CRISPR-Cas9已经成为一项强大的技术，该技术依靠Cas9 / sgRNA核糖核蛋白复合物（RNP）来靶向和编辑DNA。但是，由于缺乏可以全身递送RNP的载体，目前尚无法获得许多治疗靶标。在这里，我们报告了一种可推广的方法，该方法允许对修饰的脂质纳米颗粒进行工程改造，以将RNP有效地传递到细胞中，并编辑包括肌肉，大脑，肝脏和肺在内的组织。静脉注射有助于小鼠肺中六个基因的组织特异性，多重编辑。尽管容易敲除多个基因，但利用高载体效力可在小鼠的肝和肺中创建器官特异性癌症模型。所开发的载体还能够递送RNP以恢复DMD小鼠中的肌营养不良蛋白表达并显着降低C57BL / 6小鼠中的血清PCSK9水平。这种普遍适用的策略的应用将促进针对适合蛋白质递送和精确基因校正方法的多种疾病靶标的广泛的纳米粒子发展。
群集规则间隔开的短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（CRISPR-Cas9）核酸酶系统已经成为各种生物医学应用的强大的基因组编辑工具1，2，3，4，5，6，7，8，9。单向导RNA（sgRNA）识别特定的靶基因组位点，并指导Cas9核酸酶切割识别的DNA序列。通过非同源末端连接修复诱导的双链断裂，以产生用于基因修饰的插入或缺失（称为Indel）或同源性定向修复。在各种策略1，10，11，12，13，14，Cas9 /因组的RNP的递送是一个有吸引力的方法，因为它是用于CRISPR-CAS基因编辑的最直接和快速的方法，并且已显示具有较少的脱靶效应和更低的免疫原性10，15，16，17，18，19，20，21。
尽管有明显的希望，但由于Cas9的体积大，sgRNA的高度负电荷以及难以保护RNP在整个制剂和输送过程中降解或变性的问题，对于非病毒载体，RNP的输送仍是最具挑战性的方法。迄今为止，几种非病毒纳米载体已经报道了在体外RNP递送到细胞中，包括DNA nanoclews 22，阳离子脂质的纳米颗粒和脂质体复合物23，24，25，基于金的纳米颗粒26，27，28，和沸石咪唑骨架29。大多数方法利用主客体相互作用和静电相互作用，通常在纳米颗粒形成后吸附RNP。其结果是，难以控制尺寸，均匀性，和所得到的制剂，其在体内应用到本地施用，具有有限的稳定性如内耳23，25，肌肉26，脑30，31，和肿瘤28。目前，用于将RNP系统递送至靶器官的稳定纳米颗粒的开发仍然难以实现。
基于对这些问题的基本理解，我们开发了一种通用化的工程方法，该方法经过合理设计，可以通过在已建立的可电离脂质纳米颗粒（LNP）配方中包含永久性阳离子脂质来保持RNP完整性（图1a）。 ）。我们显示，补充脂质成分介导具有保留活性的RNPs封装，并将DNA编辑重定向至目标组织，包括低剂量静脉内（IV）注射后的肺和肝。我们进一步证明，该方法适用于三类不同的LNP，包括树状聚合物脂质纳米颗粒（DLNP），稳定的核酸脂质颗粒（SNALPs）和类脂质纳米颗粒（LLNP）。这导致了能够快速编辑不同组织中细胞DNA的修饰脂质纳米颗粒的开发。高DLNP效能可在小鼠的肝脏和肺部轻松创建器官特异性癌症模型。修饰的DLNP还可递送RNP来恢复DMD小鼠中的肌营养不良蛋白表达，并显着降低C57BL / 6小鼠的血清PCSK9水平。总的来说，
一个永久阳离子补充成分（例如，DOTAP）到传统的LNP制剂的过程中加入纳米粒子形成使用中性缓冲液启用封装和Cas9 /因组复合物的保护。精确调节DOTAP百分比介导的组织特异性基因编辑。b在PBS缓冲液（pH 7.4）和柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0）中制备的Cas9 / sgLuc RNP的大小分布。尺寸增加可能是由于变性。c在PBS和柠檬酸盐缓冲液中制备的封装有Cas9 / sgLuc RNP的5A2-DOT-10的大小分布。不用RNP制备的5A2-DOT-10用作对照。d Cas9 / sgLuc摩尔比为1 / 1、1 / 3和1/5的Cas9 / sgRNA RNP的大小分布。Ë封装Cas9 / sgLuc的5A2-DOT-10的尺寸分布，摩尔比为1 / 1、1 / 3和1/5。f Cas9 / sgRNA RNP的Zeta电位显示电荷降低。数据表示为平均值±sem（n = 3个生物学独立的样本）。g对于不同摩尔比的5A2-DOT-10封装Cas9 / sgLuc，zeta电位没有显着差异。数据表示为平均值±sem（n = 3个生物学独立的样本）。h封装EGFP融合的Cas9 / sgRNA的5A2-DOT-10 LNP随时间的细胞摄取，显示出胞质释放并逐渐进入细胞核（n = 3个生物学独立的样本）。比例尺：10μm。红色箭头表示EGFP融合的Cas9 / sgRNA在细胞内的分布。我使用特异性内吞作用抑制剂5A2-DOT-10 LNP摄取的抑制进行了研究。阿米洛利（AMI）：巨胞饮抑制剂；氯丙嗪（CMZ）：网格蛋白介导的内吞作用抑制剂；Genistein（GEN）：染料小窝介导的胞吞作用的抑制剂；甲基-β-环糊精（MβCD）：脂质筏介导的胞吞作用；4度：能量介导的内吞作用。数据表示为平均值±sem（n = 3个生物学独立的样本）。源数据在源数据文件中。
我们开发出一种将RNP加载并稳定到纳米颗粒中的通用策略的核心是认识到，通常用于配制各种基于脂质和聚合物的纳米颗粒的既定稀释方法（例如乙醇/酸性缓冲液）与RNP的传递不协调。我们观察到，Cas9 RNP在酸性缓冲液中变性，导致流体动力学尺寸从10 nm增加到150 nm（图 1b）。如果不是不可能的话，这会使RNP难以包封到单分散纳米颗粒中。在这里，我们专注于脂质纳米颗粒（的LNPs），因为它们是最有效的类RNA递送载体1，32，33，34在临床前模型和人类中35。在LNP的四个组成部分中[可离子化的阳离子脂质，两性离子磷脂，胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质]]，pKa约为6.4的可电离的阳离子脂质对活性至关重要，因为它们在pH为pH的条件下结合带负电荷的RNA。混合（例如当胺被质子化时的pH值为4），在细胞摄取前在中性pH处失去电荷，然后随着内体pH降低而与内体膜融合并再次释放货物至细胞质，从而再次获得电荷。但是，此关键特征阻止了在中性pH下货物的有效封装，因为可电离的阳离子脂质在中性pH下不带电荷。为了克服这一挑战，我们假设需要补充添加阳离子脂质，该脂质在中性pH下会带正电荷， 1a）。
