突触复合物（SC）是减数分裂特异的核多蛋白复合物，对于同源染色体的正确突触，重组和分离必不可少。我们将结构照明显微镜（SIM）与不同的扩展显微镜（ExM）协议（包括U-ExM，proExM和蛋白质组学（MAP）的放大分析）相结合，以研究SC的分子组织。通过与未扩展的SC的单分子定位显微镜获得的结构数据进行比较，我们可以研究扩展的SC的超微结构保存。对于图像分析，我们开发了一种自动图像处理软件，该软件能够无偏比较膨胀前和膨胀后的结构特性。这里，MAP-SIM可提供最佳结果，并能够对精母细胞中整个染色体的SC进行可靠的三色超分辨率显微镜检查，其空间分辨率为20–30 nm。我们的数据表明，通过MAP-SIM进行扩增后标记可提高免疫标记效率，从而使我们能够揭示SC分子组织先前隐藏的细节。
成像技术是驱动生物学和医学科学几乎所有学科的基础研究的中心平台。但是，经典荧光显微镜的衍射障碍阻碍了获得有关蛋白质装配体及其相互关系的分子结构的高分辨率信息。到目前为止，只有电子显微镜（EM）技术提供了一种空间分辨率，可以研究多蛋白复合物1的分子组成和结构。超分辨率显微方法现在可以提供空间分辨率即远低于光学显微镜的接近几乎分子分辨率衍射极限2，3。感兴趣的细胞结构的物理扩展代表了绕过衍射极限并在标准荧光显微镜上实现超分辨率成像的另一种方法。为此目的，已经开发了扩展显微镜（ExM），并通过共聚焦激光扫描显微镜4成功地将其用于可视化具有约70 nm横向分辨率的细胞结构。
最初的ExM方案使用功能化的抗体-寡核苷酸结合物，该结合物与目标蛋白结合并在聚合过程中共价交联成可溶胀的水凝胶。在通过酶解蛋白降解天然蛋白质后，样品在水中4扩增约4.5倍。为了在聚合和蛋白酶消化替代EXM协议回避荧光团损失已被引入使蛋白质，RNA，和细菌中培养的细胞，神经元，和组织也与超分辨率显微镜组合的成像5，6，7，8，9，10，11。例如，蛋白质保留ExM（ProExM）6已经开发了蛋白质组（MAP）7的放大分析，并将蛋白质本身交联到聚合物基质中。通过加热和化学诱导的变性取代蛋白质消化，可以对化学嵌入的蛋白质进行扩展后免疫标记。为了进一步增加可实现的分辨率，膨胀因子已增加至20倍12，13。然而，如此高的膨胀系数显着降低了标记密度，因此也降低了可达到的结构分辨率，并且最终需要单分子敏感的成像方法来可视化这种极度稀释的荧光信号。此外，对于统一的三维（3D）扩展和超微结构细节（尤其是多蛋白复合物）的保存，仍存在一些疑问。最近，已经显示出各种扩展方案不能完全保留中心粒的3D分子结构。只有通过仔细优化扩展协议，U-ExM 14才能如实保存中心粒的超微结构细节。
最近，EXM与组合结构照明显微镜（SIM）已被用于研究的三维（3D）组织果蝇与〜30纳米的横向分辨率联会复合体（SC）的9，15。为了使膨胀后的样品尽可能靠近盖玻片，必须将其脱水，冷冻切片成10 µm切片，然后再次膨胀并固定在盖玻片上。最后，已经完成了具有油浸物镜和最小球差的SIM卡。此外，ExM已与二维单分子定位显微镜相结合，以阐明侧向分辨率为10–20 nm的核扩散中SC的鼠染色体轴的分子组织16。但是，由于〜3-4倍的扩展因子以及SIM提供的空间分辨率提高了2倍，目前，Ex-SIM代表了多种蛋白复合物（如SC）的3D多色超分辨率成像的首选方法。
在本研究中，我们测试了不同的ExM协议对通过SIM对哺乳动物的突触复合体（SCs）分子结构进行研究的适用性。用EM 17，18，19，20，21和单分子定位显微镜22关于SC蛋白质分布的可用数据，它非常适合用作评估不同ExM方案的各向同性扩展和结构保存的基准结构。我们为Ex-SIM开发了强大的核扩散工作流程，并开发了自动图像处理软件，以简化多色Ex-SIM的实施和完善的数据分析。发达的方法使我们能够揭示SC分子组织的新细节。
联会复合体（SC）的特定减数分裂多蛋白复合物，对于突触，重组和同源染色体的分离是必不可少的，导致在遗传上多样的单倍体配子的产生，进行有性繁殖的前提23，24。SC表现出进化上保守的梯状组织，该组织由两个侧向元素（与同源染色体的染色质相关联）和一个中央区域组成。在鼠标中，中央区域由在侧向元素之间延伸的中央元素以及连接侧向元素和中央元素的大量横向细丝形成（图 1）。）。早期EM 3D重建示出了带状的SC跨过跨越核一边转动一边环绕自身的轴线的横向单元（LE）17，18，19，20。在哺乳动物中，8种SC蛋白成分迄今已鉴定：横向元件的蛋白和SYCP2 SYCP3，横向丝和蛋白质SYCE1，SYCE2，SYCE3，TEX12，和中心元素的SIX6OS1的SYCP1 23，24。该SC蛋白的成复杂的分子结构的组件，在此紧密地与必要的减数分裂过程的协调，并且因此跨物种保守23，24。因此，需要SC蛋白的定位图来揭示SC分子结构在突触和重组中的功能，从而获得减数分裂的整体成功。
