; R 2  = 0.004)或核苷类似物治疗状态(图   4D)的相关性。在慢性感染期间持续暴露于抗原可能会导致病毒特异性T细胞的逐步缺失,但我们并未观察到与HBsAg水平的任何相关性(图   4 E; R 2  = 0.029)。此外,我们发现HBV特异性T细胞频率与ALT水平无显着相关性(图   4 F; R 2 = 0.01)。我们也没有观察到基于HBeAg状态的显着差异。但是,我们队列中的HBeAg +患者太少(n = 4),无法得出有意义的结论(数据未显示)。重要的是,ELISpot无反应的CHB患者(红色菱形)未与任何分析的参数聚类。这些数据表明临床或病毒学参数不影响功能性HBV特异性T细胞的离体检测。

图4
图4

离体T细胞频率不会因临床参数而改变。按(A)年龄(R 2  = 0.0010),(B)性别(p  = 0.6590),(C)HBV DNA(R 2  = 0.0041),(D)治疗(p绘制慢性患者HBV特异性T细胞频率 = 0.4153),(E)HBsAg水平(R 2  = 0.0296)和(F)ALT(R 2  = 0.0122)。蓝色圆圈表示对ELISpot有反应的患者,而红色菱形表示对无反应的患者。

三色FluoroSpot可提高灵敏度并测量多功能HBV特异性T细胞

在某些ELISpot阴性反应的CHB患者中,斑点大小明显变大的观察表明,我们低估了检出率。这可能归因于ELISpots固有的酶促扩增,导致人为地产生较高的背景并降低了特异性。因此,我们使用优化的离体刺激方案通过三色FluoroSpot检测法测量T细胞功能,该方法可测量IFN-γ,IL-2和TNF-α。患者特征在线列出在补充表S4中FluoroSpots改善了接种疫苗的供体(10/10)和CHB患者(13/13;图5 A)中IFN-γ+反应的检测   我们在9/10接种疫苗的供体和10/13 CHB患者中检测到IL-2反应(图   5)。B)。TNF-α反应显示出较低的敏感性,在7/10接种疫苗的供体和7/13 CHB患者中可检测到反应(图   5 C)。尽管13名CHB患者代表一小群受试者,但这些数据表明,FluoroSpot分析的特异性增强,并且HBV特异性T细胞的离体功能比以前意识到的要广泛。

图5
图5

适应3色FluoroSpot分析可提高灵敏度并测量离体HBV特异性T细胞的多功能性。A对HBV OLP和DMSO对照的IFN-γ(绿色),(B)IL-2(红色)和(C)TNF-α(橙色)FluoroSpot反应。D)CHB患者和接种疫苗的供体之间的多功能性计算为独特SFU计数中双/三阳性SFU的总数。E)进一步划定了双阳性子集,并在两个队列之间进行了比较。在必要时,每个面板旁边还包括重要性级别。

我们比较了接种疫苗的供体和CHB患者中多功能T细胞的频率。与CHB患者相比,接种疫苗的供体平均产生2种和3种细胞因子的T细胞频率更高,但差异没有统计学意义(图   5 D;p  = 0.1721,p  = 0.4113)。产生三种细胞因子的细胞很少,并且没有提供足够的数量进行稳健的分析。产生TNF-α+ IL-2的T细胞在产生双重细胞因子的T细胞中所占比例最大,并且在接种疫苗的供体和CHB患者之间没有显着差异。相反,我们观察到,与接种疫苗的供体相比,CHB患者显示出产生IFN-γ+TNF-α的T细胞显着扩增(图   5)。E; p  = 0.0315)。

CHB患者中IFN-γ+TNF-α+ T细胞频率增加的潜在混杂因素是在TNF-α中观察到高背景。对背景TNF-α斑点的分析显示95.55%是单阳性(n = 13),在DMSO孔中很少有TNFα+细胞产生两种或多种细胞因子(补充图S5)。但是,为了进一步评估这种多功能测量的准确性,我们测试了同一名患者对CMV,EBV和流感(CEF)的反应。我们发现8/10的疫苗接种供体和100%的CHB患者具有可检测的IFN-γ反应(补充图S6 A),7/10的供体和12/13患者具有可检测的IL-2反应(补充图S6)B),只有3/10个供体和6/13个患者对CEF肽具有可检测的TNF-α反应(补充图S6 C)。供体和CHB患者之间的双阳性和三阳性T细胞频率无显着差异(补充图S6 D;p  = 0.7844,p  = 0.4100)。重要的是,在接种CEF肽后,接种疫苗的供体和CHB患者之间未发现IFN-γ+TNF-α+ T细胞频率(无其他亚群)有显着差异(补充图S6 E;p = 0.2518)。这表明观察到的T细胞功能差异与慢性HBV感染有关。

