肿瘤相关的KRAS突变在这三种RAS家族亚型中最普遍，并且涉及许多不同的氨基酸。因此，能够干扰突变型KRAS蛋白的分子对于广泛的肿瘤治疗可能具有重要意义。我们描述了基于蛋白质大分子（大分子）融合到特定的E3连接酶的两个RAS降解剂的工程设计。将与VHL E3连接酶融合的KRAS特异性DARPin与与CHIP E3连接酶的UBOX域融合的泛RAS细胞内单域抗体（iDAb）进行比较。我们证明，虽然KRAS特异性DARPin降解物诱导突变型和野生型KRAS的特异性蛋白水解，但它仅在体外和体内抑制表达突变型KRAS的癌细胞的增殖。但是，Pan-RAS蛋白降解会影响增殖，而与RAS突变无关。
KRAS致癌基因的突变占所有RAS家族突变1的 85％以上，并且个别突变发生在各种密码子上，从而产生了多种形式的KRAS突变蛋白2。最近，几个大分子3，4，5，6，7和化合物8，9，10，11，12，13已经开发出影响RAS家族成员功能的药物。尽管如此，只有KRAS的G12C突变已经具体小分子凭借共价键的半胱氨酸突变体的化合物的结合的有针对性的14，15，16，17，18，19，20，21。现在有几种小分子正在临床试验中22。但是，只有一小部分突变的KRAS肿瘤表达KRAS G12C蛋白（约12％，Cosmic数据库v91，https： //cancer.sanger.ac.uk/cosmic），并且可以被这些抑制剂作为目标。此外，在用这些抑制剂治疗后，最近已在KRAS G12C肿瘤群体中描述了快速适应性变化，以使某些细胞对药物不敏感23。因此，需要新的策略以特异地靶向表达突变体KRAS的大量其他肿瘤。可能被应用到该目标的试剂被设计为锚蛋白重复蛋白（DARPins）K13和K19，它们特异性干扰KRAS 3。尽管这些DARPins不能将突变体与野生型KRAS（KRAS WT），它们不与NRAS和HRAS结合，因此使用这些DARPin在细胞内产生的任何表型都将保留这两个家族成员的表达和功能3。
先前涉及在人细胞系异种移植物中表达泛RAS结合的细胞内单域抗体（iDAb，以下称为iDAb RAS）的研究表明，肿瘤的生长在表达细胞内抗体片段的过程中受到抑制，并在去除抗体后恢复24。在这种情况下，潜在的互补方向可能是向这些大分子25添加弹头，例如与蛋白酶体靶向序列26融合的单链片段变量（scFv）或在细胞内单个结构域上工程化的E3连接酶（称为大分子降解物），到的目标调用蛋白水解27，28，29，30，31，32。大分子降解物通过泛素-蛋白酶体系统诱导其靶标的消耗。它们由靶向目标蛋白（例如细胞内单结构域），接头和E3连接酶结构域的结合剂组成。类似的蛋白靶降解策略已经被开发，其中小分子，其结合蛋白质被链接到E3连接酶结合配体被称为蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）或小分子降解剂33，34。
蛋白水解策略的主要优点是仅需要结合剂，而结合剂不需要抑制蛋白质的功能。事实上，与经典的蛋白-蛋白抑制剂或其他占用驱动抑制剂，所述降解剂依靠动作的事件驱动模式，并且因此往往比亲实体更有效的35，36，37，38，39。大部分电流作用的降解成分靶向溴结构域或激酶家族40，41，42，43，只有少数目标“undruggable”蛋白如转录因子44。迄今为止，仅适用于RAS的PROTAC是与KRAS G12C结合的化合物，但它们仅降解外源GFP-KRAS G12C融合蛋白，而不靶向内源性KRAS G12C 45。另外，在致癌靶标的RAS家族中，没有显示出大分子或基于小分子的降解剂对KRAS具有特异性。
我们在此报告了将KRAS特异性DARPin K19（以下称为DP KRAS）3工程化为KRAS特异性降解剂的情况，并与由先前所述的pan-RAS改造的工程化pan-RAS降解剂比较了功效和肿瘤特异性。 RAS细胞内单结构域抗体7，46。我们显示，KRAS降解剂在体外和体内均能有效诱导内源性KRAS降解，并特异性抑制KRAS突变体肿瘤，而不会仅以KRAS WT影响细胞，而pan-RAS降解剂则抑制所有类型的细胞，而不论RAS同种型突变如何。因此，我们利用这种KRAS特异的大药来证明KRAS消融可以成为靶向任何表达KRAS突变的肿瘤的诱人方法。
向细胞内抗体和其他大分子试剂中添加弹头是提高效力的隐含策略，例如，通过将目标蛋白转移至蛋白酶体进行降解。细胞内单结构域已被官能化与E3连接酶结构域，例如羧基末端的UBOX域的Hsc70相互作用蛋白（CHIP）连接酶31，该希佩尔-林道（VHL）29，32或FBOX 27，28，但也有没有关于在特定情况下适用哪种E3连接酶的规则，也没有关于蛋白质应如何进行工程设计的规则（与E3连接酶的N或C末端融合）。我们已经测试了与特定DP KRAS 3融合的UBOX域和VHL E3连接酶或iDAb RAS 7。对照包括突变的DARPin，其中RAS结合的色氨酸重复序列被突变成甘氨酸和丙氨酸残基3（在此为DP Ctl）或无关的iDAb（在此为iDAb Ctl）47。所有蛋白都经过了N或C端融合酶E3连接酶的改造。因此，如生物发光共振能量转移（BRET）供体饱和测定法（补充图1a）和共免疫沉淀法（补充图1b）所示 ，DP Ctl不结合KRAS（突变体和WT ）。此外，像阴性对照DARPin E3.5 4一样，DP Ctl突变体不会抑制突变体KRAS / CRAF FL相互作用（补充图。 1c）或BRET竞争测定法中的突变KRAS二聚化（补充图 1d）。