一个鼠标的表示两个横向元件包括SYCP2和SYCP3侧翼SYCE1 / 2/3，Tex12，和SIX6OS1构成的中心元素的三方SC结构（LES）的示意图。横向丝蛋白SYCP1将侧向元件和中央元件与位于中央元件32的侧向和N末端的SYCP1 C末端连接。b SC的螺旋结构的示意图，其中暴露了正视图部分和侧视图部分。横向元件（SYCP3，SYCP2）在蓝色，中心元件（SYCE3-SYCE1，SIX6OS1，和SYCE2-TEX12）在紫绿色，横向丝（SYCP1）按照一。各个横向细丝还标有星号。在侧视图部分中未显示横向元素，以暴露中心元素和横向细丝。
为了阐明SC的精确分子结构，需要由EM或超分辨率显微镜提供纳米级分辨率。使用d STORM的免疫标记和超分辨率显微镜，可以观察到SC的不同蛋白质在核扩散上的位置，横向分辨率约为20–30 nm。图像显示横向元素蛋白SYCP3显示出双峰分布，相距221.6±6.1 nm（SD）22。这个值是根据由EM平行取向的横向元件的两个带的中心之间测量的距离17，18，19，20。利用现有的SC蛋白分布数据，现在可以有效地评估不同ExM方案的结构保留和均匀扩展。
为了避免脱水和冷冻切片步骤，并通过SIM对扩展的SC进行超分辨率成像，我们首先优化了样品处理。因此，我们使用了小鼠精母细胞的核扩散，这是一种广泛用于研究核蛋白的技术，特别是在减数分裂领域。SC的直接扩散到盖玻片表面会导致蛋白质在膨胀后靠近盖玻片定位，因此避免了样品的脱水和冷冻切片，从而可以使用高数值孔径的物镜对水凝胶成像而无球差。此外，我们调整了水凝胶的成分，使我们能够将整个样品完全从玻璃表面分离并转移到水凝胶中。
我们首先使用三种不同的ExM方案对SYCP3，SYCP1的N末端（SYCP1N）和SYCE3进行免疫标记，分别标记为SC的侧向元素，横向细丝和中心元素在核扩散中的蛋白（图。 1）。为了自动，客观地分析荧光标记的SC蛋白的平均位置并从横截面轮廓确定双峰分布蛋白之间的距离，我们开发了“ Line Profiler”，这是一种自动图像处理软件25。Line Profiler使用几种图像处理算法来评估2D最大强度投影图像中的潜在关注区域。第一步，通过使用阈值和骨架化算法，将SYCE3通道中的所有结构缩小为一个像素宽度的线。对生成的像素坐标进行排序，并使用c样条拟合。这给出了SYCE3方向的分析描述，因此很好地近似了螺旋排列的SYCP3蛋白的中心（线坐标）和整体方向（2通道模式）（补充图 1）。注意，如果无法评估SYCE3通道（1通道模式）（补充图2），也可以仅使用SYCP3通道来确定方向 。
为了计算SC链之间的距离，我们对SYCP3通道应用了Floodfill算法，仅保留嵌入闭合形状中不等于零的区域。这使我们能够确定SC的螺旋结构在平面内的区域（股之间最大距离的区域）。这些区域之外的所有线坐标都将被丢弃。随后为垂直于c样条的导数的每个其余线坐标构造线轮廓。为了求平均，将线轮廓后对齐到其峰值之间的中心。当Line Profiler使用2D图像时，由于所拍摄的轮廓接近螺旋扭曲，因此偏向于低估了真实的峰峰值距离。因此，我们对所有轮廓的距离进行直方图绘制，并通过将曲线拟合到最高峰来确定更精确的值（有关更多详细信息，请参见方法）。我们比较了两个SYCP3链的未扩展和扩展SC的最大强度之间的距离，分别由d STORM和SIM分别用于不同的扩展协议（图 2）。为了评估扩展因子，我们使用1通道模式，因为SYCP3是未扩展SC 的参考d STORM实验中使用的唯一标签。用d STORM 成像的未扩增SC的SYCP3双峰蛋白分布导致平均链距为220.0±21.6 nm（SD），与我们先前的d STORM数据22一致（补充图 3）。
一个未膨胀SYCP3的SIM图像标记有Alexa氟568. b d标记有Alexa氟647未膨胀SYCP3的STORM图像Ç标记SeTau647扩展MAP-SIM SYCP3信号（最大强度投影）。d – f分别将a – c中的方框区域放大后的视图。图像表明，MAP-SIM 在成像平面中提供了与20-30 nm的d STORM 相似的标记密度和空间分辨率。比例尺，a – c 10 µm，d – f 3 µm。
我们测试了扩展前的标签协议proExM 6和两个扩展后的标签协议MAP 7和U-ExM 14。在所测试的三个ExM协议中，MAP优于其他协议，导致使用1通道模式分析SYCP3信号的横截面轮廓的平均峰峰距离为650.0±50.0 nm（SD）剖面图（补充图 2）。由d STORM从未扩展的SC 测得的双峰分布相距220.0 nm±21.6 nm（SD）（补充图 3），MAP协议显示，测得的SYCP3峰到峰距离增加了约3.0倍。U-ExM可以使用各种荧光团和三色SIM进行扩增后标记，但是扩增后的SC出现结构断裂，表明蛋白质不足以掺入凝胶基质（补充图 4）。SYCP3信号的横截面轮廓的平均峰峰距离为540±31.3 nm（SD），使用1通道模式方法显示，峰峰距离增加了〜2.5倍（补充图 5） 。在另一方面，提供proExM在峰-峰距离〜4.0的最大增加×通过使用1通道模式确定（补充图 5）4，6。