慢性患者的HBV抗原特异性和T细胞功能

我们调查了一小部分CHB患者(n = 5)中有足够的PBMC来进行测定(至少25×10 6 PBMC)的HBV特异性T细胞的抗原特异性功能等级患者特征在线列出在补充表S4中我们测试了对单个HBV抗原的多功能反应,与图1 D中的疫苗接种供体相似。   总体而言,IFN-γ是主要反应,其中5/5患者对聚合酶池有反应,对核心酶反应为3/5,对核心酶反应为1/5每个信封和X(图   6一个)。在3/5患者中检测到IL-2反应。IL-2反应主要针对聚合酶和核心。其次是包膜和X。离体IFN-γ反应的关注范围很窄,其中4/5患者对8种肽库中的≤3种有反应(图   6 B)。产生IL-2的T细胞患者的反应广度高于IFN-γ,观察到的IL-2反应≥5个肽库。TNF-α反应仍然是检测最少的,只有2/5例患者对聚合酶和包膜有反应,而只有一种对核心反应。这些数据支持以前的观察结果,即离体IFN-γT细胞反应受聚合酶和核心作用支配,表明具有IL-2反应的CHB患者表现出最大的T细胞反应广度。

图6
图6

离体FluoroSpot可测量CHB患者的抗原特异性多功能反应。A每个池刺激慢性患者PBMC(n = 5;每次测定16×10 6个 PBMC)。绘制了针对每种细胞因子针对每种HBV抗原(聚合酶,核心,包膜和X)的可检测到的离体T细胞应答(彩色)的百分比。B)每个测试患者中每种细胞因子的反应广度。患者可能对总共8个肽库有反应(即图   1 D)。

讨论区

不存在能够持续测量HBV特异性T细胞功能的离体慢性乙型肝炎患者的测定法的创造在疾病的发病机制,病毒控制和治疗性干预的主要知识缺口1112在这项研究中,我们重新评估了当前策略并优化了IFN-γELISpot分析方法,以开发出可以在任何HBV免疫学实验室中共享和实施的方案。我们优化了细胞数量,肽浓度和脉冲策略的关键变量,并验证了其一致性以检测应答和对HBV抗原的特异性。这使其能够适应FluoroSpot分析,从而进一步改善了大多数CHB患者离体的IFN-γ+ HBV特异性T细胞的检测和多功能性的测量。

临床分期如“免疫耐受”的老命名最近受到了挑战,我们的数据支持是T细胞应答是慢性乙型肝炎的不同阶段之间的相似71617但是,我们研究的目的是证明在大多数CHB患者中都可以在体内检测到HBV特异性T细胞,并且其功能性可以超过IFN-γ的产生。我们的30名CHB患者队列并非按疾病阶段均匀分布,但我们确实将T细胞功能与临床和病毒学参数进行了比较。我们没有发现任何重大影响。最稳健的对比是未处理的CHB患者和患者核苷类似物治疗,已在体外用改进的HBV特异性T细胞扩张有关之间518192021治疗与未治疗患者之间缺乏差异可能表明病毒载量的降低会影响HBV特异性T细胞的体外扩增能力,而不是其离体频率。现在,可以使用改编的ELISpot分析法解决这些重要问题。

除了在不同类型的CHB患者中测试T细胞反应外,我们还使用一小部分患者使用三色FluoroSpots来研究抗原特异性。在测试的五位CHB患者中,我们观察到聚合酶特异性T细胞在离体T细胞反应中占主导地位,其次是核心。特异性聚合酶-T细胞在周围的保持可能是由于HBV聚合酶蛋白的较低的表达822聚合酶特异性T细胞的优势可能为缺乏临床和病毒参数之间的差异提供了解释。但是,需要对CHB患者的不同队列进行更强有力的分析,以确定抗原特异性等级在较大的队列中是否成立。

