尽管进行了广泛的研究，对败血症的有效治疗仍然难以捉摸，并且需要对感染的炎性反应有更好的了解，以发现潜在的治疗新靶标。在这项研究中，我们首次使用RNAi技术来显示可诱导的溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶2（LPCAT2）在巨噬细胞炎症基因表达中起关键作用，以响应细菌配体的刺激。使用siRNA或shRNA介导的敲低，我们证明，与组成型LPCAT1相比，LPCAT2是巨噬细胞细胞因子基因表达和响应TLR4和TLR2配体刺激释放所必需的，而不是非TLR依赖性刺激所必需的。此外，转染过表达LPCAT2的细胞表现出对LPS和其他细菌配体的响应，炎症基因表达增加。此外，我们已经使用免疫沉淀和蛋白质印迹来显示响应LPS，LPCAT2（而非LPCAT1）迅速与TLR4缔合并转移到膜脂质筏结构域。因此，我们的数据提出了一种针对细菌刺激而调节炎症基因表达的新机制，并突出了LPCAT2作为抗炎和败血症治疗方法开发的潜在治疗靶标。
败血症是一种威胁生命的疾病，据估计每天全世界多达20,000人死亡1。尽管进行了广泛的研究和大量的临床试验，但目前尚无针对脓毒症2的有效疗法。因此，为败血症患者确定新的治疗选择至关重要。细菌分子，例如脂多糖（LPS）在脓毒症的发生中起关键作用。由先天免疫细胞LPS的检测是针对革兰氏阴性细菌还未经调节的应答的宿主防御的重要可产生过量细胞素释放，这最终可导致心血管紊乱和器官功能障碍是严重的败血症的标志3，4，5。LPS激活细胞（如巨噬细胞）上的TLR4 / MD2复合物，导致细胞内信号传导以及NF-κB和MAPKs的激活，最终导致炎性细胞因子6和脂质介体7的释放。阻断个体炎症介质的方法在临床试验中的败血症尚未证明是成功的1，8并因此通过TLR的激活炎症途径的更好的理解需要开发有效的治疗。
除了是生物膜的主要和基本结构成分外，磷脂（PL）及其代谢产物在细胞信号传导和激活9中也起着关键作用。PL代谢产物，如lysoPLs（LPL）和氧化PL（oxPL），已被证明可介导炎症反应并影响败血症10实验模型的结果。多样磷脂组合物轮廓所需要的膜流动性，囊泡运输和特殊域形成用于信令11，12。最近已经更好地理解了构成不同磷脂成分的重塑过程的机械细节。膜的多样性和不对称性通过所谓的“土地循环” 13中磷脂的协同去酰化和再酰化来维持。脱酰基反应由磷脂酶，特别是磷脂酶A2（PLA2）介导，其活性在炎症中增加。主要膜磷脂磷脂酰胆碱（PC）的再酰化是通过LysoPC酰基转移酶（LPCAT）酶家族进行的。最近的研究揭示了四种具有LPCAT活性的酶，即LPCAT1，LPCAT2，LPCAT3和LPCAT4 14。除了LPCAT活性，LPCAT1和LPCAT2已经显示出表达溶血血小板活化因子乙酰基转移酶（LPAFAT）活性15，16。LPCAT1已经发现，肺组织，其中它调节表面活性剂的脂质代在中高表达15，17，18。据报道LPCAT2在炎症细胞中表达，并通过LPS刺激15上调。
酰基转移酶的活性与炎症性疾病有关。例如PC /溶血PC在血浆中的比例已被证明是炎症的类风湿性关节炎的量度19，和溶血PC，氧化低密度脂蛋白的主要组成部分，已被证明是在实验性败血症模型中是有益20。败血症患者血浆LysoPC水平降低，而LysoPC / PC比降低与败血症死亡率高度相关10。