为了验证各向同性的扩增，我们使用了MAP协议，并研究了用SYCP3免疫标记的相同精子在核扩散中的扩增前和扩增后图像（补充图 6）。通过比较扩展前和扩展后的图像，我们确定了〜4.2x的宏观扩展因子（补充图 6k）。重叠的图像和相应的变换矩阵显示出由物理扩展过程引入的最小失真（补充图 7）。此外，我们的MAP-SIM数据表明，SC的分子结构已完全保留，表明各向同性膨胀（图 3）。）。例如，SYCP3信号显示出清晰的螺旋结构，两条链之间相隔667.0 nm±7.1 nm（SD）（图 3a–c）。
扩展后的SeTau647 的 SIM图像，标记为SYCP3作为侧向元素的组成部分（红色），横向细丝SYCP1 N末端标记为Alexa Fluor 488（绿色），中央元素的SYCE3标记为Alexa Fluor 568（品红色） 。b（a）中白色框区域的放大视图。ii。i中水平白色虚线的正交视图。iii（i）中垂直白色虚线的正交视图。c垂直于（b）中所示SC方向的横向强度分布。所选部分显示SYCP3信号的双峰分布，相距667.0 nm±7.1 nm（SD）。（b的SYCP1 N终点和SYCE3信号）显示单峰分布，FWHM分别为214.7±6.9 nm（SD）和258.3±4.8 nm（SD）。d大视野（100×100×30 µm 3）扩展的3D重新扫描共聚焦显微镜图像。SYCP3被SeTau647标记为扩增后。e（d）中方框图的放大图。（f）通过用SeTau647对SYCP3进行扩增后标记而可视化的精母细胞中整个染色体集合的SC的3D-MAP-SIM图像。入口在（f）中显示了框状区域的放大视图。比例尺，（a）10 µm，（b），i–iii 1 µm，（d）25 µm，（e）10 µm，（f）15 µm，（f），入口5 µm。
根据SCs的前后膨胀图像确定的〜4.2x的不同膨胀因子和根据横向元件SYCP3横截面轮廓的峰峰值距离的比较得出的〜3.0x 的不同膨胀因子（补充图6）。 MAP-SIM（补充图 2）和未扩展的d STORM图像（补充图 3）的信号看起来令人困惑，但可以通过标记和扩展协议的差异很好地解释。横向元件由200nm的分离，表现出37.1纳米的宽度和100nm的深度如先前通过在小鼠精母细胞EM实验确定（补充图 8）26，27。但是，通过用一级和二级IgG抗体免疫染色28，SC的两侧都变宽了。因此，在横向元件SYCP3的未扩展的d STORM图像中的峰到峰距离被确定为〜220nm（补充图 3）。我们推测，在SC的周缘的表位SYCP3主要标记，而所述表位的可接近性在SC的中心更限制可能是由于黏着复合物在这些位点的结合26，27。遵循proExM协议6对扩展后测得的SYCP3信号进行分析后发现分离距离约为870 nm（补充图 5e）。距离的增加对应于预期的〜4倍宏观膨胀，因为预膨胀引入的标签随凝胶膨胀因子而膨胀。
另一方面，MAP 7和U-ExM 14协议均使用SYCP3 的扩增后免疫标记。我们假设抗体也到达SC中心的表位，这些表位在未扩展状态下不可访问（补充图 8）。此外，一抗和二抗不会扩增，因此不会有助于横截面轮廓的扩大。另一个决定性的优势是，使用一抗和二抗进行扩增后标记可将取决于实际扩增因子的连接错误降低至仅几纳米29。扩展后的MAP减少的连锁错误和改善的表位可及性均导致更短的峰峰距离，该峰峰距离由650 nm的截面轮廓确定（补充图 2和 8）。
此外，不同的结果由MAP获得和U-EXM协议（图 2和补充图 4）出现在光我们最近的研究，以评估使用不同的扩展协议中心粒的结构保存令人惊讶14。对于中心粒，不适合使用MAP方案，因为与未扩增的样品相比，经MAP处理的中心粒显得更小。因此，已引入U-ExM作为MAP协议的一种变体，它使用了较弱的固定方式，从而实现了出色的各向同性扩展和中心粒超微结构的保存14。中心粒和SC之间的主要区别在于它们的生物分子组成。尽管中心粒仅由蛋白质组成，但SC由DNA和蛋白质之间的紧密结合组成，这可能会影响扩增效率和各向同性。使用MAP方案，蛋白质在高温胶凝后使用十二烷基硫酸钠（SDS）变性。除了变性，SDS还赋予它的负电荷的蛋白质30，31。由于DNA也带负电荷，因此交联的DNA和蛋白质会互相排斥。我们假设使用MAP协议，DNA和蛋白质之间的排斥作用促进了SC的各向同性扩展。
总体而言，具有优化凝胶组成的MAP-SIM可以实现各向同性的〜4.2倍扩增，蛋白质有效转移到水凝胶中以及SC的分子结构保护。在具有SIM的两倍分辨率增强组合，MAP-SIM提供类似的空间分辨率d STORM 22但除了由于后膨胀协议的改进的表位可访问的较高免疫标记效率和较小的链接错误14，29。因此，我们在以下所有实验中使用了优化的MAP-SIM方法（补充图 9）来研究SC分子结构的细节。