为了评估此策略，我们选择5A2-SC8作为可离子化的阳离子脂质，因为5A2-SC8 LNP安全地将短小干扰RNA（siRNA）/ microRNA（miRNA）和长mRNA递送给肝功能受损的小鼠，包括MYC驱动的肝癌36，37，38或延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）的遗传敲除39。令人兴奋的是，向传统的4组分5A2-SC8 LNP配方中引入永久性阳离子脂质（例如1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷（DOTAP））确实允许通过混合乙醇的乙醇溶液进行受控的自组装。用RNP的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（1/3，v / v）清除脂质。我们评估了总脂质的5至60摩尔％掺入的DOTAP（补充图 1和20），这揭示了体外10–20％的基因编辑水平更高，并且形成了尺寸小于200 nm的稳定的RNP负载纳米颗粒。 （补充图 2）。最初使用靶向报告基因荧光素酶（sgLuc）的sgRNA，我们观察到掺入10摩尔％DOTAP的LNP的大小称为5A2-DOT-10（5A2-SC8 / DOPE / Chol / DMG-PEG / DOTAP = 15/15/30 /使用PBS缓冲液制备的3/7（mol / mol））比没有RNP负载的纳米颗粒稍大。使用低pH缓冲液制备的相同LNP不会改变大小，这表明RNP没有被封装（图 1c）。为了确定Cas9蛋白与sgRNA之间的最佳摩尔比，我们制备了分别为1 / 1、1 / 3和1/5（mol / mol）的Cas9 / sgRNA复合物，从而减小了RNP的大小（图1d）。 （图 1f）。令人鼓舞的是，在封装后，RNP的比例不会改变所得LNP的大小或Zeta电位（图 1e，g）。所有LNP的表面电荷均为中性，这不仅表明封装成功，而且对于最大程度地减少免疫单核吞噬细胞系统（MPS）系统的体内摄取也很重要。为了进一步检查5A2-DOT-10是否可以成功介导RNP传递到细胞核中，我们用封装的荧光EGFP融合Cas9蛋白追踪了LNP。单独的游离RNP无法进入细胞，因为在背景以上没有绿色荧光被检测到（补充图 3）。惊人地，在5A2-DOT-10处理3小时后，在细胞质中观察到亮绿色的荧光。然后观察到EGFP融合的Cas9蛋白在6小时内逐渐进入细胞核（图 1h）），因为Cas9上存在核定位信号。内吞作用是能量依赖性的，并且主要依赖于脂质筏，因为基于脂质筏的内吞作用的抑制剂MβCD的治疗显着抑制了纳米颗粒的细胞摄取（图 1i）。
为了量化基因编辑功效，我们使用了HeLa-Luc和HeLa-GFP报告基因细胞。检查不同的Cas9 / sgLuc比率，基因编辑在1/3和1/5处比在1/1处更高（图 2a）。T7核酸内切酶I（T7EI）分析的结果表明，大多数目标DNA条带（720 bp）均以1/3和1/5的比例被切成两个切割带（536 bp和184 bp）。对照治疗组未观察到切割带。因此，对于所有后续研究，我们将Cas9 / sgRNA的摩尔比固定为1/3。为了检验我们的假设，即需要中性pH缓冲液来封装RNP并保持Cas9功能，我们还评估了使用pH 4柠檬酸盐缓冲液制备的5A2-DOT-10的基因编辑效率。没有观察到分裂带（图 2a））。Sanger测序进一步证实了这一结果，提供了其他证据，表明传统的基于酸的配制方法无法产生有效的NP。切换到表达GFP的细胞，将Cas9 / sgGFP诱导的Indels封装到GFP DNA中的5A2-DOT-10几乎敲除了所有GFP的表达。对照组显示与PBS处理的细胞相似的荧光强度（图 2b），这通过流式细胞仪确认（图 2c和补充图 4）。通过在生长的细胞中至少5天无限丢失GFP，可以永久地进行基因编辑（图 2d和补充图 5a））。着眼于最终的临床翻译，我们在4°C下监测了加载RNP的5A2-DOT-10的稳定性2个月。LNP大小不变，保持一致（PDI <0.2）（图 2e和补充图 5b）。连续测试5A2-DOT-10纳米颗粒显示了恒定的基因编辑活性，即使在储存60天后也是如此（图 2f）。这些结果对于将来的临床翻译很有希望。
从用各种制剂处理的HeLa-Luc细胞中分离的DNA 的 T7EI裂解测定。高效基因编辑是由5A2-DOT-10介导的Cas9 / sgLuc RNP（1/3和1/5）介导的。红色箭头表示切割带。通过Sanger测序和TIDE分析定量Luc位点的插入缺失（％）。该实验独立地重复了三遍，结果相似。b用各种制剂（n = 3个生物学独立的样品）处理后的HeLa-GFP细胞的荧光显微镜图像。比例尺= 100μm。5A2-DOT-10 Cas9 / sgGFP处理显着降低了GFP荧光。C用各种制剂处理后的HeLa-GFP细胞的流式细胞仪分析。对于5A2-DOT-10 Cas9 / sgGFP组，GFP阳性细胞的峰完全向左移动，表明几乎所有GFP阳性细胞都变黑了。d各种处理后HeLa-GFP细胞的时间依赖性GFP荧光强度（平均值±sem，n = 3个生物学独立的样品）。Sanger测序和TIDE分析支持5A2-DOT-10 Cas9 / sgGFP处理，观察到永久性GFP荧光丢失。将 5A2-DOT-10 Cas9 / sgGFP LNP在4°C下保存2个月。随时间监测纳米颗粒直径和PDI（平均值±sem，n = 4个生物学独立的样品）。F用储存的LNP定期处理HeLa-GFP细胞显示没有活性损失，表明LNP和RNP具有长期稳定性（平均值±sem，n = 3个生物学独立的样品）。g单独用Cas9 / sgGFP，5A2-DOT-10，C12-200-DOT-10，MC3-DOT-10，C12-200 LNP，MC3 LNP和Cas9处理后的HeLa-GFP细胞的平均荧光强度（％） / sgGFP加载的RNAiMAX（平均值±sem，n = 3个生物学独立的样品）。用所有三种DOTAP修饰的制剂处理后，GFP荧光显着降低。对Sanger测序数据的TIDE分析进一步证实，最高的基因编辑效率是5A2-DOT-10 LNP。H用Cas9 / sgGFP配制的5A2-DOT-10在不同缓冲液中处理后，Hela-GFP细胞的平均荧光强度（％）。RNP封装和递送需要中性缓冲液（平均值±sem，n = 3个生物学独立的样品）。使用单向方差分析和邓内特的多重比较检验确定g和h的显着性。（* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001）。源数据在源数据文件中。