除了抗原特异性,我们还使用了FluoroSpots来提供证据,证明HBV特异性T细胞在体外没有显示出完全耗尽的功能。IFN-γ是主要的细胞因子,在所有13位接受测试的CHB患者中均检出。但是,我们在高比例的CHB患者中检测到能够直接离体产生IL-2的T细胞。具有HBV特异性IL-2反应的患者表现出最大的反应广度,对5种或更多的肽库有反应,这与功能表型不那么疲倦相符。因此,在不同的患者群体中使用FluoroSpot分析可提供更多详细信息,以了解慢性乙型肝炎进展期间HBV特异性T细胞的功能概况以及治疗干预的效果。

为了解决技术问题,细胞数量是人类研究的永恒障碍,尤其是在需要严格监控的临床研究中。因此,主要挑战是克服HBV特异性T细胞频率的数学局限性,而又不使用使该测定不适用于常规用途的大量细胞。对于带有阴性和阳性对照的每个HBV肽库(通常为8个库),一式三份的标准方法需要大约9×10 6个 PBMC。另一方面,我们的测定使用2×10 6 PBMC /条件,同时用所有HBV肽脉冲,以实现最大的灵敏度。结合额外的阳性和阴性对照,以及由于过夜休息而导致的细胞丢失,该测定需要8×10 6PBMC。PBMC分离后,10 mL全血将产生10–15×10 6个 PBMC,从而可以通过单管血液通过其他测定分析剩余的细胞。这有助于在临床试验中进行免疫监测。因此,我们提高了IFN-γELISpot的灵敏度,并减少了运行测定所需的PBMC数量。

ELISpot的主要挑战是测定间差异和确定相对界限,以准确区分阳性反应和阴性反应。在我们的测定中,背景的两倍截止效果很好,但排除了一些阳性反应,这些反应后来被FluoroSpot检测到。我们观察到,这种可变性的大部分来自DMSO孔中检测到的非特异性斑点,并且每个测定之间的斑点计数都不同,但S:N比率保持更一致。为了证明这一点,我们测试了在四个不同时间点抽取的3个接种疫苗的供体。反应阴性的捐助者仍为阴性(信噪比<2),而阳性反应的捐助者仍为阳性(信噪比≥2)。我们尝试在S上进行改进:通过比较DMSO和HBV OLP刺激的孔之间的平均斑点大小,可将N比作为阳性反应的临界值。由于ELISpots中的酶促扩增作用,DMSO(较小斑点)或HBV特异性(较大斑点)的绝对值无法在实验之间标准化。此外,光斑大小无法转换为FluoroSpots,因为荧光强度会受到激光强度,暴露于光和光漂白的影响很大。使用来自各个供体的多个时间点的数据,我们计算出信噪比的变异系数(CoV)约为25%。这表明,S:N比值的变化超过25%可以定义为HBV特异性T细胞反应的变化,从而可以纵向监测和量化CHB患者中的T细胞免疫力。由于ELISpots中的酶促扩增作用,DMSO(较小斑点)或HBV特异性(较大斑点)的绝对值无法在实验之间标准化。此外,光斑大小无法转换为FluoroSpots,因为荧光强度会受到激光强度,暴露于光和光漂白的影响很大。使用来自各个供体的多个时间点的数据,我们计算出信噪比的变异系数(CoV)约为25%。这表明,S:N比值的变化超过25%可以定义为HBV特异性T细胞反应的变化,从而可以纵向监测和量化CHB患者中的T细胞免疫力。由于ELISpots中的酶促扩增作用,DMSO(较小斑点)或HBV特异性(较大斑点)的绝对值无法在实验之间标准化。此外,光斑大小无法转换为FluoroSpots,因为荧光强度会受到激光强度,暴露于光和光漂白的影响很大。使用来自各个供体的多个时间点的数据,我们计算出信噪比的变异系数(CoV)约为25%。这表明,S:N比值的变化超过25%可以定义为HBV特异性T细胞反应的变化,从而可以纵向监测和量化CHB患者中的T细胞免疫力。DMSO(较小斑点)或HBV特异性(较大斑点)的绝对值在实验之间无法标准化。此外,光斑大小无法转换为FluoroSpots,因为荧光强度会受到激光强度,暴露于光和光漂白的影响很大。使用来自各个供体的多个时间点的数据,我们计算出信噪比的变异系数(CoV)约为25%。这表明,S:N比值的变化超过25%可以定义为HBV特异性T细胞反应的变化,从而可以纵向监测和量化CHB患者中的T细胞免疫力。DMSO(较小斑点)或HBV特异性(较大斑点)的绝对值在实验之间无法标准化。此外,光斑大小无法转换为FluoroSpots,因为荧光强度会受到激光强度,暴露于光和光漂白的影响很大。使用来自各个供体的多个时间点的数据,我们计算出信噪比的变异系数(CoV)约为25%。这表明,S:N比值的变化超过25%可以定义为HBV特异性T细胞反应的变化,从而可以纵向监测和量化CHB患者中的T细胞免疫力。使用来自各个供体的多个时间点的数据,我们计算出信噪比的变异系数(CoV)约为25%。这表明,S:N比值的变化超过25%可以定义为HBV特异性T细胞反应的变化,从而可以纵向监测和量化CHB患者中的T细胞免疫力。使用来自各个供体的多个时间点的数据,我们计算出信噪比的变异系数(CoV)约为25%。这表明,S:N比值的变化超过25%可以定义为HBV特异性T细胞反应的变化,从而可以纵向监测和量化CHB患者中的T细胞免疫力。