以前d STORM和免疫EM实验已经表明，SYCP1的C末端定位于横向元件和SYCP1的N末端在中心元件相互作用的内边缘22，32。这些研究结果是根据对2.7进行的最近STORM试验×扩展核铺开16。此处，SYCP1 N末端位于中心元件中，距离SYCP3标记的横向元件（LE）约110 nm，而SYCP1 C末端位于SYCP3的内侧25 nm，这对应于横向元件16的内边缘。此外，在d在STORM实验的正面图中，横向丝蛋白SYCP1和中心元素蛋白SYCE3的N末端单峰定位分布的宽度分别确定为39.8±1.1 nm（SD）和67.8±2.1 nm（SD）。 SC 22。SYCE3定位信号的分布范围更广，这表明SYCP1和SYCE3的相互作用可能不限于SYCP1的N末端。这与在SC的正视截面中测得的SYCP1N的MAP-SIM蛋白质分布扩展为160.2±1.1 nm（SD），而SYCE3的MAP-SIM蛋白质分布扩展为207.5±0.78 nm（SD）（补充图 2e）。
作为d STORM需要在有机染料的光控高效贫氧硫醇缓冲器，它目前仅限于双色实验，由此羰花青染料如Cy5的和Alexa Fluor 647是最适合的荧光团33，34。相比之下，MAP-SIM提供类似的分辨率，但无需优化光电转换缓冲条件即可同时进行多达三种颜色的成像。因此，仅可用激光线的数量限制了多色超分辨率显微镜实验。因此，我们在三重定位MAP-SIM实验中也用免疫标记了SC的结构特征（SYCP1，SYCE3和SYCP3的N末端），与之前的d STORM实验相同（图 3a–c）。MAP-SIM图像清楚地显示了SC分子结构的相似细节，这是未膨胀样品的单分子定位显微镜。另外，图像证实了SC的各向同性膨胀和分子结构的保留。有趣的是，SC与MAP结合的扩展使我们能够通过重新扫描共聚焦显微镜（RCM）35获得大型扩展样品的3D超分辨率图像，例如100×100×30 µm 3（200 nm z步长）（图。 3D，E）和80×80×15微米3（110纳米ž -steps）和由SIM较大，即与（图单染色体的详细的结构信息的精母细胞整套染色体的SCS的成像。 3f）。
SC侧视图的MAP-SIM图像揭示了横向丝蛋白质SYCP1的拓扑结构，该结构垂直于横向元素蛋白质SYCP3和中心元素蛋白质SYCE3。d STORM和免疫EM图像显示SYCP1和SYCE3的N末端的在SC的侧视图区段的双峰分布21，22。EM断层揭露在昆虫中央元件的多层组织36，37。另一方面，基于EM层析成像的鼠类SC的3D模型最近显示，SC中心区域没有分层组织。相反，视觉和数学分析均指向中心元素蛋白的非结构化组织27。
因此，我们接下来通过核扩散的MAP-SIM更详细地分析横丝蛋白SYCP1的N末端的信号分布。除了分析蛋白质在正面的分布外，我们还从侧面生成了SC蛋白的谱线图（图 4a–c，补充图 10和补充电影 1）。与EM协议断层数据38中，MAP-SIM的信号分布成像SYCP1 N末端和SYCE3指示所述中心区域的蛋白质的比以前所描述的双峰分布复杂得多分布d STORM和免疫金EM 21，22。SYCE3和SYCP1N的平均横截面强度分布图（图 4e，f）清楚地显示了两种蛋白质的单峰分布（图 4d和补充图 10），这与横丝成大单个的非结构化组织有关EM层析成像在先前的研究中揭示的层27。另一方面，在SYCP3信号的MAP-SIM图像的某些侧视图中，横向细丝蛋白SYCP1和中心元素蛋白SYCE3的N末端显示出双峰和多峰信号分布，支持中心元素的多层组织（图 4g和补充图 10）。在MAP-SIM扩展SC的某些侧视图部分中偶尔披露的多峰分布可归因于MAP提供的高标记密度。结合SIM的后处理超分辨率，MAP-SIM可以解析单个SYCP1阳性横向细丝，这反映在检测到的多峰分布中（补充图 10）。
分别用Alexa Fluor 568（洋红色）标记的SYCE3，用Alexa Fluor 488标记的SYCP1N（绿色）和用SeTau647（红色）标记的SYCP3 的 MAP-SIM图像。SC的侧面剖视图可视为SYCP3信号中的扭曲（由白色虚线框标记，并在（a）的入口中仅显示SYCP3通道的箭头中指示）。b在（白盒装区域的放大视图一个。Ç，ê，˚F）放大视图高亮区域中（b）表示红色，（SYCP3信号Ç），在绿色（在SYCP1N信号ë）和品红色SYCE3信号（f），并选择了两个用于蛋白质分布分析的位点（1、2）。d在（a）指定的区域用白色虚线框分析的沿SYCE3（品红色）和SYCP1N（绿色）信号的所有截面强度轮廓的平均轮廓，显示SYCP1N和SYCP1N 的单峰信号分布为168.0±1.1 nm（SD） SYCE3的211.43±0.89 nm来自单高斯拟合。g SC的侧视图部分1和2的横截面强度曲线（用e和f表示）显示了中心元素蛋白质SYCE3（品红色）和SYCP1的N末端（绿色）的多峰组织。比例尺，（a）10 µm，（b）3 µm，（c，e，f）1 µm。