向经典的4组分LNP中添加永久阳离子脂质以实现有效RNP递送的策略不限于基于树枝状聚合物的可电离脂质5A2-SC8。为了证明这一点，我们将补充DOTAP包括在使用其他类型的可电离材料制备的纳米制剂中：在FDA批准的Onpattro 35中使用的众所周知的DLin-MC3-DMA脂质和C12-200脂质（补充图 6a，b）。尽管与5A2-SC8相比它们具有非常不同的化学结构（补充图 6c），所有DOTAP修饰的纳米粒子都可以有效地编辑细胞，而先前建立的没有DOTAP的C12-200或MC3制剂显示出低编辑效率（图 2g和补充）图 6d）。5A2-DOT-10的编辑效率也比阳性对照RNAiMAX高。由于5A2-DOT-10 LNP比MC3-DOT-10和C12-200-DOT-10更有效，因此我们使用5A2-SC8进行了所有后续实验。除了DOTAP，我们还将其他阳离子脂质（包括DDAB和EPC）引入了LNP配方中（补充图 6e–g）。具有不同化学结构的所有三种阳离子脂质的结果相似（补充图 6h））。这些结果表明，该策略适用于可电离的阳离子脂质纳米颗粒（DLNP，LLNP，SNALP）和其他在pH 7.4带正电的阳离子脂质。由于我们的方法允许调整FDA批准的Onpattro制剂以实现RNP的递送，因此该方法为临床上可翻译的人类疾病治疗提供了新的方向。
RNP成功递送的关键是用PBS缓冲液代替标准的酸性缓冲液以维持蛋白质的稳定性。为了测试我们的方法是否与其他中性缓冲液兼容，我们在PBS，Opti-MEM培养基和HEPES中配制了LNP。在柠檬酸盐缓冲液（pH 4）中制备的制剂用作对照（补充图 6i）。使用在所有三种中性缓冲液条件下制备的LNP均可实现显着且等效的基因编辑，而在酸性缓冲液中则无法实现（图 2h和补充图 6j）。Sanger测序结果与流式细胞仪显示的结果一致（补充图 6k）。该结果进一步证实中性缓冲液对于RNP递送至关重要。
为了检查体内基因编辑，我们将包裹Cas9 / sgTOM复合物的5A2-DOT-10交付给Td-Tomato小鼠（Ai9小鼠）模型（图 3a）。经过基因工程改造的Ai9小鼠带有三个重复的终止盒（SV40 polyA序列），可阻止tdTomato荧光蛋白的表达。CRISPR介导的两个重复盒的缺失足以激活下游tdTom表达31。这使得可以容易地确定成功的基因编辑细胞。我们通过肌肉注射以1 mg kg -1 sgTOM的剂量向小鼠的左腿注射了装载有Cas9 / sgTOM RNP的5A2-DOT-10 LNP。由于以前通过局部注射进行基因编辑使用23，将与Cas9 / sgTOM RNP复合的RNAiMAX用于比较。在用5A2-DOT-10处理的肌肉中观察到比用RNAiMAX处理的小鼠更高的Td-Tom荧光（图 3b）。组织切片的成像进一步证实了基因编辑在5A2-DOT-10治疗组中产生更亮的红色荧光（图 3c）。接下来，我们将5A2-DOT-10注射到Td-Tom小鼠的大脑中（0.15 mg kg -1 sgTOM）。再次在注射部位附近观察到亮红色信号，确认编辑了小鼠的大脑（图 3d，e）。我们设想了将来用于中枢神经系统疾病纠正的实用工具。
一示意图示出了如何递送Cas9 / sgTOM的RNP激活TD-汤姆在TD-番茄的转基因小鼠表达的。将5A2-DOT-X LNP局部（通过肌肉内或脑内注射）和全身性（通过尾静脉静脉注射）注射到Td-Tom小鼠中。肌肉内（1 mg kg -1 sgTOM）（b）或脑内（0.15 mg kg -1 sgTOM）（d）注射5A2-DOT-10 Cas9 / sgTOM 后对Td-Tom小鼠的体内成像腿部肌肉或大脑组织中的红色荧光（分别）。通过对c肌肉和e的共聚焦成像进一步证实了成功的CRISPR-Cas基因编辑脑组织切片。比例尺：20μm。5A2-DOT-10与以前用于局部RNP注射的阳性对照RNAiMAX相比，具有更高的基因编辑效率。f静脉内（IV）注射具有不同摩尔百分比的DOTAP的5A2-DOT-X Cas9 / sgTOM LNP后，Td-Tom小鼠的体内成像。Td-Tom荧光作为DNA编辑的下游读数，表明低DOTAP百分比有助于肝脏编辑，而高DOTAP百分比则有助于肺编辑（1.5 mg kg -1 sgTOM，IV）。克成功CRISPR-CAS基因编辑物通过共焦成像进一步证实。比例尺：20μm。H在用5A2-DOT-5、5A2-DOT-10、5A2-DOT-50和5A2-DOT-60封装Cas9 / sgPTEN进行全身IV处理后，对从肝脏和肺组织分离的DNA进行T7EI裂解测定。红色箭头表示产生的切割带。使用从收获的组织分离的DNA的下一代测序（NGS）计算插入缺失（％）。我 5A2-DOT-50的LNPs含有汇集sgRNAs为6个目标（sgTOM，sgP53，sgPTEN，sgEml4，sgALK，和sgRB1）（5A2-DOT-50-池）中以2总RNA剂量施用到TD-汤姆小鼠IV mg kg -1（每个sgRNA 0.33 mg kg -1）。通过体内成像和j证实了TOM位点的基因编辑使用T7EI分析在肺组织上确认了其他五个基因座的编辑。使用Sanger测序和TIDE分析测量插入缺失百分比。红色箭头表示产生的切割带。的数据Ç，ê，克，ħ，和Ĵ具有类似的结果重复独立地三次。