我们小组一直在研究磷脂代谢物在对LPS的炎症反应中的作用。我们以前的研究，使用LPCAT的全球药物抑制，提示这些酶的关键作用在炎症尽管负责这些影响LPCAT的具体亚型没有阐明11，21，22。LPCAT1和LPCAT2已被证明是差异表达的，并且具有独特的磷脂代谢功能[15,16]，因此，调节炎症的LPCAT同工型的特性将成为靶向抗炎疗法发展的关键。在目前的研究中，我们利用了最近的抗体和序列数据的可用性和LPCAT1 2 15，17，18开发RNA干扰（RNAi）技术，以确定LPCAT1和2在细菌诱导的炎症反应中的作用。我们在这里显示LPS刺激LPCAT2和TLR4之间的关联以及LPCAT2易位到膜脂筏域中。我们还表明，过表达LPCAT2的细胞响应LPS和其他细菌配体产生增强的炎症基因表达，并且选择性敲低LPCAT2抑制了炎症基因表达。因此，我们的数据支持LPCAT2在调节对LPS和其他细菌TLR配体的炎症反应中的主要作用。
使用实时定量PCR确定LPCAT mRNA的存在和绝对转录水平。RAW264.7细胞在静止状态下表达LPCAT1和-2。在未刺激的细胞中，LPCAT1转录物的量是LPCAT2的八倍（5.575 + 0.15 Vs. 4.671 + 0.14，Log 10平均转录物水平+ SE，p = 0.0115）（图 1A）。已显示巨噬细胞与TLR4或-9配体孵育16小时可上调LPCAT2 15的mRNA表达。。在当前的工作中，我们进一步检查了TLR4配体LPS和TLR2配体脂磷壁酸（LTA）对LPCAT1和2的诱导。我们发现，当细胞在6小时后用TLR2或TLR4配体刺激时，LPCAT2表达水平显着上调。相比之下，与静息细胞相比，当用LPS或LTA刺激细胞长达24小时时，LPCAT1 mRNA表达没有显着改变（图 1B，C）。
RAW264.7细胞中LPCAT1和2的表达水平以及LPS或LTA对其的诱导。如方法部分所述确定RAW264.7细胞中LPCAT的拷贝数。在静止细胞中，LPCAT1转录物的水平相对高于LPCAT2（A）。RAW264.7细胞中的LPCAT 1和LPCAT2 mRNA表达可刺激LPS（1 µg / mL）（B）或LTA（10 µg / mL），显示这些配体可诱导LPCAT2（C）。n = 3；* p <0.05 Vs LPCAT1。
为了评估LPCAT1和2在细胞内的定位，通过连续去污剂提取24分离了静息细胞和LPS刺激的细胞的胞浆，核和膜部分。LPCAT1和-2在细胞内的分布情况是相同的，两种酶都存在于膜和核部分中，但不存在于细胞质中（图 2A）。在静止细胞中，大多数LPCAT1和LPCAT2被发现在膜的非筏结构域中（图 2B）。然而，在LPS刺激细胞时，发现LPCAT2易位到脂质筏域，而LPCAT1却没有增加脂筏比例（图 2B–D）。
LPCAT1和LPCAT2的亚细胞位置。分离出不同的细胞级分，并通过免疫印迹探测每个级分的LPCAT1或2。LPCAT1和2均存在于富核级分中（组蛋白H3用作标记），但不存在于胞质溶胶中（β-微管蛋白用作胞质标记），LPS刺激后它们的相对丰度不变（A）。分离膜级分显示，大多数LPCAT1和2在非筏膜结构域中表达，但脂筏结构域中LPCAT2的水平在LPS刺激后增加，而LPCAT1的水平则保持不变（B）。在（C）中显示了LPCAT2，在（D）中显示了来自B的馏分的光密度分析。
LPCAT1和2的表达被小干扰RNA分别成功地抑制，其击倒率分别为81.35 + 6.4％和80.09 + 1.36％，而转染试剂对细胞毒性没有明显影响（图 3A）。使用这种最佳的siRNA敲低LPCAT1和-2表达，最初使用实时定量PCR研究了LPCAT1或-2沉默对LPS诱导的细胞因子基因表达的影响。我们在这里首次证明了对LPCAT2表达的抑制显着下调了LPS诱导的TNF-α，IL-6和IL-10的mRNA表达（图 3B–D）。还使用Milliplex MAP小鼠多重试剂盒研究了LPCAT2抑制对LPS诱导的蛋白质释放的影响。siRNA抑制LPCAT2后，LPS介导的炎性细胞因子的释放也显着减少（图3E，F），这与炎性细胞因子mRNA的降低相类似 。与LPCAT2沉默相比，LPCAT1的siRNA敲低对LPS诱导的炎症细胞因子基因表达在mRNA或蛋白水平上都没有影响（图 3B–F）。