用这些UBOX /单结构域构建体瞬时转染HCT116细胞（表达KRAS G13D），并通过Western blot检测K / N / HRAS蛋白水平。iDAb RAS-UBOX和UBOX-iDAb RAS构建体均诱导KRAS，NRAS和HRAS蛋白水平降低，而iDAb RAS-UBOX表现出更大的降解作用（图 1a，b）。相反，尽管在N端VHL融合蛋白（即VHL-iDAb RAS）中观察到一些降解，但我们可以通过C端VHL与iDAb RAS融合（即iDAb RAS-VHL）检测到很少的RAS转换（图1c）。 ，d）。同样，UBOX与DP KRAS融合体对RAS蛋白水平的影响很小（图 1a，b）。但是，当我们在DP KRAS的N端设计VHL融合蛋白（VHL-DP KRAS）时，我们观察到了转染的HCT116细胞中KRAS蛋白的大量减少（图 1c，d）。与DP KRAS-VHL融合相比，VHL-DP KRAS融合降低了KRAS蛋白水平（图 1d）。一个关键的观察结果是，与iDAb RAS-UBOX不同，由于该DARPin 3的KRAS特异性结合特性，VHL-DP KRAS仅消耗KRAS而不消耗NRAS或HRAS（图 1c，d）。这些降解作用是蛋白酶体依赖性的，因为环氧霉素处理（蛋白酶体抑制剂48）阻碍了iDAb-UBOX和VHL-DP KRAS的RAS降解（图 1e，f）。因此，具有UBOX域的iDAb RAS（以下称为pan-RAS降解剂）和具有VHL的DP KRAS（以下称为KRAS降解剂）的功能化分别促进RAS和KRAS降解（图 1g，补充图1e和2的序列）。 – 4）。
一个上RAS融合单个域UBOX的影响蛋白水解通过Western印迹评估。将UBOX域融合在pan-RAS iDAb（iDAb RAS）或iDAb Control（Ctl），KRAS特异性DARPin K19（DP KRAS）或DARPin Control（DP Ctl）的N端或C端。质粒在HCT116细胞中转染后二十四小时，进行Western印迹法测定RAS蛋白水平以及FLAG抗体对每个构建体的表达。β-肌动蛋白是负荷控制。黑色箭头显示了在观察到的双峰中对应于NRAS蛋白的特定条带。b直方图显示了从两个独立的生物学重复（灰色点）标准化为未转染细胞的每种RAS同工型的定量。C通过Western印迹评估融合单结构域VHL对RAS蛋白水解的影响。d如b所示，对未转染的细胞标准化的两个独立的生物学重复（灰色点）的定量。在一个 - d，最好泛RAS和KRAS降解菌已分别强调了橙色和蓝色。È HCT116转染的细胞用指定的构建体用DMSO（ - ）或0.8μM的蛋白酶体抑制剂环氧酶素（+）的18小时。通过蛋白质印迹评估KRAS降解。f对未转染细胞标准化的两个独立的生物学重复的KRAS降解定量。实验一，c e进行了两次。在误差棒b，d和˚F是平均值±SEM从两个独立的生物重复。g方案概括了两种RAS降解剂的作用：泛RAS降解剂（iDAb RAS-UBOX）通过蛋白酶体机制降解所有RAS亚型，而KRAS降解剂（VHL-DP KRAS）仅诱导KRAS降解而不影响NRAS或HRAS。a – f源数据作为源数据文件提供。
我们在稳定转导的H358（肺癌，KRAS G12C）癌细胞系中比较了KRAS降解剂和pan-RAS降解剂的KRAS 特异性。使用Tet-On诱导系统（即在强力霉素处理后诱导降解表达）在慢病毒载体转导的细胞中表达工程蛋白。我们首先通过增加剂量的强力霉素诱导来表征这些H358细胞的降解特性，这表明KRAS降解剂仅消耗KRAS，而pan-RAS降解剂以剂量依赖性方式击倒所有三个K / N / HRAS蛋白。 （图 2a，b）。对照降解菌未见效果（图 2a，b）。这些结果证实了在图1所示的瞬时转染实验中观察到的降解的特异性 。我们分析了强力霉素诱导泛RAS降解剂或KRAS降解剂后RAS蛋白降解的动力学，以及RAS依赖性下游信号传导的结果。强力霉素处理后仅2小时即可观察到降解蛋白的合成（使用抗FLAG抗体使用Western印迹检测）（图 2c，d），K，N和HRAS的损失与图2相似。 h当表达pan-RAS降解物时（图 2c）。然而，表达KRAS降解子时仅降低KRAS水平，并且KRAS降低与降解子表达同时发生（图。 2d）。正如预期的那样，我们还观察到与任一降解物合成同时发生的AKT，MEK和ERK磷酸化的损失（图 2e，f）。通过用蛋白酶体抑制剂环氧肟酸处理细胞，证实RAS降解是蛋白酶体依赖性的（补充图 5a）。此外，与有效抑制MAPK途径活性一致，pan-RAS和KRAS降解子均降低了MAPK途径下游转录物DUSP6的表达（补充图 5b）。）。我们的数据表明，在强力霉素治疗期间（长达72小时），KRAS特异性降解剂会导致KRAS迅速耗竭，同时抑制RAS下游信号并持续降解KRAS。泛RAS降解剂显示出相似的特性。
大剂量药物降解剂诱导后用于剂量反应和时程分析的RAS和效应蛋白水平的蛋白质印迹。a，b用指示的强力霉素（dox）浓度在表达iDAb Ctl-UBOX或iDAb RAS-UBOX（a），VHL-DP Ctl或VHL-DP KRAS（b）的H358细胞中孵育18小时的剂量反应实验。通过蛋白质印迹法评估KRAS，NRAS和HRAS蛋白水平。FLAG抗体显示了构建体的表达，α-微管蛋白是上样对照。黑色箭头显示了在观察到的双峰中对应于NRAS蛋白的特定条带。Ç，d H358细胞的表达相同作用的降解如在时间响应实验一，b。使用β-肌动蛋白作为上样对照测定了pan-RAS（c）和KRAS降解物（d）对KRAS，NRAS和HRAS蛋白水平的影响。一个 - d α微管蛋白/β肌动蛋白标准化KRAS，NRAS和HRAS丰度值被报告各个车道的下方。e，f评估了pan-RAS（e）和KRAS降解物（f）对RAS依赖途径的影响，β-肌动蛋白负荷控制与面板c和d相同，为清晰起见将面板分开。pAKT S473的定量/ AKT，pMEK / MEK和pERK / ERK信号归一化为无Dox（-）条件，显示在各个通道下方。每个实验进行两次。a – f源数据作为源数据文件提供。