接下来，我们评估了5A2-DOT-10改善的稳定性和功效是否可以介导组织中成功的系统基因编辑。与本报告同时，我们探索了多种其他的第五种脂质，并制定了用于器官特异性mRNA表达40的完整方法。我们发现，对补充分子的摩尔百分率和化学特性进行系统的调节，可以精确调节靶细胞中组织的生物分布和mRNA的释放。在此最新进展的基础上，我们制备了具有不同摩尔百分比的DOTAP（5-60％）的LNP，并将RNP递送至Td-Tom小鼠IV（1.5 mg kg -1sgTOM）。令人兴奋的是，在注射5A2-DOT-5后7天，仅在肝脏中观察到Td-Tom荧光。将掺入的DOTAP百分比从5％增加到60％会导致从肝脏到肺部逐渐出现荧光（CRISPR引导的基因编辑）。5A2-DOT-60主要实现了肺部编辑（图 3f和补充图 7）。这些结果表明，可以通过调节内部脂质组分的化学性质和摩尔比，以组织特异性的方式实现深层组织编辑。通过对组织切片进行共聚焦成像进一步证实了组织特异性编辑（图 3g）。接下来，我们研究了内源性靶标PTEN的编辑通过将封装Cas9 / sgPTEN RNP的LNP系统注射到野生型C57BL / 6小鼠中。仅在5A2-DOT-5处理的小鼠的肝脏中和在肺中对于5A2-DOT-50和5A2-DOT-60处理的小鼠中检测到清楚的T7EI切割带（图 3h和补充图 20）。对从小鼠肝脏和肺中分离的DNA进行的下一代深度测序（NGS）进一步证实了高基因编辑功效（图 3h）。此外，我们利用了Cas-OFFinder预测网络工具来确定排名前10位的sgPTEN脱靶位点。然后，我们从5A2-DOT-50 Cas9 / sgPTEN RNPs处理过的肺中扩增了这十个潜在的脱靶位点，并使用T7EI分析测量了CRISPR-Cas编辑。在这些偏离目标的位置中均未观察到偏离目标的切割（补充图 8和20）。
为了评估是否有可能在体内编辑多个基因，我们将Cas9蛋白和6种不同的sgRNA封装到5A2-DOT-50中。将sgTOM，sgP53，sgPTEN，sgEml4，sgALK和sgRB1加载到Cas9蛋白中。然后，我们通过尾静脉注射（0.33 mg kg -1的每个sgRNA）用5A2-DOT-50（游泳池）治疗Td-Tom小鼠。1周后，在肺中检测到明亮的Td-Tom荧光，表明TOM的基因编辑（图 3i）。在低剂量（0.33 mg kg -1）下，在所有其他五个基因组位点均观察到清晰的T7EI裂解带，表明5A2-DOT-50 LNP能够有效编辑肺中的多个基因（图 3j和补充图 20）。sgRNA）。我们注意到，此处使用与第一和最后三个核苷酸的末端修饰sgRNAs以增强因组的稳定性和再现性（补充图 9）13，41。报道显示，与别的核苷酸的精确的修饰可以在体内基因增加编辑二维相比末端改性sgRNAs四倍13，42，这表明编辑效率本文报道的可以是具有进一步优化因组更高。然而，5A2-DOT-50的高效力和组织特异性允许一次注射在肺中进行多重编辑。
传统上，动物模型是通过转基因或基因工程在胚胎干细胞中生成的，这既耗时又昂贵。使用CRISPR-Cas对成年小鼠中的肿瘤及其他疾病相关基因进行直接突变为快速生成模型提供了一种可行的方法。此只被使用必须设计为每个目标和通过高压注射进入肝脏昂贵慢病毒完成5，8。由于通常需要多个基因的突变来产生功能性癌症模型，因此非常需要开发一种廉价且有效的基于非病毒纳米粒子的多路复用方法。由于5A2-DOT-X LNP具有强大的功能，可以同时编辑多个靶标，可以重复施用，并提供组织特异性，因此它们为生成各种动物模型提供了引人注目的途径。
为了证明这一点，我们使用了5A2-DOT-5在肝脏中选择性敲除了三个抑癌基因（P53，PTEN和RB1）。这些基因已在包括肝脏在内的许多人类癌症中得到鉴定。我们通过每周静脉内注射2.5 mg kg -1总sgRNA来治疗C57BL / 6小鼠，持续3周，并检测了小鼠肝脏中的基因编辑效率（图 4a）。我们通过T7EI测定的2个处理，12，15，和20周（图之后在所有三个基因座观察到的清楚的切割条带 图4b和补充图 10，11，20）。随着时间的流逝，切割带更加明亮，表明肿瘤的生长。当我们在15周和20周处死小鼠时，我们在肝脏上发现了可见的肿瘤，在腹腔中发现了一些转移性肿瘤（图 4b和补充图 12）。我们还通过H＆E染色和IHC染色在不同时间点靶向肿瘤增殖生物标志物Ki67检测了肿瘤的产生（图 4d和补充图 13）。
一个要创建原位肝特异性癌模型，5A2-DOT-5的LNPs包封Cas9 / sgP53 / sgPTEN / sgRB1的RNP注射到成年C57BL / 6小鼠每周（三次注射，2.5毫克千克-1总因组，IV，n = 4）。在第12、15和20周后，处死小鼠并收集肝脏以分析肿瘤的产生。b从肝脏提取的基因组DNA进行的T7EI切割结果证实，基因编辑发生在所有三个基因座上。红色箭头表示切割带。凝胶图像下显示的插入缺失百分比是通过Sanger测序和TIDE分析测量的。c注射后20周切除含有肿瘤的小鼠肝脏的代表性照片。dH＆E和Ki67染色进一步证实了进行性肿瘤形成。在肿瘤病变中检测到更高的肿瘤增殖生物标志物Ki67表达。比例尺= 100μm。e为了建立原位肺特异性癌症模型，将封装Cas9 / sgEml4 / sgAlk RNP的5A2-DOT-50 LNP一次（2 mg kg -1）或两次（每周1.5 mg kg -1）注入成年C57BL / 6小鼠2周）（IV，n = 5）。10、16和24周后，处死小鼠并收集肺以分析肿瘤的产生。f从肺部提取的基因组DNA进行的T7EI切割结果证实了基因编辑发生在Eml4和Alk位点。红色箭头表示切割带。凝胶图像下显示的插入缺失百分比是通过Sanger测序和TIDE分析测量的。在用5A2-DOT-50 LNP处理过的所有肺中也检测到了Eml4-Alk重排的g PCR扩增子。h Eml4-Alk重排通过亚克隆和DNA测序进一步证实。我 H＆E和Ki67染色进一步证实渐进肿瘤形成。在肺肿瘤病变中检测到更高的肿瘤增殖生物标志物Ki67表达。比例尺= 100μm。的数据b，d，˚F，克，并且我用类似的结果独立地重复三次。