总之,类似于四聚体染色对四聚体富集的适应,我们的适应性检测提供了一种测量HBV特异性T细胞免疫力的新策略。我们对测定的最初使用表明,大多数CHB患者离体均可检测到T细胞,其中许多表现出多功能性。通过改进的检测方法,我们和其他人可以解决关于慢性乙型肝炎进展中的T细胞功能以及新疗法对HBV特异性T细胞免疫的影响的长期问题,从而开发出基于抗原特异性T的稳健的免疫生物标记细胞。

材料和方法

人体和全血处理

这项研究已获得大学健康网络研究伦理委员会的批准,并根据UHN指南进行了实验。参加研究的所有受试者均提供书面知情同意书。所有CHB患者均在多伦多肝病中心招募。通过密度梯度离心收集PBMC,并将其冷冻保存在液氮中,浓度为90%的基因敲除血清替代品(Life Tech)+ 10%DMSO(Sigma)。补充表S3总结了图2中用于ELISpots的CHB患者的临床特征   补充表S4总结了图1和2中用于FluoroSpots的CHB患者的特征。 56(和补充图S6)。

HBV重叠肽(OLP)库

从GenScript购买310个HBV基因型C(登录号:AB112063)与10个残基重叠的15-mer肽,纯化至> 70%。将肽溶解在100%DMSO中,浓度为50 mg / mL。将15聚体肽在Aim-V培养基中稀释,并如表1所示合并成8个集合

表1 HBV 15-mer OLP库

离体T细胞刺激

将冷冻保存的PBMC解冻,重悬于含有2%人血清的Aim-V培养基(Life Tech)(VWR International)中,并在5%CO 2于37°C 以4×10 6 PBMCs / mL在30 mL聚丙烯管中静置过夜。帽子松动。过夜休息并没有显着改变PBMC样品中活细胞,单核细胞,总T细胞,CD4或CD8 T细胞的频率(补充图S7A)。过夜休息后的细胞恢复率为60–100%,与T细胞反应无关(补充图S7 B)。休息后,对PBMC进行计数,计数为4.5×10 5将PBMC(20%)转移至1.5 mL Eppendorf管中,并用2%人血清重悬84 µL Aim-V。为了测量总的T细胞反应,将2 µL 250 µg / mL每个肽库的储备液(图   2 A)添加到细胞中,使最终体积为100 µL Aim-V,DMSO最终浓度为3.1 %(v / v)和5 µg / mL的最终肽浓度。对于测试抗原特异性的单个肽库,4.5×10 5将PBMC(20%)重悬于98 uL Aim-V中,将血清重悬于9个单独的1.5 mL Eppendorf管中,每个抗原肽池和DMSO对照一个。将每种250 µg / mL肽库或DMSO载体中的2 µL加入其各自的试管中,最终DMSO浓度为0.3875%(v / v),最终肽浓度为5 µg / mL。在37°C,5%CO 2中进行肽加载1 h 以与肽库中相同的v / v浓度添加DMSO作为媒介物对照:总T细胞反应(8个库)为3.1%,抗原特异性肽库(1个库)为0.39%。肽加载1小时后,将PBMC以350xg离心,除去肽加载培养基,并将脉冲细胞重悬于225 µL无血清的Aim-V中。对于其余80%的无脉冲电池,1.8×10 6每次刺激后,将细胞转移至1.5 mL Eppendorf管中,以350xg离心,重悬于900 µL无血清的Aim-V中。将载有肽的细胞与无脉冲细胞合并在一起,总体积为1.125 mL,最终细胞浓度为2×10 6细胞/ mL。然后将合并的细胞以4×10 5 PBMC /孔(200 µL)在5孔中(图   2 A)。我们将20:80策略与所有HBV OLP池中的100%PBMC脉冲在5%CO 2中在37°C的条件下在37°C下进行了1小时的比较(补充图S8)。)。20:80策略将DMSO暴露限制在一部分细胞(20%)中。我们发现,仅用HBV OLP脉冲处理20%的细胞即可保持阳性反应并导致较低的背景,从而提供相等或更好的信噪比。当来自5个孔的HBV特异性SFU的总数均超过25个SFU,并且是背景DMSO SFU的两倍以上时,则表示为阳性。