siRNA对LPCAT2的抑制作用显着下调LPS诱导的炎症细胞因子基因表达和蛋白质释放。RAW264.7细胞用LPCAT1或LPCAT2的siRNA处理导致81.35 + 6.4和每LPCAT1和2的表达，分别的百分之击倒80.09 + 1.36，相比于用一个控制负的siRNA（治疗阿）。siRNA敲低LPCAT1或LPCAT2后，以1 µg / mL的LPS刺激细胞4小时以表达细胞因子mRNA（B–D），或24小时以释放蛋白质（E，F）。* p <0.05 Vs阴性siRNA（B–F）。
LPCAT2抑制对RAW264.7细胞炎症反应的调节并不限于TLR4配体刺激。RAW264.7细胞对脂蛋白（LTA）或Pam 3 Cys的刺激反应强烈，它们分别是TLR2 / 6和TLR2 / 1配体26。我们发现在用LTA或Pam 3 Cys 刺激的LPCAT2的siRNA敲低的细胞中，细胞因子基因的表达也被显着抑制（数据未显示）。但是，siRNA对LPCAT1的抑制作用对LTA或PAM 3 Cys诱导的应答均无影响（数据未显示）。
为了在离体细胞中证实这些结果，通过腹膜巨噬细胞中的siRNA敲低了LPCAT1和2，如Zhang 等人，2008 23所述收集和分离。当LPCAT2的表达受到抑制时，LPS诱导的由LPS刺激的腹膜巨噬细胞释放的TNFαmRNA和蛋白的表达水平显着降低（图 4A–C）。但是，与RAW264.7细胞一样，LPCAT1的siRNA敲低对腹膜巨噬细胞中LPS诱导的炎症细胞因子基因表达没有影响（结果未显示）。
LPCAT2沉默可降低LPS诱导的TNF-α基因表达和蛋白质从小鼠腹膜巨噬细胞和人单核细胞系的释放。通过将原代小鼠腹膜巨噬细胞与LPCAT2 siRNA孵育，LPCAT2的表达显着降低（相对于对照阴性siRNA，p = 0.0192）（A）。用LPS（100ug / ml）刺激后，沉默的LPCAT2原代巨噬细胞显示TNF-α基因表达（B）和蛋白质释放（C）显着降低。用靶向LPCAT2基因的shRNA慢病毒颗粒转导人单核细胞系MM6，导致LPS刺激后TNF-α（D）和IL-6（E）细胞因子的产生减少。* p <0.05 vs阴性siRNA（B，C）与向量控制（D，E）。
LPCAT2对LPS诱导的反应的影响并非鼠巨噬细胞独有。当使用shRNA在人单核细胞系MonoMac6（MM6）中沉默LPCAT2的表达时，当用LPS刺激细胞时，促炎性细胞因子也显着下调（图 4D，E）。
上面我们表明选择性抑制LPCAT2基因表达抑制了对TLR4和TLR2配体LPS和LTA的炎症反应。为了进一步显示LPCAT2在巨噬细胞对细菌配体的应答中的作用，用携带LPCAT2基因插入片段的质粒转染RAW264.7细胞。与用空载体转染的细胞相比，携带插入物的巨噬细胞显示出LPCAT2的表达增加（图 5A）。LPS刺激进一步增强了LPCAT2的表达（图 5B），证实了转染的LPCAT2的诱导。过表达LPCAT2的细胞显示TNF-α基因（图5C）和蛋白质（图5D） 表达增加 ）用LPS刺激后。而且，当用LPCAT2转染的细胞也受到LPCAT2的siRNA敲低时（图 5E），LPS刺激的TNF-α的基因表达再次被显着抑制（图 5F）。这些结果支持了LPCAT2在巨噬细胞炎症反应中的关键作用。