以产生一个具有挑战性的肺癌小鼠模型中，我们侧重于EML4-ALK染色体重排（补充图 14），这是一个复杂的突变在许多实体人类肿瘤，特别是非小细胞肺癌的癌症中发现8，43。在Eml4和Alk之间重排后产生的Eml4-Alk融合蛋白促进癌症的发展。利用5A2-DOT-50的高效力和肺靶向特异性，我们每周注射一次（总sgRNA 的2 mg kg -1剂量）或两次（每周总sgRNA 的1.5 mg kg -1剂量）静脉注射并评估了肿瘤的产生过程（图 4e）。在所有检查的时间点，从两组小鼠提取的肺DNA中均可检测到Indel产生（图 4f和补充图 15和20）。更重要的是，在经5A2-DOT-50处理的小鼠的肺中检测到了清晰的基因重排带，证实了成功产生的染色体重排（图 4g和补充图 15和20）。这些PCR扩增子的亚克隆后的测序结果进一步证实了Eml4-Alk重排（图 4h和补充图 15）。通过H＆E染色和Ki67染色，我们在16周和24周后在肺部观察到了一些肿瘤病变（图。 4i和补充图。 16和17）。这些结果表明，单次注射5A2-DOT-50 LNP可以成功产生染色体重排并导致成年小鼠发生肺部肿瘤。因此，这些LNP定位为极大地加速各种疾病模型的原位创建。
除了展示5A2-DOT-X LNP在创建动物模型中的效用外，我们接下来的目标是研究治疗干预的潜力。为了证明疾病治疗，我们在两个治疗性小鼠模型中评估了5A2-DOT-X。首先，我们利用了DMD外显子44缺失小鼠模型（ΔEx44DMD小鼠），该模型最近被证明可概括杜氏肌营养不良症（DMD）44。外显子44的缺失导致外显子43和45的剪接，破坏了肌营养不良蛋白的开放阅读框并引入了过早的终止密码子。可以通过使用CRISPR-Cas9基因编辑来跳过或重组外显子45来恢复阅读框，从而允许在外显子43和46之间进行剪接并恢复功能性肌营养不良蛋白的表达44。为此，我们每周向ΔEx44DMD小鼠的胫前肌（TA）注射5A2-DOT-10 LNP，将Cas9 / sgDMD RNP封装入胫骨前肌（3次注射，1 mg kg -1 sgRNA），并检测抗肌营养蛋白在TA肌肉中的表达3最后一次注射后数周（图 5a）。抗肌营养不良蛋白在TA肌肉中的表达在用封装Cas9 / sgDMD RNP的5A2-DOT-10 LNPs处理后得以成功恢复，通过免疫荧光法（图5b）和蛋白质印迹分析（图 5c和补充图 20）证明 。蛋白质印迹结果的定量分析表明，恢复了4.2％的肌营养不良蛋白。
a为了恢复抗肌萎缩蛋白的表达，每周将封装Cas9 / sgDMD RNP的5A2-DOT-10 LNPs注射到DMD外显子44缺失小鼠的TA肌肉中（3次注射，1 mg kg -1 sgDMD，n = 3）。最后一次注射后三周，收集TA肌肉以检测肌营养不良蛋白的表达。b免疫荧光图像表明5A2-DOT-10 LNPs治疗成功纠正了肌营养不良蛋白基因并恢复了肌营养不良蛋白在TA肌肉中的表达。仅5A2-DOT-10 LNPs纳米颗粒处理用作阴性对照（NC）。比例尺= 100μm。数据独立重复两次，结果相似。C蛋白质印迹分析进一步证实了抗肌萎缩蛋白蛋白在封装Cas9 / sgDMD RNPs治疗组的5A2-DOT-10 LNPs中的表达。恢复了4.2％的肌营养不良蛋白。NC：仅5A2-DOT-10 LNPs纳米颗粒；野生型野生型。d为了敲除小鼠肝脏中的PCSK9基因，每周通过尾静脉注射对成年C57BL / 6小鼠施用封装Cas9 / sgPCSK9 RNP的5A2-DOT-5 LNP（三剂，2.5 mg kg -1 sgPCSK9，IV，n = 3 ）。最后一次注射后一周，收集小鼠血清和肝脏进行分析。Ë使用PCSK9 Elisa试剂盒检测到，在包裹Cas9 / sgPCSK9 RNP的5A2-DOT-5 LNP中，血清中相对PCSK9水平显着降低。数据表示为平均值±sem（n = 3个生物学独立的动物）。使用单向方差分析和邓内特的多重比较检验确定数据的重要性。（* P <0.05）。f从小鼠肝脏提取的基因组DNA进行的T7EI切割结果证实，基因编辑发生在PCSK9基因座上。红色箭头表示切割带。凝胶图像下显示的插入缺失百分比通过Sanger测序和TIDE分析进行测量。源数据在源数据文件中。
最近，人们越来越有兴趣使用基因编辑来敲除与心血管疾病有关的基因，将其作为对慢性和致命疾病的潜在长期治疗方法45。在这些中，PCSK9基因是最有吸引力的药物靶标用于治疗高胆固醇血症一个46，47。为此，我们通过尾静脉注射（3次注射，2.5 mg kg -1 sgRNA）向C57BL / 6小鼠注射了封装Cas9 / sgPCSK9 RNP的5A2-DOT-5 LNP，并定量了小鼠血清和肝组织中PCSK9的水平（图。 5D）。静脉内注射封装有Cas9 / sgPCSK9 RNP的5A2-DOT-5 LNP会显着降低两种血清中PCSK9的蛋白水平（图 5e））和肝组织（补充图 18和20）。T7EI分析结果进一步证实了封装Cas9 / sgPCSK9 RNPs治疗组的5A2-DOT-5 LNPs中PCSK9基因位点的插入缺失生成。（图 5f和补充图 20）。这些结果表明5A2-DOT-X LNP具有治疗疾病的治疗潜力。
本文所述的模块化策略为通过RNP的全身递送进行组织特异性基因编辑提供了一种通用方法。我们发现将永久性阳离子脂质掺入经典LNP配方中有助于使用中性缓冲液封装Cas9 RNP，从而保护和保留Cas9功能。通过调节分子成分和比例，我们在全身注射后在小鼠的肝脏和肺部选择性地实现了组织特异性基因编辑。令人兴奋的是，靶向肺的5A2-DOT-50 LNP显示出高编辑效率。5A2-DOT LNP靶向多个基因并原位创建复杂动物模型的能力在蛋白质功能发现，生物学机制探索和疾病治疗等方面具有广泛的应用，特别是因为可以通过对任何年龄的标准小鼠进行简单的IV注射来完成。5A2-DOT LNP可以有效地将其他蛋白质（例如卵清蛋白）递送到细胞质中（补充图。 19），表明其对于靶向免疫疗法或蛋白质替代的其他类型的蛋白质递送具有重要意义。通用方法也可以应用于其他递送系统，包括FDA批准的DLin-MC3-DMA SNALP，从而进一步建立潜在的翻译平台。所描述的模块化RNP递送策略将指导针对各种临床前和临床载体的组织特异性基因组工程的合理设计。我们目前正在探索这项技术，以对各种遗传疾病进行精确的基因校正。