我们还评估了除H358以外的几种稳定转导的癌细胞系中两种降解物降解的特异性，分别是MIA PaCa2（胰腺，KRAS G12C），A549（肺，KRAS G12S），H1299（肺，NRAS Q61K），HT1080 （纤维肉瘤，NRAS Q61K），T24（膀胱，HRAS G12V），HCC827（肺，RAS WT但EGFR突变）和未转化的细胞系：MRC5（未转化的肺成纤维细胞，RAS WT）。使用Tet-On诱导系统在慢病毒载体转导的细胞中再次表达工程蛋白。在强力霉素诱导下，使用抗FLAG标签抗体在Western印迹中检测到降解物表达（图 3））仅在表达KRAS降解物时（图3b）才导致表达pan-RAS降解物的细胞中K，N和HRAS的有效敲低（图 3a）或KRAS降解 。这发生在所有测试的细胞系中。
大药降解剂诱导后RAS家族蛋白水平的蛋白质印迹。a，b泛RAS（a）和KRAS降解子（b）在具有所示各种RAS突变的各种人类细胞系中消耗其靶标的功效。多西环素以0.2μg.mL -1（+）或未诱导（-）对细胞进行强力霉素处理72小时后，通过Western blot鉴定KRAS，NRAS和HRAS蛋白水平。使用的系是突变的KRAS细胞系H358，MIA PaCa2和A549，突变的NRAS H1299，HT1080和突变的HRAS T24细胞系以及RAS WT HCC827和MRC5细胞。用FLAG抗体显示了降解子的表达。β-肌动蛋白是负荷控制。在每个实验一，b被执行了两次。a，b源数据作为源数据文件提供。
检查H358细胞中RAS降解的动力学，以确定对RAS信号传导的影响的开始和持续时间（图 2）。我们用强力霉素诱导后72小时，使用蛋白质印迹进一步评估了pan-RAS或仅KRAS降解对细胞系面板的RAS下游信号通路的影响。泛RAS降解物诱导RAS蛋白丢失，从而导致RAS信号（PI3K和/或MAPK途径）受到抑制。尽管并非所有MAPK和PI3K途径中的蛋白质都受到类似的影响，但这是通过在所有细胞系中AKT，MEK和/或ERK磷酸化的降低来确定的（图 4和5i）。在没有RAS的两条细胞中也观察到RAS信号丢失基因突变（图 4g，h），而对照iDAb Ctl-UBOX没有作用（图 4a–h）。相反，在具有突变KRAS的细胞（即H358，MIA PaCa2）中，KRAS降解物仅抑制AKT，ERK和MEK磷酸化，而在A549中则抑制程度较小（图 5a–c，i）。实际上，它对具有NRAS突变（H1299和HT1080）或HRAS（T24）或没有突变RAS（HCC827和MRC5）的细胞没有影响（图 5d–h）。VHL-DP Ctl没有作用（图 5）。这些数据在图5i中被量化 。先前已经报道了亲本粘合剂的转化为降解剂可以改变其特异性49，50，51，因此我们在研究中添加了亲本粘合剂作为对照。与GFP 2融合的pan-RAS iDAb的表达导致H358，A549和T24中的RAS水平降低（补充图 6a–h），这可能是由于iDAb RAS的表达水平，而KRAS特异性DARPin与GFP 2融合的蛋白对RAS蛋白水平没有影响（补充图 7a–h）。iDAb RAS-GFP 2对RAS下游途径的抑制作用与其降解剂形式相似（定量图的补充图 6a-h和7i）。KRAS特异性DARPin与GFP 2融合在突变的KRAS细胞（补充图7a-c，i中的 H358，MIA PaCa2和A549）中，也降低了RAS信号传导 ，而在其他细胞系中（其他补充图7d-i）它却以不同的方式改变了RAS信号传导 。确实，它增强了MEK和ERK的磷酸化，而对具有突变NRAS或HRAS的H1299，HT1080和T24细胞中的pAKT水平降低或没有影响（补充图 7d-f，i），并减少了HCC827中的pERK和pAKT。和缺少RAS突变的MRC5细胞系（补充图 7g–i）。KRAS特异的DARPin与KRAS-GTP和KRAS-GDP相互作用，可能是GAP抑制剂3，因此pMEK / pERK信号的增加可能归因于其对KRAS WT的 GAP抑制机制。。
的效果泛RAS降解剂上RAS各种细胞系的下游信号传导途径，通过Western印迹分析检测：一个 H358（KRAS G12C），b MIA PACA-2（KRAS G12C），Ç A549（KRAS G12S），d H1299（ NRAS Q61K），e HT1080（NRAS Q61K），f T24（HRAS G12V），g HCC827（RAS WT）和h MRC5（RAS WT）。所有细胞系稳定表达dox诱导的iDAb RAS-UBOX或其阴性对照iDAb Ctl-UBOX。当用0.2μg.mL -1多西环素诱导72 h（+）或未诱导（-）时，FLAG抗体用于确定iDAbs的表达。β-肌动蛋白是负荷控制。每个实验至少进行三次。a – h源数据作为源数据文件提供。