中心元素平均为26 x 38 nm，并且在小鼠中包含至少七个蛋白质。在传统的免疫荧光和免疫EM制剂，抗体-抗体-荧光团和抗体-抗体-金配合本地化的20-25纳米围绕中心抗原的半径38，39，40，41。在第一复合物结合到它们各自的表位之后，在中央元件的核心处的游离表位可能难以接近。使用MAP-SIM，由于在扩展后标记之前多蛋白复合物的初始物理扩增，提高了表位的可及性。所产生的更高的贴标密度，特别是在中心元件的核心，并结合了扩展后贴标减少的连接误差29提供了中心元素分子组织的更细粒度分辨率。因此，MAP-SIM公开了有关SC分子组织的新信息，特别是中央元素蛋白并非明确组织为不同的层，而是形成了由横丝蛋白SYCP1和中央元素蛋白SYCE3组成的复杂网络。作为其他中心元素蛋白与最近的电子断层扫描结果相符27。
侧向元素的一个惊人的形态特征是光学分裂之前无法通过光学显微镜观察到的，它们偶尔会分裂成两个或多个亚侧向元素（subLEs）。叙布莱的变化已经在物种间观察到从动物到植物酵母各种EM制剂（组织切片，整个安装制剂，铺张）17，42，43，44，45，46，47，48。再次，MAP-SIM的连续信号分布使我们能够弥合光学显微镜和EM之间的现有差距，并解决了小鼠粗粗精细胞中两条SYCP3链的分裂（图 5）。，补充图。 11和12，以及补充电影 2）。精母细胞含有40条染色体，它们沿着突触复合体突触为同源染色体的二价突触，以便重组。因此，完全突触的二价跨越核空间，两对端粒位于核包膜的远侧。在XY对中，突触仅限于假常染色体区域，因此不完整。在常染色体中，MAP-SIM在SC的侧视图部分和SYCP3链末端分别（但不排他地）分解了每个SYCP3链（即LE）的加倍（图 5，补充图11和图11）。 12和补充电影 2）。
随着前期I的进行，SYCP3链末端的磨损程度增加。在我们的实验中，我们观察到了SYCP3末端在前中期分叉处和分叉后在早期的早中期/早早期克隆瘤中分裂成多条链（图 5，补充图 11和12和补充影片 2）。这些观察结果与小鼠传播中subLEs的EM发现一致[ 45]。在这里，已经提出了通过与两个姐妹染色单体相互作用而排列成两个紧凑的subLEs的横向元件的多链组织44。在小鼠SC的银染散布的EM图像中，两个轴在不成对的区域出现了双链或多链子链，并具有较高的subLE频率48。使用MAP-SIM，我们首次通过光学显微镜解决了将轴磨损成SYCP3阳性原纤维的报道。按照常染色体的叙布莱，养护也是的磨损XY轴是哺乳动物共同49，50。
在上丘脑中期，同源物沿SC完全突触。在这里，经常观察到横向元素加倍，并且可能与同系物的两个姐妹染色单体的缔合有关。在二倍体瘤中，突触开始并且SC逐渐分解。在此阶段，侧向元素似乎分散到单个SYCP3原纤维中。在XY对的未配对区域中也观察到强烈的磨损。2014年，Syrjänen等人。解析了人类SYCP3 51的晶体结构。他们表明，四聚体蛋白的长度约为20 nm，并以反平行排列的方式组织，从而在任一端暴露其N端DNA结合位点。结合到DNA片段上，SYCP3自组装成高阶纤维，类似于体外的侧向元件。基于在EM中观察到的侧向元素加倍，我们推测SYCP3可能在每个姐妹染色单体中组装成一个subLE，以防止姐妹染色单体之间的重组，同时保持染色质的凝聚力51。SC链断裂的分辨率是分子细节程度的一个示例，可以使用MAP-SIM整体解决分子细节程度，从而发现细胞生物学的新研究领域。我们的数据表明，通过使用SIM结合各向同性的结构扩展，可以使用标准的免疫荧光技术，在使用高数值孔径水浸显微镜物镜的轴向深度高达〜60 µm的普通样品制备中，揭示SC的超微结构细节。
超分辨率显微镜技术，如d STORM和Palm已经启用了新的见解EM蛋白质如何在细胞和多蛋白复合物是有组织的，具有空间分辨率几乎接近水平2，3。尽管如此，多蛋白复合物分子结构的分子结构细节仍然只能通过EM方法获得。超分辨率显微镜方法的这种缺陷通常归因于结构分辨率不足，而最终由标记密度控制。我们的结果表明，扩展后标记协议可减少链接错误。此外，SC长丝的多个连续的标记观察到后膨胀标记建议更高的表位可访问性导致改进的标记密度的特别空间要求的IgG抗体的多蛋白复合14，29。因此，MAP-SIM提供了增强的超微结构分辨率，如此处所示，它是一种重要的与DNA相关的多蛋白复合物。
根据德国动物福利法（德国农业，卫生与经济合作部）提供的准则进行动物护理和实验。动物舍舍，繁殖和实验规程已获维尔茨堡市监管机构批准（1992年5月6日批准的参考号821-8760.00-10 / 90；根据德国动物福利法第11/1 o.1条）请遵循严格的准则，以确保对小鼠进行仔细，一致和符合道德的处理。