通过以下公开的方案合成和纯化5A2-SC8 36和C12-200 48。DLin-MC3-DMA 49从MedKoo Biosciences购买。1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE），1,2-二油酰基--3-三甲基铵丙烷（DOTAP），二甲基二十八烷基铵（DDAB），1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱（EPC），1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）和1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）购自Avanti Polar Lipids。胆固醇购自Sigma-Aldrich。1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基（聚（乙二醇）MW 2000）（DMG-PEG2000）购自NOF America Corporation，ONE-Glo + Tox荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega Corporation。 -A-Lyzer Midi透析试剂盒（WMCO，3.5 kDa）购自Sigma-Aldrich.4'，6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride（DAPI），Hoechst 33342，DLS Ultramicro比色皿，Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent和Lab-Tek密室玻璃罩购自Thermo Fisher Scientific。Cas9蛋白和Ki67单克隆抗体购自Thermofisher。单克隆抗肌营养不良蛋白抗体（D8168）和单克隆抗Vinculin抗体（V9131）购自Sigma-Aldrich。GenCrispr NLS Cas9-EGFP核酸酶购自GenScript。修饰的sgRNA（补充表 1）从Synthego购买。所有引物（补充表 2）均由Integrated DNA Technologies（IDT）合成。
在标记的缓冲液中将Cas9蛋白质和sgRNA的分离溶液等体积混合在一起。混合后，允许RNP在室温下孵育5分钟以形成完整的Cas9 / sgRNA复合物自组装。使用的Cas9蛋白与sgRNA的摩尔比为1 / 1、1 / 3和1/5。
首先，向装有搅拌棒的20 mL桶中添加四亚乙基五胺（5A2，4.0 g，1.0当量），2-（丙烯酰氧基）甲基丙烯酸乙酯（AEMA，20.4 g，5.25当量）和丁基化羟基甲苯（BHT 838毫克，0.18当量）。将所得反应混合物在N 2下在50℃以500 rpm搅拌24小时。粗产物通过快速柱色谱法纯化（二氧化硅，具有3％三乙胺的30至50％丙酮/己烷），得到5A2-G1（5.2g，19％）。Rf ＝ 0.15（50％丙酮/己烷和3％三乙胺，二氧化硅）。其次，向装有搅拌棒的20 mL桶中添加5A2-G1（3.9 g，1.0当量），二甲基苯基膦（DMPP，193μL，0.45当量）和1-辛烷硫醇（SC8，4.71 mL，6 * 1.5当量）。将得到的反应混合物在55℃，500 rpm下，N下搅拌48 h。2。将粗产物溶解于CH最小量的2氯2，并通过快速柱色谱法（中性氧化铝纯化2 ö 3，20至乙酸乙酯/己烷的100％），得到5A2-SC8（4.2克，64％）。Rf ＝ 0.2（70％乙酸乙酯/己烷，中性Al 2 O 3）。HRMS计算 C 110 H 203 N 5 O 24 S 6的分析值：2170.31，发现：2170.29。
综合协议基于先前的报告48。首先，通过催化氢化合成N1-（2-（4-（2-（氨基乙基）哌嗪-1-基）乙基）乙烷-1，2-二胺。将2-（4-（2-（（（氰基甲基）氨基）乙基）哌嗪-1-基）乙腈（1.0 g）与Raney-Nickel 2400（5 mL浆液，2.5）在60 psi下用H 2（g）氢化g），25％NH 4 OH（28 mL）和乙醇在室温下放置23 h。后处理后，获得0.98g N 1-（2-（4-（2-（2-氨基乙基）哌嗪-1-基）乙基）乙烷-1，2-二胺（85.6％收率）。接下来，在玻璃小瓶中使N1-（2-（4-（2-（2-氨基乙基）哌嗪-1-基）乙基）乙烷-1,2-二胺与1,2-环氧十二烷（4/1，摩尔）纯净反应在90°C下放置2.5天。粗产物通过快速柱色谱法纯化（二氧化硅，CH 2 Cl2至75 ： 22 ： 3 CH 2 Cl 2 / MeOH / NH 4 OH（aq））产生C12-200。HRMS计算 C 70 H 146 N 5 O 5的分析值：1137，发现：1138。
电离的阳离子脂质（5A2-SC8，C12-200，或DLIN-MC3-DMA）36，48，49将两性离子脂质（DOPE或DSPC），胆固醇，DMG-PEG和永久性阳离子脂质（DOTAP，DDAB或EPC）以给定的摩尔比溶解在乙醇中。将Cas9 / sgRNA复合物溶解在1x PBS缓冲液中。将PBS缓冲液中的Cas9 / sgRNA RNP复合物溶液以3：1的体积比（Cas9 / sgRNA RNPs：脂质，v / v）快速移液到乙醇中的脂质溶液中，使总脂质与sgRNA为40：1（wt），然后在室温下孵育15分钟。然后，将新鲜制剂直接表征并用于体外测定。对于动物实验，在局部注射（肌肉内或脑内注射）或全身注射（静脉内注射）之前，将制剂对1×PBS透析（Pur-A-Lyzer Midi透析试剂盒，WMCO 3.5 kDa）以去除乙醇。注射）。λ = 632纳米; 检测角= 173°）。
为了制备RNAiMAX复合RNP，在Opti-MEM中制备Cas9 / sgRNA复合物，并与在Opti-MEM中稀释的脂转染胺RNAiMAX转染试剂轻轻混合（剂量为每μgsgRNA 1μLRNAiMAX）。将混合物溶液在室温温育30分钟以完成络合。