LPCAT2基因的过表达显着上调LPS诱导的TNFα基因表达和蛋白质释放。用携带LPCAT2插入片段（标记为LPCAT2）的质粒转染RAW264细胞，这导致LPCAT2基因表达显着增加（A）。当用LPS（B）刺激细胞时，这种过表达进一步增加。LPCAT2的过表达显着增加TNFα基因表达（C）和蛋白质释放（D）。siRNA沉默可显着降低携带LPCAT2质粒的RAW264细胞中LPCAT2的表达（E），并显着抑制这些细胞中的TNFα基因表达（F）。数据代表四个独立实验的平均值（n = 4）±标准误差。* p < 0.05，** p < 0.01，** p < 0.001。
为了评估LPCAT2在细胞对TLR依赖性配体的反应中的作用，将LPCAT2表达在RAW264.7细胞中沉默，RAW264.7细胞用可溶性激活剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）刺激，并通过活性氧来确定细胞激活（ROS）生成使用流式细胞仪。如图6A所示， 当用对照阴性siRNA或LPCAT2 siRNA转染细胞时，响应PMA的ROS产生没有差异。但是，在LPS2刺激的LPCAT2 siRNA转染的细胞中，ROS的产生显着受损。该结果表明，LPCAT2介导对TLR配体的细胞炎性反应，但不介导对TLR非依赖性的刺激。
LPCAT2抑制对PMA诱导的总活性氧（ROS）的生成没有影响，而抑制LPS诱导的ROS的产生（A）。当将RAW264.7细胞用LPCAT2或对照siRNA转染24小时后，用LPS刺激30分钟时，在用siRNA处理的细胞中LPS诱导的p38活化显着降低为LPCAT2（B）。LPS刺激还诱导LPCAT2和TLR4（C）之间的物理关联。用LPS刺激细胞15或30分钟后，通过免疫沉淀（IP）证明了LPCAT2和TLR4的物理缔合。IP后分别使用抗TLR4和抗LPCAT2抗体通过免疫印迹检测LPCAT2和TLR4（C）。
为了研究LPCAT2如何调节巨噬细胞对细菌配体的炎症反应，在LPS或LTA刺激4小时后，在转染了LPCAT2 siRNA和对照细胞中测定了近端信号受体CD14，TLR2和TLR4的表达。用LPS或LTA刺激细胞后，对LPCAT2的抑制对CD14，TLR4或TLR2 mRNA表达没有影响。LPCAT2沉默对细胞表面TLR2或TLR4的表达也没有影响（数据未显示）。
有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPKs）是至关重要的丝氨酸/苏氨酸信号激酶，其通过磷酸化激活，从而通过调节细胞核中的基因表达来调节细胞反应27。LPS已经显示出诱导的p38的磷酸化和活化的p38调节LPS诱导的炎症反应28，29，30。因此，我们评估了LPS刺激细胞后LPCAT2抑制对p38磷酸化的影响。如预期的那样，LPS处理30分钟后，在用阴性siRNA转染的对照细胞中p38磷酸化显着上调。然而，在用LPS刺激之前使LPCAT2沉默的细胞中，p38的磷酸化显着降低（图 6B）。这表明LPS2刺激细胞后，p38的完全磷酸化需要LPCAT2。
检查了静息细胞和LPS刺激的细胞中LPCAT2与TLR4的物理联系，以进一步阐明LPCAT2在LPS诱导的反应中的作用。在使用抗TLR4或抗LPCAT2进行免疫沉淀（IP）之前，用与产生抗TLR4和抗LPCAT2抗体相同物种的正常抗体预清除细胞裂解液，以减少非特异性结合抗体。在未刺激的细胞中，TLR4和LPCAT2之间的关联最小。但是，在用LPS刺激15分钟后，TLR4的免疫沉淀显示LPCAT2与之相关。这种关联是短暂的，并且减少了30分钟（图 6C）。类似地，当LPCAT2被免疫沉淀并且探测到TLR4时，在LPS刺激的细胞中也观察到了TLR4和LPCAT2之间的关联（图 6C）。当以类似方式探索LPCAT1和TLR4之间的缔合时，在用LPS刺激细胞后未发现这两种蛋白质的缔合（数据未显示）。