丙烯酰胺（AA，40％，A4058，Sigma），丙烯酰基-X，SE，6-（（丙烯酰基）氨基）己酸，琥珀酰亚胺酯（A20770，ThermoFisher），琼脂糖（A9539，Sigma），过硫酸铵（APS，A3678 ，Sigma），牛血清白蛋白（BSA，A2153，Sigma），二甲基亚砜（DMSO，D12345，ThermoFisher），乙醇（绝对值，≥99.8％，32205，Sigma），乙二胺四乙酸（EDTA，E1644，Sigma），甲醛（ FA，36.5–38％，F8775，Sigma），盐酸胍（HCl盐酸，50933，Sigma），葡萄糖（G8270，Sigma），葡萄糖氧化酶（Sigma），β-巯基乙胺（MEA，M9768，Sigma），N，N '-亚甲基双丙烯酰胺（BIS，2％，M1533，Sigma），N，N，N '，N'N'-四甲基乙二胺（TEMED，T7024，Sigma公司），正常山羊血清（50197Z，赛默飞世），PBS（P5493，Sigma公司），聚D赖氨酸hydropromide（P6407，Sigma）的，聚氧乙烯（20）脱水山梨醇单月桂酸溶液（Tween-20的，10％，93774，Sigma），氢氧化钾（P1767，Sigma），蛋白酶K（P4850，Sigma），丙烯酸钠（SA，97–99％，408220，Sigma），氯化钠（NaCl，S7653，Sigma）十二烷基硫酸钠（SDS，L3771，Sigma），Tris碱（T6066，Sigma），Triton X-100 Surfact-Amps洗涤剂溶液（10％（w / v），28313，ThermoFisher），Tween-20 Surfact-Amps洗涤剂溶液（Tween-20，28320，Sigma）。
使用CO 2杀死野生型C57.6J / Bl6小鼠，然后进行颈脱位。切除睾丸，并在解囊后将曲细精管抽出并浸入PBS中。接着，如de Boer等人所述，进行核扩散。52。简而言之，将生精小管转移至低渗缓冲液中，孵育60分钟。将各个生精小管转移至载玻片上的无菌蔗糖溶液中，用镊子打碎，并通过用10 µl移液器重悬冲洗细胞。同时，将聚赖氨酸玻片浸入1％甲醛中，在MAP和U-ExM方案的情况下（用MAP的30％AA，PBS中的4％FA，对于MAP的1％AA，PBS中的0.7％FA）浸入丙烯酰胺中。 U-ExM）。将蔗糖中的20 µl睾丸细胞转移至在玻片角上收集的一滴甲醛溶液中，并均匀地铺在整个玻片上。将载玻片在湿室中孵育2小时，然后在半开的湿室中干燥过夜。为了确保易于处理，将核分散在圆形的18毫米盖玻片上（编号1.5H）。
豚鼠和兔子抗SYCP1（N末端氨基酸1-124）53，豚鼠抗SYCP3（N末端氨基酸27-38氨基酸）54和兔抗SYCE3（全长蛋白质）55通过用相应的肽免疫宿主并通过亲和力纯化，在使用前通过Seqlab产生cDNA。兔抗SYCP3（NB300-232；针对C末端）购自Novus Biologicals，小鼠抗SYCP3（ab97672；全长蛋白）购自Abcam。Al647山羊抗豚鼠IgG（H + L），高度交叉吸收（A-21450）Invitrogen（ThermoFisher）；从ThermoFisher购买了高度交叉吸附的山羊抗兔IgG（H + L）Alexa Fluor 568（A-11036）；从Dianova（106-546-003）购买Alexa 488缀合的AffiPure F（ab'）2山羊抗豚鼠IgG（H + L）。将SeTau647 NHS（K9-4149； SETA Biomedicals）与山羊抗小鼠IgG（SA-10225; ThermoFisher）的F（ab'）2偶联。F（ab'）2山羊抗兔IgG（H + L）交叉吸附的Alexa Fluor 647（A-21246）和F（ab'）2山羊抗小鼠IgG（H + L）交叉吸附的Alexa Fluor 488 （A-11017）从ThermoFisher购买。补充表 图1总结了用于不同实验的免疫标记。
具有固定的核扩散的盖玻片用PBS洗涤。非特异性表位在10％正常山羊血清（NGS）中封闭1小时。室温下在潮湿的房间中，将核扩散面朝下在100 µl一抗上孵育1小时。然后将铺展物用PBS洗涤，并在10％NGS中封闭30分钟，然后在室温下于湿度箱中与二抗孵育30分钟。对于多色实验，从小鼠体内产生的抗体开始依次进行免疫染色。
凝胶接头处理：为了使酰胺基交联到聚合物水凝胶网络中，将样品在新制备的PBS中的胺反应性AcX溶液（0.1 mg / ml）中孵育。因此，将等份保存在-20°C的干燥AcX储备液（10 mg / ml）重悬于10 µl无水DMSO中，并在PBS（1x）中以1：100稀释。然后将每个盖玻片用1 ml AcX溶液覆盖样品，并在室温下于加湿室中孵育过夜。
凝胶形成，消化和膨胀：在盖有石蜡膜的细胞培养板盖上进行水凝胶形成。将板置于冰上以提供冷却且平坦的疏水性凝胶化表面。从proExM单体储备液中制备80μl预冷（4°C）胶凝溶液（8.55％SA，2.5％AA，0.15％Bis-AA，0.2％APS，0.2％TEMED，11.7％NaCl，1x PBS）由丙烯酸共聚物和交联剂（8.55％SA，2.5％AA，0.15％Bis-AA，11.7％NaCl，1x PBS）的混合物组成的溶液，在使用前先补充有自由基聚合引发剂APS和促进剂TEMED。将凝胶溶液置于石蜡膜上，将盖玻片置于形成的液滴的顶部，使铺展的细胞朝下。在冰上孵育5分钟后，在37°C的湿润室内进行交联聚合1.5 h。然后在消化缓冲液（50 mM Tris pH（8.0），1 mM EDTA，0.5％Triton X-100、0.8 M盐酸胍）中用8 U / ml蛋白酶K处理样品。为了使样品膨胀，将水凝胶在双去离子水中洗涤几次，直到达到凝胶的最大溶胀程度。