为了制备封装RNP的C12-200和MC3 LNP，将柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0）中的Cas9 / sgRNA RNP复合物溶液以3：1的体积比快速移液到乙醇中的脂质溶液中（Cas9 / sgRNA RNP：总脂质，v / v），使总脂质与sgRNA的重量比为40：1（wt / wt），然后在室温下孵育15分钟。对于C12-200 LNP，C12-200 / DOPE / Chol / DMG-PEG的摩尔比为35/16 / 46.5 / 2.5；对于MC3 LNP，DLin-MC3-DMA / DSPC / Chol / DMG-PEG的摩尔比为50/10 / 38.5 / 1.5。
为了检查细胞摄取，将HeLa-Luc细胞以每孔2×10 4个细胞的密度播种到Lab-Tek室盖玻片（8个孔）中，并在37°C下孵育过夜。然后，将旧培养基换成150μL新鲜的含10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），并用50μL封装Cas9-EGFP / sgLuc RNP的5A2-DOT-10（每nn 9 sgRNA）处理好）。处理后1、3、6和24小时，将细胞用PBS洗涤3次，并在37°C下用Hoechst（0.1 mg mL -1）染色15分钟，然后通过共聚焦显微镜（Zeiss LSM 700）和使用ZEN 2010软件6.0.62版（Carl Zeiss MicroImaging GmbH）分析数据。
为了检查摄取机制，使用Hela-Luc细胞评估了对内吞途径的特异性抑制的测定。仅5A2-DOT-10处理用作对照。HeLa-Luc细胞以5×10 5的密度接种每孔细胞在12孔板中，并在DMEM完全培养基中孵育24小时。然后将细胞用PBS洗涤，然后与以下溶解于Opti-MEM的下列内吞作用抑制剂之一在37°C下预孵育1小时：20μM氯丙嗪（CMZ，网格蛋白介导的内吞作用抑制剂），2 mM阿米洛利（AMI，巨噬细胞增多症的抑制剂），200μMGenistein（GEN，小窝介导的内吞作用的抑制剂），5 mM甲基-β-环糊精（MβCD，脂质筏介导的内吞作用的抑制剂）。接下来，除去培养基，并用包含5A2-DOT-10 Cas9 / sgLuc（24 nM sgLuc）的完全DMEM培养基替换另外30分钟。之后，除去培养基，并用PBS洗涤细胞3次。然后收集细胞并通过流式细胞仪分析。所有实验均重复三次。这里，使用Cas9-EGFP蛋白来配制Cas9 / sgLuc复合物。为了评估它是否是能量依赖的内吞作用，还将细胞在4°C下预孵育1 h，然后再用含有5A2-DOT-10 Cas9 / sgLuc（24 nM sgLuc）的完全DMEM培养基处理30分钟在通过流式细胞仪分析之前。
为了进行体外基因组DNA编辑分析，将HeLa-Luc细胞以1.5×10 5的细胞密度接种到12孔板中细胞/孔并孵育过夜。然后，将包含24 nM sgRNA的不同纳米制剂添加到细胞中。3天后，收集细胞，洗涤并将其与2μL蛋白酶K（Thermofisher）一起重悬于50μL1×被动裂解缓冲液（Promega）中。之后，运行裂解PCR程序（65°C持续15分钟，95°C持续10分钟）以获得细胞裂解液。然后使用以下PCR扩增程序（95°C 5分钟；（95°C 30 s； 60–64°C 30 s； 72°C 1分钟））扩增目标基因组位点40个循环； 72 °C持续7分钟，然后保持在4°C）。细胞裂解物用作DNA模板。然后使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化扩增子，并将200 ng纯化的DNA添加到19μL含1×NEBuffer 2的退火反应中。然后将PCR产物在热循环仪中使用以下条件退火（95°C 5分钟，然后将混合物从95冷却至85°C，升温速率为每秒-2°C，然后在85至25°C下冷却至升温速率为每秒-0.1°C，然后保持在4°C）以形成本文双链体DNA。之后，加入1μLT7EI（NEB）并在37°C下孵育15分钟。然后通过添加1.5μL的0.25M EDTA终止切割反应。接下来，使用2.5％琼脂糖凝胶电泳分析消化的DNA。补充表中列出了用于T7EI分析的所有引物 加入1μLT7EI（NEB），并在37°C下孵育15分钟。然后通过添加1.5μL的0.25M EDTA终止切割反应。接下来，使用2.5％琼脂糖凝胶电泳分析消化的DNA。补充表中列出了用于T7EI分析的所有引物 加入1μLT7EI（NEB），并在37°C下孵育15分钟。然后通过添加1.5μL的0.25M EDTA终止切割反应。接下来，使用2.5％琼脂糖凝胶电泳分析消化的DNA。补充表中列出了用于T7EI分析的所有引物 2。
对于体内基因组DNA编辑分析，根据制造商的说明，使用PureLink Genomic DNA Mini Kit（Invitrogen）从组织中提取基因组DNA。随后，按照上述步骤进行上述T7EI检测。
纯化的PCR扩增子及其正向引物由UT西南医学中心的McDermott中心测序核心设施测序。测序数据使用“按插入的插入序列进行分解”（TIDE）（https://tide.deskgen.com/）进行分析。在Luc，GFP，TOM，PTEN，P53，RB1，Eml4，Alk和PCSK9位点进行Sanger测序/ TIDE分析。
在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中于37°C / 5％CO 2培养HeLa-GFP报告基因细胞。为了进行实验，将HeLa-GFP细胞以1.5×10 5的细胞密度接种到12孔板中每孔细胞数并孵育过夜。然后，将培养基替换为0.5 mL新鲜的完全DMEM，然后添加100μL纳米颗粒分散液（sgRNA的终浓度固定为24 nM）。处理三天后，使用Keyence显微镜（Bence-X Analyzer软件版本1.0.0，Keyence Corporation）使细胞成像。对于流式细胞术分析，收集细胞，用PBS洗涤，重悬于PBS中，并使用BD分析仪LSRFortessa SORP（8.0.1版，BD Biosciences）进行测量。使用FLOWJO软件7.6版（FLOWJO）分析流式细胞仪的数据。