综上所述，这些结果表明，在LPS刺激后，可诱导的LPCAT2易位到膜脂筏域，并直接与TLR4相互作用以调节巨噬细胞的炎症反应。这证明了磷脂代谢酶在巨噬细胞活化和炎症反应中的新作用。
巨噬细胞在多种炎性病症，包括败血症，造成失调的宿主对感染的反应已经被证明非常难以治疗的携带有高死亡率威胁生命的器官功能障碍中发挥关键作用1，31，32。我们以前报道，LPCAT是对LPS和其他细菌刺激巨噬细胞炎性反应的重要，虽然LPCAT的负责这些影响的亚型是未知的11，21，22。使用LPCAT序列数据和RNAi技术，我们现在显示LPCAT2在巨噬细胞对细菌配体刺激的炎症反应中起关键作用。我们证明，与LPCAT1相反，LPCAT2是细胞因子基因表达对TLR4和TLR2配体刺激的响应所必需的。此外，我们的结果表明，该活性可能是通过膜脂质筏结构域中LPCAT2与TLR4的直接缔合引起的。
LPCAT1和LPCAT2的组织位置和活动是当前辩论的主题。LPCAT1已经发现，肺组织，其中它调节表面活性剂的脂质代在中高表达17，18。据报道，LPCAT2在炎症细胞中表达，并受LPS刺激上调15。然而，先前的研究尚未报道这些酶在细胞类型中同时表达的水平。在这里，我们确定了RAW264.7巨噬细胞中内源性LPCAT1和LPCAT2的确切拷贝数。令人惊讶的是，在静止条件下，这些细胞中LPCAT1比LPCAT2更丰富地表达。但是，在用细菌配体LPS或LTA刺激6小时后，LPCAT2的表达显着且显着增加，并在刺激24小时后仍保持升高，而LPCAT1的水平则保持不变。先前已经在巯基乙酸盐诱导的鼠巨噬细胞中报道了这种LPCAT2表达的诱导，尽管它需要16小时的LPS刺激15。我们的免疫沉淀实验表明，LPS刺激引起LPCAT2和TLR4之间快速且可逆的结合（图 6C）。与LPCAT1的这种关联并不明显。该结果，以及在敲低LPCAT2表达后巨噬细胞应答的抑制作用，强烈表明LPCAT2和TLR4之间的缔合促进了TLR4信号通路和基因表达的激活。
我们进一步检查了LPCAT的亚细胞定位。LPCAT1和LPCAT2均在RAW264.7细胞的膜和细胞核部分表达，但不在胞质部分表达。有趣的是，对细胞的LPS刺激并未增加核级分中LPCAT1或LPCAT2的量。这与最近的一项研究，通过LPS刺激报道LPCAT1的在鼠肺上皮细胞系中的细胞内的存在和其易位至核33，34。胞质表达的差异可能是由于细胞类型（肺上皮细胞与巨噬细胞）和所用方法的差异所致。在我们的实验中，在分离核之后，进一步旋转细胞裂解液以分离胞质和膜级分。然而，Zou及其同事[ 33]和[ 34]的研究认为，分离细胞核后，整个裂解物是胞质的。这些作者进一步表明，LPCAT1可以酰化组蛋白并调节基因表达33。LPCAT2在巨噬细胞核中的存在的生物学意义目前正在我们的实验室中进行研究，但是LPCAT2也可能会酰化或乙酰化核蛋白并调节巨噬细胞中的基因表达。
在静止细胞中，我们发现LPCAT1和LPCAT2主要位于细胞膜的非脂质筏部分中。先前的研究报道，LPCAT2同时存在于肠上皮细胞系35的筏域和非筏域中。但是，我们的研究表明，LPS刺激后，很大一部分LPCAT2易位到脂质筏域中，而LPCAT1仅保留在非筏部分中。LPCAT2可以转位至活化细胞中的筏域的这一证明，以及我们对LPS诱导的LPCAT2和TLR4之间的缔合的发现，表明该酶可以调节巨噬细胞的炎症途径的机制中的重要一步。