凝胶接头处理：对于MAP和U-ExM扩增的样品，将铺展液在AA / FA溶液中孵育（对于MAP，30％AA，PBS中4％FA，对于U-，1％AA，PBS中0.7％FA） ExM）在加湿室中于37°C下放置4小时，然后进行样品胶凝。
凝胶形成，变性和扩增：在AA / FA温育后，将样品在PBS（1x）中洗涤3次，每次5分钟。然后使用优化的MAP凝胶溶液（7％SA，20％AA，0.05％Bis-AA，0.5％APS，0.5％TEMED，1×PBS）或U-如'蛋白质保留方案'所述进行水凝胶聚合ExM凝胶溶液（19％SA，10％AA，0.1％BIS-AA，0.5％APS，0.5％TEMED，1x PBS）。与原始配方相比，MAP单体溶液的组成发生了变化7关于单体与交联剂的比率。聚合后，将水凝胶小心地从盖玻片上取下，然后直接转移到1.5 ml离心管中的预热（95°C）变性缓冲液（200 mM SDS，200 mM NaCl，50 mM Tris，pH 9.0）中。然后将样品在带有封闭管盖的加热块培养箱中变性1小时。为了使样品溶胀，将水凝胶用过量的双去离子水洗涤，将其交换几次直至达到最大膨胀水平。
对于MAP和U-ExM处理的样品，在扩增后进行免疫染色。将完全膨胀的凝胶在封闭缓冲液（PBS中的0.15％BSA）中孵育两次，每次30分钟。凝胶在该封闭步骤中收缩。然后，在每个抗体温育步骤之后，将一级抗体依次在加湿室中于37°C孵育3 h，并在封闭缓冲液中进行两个20分钟的洗涤步骤。接下来，在加湿室中在37°C下同时添加二级抗体混合物3 h。然后将样品用洗涤缓冲液（PBS中的0.1％Tween-20）洗涤两次，每次30分钟，再过夜。然后将样品在双去离子水中洗涤，并膨胀回最大水凝胶体积。
盖玻片的聚赖氨酸涂层：将24毫米圆形盖玻片（1.5。H）在双去离子水，1 M KOH和无水乙醇（≥99.8％）中分别超声处理15分钟。每个超声处理步骤之后，将玻璃用双去离子水冲洗。超声处理后，将玻璃最终在烤箱中于100°C干燥。然后用0.1％聚D-赖氨酸覆盖盖玻片，并在室温下孵育1小时。接下来，将玻璃再次用水洗涤并风干，并保存在密闭的玻璃容器中以避免粉尘污染。涂布的盖玻片在4°C下保存，使用时间长达1周。
防护玻璃的荧光标记处理：直接引入水凝胶的荧光珠在聚合过程中由于过硫酸根自由基引起强烈的荧光损失。因此，我们直接在盖玻片上涂上荧光标记以进行通道对齐。因此，将荧光标记储备悬浮液（0.1 µm，〜1.8 ×10 11个颗粒/ ml，TetraSpeck微球体，ThermoFisher）涡旋约1分钟，然后在PBS（1x）中以1：1000稀释并再次涡旋。在室温下用悬浮液覆盖玻璃杯30分钟，以使荧光标记物沉降下来。然后将盖玻片用双去离子水洗涤，风干，然后用于用琼脂糖固定水凝胶。
琼脂糖包埋：使用剃须刀将膨胀后的样品切成约1.5×1.5 cm的块，并用实验室擦拭布小心地从凝胶中除去过量的水。然后将凝胶转移到聚赖氨酸包被的盖玻片上。为了进一步避免样品在长期成像过程中发生漂移，将采集凝胶另外包埋在水中的1％（w / v）琼脂糖中。因此，将第二个未涂覆的圆形18毫米盖玻片放在切好的水凝胶的顶部，并用移液管小心地将融化的琼脂糖（约40°C）涂在水凝胶的侧面。注意避免琼脂糖在水凝胶下方流动。随后将琼脂糖凝胶在4°C下硬化约10分钟，并小心地除去上盖玻片。然后将双去离子水加到水凝胶上，以防止在成像过程中脱水。
使用Zeis Elyra S.1 SIM成像系统（由反Axio观察者组成）执行结构照明显微镜（SIM）成像。配备C-APOCHROMAT×63（NA 1.2）水浸物镜的Z1显微镜和四个不同的激发激光器（405 nm二极管，488 nm OPSL，561 nm OPSL和642 nm二极管激光器）。扩展后的样品的三维SIM成像记录在PCO边缘sCMOS（科学互补金属氧化物半导体）相机上，0.110 µm z-步由插入的Z-Piezo平台调整。对于每个获取的通道，网格图案的三个旋转投影在图像平面上。在使用较低波长的荧光团之前先对红色荧光团成像，以最大程度地减少光漂白。使用Zeiss ZEN软件（黑色版本）处理原始数据图像。将安装在盖玻片上，位于样品成像区域正下方的荧光珠设置为最低成像平面，并与每个3D z堆栈的样品一起记录。对于对齐和SIM处理，裁剪出包含荧光标记的图像，并用于对齐每个记录的z中的通道-通过Zeiss Zen软件通道对齐工具进行堆栈。在尼康TiE倒置显微镜结合RCM单元（Confocal.nl）上进行重新扫描共聚焦显微镜（RCM）成像。