您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2020
本企业通过iso9001质量体系认证

单克隆抗体制备- 免疫荧光技术

 二维码
发表时间:2019-07-12 17:23作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

单克隆抗体制备- 免疫荧光技术

免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测,如细胞性抗原(包括细菌和动物细胞)、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作简单、敏感性高,可直接观察抗原定位等优点,在McAb的筛选与鉴定上具有重要的应用价值。

A、器材和试剂

a. 供检测抗体用的抗原制备固定细胞片或板,活细胞悬液。b. PBSPH7.20.01mol/Lc. 待检的McAb样品。d. 冷丙酮 e. FITC(异硫氰酸荧光素)或TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素)标记的抗鼠Ig抗体等 f. 荧光显微镜,磁力搅拌器,离心机,水浴箱等。

B、间接免疫荧光法

a. 固定细胞片的制备:生长在盖片上的细胞(接种或未接种病毒),可直接收获盖片,在PBS中洗涤,用4丙酮固定10分钟,空气干燥,置密封容器于-20保存备用;单细胞悬液可在盖片上制成涂片,固定方法同上。细胞涂片的制备:将10ul细菌悬液(1×108/ml)涂抹7×21mm盖片上,自然干燥后,用-20丙酮固定10-15分钟,于-20保存备用。

b. 盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10-20ul杂交瘤上清或其他待检样品;设立阳性、阴性对照;置37水浴孵育0.5-1小时。

c. 取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。

d.盖片置架上,滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10-20ul37孵育0.5-1小时。

e.同法洗涤15分钟;取出盖片,用延缓荧光碎灭的封载剂(如缓冲甘油,9份甘油加1PBS)封于干净载玻片上。

f.光显微镜上观察,阳性结果可见特异性荧光(FITC为黄绿色荧光,TRITC为桔红色荧光)。

g. 细胞固定片的制备,也可改在培养板孔中进行,其余步骤同上,在观察结果时,将培养板翻转置于荧光显微镜下,判断标准不变。

C、 细胞的膜荧光染色

完整的活细胞的细胞膜,抗体不能透过。如果细胞在4操作,则荧光染色仅限于细胞膜。必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体,因此试验过程中要保证细胞的高活力。活细胞的膜荧光染色大致步骤如下:

a. 制备活性较好的细胞悬液,调节浓度至107/ml

b. 在小试管(5×50mm)中加入100ul细胞悬液,再加入100ul待检McAb的样品,混匀,4作用30-90分钟。

c. 用洗涤液(PBS 900ml,小牛血清50ml4%NaN3 50ml)洗二次,每次加洗涤液1-5ml1000r/min离心5分钟,弃上清。加入100ul荧光抗体,4作用30-90分钟。

d. 同法洗涤,将细胞重新悬于20-30ul10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中;滴加于载玻片上,加盖片封载。

e. 立即在荧光显微镜上检查。

f. 细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定,立即检查,或至少在4可保存一周。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297