这项研究表明，LPS诱导LPCAT2易位到膜筏域中，并刺激LPCAT2和TLR4之间的缔合。因此，我们假设通过这些机制，LPCAT2参与了对LPS的炎症反应的调节。我们以前表明，使用的药理学抑制剂，即LPCAT能调节到LPS炎症反应11，21，36。然而，负责这种调节的LPCAT同工型和潜在机制尚不清楚。在这里，我们使用siRNA敲除实验表明LPCAT2是介导对LPS和其他细菌配体的炎症反应的同种型。LPCAT2敲低对炎症基因表达的抑制作用是显着的，但不是全部。这可能反映了所用siRNA对LPCAT2 mRNA表达的不完全抑制（80％），其他分子也可能调节这些反应。但是，响应LPCAT2敲低LPS刺激而引起的细胞因子基因表达的大幅降低表明该酶在控制这些炎症反应中起着重要作用。此外，敲低LPCAT2导致LPS诱导的关键p38 MAPK磷酸化受到抑制，表明LPCAT2在p38上游起作用。相反，发现LPCAT1在巨噬细胞中不诱导炎症反应。此外，发现LPCAT2可以特异性调节TLR介导的反应，因为在不依赖TLR的可溶性刺激下，ROS的产生在siRNA转染的RAW细胞中没有被抑制，而LPS诱导的ROS的产生却被抑制。LPCAT2对TLR介导的反应的调控并不限于RAW264.7巨噬细胞。在小鼠腹膜巨噬细胞中敲低LPCAT2也导致LPS刺激的炎症细胞因子表达和蛋白释放的显着抑制。这表明，LPCAT2介导的巨噬细胞炎症反应调节不仅限于细胞系，而且还存在于细胞中 发现LPCAT1在巨噬细胞的炎症反应的诱导中没有作用。此外，发现LPCAT2可以特异性调节TLR介导的反应，因为在不依赖TLR的可溶性刺激下，ROS的产生在siRNA转染的RAW细胞中没有被抑制，而LPS诱导的ROS的产生却被抑制。LPCAT2对TLR介导的反应的调控并不限于RAW264.7巨噬细胞。在小鼠腹膜巨噬细胞中敲低LPCAT2也导致LPS刺激的炎症细胞因子表达和蛋白释放的显着抑制。这表明，LPCAT2介导的巨噬细胞炎症反应调节不仅限于细胞系，而且还存在于细胞中 发现LPCAT1在巨噬细胞的炎症反应的诱导中没有作用。此外，发现LPCAT2可以特异性调节TLR介导的反应，因为在不依赖TLR的可溶性刺激下，ROS的产生在siRNA转染的RAW细胞中没有被抑制，而LPS诱导的ROS的产生却被抑制。LPCAT2对TLR介导的反应的调控并不限于RAW264.7巨噬细胞。在小鼠腹膜巨噬细胞中敲低LPCAT2也导致LPS刺激的炎症细胞因子表达和蛋白释放的显着抑制。这表明，LPCAT2介导的巨噬细胞炎症反应调节不仅限于细胞系，而且还存在于细胞中 因为在不依赖TLR的可溶性刺激下，ROS的产生并未抑制siRNA转染的RAW细胞中的PMA，而LPS诱导的ROS产生则受到抑制。LPCAT2对TLR介导的反应的调控并不限于RAW264.7巨噬细胞。在小鼠腹膜巨噬细胞中敲低LPCAT2也导致LPS刺激的炎症细胞因子表达和蛋白释放的显着抑制。这表明，LPCAT2介导的巨噬细胞炎症反应调节不仅限于细胞系，而且还存在于细胞中 因为在不依赖TLR的可溶性刺激下，ROS的产生并未抑制siRNA转染的RAW细胞中的PMA，而LPS诱导的ROS产生则受到抑制。LPCAT2对TLR介导的反应的调控并不限于RAW264.7巨噬细胞。在小鼠腹膜巨噬细胞中敲低LPCAT2也导致LPS刺激的炎症细胞因子表达和蛋白释放的显着抑制。这表明，LPCAT2介导的巨噬细胞炎症反应调节不仅限于细胞系，而且还存在于细胞中 在小鼠腹膜巨噬细胞中敲低LPCAT2也导致LPS刺激的炎症细胞因子表达和蛋白释放的显着抑制。这表明，LPCAT2介导的巨噬细胞炎症反应调节不仅限于细胞系，而且还存在于细胞中 在小鼠腹膜巨噬细胞中敲低LPCAT2也导致LPS刺激的炎症细胞因子表达和蛋白释放的显着抑制。这表明，LPCAT2介导的巨噬细胞炎症反应调节不仅限于细胞系，而且还存在于细胞中体内。此外，LPCAT2在调节炎症反应中的活性不限于鼠细胞。在人类单核细胞系MM6中使用shRNA敲低LPCAT2表达，也显着抑制了对LPS的炎性细胞因子反应。这表明LPCAT2调节炎症基因表达对细菌的刺激可能是先天免疫细胞中的常见机制。有趣的是，这种调节不是通过影响Toll样受体或辅助分子CD14的转录水平或表面表达来介导的。