检查对各种细胞系的RAS下游信号传导途径的KRAS降解剂的效果通过Western印迹分析：一个 H358（KRAS G12C），b MIA PACA-2（KRAS G12C），Ç A549（KRAS G12S），d H1299（NRAS Q61K），e HT1080（NRAS Q61K），f T24（HRAS G12V），g HCC827（RAS WT）和h MRC5（RAS WT）。所有细胞系稳定表达dox诱导的VHL-DP KRAS或其阴性对照VHL-DP Ctl。当用0.2μg.mL -1强力霉素诱导72 h（+）或未诱导（-）时，FLAG抗体用于确定DARPins（DP）的表达。β-肌动蛋白是负荷控制。i图2和3 中pAKT S473 / AKT和pERK / ERK信号的定量。 4和5。将信号归一化为no dox（-）条件。在每个实验一 - ^ h进行至少三次。i中的误差线是至少三个生物学重复的平均值±SEM（n 对于定量的A549 DP KRAS ＝ 3，对于pAKT定量的HCC827 ＝ 3，所有其他细胞系n = 4）。a – i源数据作为源数据文件提供。
我们的数据表明，与亲本DARPin相比，改造成降解物的KRAS特异性DARPin K19具有针对突变KRAS细胞的特异性。我们通过在2D贴壁和3D球体分析中测试增殖，评估了KRAS或pan-RAS降解对我们的可诱导大分子细胞系增殖的影响。在2D贴壁或3D球体分析（图6a–h）中，pan-RAS降解物均能抑制所有细胞系的增殖（ 包括未转化的具有野生型RAS的MRC5）。亲本iDAb RAS-GFP 2在2D粘附增殖试验中也观察到了这一现象（补充图 8a–h）。在2D贴壁和3D球体分析中，KRAS降解剂特异性降低了具有突变KRAS表达的细胞的增殖（图 6a–c），但没有改变具有突变NRAS或HRAS的癌细胞系的增殖（图 6d–f），也没有RAS WT细胞HCC827和MRC5的结构（图 6g，h）。这些数据与图5中在RAS信号传导途径上描述的KRAS降解剂的作用一致 。相反，亲本DARPin KRAS-GFP 2像pan-RAS iDAb-GFP 2和pan-RAS降解剂一样，降低了所有稳定细胞系的2D粘附增殖（图 6，补充图 8a– H），支持将DARPin KRAS工程化为KRAS特定的降级程序的好处。
评估pan-RAS和KRAS降解物对各种细胞系的2D粘附和3D球体增殖的影响。突变KRAS系a H358，b MIA PaCa2和c A549稳定细胞系。d，e突变NRAS行：d H1299和e HT1080。f突变的HRAS T24细胞系。g，h野生型RAS细胞系：g HCC827和hMRC5。请注意，MRC5细胞在3D低附着平板中不会像球体一样生长，因为作为未转化的细胞，它们需要锚定才能生长。将每个细胞系的所有增殖测定（2D和3D）均归一化为无Dox条件。虚线表示经DOX处理的细胞，而虚线表示无DOX条件。在每个实验一 - ^ h进行至少三次。在误差棒一个 - ħ是平均值±SD来自至少三个生物重复（Ñ = 3（一 - ç，克）和Ñ 在= 4（d - ˚F，ħ））。一个– h源数据作为源数据文件提供。
pan-RAS和KRAS降解物均通过诱导程序性细胞死亡来抑制H358细胞的增殖，这由裂解的PARP和裂解的caspase 3的细胞凋亡标志物的证据表明，从加入多西环素后的16-24小时开始，最高的反应为72 h（图 7a）。因此，我们评估了所有稳定细胞系中降解子表达72 h后诱导凋亡标志物的情况。仅在表达了pan-RAS降解物时，KRAS降解剂和pan-RAS诱导了H358和MIA PaCa2细胞系以及A549细胞中caspase 3和PARP的裂解（图 7b）。与阴性对照相比，其他细胞系几乎没有裂解的PARP或caspase 3（图 7b）， C）。这些结果表明，在KRAS降解剂通过在KRAS依赖性细胞（即H358和MIA PaCa2）诱导细胞凋亡阻断表达突变体KRAS细胞的增殖，而它在2D贴壁培养方法KRAS独立细胞（A549）没有52，53。
一个凋亡指标Western blot分析，即：在时间响应实验中，降解子在H358细胞中表达后诱导PPAR（cPARP）和caspase 3（cCASP3）裂解。b，c在强力霉素0.2 g.mL -1（+）处理或未诱导72h后，在本研究中测试的所有8种细胞系的2D贴壁培养物中表达降解剂后，对两种凋亡标记物进行Western blot分析（ -）。α-微管蛋白是负荷控制。两个箭头指示在17/19 kDa处切割的caspase 3片段。（a – c）中的每个实验进行了两次。a – c源数据作为源数据文件提供。
我们最终确定了降解剂在皮下异种移植小鼠模型中是否有效。从我们先前建立的H358和H1299稳定细胞系中，我们分离出pan-RAS / KRAS降解子的独特克隆，这些克隆还将表达萤火虫荧光素酶（FLuc）以在体内检测肿瘤。这些单独的克隆在体外通过蛋白质印迹和生长曲线表征。在H358中诱导pan-RAS和KRAS降解子的表达抑制了RAS下游信号传导途径（补充图 9a），并强烈阻碍了细胞的生长（补充图 9b）。仅pan-RAS降解剂对RAS信号通路和H1299细胞的细胞生长具有抑制作用（补充图 9a，c），但KRAS降解剂对H1299均无效（补充图 9a，c）。
通过在裸鼠中皮下注射细胞以建立异种移植模型来检查强力霉素诱导的细胞在体内的生长。尽管pan-RAS降解剂显着阻碍了H1299肿瘤的负担（补充图 9d），但KRAS降解剂几乎没有引起抑制作用（补充图 9e）。然而，仅在强力霉素治疗3天后，突变KRAS H358异种移植物中的pan-RAS和KRAS降解物的表达即可诱导肿瘤消退，而在治疗20天后，所有肿瘤均显着消退（图 8a–d）。为了分析H358异种移植物中的RAS下游信号传导，与未治疗的肿瘤相比，在对它们的肿瘤进行蛋白质印迹分析之前，将两只小鼠用强力霉素治疗48小时，因为用强力霉素治疗的肿瘤消退了，并且在治疗20天后无法切除。强力霉素处理48小时后，我们观察到H358 pan-RAS和KRAS降解物中MEK和ERK的磷酸化大大降低，同时其RAS靶标也被降解（图 8e，f）。相反，在治疗后20天的H1299肿瘤中，我们在表达pan-RAS降解子（补充图9f）而非KRAS降解子（补充图 9g）的肿瘤中检测到MEK和ERK激酶的磷酸化减少 。