为了测量稳定性，我们制备了封装Cas9 / sgGFP RNP复合物的5A2-DOT-10 LNP，并将其在4°C下保存2个月。储存不同时间后测试这些纳米粒子的大小和PDI，并在HeLa-GFP细胞中通过添加纳米粒子（24 nM sgRNA剂量）并在3天后定量基因编辑来评估其基因编辑效率。对于每个时间点，均提取并分析了封装有Cas9 / sgGFP RNP的5A2-DOT-10 LNP的等分试样（大小，PDI，功效）。
所有动物实验均由德克萨斯大学西南医学中心的动物保护与使用委员会批准，并与适用的地方，州和联邦法规一致。将小鼠饲养在具有12小时的明/暗循环的屏障设施中，并保持在标准食物（2916 Teklad Global）上。C57BL / 6小鼠获自UTSW小鼠育种核心设施。B6.Cg- Gt（ROSA）26Sor tm9（CAG-tdTomato）Hze/ J小鼠（也称为Ai9或Ai9（RCL-tdT）小鼠）从杰克逊实验室（007909）获得，并繁殖以维持Cre报告基因等位基因的纯合表达，该基因具有loxP侧翼STOP盒，可阻止CAG的转录启动子驱动的红色荧光tdTomato蛋白。在Cas9 / sgRNA RNP介导的基因编辑后，Ai9小鼠将表达tdTomato荧光。Ai9小鼠在C57BL / 6J遗传背景上是同基因的。ΔEx44DMD小鼠由Eric Olson教授的实验室44提供。
为了在肌肉中进行基因编辑，以1 mg kg -1的剂量向Td-Tomato小鼠注射了5A2-DOT-10 LNP，它们包裹了Cas9 / sgTOM RNP复合物肌肉注射在左腿中的sgTOM。封装Cas9 / sgTOM RNP复合物的RNAiMAX被用作阳性对照。治疗7天后，收集所有治疗组的肌肉组织，并使用IVIS Lumina系统（Perkin Elmer）成像。之后，将肌肉组织嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中，并切成10μm切片。将切片用4％多聚甲醛（Thermo Fisher Scientific）固定20分钟，用PBS缓冲液洗涤3次。然后，将每滴含DAPI的ProLong金贴剂（Thermo Fisher Scientific）涂在每张玻片上。放置盖玻片，并通过共聚焦显微镜（Zeiss LSM 700）对载玻片成像，并使用ZEN 2010软件版本6.0.62（Carl Zeiss MicroImaging GmbH）分析数据。对于大脑中的基因编辑，大脑内注射sgTOM -1。治疗6天后，使用IVIS Lumina系统（4.4.0.0版，Caliper Life Sciences）切除大脑并成像。按照上述方案制备脑的冰冻切片，并通过共聚焦显微镜成像。
为了通过IV注射进行基因编辑，通过尾静脉注射用含有不同百分比的DOTAP的5A2-DOT-X LNP治疗小鼠。在牺牲点，收集所有器官用于进一步分析。
将五十微升封装sgDMD的5A2-DOT-10注射入P12雄性ΔEx44DMD小鼠的胫前肌（TA）肌肉（剂量为1 mg kg -1 sgDMD）三次（每周一次）。最后一次注射后三周，取出TA肌肉进行Western印迹分析（抗肌营养不良蛋白抗体以1：1000稀释，抗葡萄菌素抗体以1：5000稀释）和免疫荧光分析（n = 3个生物学独立的动物）。仅5A2-DOT-10纳米颗粒治疗组用作阴性对照。基于蛋白质印迹结果，使用Image J（1.50b Java 1.8.0_60（64位），美国国立卫生研究院）分析了还原的肌营养不良蛋白表达的定量。
通过尾静脉注射（以2.5mg kg -1 sgPCSK9的剂量）三次（每周一次）将封装sAPCSK9的5A2-DOT-5注射入C57BL / 6小鼠。最后一次注射后一周，使用PCSK9 Elisa试剂盒（ab215538，Abcam）收集小鼠血清以检测血清PCSK9水平。然后处死小鼠，并收集肝脏组织以通过T7EI测定，Sanger测序和western印迹在PCSK9基因位点检测基因编辑。PBS治疗组和仅5A2-DOT-5纳米颗粒治疗组用作阴性对照（n = 3）。
使用从不同5A2-DOT-X纳米制剂处理过的组织中提取的基因组DNA 扩增PTEN位点的PCR扩增子。然后将这些样品邮寄到GENEWIZ公司，以使用下一代深度测序（NGS）检测基因编辑效率。
体内Eml4-Alk重排通过巢式PCR 43进行测试。对于第一轮PCR，将40 ng基因组DNA用作模板，PCR程序在95°C下反应5分钟；（95°C持续30 s; 64°C持续30 s; 72°C持续30 s）进行18个循环; 72°C持续7分钟，然后保持在4°C。对于第二轮PCR，将1μL的第一轮PCR产物（100稀释液）用于PCR反应（95°C持续5分钟;（95°C持续30 s; 68°C持续30 s; 72°C持续进行） 30 s）30个循环； 72°C 7分钟，然后保持在4°C补充表2中列出了PCR反应中使用的引物，将 PCR扩增的靶向基因GAPDH用作内部对照。
使用Cas-OFFinder网络工具预测了排名前10位的潜在脱靶位点，并通过PCR扩增了这些位点，然后使用T7EI分析进行了分析。相对引物信息在补充表2中列出 。
简而言之，将10％福尔马林溶液固定的组织包埋在石蜡中，切片，并用UTSW的Molecular Pathology Core进行H＆E染色。以标准方式进行4μm切片，并用用于IHC的Elite ABC试剂盒和DAB底物（矢量实验室）进行检测。使用NANOZOOMER（NDP.scan软件版本3.1.9，Hamamatsu）扫描这些幻灯片，并使用NDP.view 2软件（2.7.25版，Hamamatsu）进行分析。
小鼠的图像（图 1一，3 A，4 A，E，5一个，d），注射器（图 1一个，4 A，E，5一个，d），和器官（图 1一个，4 a，e）是使用BioRender.com创建的。
使用GraphPad Prism软件（版本7.04）（美国GraphPad软件），通过单向方差分析（ANOVA），然后进行Dunnett多重比较测试进行统计分析。甲P-值<0.05被认为是统计学显著。
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