干扰素-γELISpot

将96孔MultiScreenHTS-IP无菌PVDF滤板(Merck Millipore)用3%乙醇的ddH 2 O 溶液活化,用无菌ddH 2 O 洗涤,然后在4°C下用5 µg / mL小鼠抗人IFN包被过夜1×PBS中的-γ单克隆抗体(Cellular Technologies Limited;克隆:ZC-11)。丢弃捕获抗体溶液,并用无菌PBS洗涤板,然后在室温下用Aim-V培养基加10%热灭活的FBS封闭30分钟。弃去封闭溶液,将细胞以4×10 5个细胞/孔的速度铺板在5孔中,有效铺板2×10 6单元格/条件。含有带有人T激活剂CD3 / 28珠(Thermo Fischer Scientific)或没有任何刺激或DMSO的PBMC的孔分别用作阳性和阴性对照(分别为7.5×10 4和1×10 6个细胞)。将平板在5%CO 2中于37°C孵育持续24小时。孵育后,弃去细胞,并用PBS洗涤板。在室温下,将生物素化的小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(Cellular Technologies Limited;克隆:ZD-51)溶液以0.5 µg / mL的浓度添加到每个孔中2 h,弃去并洗涤。在室温下将链霉亲和素-ALP以0.25 ng / mL的浓度添加到每个孔中30分钟,弃去并洗涤。在碱性磷酸酶缓冲液(100 mM Tris–HCl [pH 9.0],150 mM NaCl,1 mM MgCl 2)中加入330 µg / mL NBT和165 µg / mL BCIP(Promega)的底物溶液,并添加50 µL在黑暗中每孔20分钟。丢弃底物溶液,并在空气干燥之前用蒸馏水洗涤板。使用CTL ImmunoSpot S6分析仪(Cellular Technology Limited)对斑点形成单位进行计数。

三色FluoroSpot

按照制造商的规程涂覆并开发了检测IFN-γ(绿色),IL-2(红色)和TNF-α(黄色)分泌物的FluoroSpot试剂盒(Cellular Technologies Ltd.)。如上所述进行离体PBMC刺激和接种以测量HBV特异性T细胞应答。

为了测量覆盖每个HBV蛋白的8个肽库的抗原特异性T细胞反应,使用上述针对总HBV T细胞反应的方案(20个),对2×10 6个 PBMC用5 µg / mL肽对每个肽库(表1进行脉冲处理装有肽的细胞百分比)。使用以33种已知的针对巨细胞病毒,爱泼斯坦巴尔病毒和流感病毒(CEF,GenScript; 1 µg / mL /肽)的抗原表位刺激的1×10 6 PBMC和以人T激活剂CD3 / 28磁珠刺激的7.5×10 4 PBMC作为刺激。阳性对照。当存在超过25个SFU,并且是背景DMSO SFU的两倍以上时,则表示为阳性。

统计分析

在HD和CHB患者中,未经治疗的DMSO和DMSO对照的SFU计数之间进行了Wilcoxon测试。进行Wilcoxon测试以比较HD和CHB中DMSO和OLP SFU的大小(图   3 B);在响应的HD和CHB OLP SFU之间进行了Mann-Whitney测试。进行了Mann-Whitney测试以比较归一化的HD和CHB SFU(图   3 C)。并比较性别与治疗状态之间的SFU计数(图   4 B,D)。显示了回归线,其中的R平方计算了针对年龄,HBV DNA,血清HBsAg和ALT水平的SFU计数(图   4 A,C,E,F)。进行了Mann-Whitney测试以比较多功能性(图   5 D,补充图S6D)和HD和CHB之间的双阳性子集(图   5 E,补充图S6 E)。

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