将总共表达FLuc / iDAb RAS-UBOX或FLuc / VHL-DP KRAS的4.5×10 6 H358细胞皮下注射到CD-1裸鼠中。肿瘤达到3-4 mm的直径后，将动物分成5只小鼠的组，并在饮用水和食物中用或不用强力霉素（dox）治疗。一个肿瘤体积使用数字测径器测量并归一化至1以DOX治疗（第1天）开始的第一天，并监测20天为每个组（Ñ = 4只小鼠为没有DOX条件和Ñ = 5只小鼠为DOX条件，平均值为±SD）。b瀑布图代表±dox治疗20天后单个肿瘤的肿瘤体积变化百分比。肿瘤体积变化百分比计算如下：V final - V initial / V initial ×100。使用的色标与（a）相同。c，d在实验结束时（第20天）通过生物发光成像评估了H358-FLuc / iDAb RAS-UBOX（c）和H358-FLuc / VHL-DP KRAS（d）的肿瘤负担。在第20天，从n = 4和n量化每组的光子通量（即发光信号） 分别在no dox和dox条件下= 5只小鼠。e，f dox 治疗48小时后与未治疗的H358-FLuc / iDAb RAS-UBOX肿瘤（e）或H358-FLuc / VHL-DP KRAS切除肿瘤（f）的H358肿瘤裂解物的Western印迹分析在实验结束时（20天）取出H358小鼠肿瘤。（e，f）中的实验进行了一次。在各个泳道下方显示了归一化为未添加dox（无dox）的条件的pMEK / MEK和pERK / ERK信号的定量。黑色箭头指示对应于FLAG标签的VHL-DP KRAS蛋白的特定条带。a – f 源数据作为源数据文件提供。
总之，我们的体内和体外数据显示，即使KRAS降解剂同时消耗内源性KRAS WT和KRAS MUT，它也只能抑制表达突变型KRAS的癌细胞。
基于开发针对包含蛋白质家族的细胞内靶标的试剂的有效癌症治疗应理想地结合单个家族成员的特异性靶向。RAS家族是一个重要的例子，其中存在三种同工型，每种同工型都可以在各种肿瘤类型中发生突变。KRAS蛋白是人类癌症中最常见的突变同工型，主要是由于碱基变化引起的，单个氨基酸变化遍布整个蛋白，但在突变热点中2。因此，靶向突变体KRAS具有挑战性，因为存在不同的突变数，并且三种RAS同工型之间的序列同一性很高（超过80％）。但是，我们最近描述的KRAS特异性DARPins显示了通过结合在RAS 3的变构叶上来特异性靶向野生型和突变KRAS的可行性。加入弹头于细胞内抗体，诸如胱天蛋白酶原融合，以诱导细胞凋亡的54，55或FBOX蛋白以蛋白水解引起27，28提供了一种机制，通过该大分子可以转换为强效的macrodrugs。虽然已经描述了PROTAC小分子，但它们都是KRAS G12C由于化合物与蛋白质45的共价相互作用，它们没有降解内源性KRAS G12C。此外，亲和性定向蛋白导弹系统已显示出KRAS和HRAS 56的降解，但到目前为止，尚未发现同工型特异性RAS降解剂。
在这项研究中，我们通过工程化KRAS特异性DARPin作为与E3连接酶的融合蛋白来调用蛋白酶体靶向KRAS并随后降解，证明了一种推广至广义KRAS抑制剂的方法。我们用E3连接酶战斗部设计了KRAS特异的DARPin，并将其与设计的pan-RAS结合iDAb 46进行了比较。。我们发现，使用两种大型药物均可轻松实现RAS降解，但是特定的E3连接酶和E3连接酶在大型药物上的末端位置非常重要。有趣的是，VHL E3连接酶与KRAS结合DARPin和来自CHIP E3连接酶的pan-RAS iDAb的UBOX结构域最有效。两种降解物均允许多种细胞系（即来自肺，胰腺，膀胱和结缔组织）中内源性RAS蛋白的有效消耗，表明该策略的广泛适用性。此外，我们显示了KRAS降解子的高特异性，它仅消耗KRAS而不影响所有测试细胞系中的HRAS或NRAS蛋白水平。因此，RAS降解物的性质将使其成为研究细胞中RAS和KRAS生物学的有用工具。降解剂可能通过与目标RAS蛋白共降解或通过催化机制发挥功能。补充图 图5a显示，当添加蛋白酶体抑制剂时，所有iDAb和DARPins的蛋白质水平（不相关和相关）增加，表明这些外源蛋白质的周转取决于蛋白酶体机制。在短时间内（长达24/48小时，图 2c），降解剂对RAS降解的影响可能是催化性的，因为降解剂蛋白水平没有明显降低，但降解时间更长（> 48 h）蛋白质水平比阴性对照下降更多，表明共降解。如前所述，我们还观察到降解器技术可以修改效力和/或亲本粘合剂的选择性49，50，51如本研究中使用DP KRAS所述。我们表明，亲本DP KRAS影响RAS下游信号通路和测试的所有细胞系的增殖，表明对突变KRAS细胞没有特异性。这可能归因于其在多个水平上调节突变型和野生型KRAS的能力3。但是，一旦转化为KRAS降解物，它只能抑制突变的KRAS癌细胞，而pan-RAS降解物对任何RAS同种型突变蛋白（如亲本结合物iDAb RAS和DP KRAS）都没有特异性。