从图像扫描原理，由此像素再分配进行纯粹optomechanically RCM导出35，56。该单元连接到Cobolt Skyra（Cobolt，HübnerGroup）激光单元，提供四个激发激光线（405、488、561和640 nm）。使用60倍水浸物镜（CFI Plan APO，1.27-NA；尼康）和固定的50 µm针孔尺寸，在sCMOS相机（Zyla 4.2P，Andor）上记录图像。该设置由显微镜软件NIS-Elements（4.6版）操作。d如先前所述，在自制的宽视野成像装置上进行未膨胀样品的STORM采集20。该设置由配备有油浸物镜（APON 60XOTIRF，NA 1.49，Olympus）的倒置IX71显微镜（奥林巴斯）组成。为了激发Alexa Fluor 647，在准TIRF模式下使用了639 nm OPS激光二极管（Genesis MX639-1000 STM； Coherent）。为了避免采集过程中的漂移，在显微镜中安装了鼻架（IX2-NPS，Olympus）。鼻架将显微镜的物镜与样品架和盖玻片机械连接。荧光被收集到电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）相机（iXon Ultra 897，安道尔）上。作为光交换缓冲液，使用补充有0.1 g / ml葡萄糖和0.5 mg / ml葡萄糖氧化酶的PBS（pH 7.4）中的100 mMβ-巯基乙胺作为氧气清除剂系统。对于图像重建，可以使用ImageJ插件ThunderSTORM 57 被使用了。
使用“线轮廓仪”的SC截面轮廓：SYCE3或SYCP3输入图像与高斯模糊卷积在一起，以补偿噪声和强度波动。通过Otsu阈值处理，图像被转换为二进制图像58。使用Lee的算法，构建骨架化图像，将所有展开的形状缩小为1像素宽度的线59。随后，对所有不等于零的连接像素进行排序并检查其连续性，即尖锐的边缘标记了开始新行的断点。然后，将每条线的像素坐标拟合为c样条曲线。c样条曲线坐标和局部导数可以很好地估计SYCP3通道螺旋结构的中心和方向。请注意，也可以通过确定质心（“ 1通道”模式）来估算SYCP3通道的方向和中心。将中心元素的样条曲线拟合与SYCP3链上使用的泛洪算法相结合，可以产生潜在的目标区域。在线坐标和泛洪图像上使用逻辑与运算可得出所需的源坐标和方向，以进行进一步评估。然后从垂直于c样条曲线导数的源坐标构造线轮廓。我们丢弃了400-1200 nm以外的所有距离，以排除不希望的结构，如两条彼此靠近的线束。由于Line Profiler使用2D图像，因此偏向于低估了接近螺旋扭曲的真实峰峰值距离。
SYCE3和SYCP1N的蛋白质分布：为了确定SYCE3的分布，从SYCP3链显示螺旋交叉的区域中手动选择SYCE3信号区域。这些区域可被视为SYCE3和SYCP1N蛋白的正视图，并用于横截面分析（图4）。
为了证明数据评估是可靠的，我们模拟了螺旋结构，并使用Line Profile对其进行了分析。螺旋结构的最大强度投影可以用公式y 1,2 =± a cos（bx）很好地描述，振幅为a，伸长率为b。如可在SYCP3的未膨胀和膨胀图像中可以看出，绞合线的距离与所述螺旋结构从外侧改变为正视图（图补充减少 1 - 3）。为确保此事实不会导致更小的峰到峰距离，我们模拟了a = 800 nm和b = 1/1612 nm 的螺旋结构-1并使用32.24 nm的像素大小对其进行渲染。然后用Line Profiler评估螺旋结构。所确定的800±5.0 nm的链距证明了我们的评估不受减小的链距的影响（补充图 13）。
横截面轮廓的平均值：使用数据分析软件Origin（Pro）2016版对所得的横截面轮廓进行平均。
扩张因子测定和扩张各向同性分析：为了比较扩张前和扩张后的图像，将在18 mm盖玻片上扩散的精母细胞用抗SYCP3的一抗和二抗Alexa Fluor 488偶联的抗体标记为扩张。以约10×10 mm 2的正方形扫描盖玻片的中心区域使用×10的空中目标 将重叠的RCM图像图块与样本的大概图对齐，并用作展开后查找相同单元的图。使用×60的水浸物镜记录了多个单元的预扩展RCM图像z堆栈。为了确定扩增因子，在根据MAP方案处理细胞后，在扩增后记录相同的细胞，并用SeTau647缀合的二抗IgG抗体对SYCP3进行扩增后标记。然后，使用开放源代码命令行程序elastix使用刚性配准对相应的扩展前和扩展后图像进行配准，如文献5所述。。调查所造成的膨胀过程的变形，前和后膨胀图像的变形矢量场使用的Elastix创建和transformix 60，61。
MAP-SIM数据的3D 可视化：使用显微镜图像分析软件IMARIS（版本8.4.1，Bitplane）可视化补充电影1和补充电影 2中显示的3D-MAP-SIM数据 。
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