我们研究的重要发现是，KRAS 降解剂耗尽KRAS WT不会导致抑制RAS WT细胞（尤其是未转化的细胞）增殖。这些数据得到以前的研究的支持，该研究表明，无RAS小鼠胚胎成纤维细胞中仅表达一种RAS并不会抑制它们的增殖能力，而只有去除三种RAS同工型才能阻止这些工程化成纤维细胞的生长57。使用此处描述的pan-RAS降解物在多个细胞系中证实了这一结论，强烈暗示了RAS WT中三个RAS同工型之间存在补偿机制。可以通过其他同种型的表达克服一个（或两个）同种型表达的丧失。此外，我们的数据突出了我们的KRAS降解物在体内的功效，并且突变KRAS肿瘤迅速消退。因此，针对具有KRAS突变而不限于任何特定密码子变化的癌症，以KRAS为目标的降解是一种有吸引力的治疗策略。
我们的研究显示了泛KRAS特异性降解剂作为治疗剂的开发的概念证明，该降解剂可在任何具有KRAS突变的癌症中实施。目前，这些抑制剂与细胞内蛋白质（如KRAS）的直接治疗用途受到限制，但是已经为通过mRNA 58或其他传递策略59传递大分子做出了努力。
A549，H358，HCT116，HEK293T，HT1080，MIA PaCa2细胞在RPMI培养基（Life Technologies）中的DMEM培养基，H1299，HCC827，T24细胞和MEMα培养基（Life Technologies）中的MRC5中生长。所有细胞系均补充有10％胎牛血清（FBS）（Sigma）和1％青霉素/链霉素（Life Technologies）。细胞在37°C和5％CO 2下生长。这些细胞系是从ATCC（报告摘要中提供的目录编号）获得的，除了MRC5，T24和H1299（它们是牛津大学的Geoff Higgins教授的礼物，以及Milli PaCa2的Gillies McKenna教授的礼物）。细胞系的鉴定是通过克隆和测序每个系的K，N和HRAS cDNA来实现的。MIA PaCa2已通过短串联重复DNA分析服务（ATTC）进行了身份验证。测试所有细胞系以确认它们不含支原体。
将HEK293T细胞接种到6孔板中（每孔650,000个细胞），并用Lipofectamine 2000（Thermo-Fisher，另请参见下文“ BRET2方法”部分）转染2μg质粒DNA。将HCT116细胞接种在6孔板中（每孔650,000个细胞）。在蛋白质印迹分析之前，细胞在24 h后用2.5μg质粒，8.75μLLipofectamine LTX和2.5μgPLUS TM试剂（Thermo-Fisher）转染另外24 h。
将所有RAS cDNA（KRAS G12D，KRAS WT，NRAS Q61H和HRAS G12V -CAAX）克隆到pEF-RLuc8-MCS，pEF-GFP 2 -MCS或pEF-3xFLAG-MCS质粒中，将全长CRAF S257L克隆到将pEF-GFP 2 -MCS和DARPin克隆到pEF-MCS-GFP 2或pEF-MCS-mCherry质粒中。所有这些质粒的克隆细节别处描述3，12，60。
将全长VHL（氨基酸1–213）和UBOX域（来自CHIP E3连接酶的氨基酸128–303）克隆到pEF-GFP 2 -MCS的PmlI / XhoI位点或pEF的NotI / XbaI位点-MCS-GFP 2质粒取代GFP 2部分。使用XhoI / XbaI位点将接头，DARPins和iDAbs插入pEF-VHL-MCS和pEF-UBOX-MCS，或使用PmlI / NotI位点插入pEF-MCS-UBOX和pEF-MCS-VHL。通过聚合酶链反应（PCR）在DARPin降解载体的羧基末端或iDAb降解载体的氨基末端添加单个FLAG标签。
通过AgeI / NheI位点通过PCR将VHL-DP KRAS-FLAG，VHL-DP Ctl-FLAG，FLAG-iDAb RAS-UBOX和FLAG-iDAb Ctl-UBOX序列克隆到TLCV2慢病毒载体（Addgene质粒＃87360 61）中。这四个构建体的编码区DNA和蛋白质序列显示在补充附图中。 1E和2 - 4。
对于每种产生的病毒，每100毫米培养皿中接种4.5×10 6个 HEK293T细胞（每病毒产生7×100毫米培养皿）到9 mL完整DMEM中。二十四小时后，用12μg目的TLCV2构建体（即VHL-DP KRAS-FLAG，VHL-DP Ctl-FLAG，FLAG-iDAb RAS-UBOX和FLAG-iDAb Ctl-UBOX）转染细胞，8微克psPAX2、3微克pMD2.G（后者分别是慢病毒包装和包膜载体）和46微升Lipofectamine 2000（一个100毫米培养皿的量）。转染后48小时收集上清液，以640× g离心5分钟 ，过滤（0.45μm过滤器），并于4°C 以48,000× g离心2 h 。将来自7×100 mm皿的病毒重悬于250μLPBS中。
在6孔板中的1 mL含8μg.mL -1聚乙烯的培养基（Sigma，Cat＃107689）中，用适当的慢病毒将细胞转导48 h 。用嘌呤霉素（MP Biomedicals，目录号194539）选择转导的细胞。用于每个细胞系的选择嘌呤霉素的浓度分别为0.5μg.mL -1为A549和HCC827细胞系，0.75μg.mL -1为H358，MIA PaCa2和HT1080细胞系，0.8μg.mL -1对于H1299和MRC5细胞系，T24细胞系为1μg.mL - 1 。
强力霉素（Sigma，Cat＃D9891）用于诱导大分子E3-连接酶或大分子GFP 2融合体或TLCV2慢病毒载体的对照表达。通过向培养基中加入原液（100μg.mL -1）并在37°C下继续孵育来进行强力霉素的诱导。对于蛋白酶体抑制，以0.8μM的浓度使用环氧环素（Sigma，Cat＃E3652）持续18 h，然后进行蛋白质分析。
按照制造商的建议，使用Lipofectamine LTX 用pEF-FLuc 24转染表达VHL-DP KRAS和iDAb RAS-UBOX的H358和H1299细胞。转染48小时后，用1 mg.mL -1的G418（Sigma，Cat＃A1720）选择细胞，并挑选克隆并鉴定其特性。
将H358细胞以每孔0.8×10 6个细胞接种在6孔板中。24小时后，将细胞用或不用0.2μg.mL -1强力霉素处理24小时。每6孔在1mL TRIzol试剂（Life Technologies）中裂解细胞。按照制造商的规程，使用Direct-zol TM RNA miniprep（Zymo Research）提取总RNA 。用15μL无核酸酶的H 2洗脱RNA使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）在每种条件下从1.5μg总RNA合成O. cDNA。用400 nM引物进行RT-PCR，引物用12.5μLFast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）稀释，最终体积为25μL。在7500 Fast（Applied Biosystems）上按照以下协议进行RT-PCR实验：95°C持续20 s，95°C持续3 s的40个循环，60°C持续30 s。从两个独立的实验中进行qRT-PCR样品并一式两份进行分析。GAPDH用于标准化。本研究中使用的引物如下：
DUSP6对于：5ʹCTCGGATCACTGGAGCCAAAAC 3ʹ
DUSP6Rev：5分GTCACAGTGACTGAGCGGCTAA 3分
GAPDHFor：5ʹGTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3ʹ
GAPDHRev：5分ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 3分
对于所有BRET实验（滴定曲线和竞争测定），将650,000个HEK293T细胞接种在6孔板的每个孔中。在37°C下放置24小时后，使用Lipofectamine 2000转染试剂（Thermo-Fisher）用总计1.6μg的DNA混合物（含供体+受体±竞争质粒）转染细胞。24小时后，将细胞分离，用PBS洗涤，并接种在白色的96孔板（透明底部，PerkinElmer）中的OptiMEM无酚红培养基中，补充了4％FBS。在BRET分析读数之前，将细胞在37°C下再孵育20-24小时。在其他地方60提供了分步协议。
使用带发光模块的CLARIOstar仪器（BMG Labtech），将腔肠素400a底物（最终10μM）注入细胞（Cayman Chemicals）后，立即确定BRET2信号。
将细胞接种在白色96孔板（透明底部，PerkinElmer，目录号6005181）中以进行2D粘附增殖测定，或接种在超低附着96孔板（Corning，目录号7007）中以进行3D球体测定。优化所有细胞接种以在测定时间内维持线性生长。第二天，准备了10倍多西环素溶液（1–2μg.mL -1表示0.1–0.2μg.mL -1最终浓度）。在强力霉素存在下将细胞孵育6天。使用CellTiter-Glo（Promega，Cat＃G7572）每两天通过与细胞孵育15分钟来分析细胞活力。通过将强力霉素处理的细胞标准化为未处理的细胞来确定细胞活力。将超低附着板的细胞转移到白色的96孔板（Greiner，Cat＃655075）中，然后在CLARIOstar仪器上读取。
每个6孔板的每孔总共接种40,000个H358-FLuc（iDAb RAS-UBOX或VHL-DP KRAS）或50,000个H1299-FLuc（iDAb RAS-UBOX或VHL-DP KRAS）细胞（每个条件在重复）。24小时后，在每个孔中添加单独的培养基（-dox）或含有0.2μg.mL -1强力霉素（+ dox）的培养基。每两天用血球计数器和锥虫蓝对活细胞计数。
将HEK293T细胞用pEF-3xFLAG-KRAS WT或pEF-3xFLAG-KRAS G12D和pEF-DARPins-GFP 2质粒转染24小时。细胞用PBS洗涤一次并在免疫沉淀缓冲液（150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM MgCl 2中溶解），10％甘油和0.5％Triton X-100）补充了蛋白酶抑制剂（Sigma，Cat＃P8340）和磷酸酶抑制剂（Thermo-Fisher，Cat＃1862495），持续20分钟。将裂解液离心15分钟，然后将上清液与蛋白G磁珠（Life Technologies，Cat＃10004D）和抗FLAG抗体（Sigma，Cat＃F3165）孵育。将复合物在4°C旋转孵育4小时。珠子用IP缓冲液洗涤5次，然后用1x上样缓冲液洗脱结合的蛋白，然后在12.5％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上分离。
用PBS洗涤细胞一次，并在补充有蛋白酶抑制剂（Sigma）和磷酸酶抑制剂（Thermo-Fisher）的SDS-Tris缓冲液（STB：1％SDS，10mM Tris-HCl pH 7.4）中裂解。细胞裂解物用Branson Sonifier超声处理。
小鼠肿瘤在放射免疫沉淀测定缓冲液（150 mM NaCl，1.0％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，50 mM Tris，pH 8.0）中以200μL裂解缓冲液的比例溶解于10 mg的肿瘤，并用电分散器（T10 basic ULTRA-TURRAX，IKA）匀浆，直至组织液化。将裂解液在冰上孵育1小时，然后以16,100× g离心 在4℃下收集上清液。通过使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo-Fisher）确定细胞和肿瘤裂解液中的蛋白质浓度。在10或12.5％SDS-PAGE上分离出等量的蛋白质（20–50μg），然后转移到聚偏二氟乙烯膜上（GE Healthcare）。用10％TBS-0.1％Tween20中的10％脱脂牛奶（Sigma，Cat＃70166）或10％牛血清白蛋白（Sigma，Cat＃A9647）封闭膜，并在4°C下与一抗孵育过夜。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗在20°C下孵育1小时。用TBS-0.1％Tween清洗膜，并使用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）和CL-XPosure膜（Thermo-Fisher）或ChemiDoc XRS +成像系统（Bio-Rad）显影。
一抗包括抗磷酸化p44 / 22 MAPK（pERK1 / 2）（1/4000，CST，Cat＃9101S），抗p44 / 42 MAPK（总ERK1 / 2）（1/1000，CST，Cat＃9102S） ），抗磷酸-MEK1 / 2（1/2000，CST，Cat＃9154S），抗MEK1 / 2（1/500，CST，Cat＃4694S），抗磷酸-AKT S473（1/1000，CST ，Cat＃4058S），抗AKT（1/1000，CST，Cat＃9272S），抗pan-RAS（1/200，Millipore，Cat＃OP40），抗KRAS（1/100，圣克鲁斯生物技术， Cat＃sc-30），抗NRAS（1/100，圣克鲁斯生物技术，Cat＃sc-31和1/3000，Abcam，Cat＃ab77392），抗HRAS（1/500，Proteintech，Cat＃18295– 1-AP），抗切割的PARP（1/1000，CST，目录号＃9541），抗切割的caspase 3（1/500，CST，目录号9664），抗GFP（1/500，圣克鲁斯生物技术， Cat＃sc-9996），抗FLAG（1/2000，Sigma，Cat＃F3165），抗β-肌动蛋白（1/5000，Sigma，Cat＃A1978）和抗α微管蛋白（1/2000，Abcam，Cat ＃ab4074）。二抗包括抗小鼠IgG HRP连接（CST，目录号7706），抗兔IgG HRP连接（CST，目录号7074）和抗山羊IgG HRP连接（Santa Cruz Biotechnologies，目录2354）。
总共皮下注射4.5×10 6表达iDAb RAS-UBOX克隆B2或VHL-DP KRAS克隆F7的H358-FLuc或5×10 6表达iDAb RAS-UBOX克隆E1或VHL-DP KRAS克隆E5的H1299-FLuc进入5-7周大的雌性CD-1无胸腺裸鼠（查尔斯河）的左侧。注射后约18天，给小鼠喂食正常饮食和水，直到其皮下肿瘤直径达到3-4 mm（H1299细胞为2-3 mm）为止。将小鼠分成2组，每组5只小鼠（对于H1299-FLuc / VHL-DP KRAS，为3只小鼠），其中一组通过饮用水（2 mg.mL -1的20％黑加仑子）提供dox（Sigma）。果汁）和强力霉素饮食（200 mg.kg -1，特殊饮食服务）。注意在强力霉素治疗的第一天，通过腹膜内注射在无菌的0.9％NaCl水溶液中向小鼠注射100μL的4 mg.mL -1强力霉素。由于缺乏肿瘤发生，将没有注射强力霉素的H358-FLuc / VHL-DP KRAS，H358-FLuc / iDAb RAS-UBOX和H1299-FLuc / VHL-DP KRAS的对照组中的每只小鼠从分析中排除。皮下肿瘤生长通过每周用数字卡尺（Thermo-Fisher）测量3次并通过如下所述的生物发光来监测。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积=（L × W 2）/ 2，其中L和W分别指肿瘤的长度和宽度。根据内政部许可限制对动物进行扑杀。在人道牺牲之后，解剖小鼠以进行肿瘤取样。牛津大学伦理审查委员会批准了手稿中所述的研究方案。
注射荧光素酶底物D-荧光素后，使用IVIS Lumina成像系统（PerkinElmer）非侵入性地测量移植的皮下肿瘤的生物发光。所有的图像被的150μL的腹膜内注射后拍摄D（30 mg.mL原液-luciferin -1在DPBS，PerkinElmer）上对应于150 mg.kg -1体重D -luciferin。注射D-荧光素5分钟后获得BLI 。在图像获取过程中，通过吸入3％异氟烷连续给小鼠镇静。使用Living Image软件（PerkinElmer）进行图像分析和生物发光定量。
使用Image Lab（Biorad），Prism 8.0（GraphPad软件）或Living Image（PerkinElmer）进行定量。使用Prism 8.0（GraphPad软件）进行BRET滴定曲线和统计分析。数据通常以图例中指定的平均值±SD或SEM表示。使用不成对的两尾学生t检验进行统计分析。ns不显着，* P <0.05。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
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