LPCAT2的酰基转移酶活性在PAF和类花生酸的磷脂前体的存储中起着重要的作用37。LPCAT2催化炎症细胞的膜生物发生（LPCAT活性），同时响应外部刺激产生PAF（LPAFAT活性）15。但是，这是LPCAT2介导先天免疫细胞中炎症蛋白表达的首次报道。由于LPS刺激后膜筏部分中LPCAT2的水平增加，并且我们发现TLR4与LPCAT2之间存在物理联系，因此我们假设LPCAT2可能促进信号蛋白或其衔接物向脂质筏结构域的募集，从而影响TLR诱导的反应。最近的报告表明，LPS通过MAPK激活的蛋白激酶2（MK2）诱导LPCAT2的磷酸化，从而影响酶的活性38。我们不知道是否还需要LPCAT2的磷酸化来介导其对炎症基因表达的影响。以前，我们发现LPCAT活性也抑制炎性基因表达的那药理学抑制响应于LPS 11，21，36。这表明，LPCAT2的酰基转移酶活性可能也是调节本研究中所见细胞因子基因表达所必需的。由于已显示LPCAT2具有LPCAT和LPAFAT活性15，因此尚需确定哪种活性可能对TLR诱导的基因表达有影响。
总之，我们的结果表明，响应LPS对细胞的刺激，溶血磷脂酰基转移酶的成员LPCAT2易位到膜脂质筏结构域，并与TLR4结合，通过激活p38 MAPK促进炎症基因表达。这项研究表明，调节膜磷脂代谢的酶还可以响应细菌配体而调节先天免疫炎症蛋白的表达。因此，LPCAT2可能是先天免疫细胞中炎症的新型调节剂，并突显了LPCAT2作为针对炎症反应不受控制的疾病（如败血症）开发新疗法的潜在新靶标。
除非另有说明，否则大多数试剂均来自Sigma-Aldrich®UK。siRNA，逆转录和Power SYBRGreen®试剂盒，OPTI-MEM培养基，Geneticin抗生素，Lipofectamine2000转染试剂和预制SDS-PAGE凝胶购自英国Life Technologies。INTERFERin购自PolyPlus（英国Source Bioscience提供）。PE缀合的Anti-TLR-2和-4由eBioscience Ltd（英国）提供，而磷酸化p38，组蛋白H3和β-微管蛋白的抗体由New England Biolab（英国）提供。抗LPCAT2抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc.（由英国Insight biotechnology提供）和Novus Biologicals（英国），而LPCAT1抗体则购自Proteintech Europe（英国）。抗TLR4和抗Giα2抗体以及Protein A / G Plus琼脂糖珠来自圣克鲁斯生物技术公司。（由英国Insight生物技术公司提供）。抗GAPDH抗体，PVDF膜，Milliplex多分析物面板（MAP）小鼠多重试剂盒和PAM3Cys购自Merck-Millipore UK Ltd（英国）。带有或不带有鼠类LPCAT-2插入片段，抗FLAG抗体和Alpha-Gold感受态细菌的True ORF Gold质粒由美国Origene提供。除从BioSera（由英国Labtech International Ltd.提供）获得的胎牛血清外，所有细胞培养耗材均来自Lonza Ltd（英国）。总活性氧（ROS）检测试剂盒由ENZO Life Sciences（UK）提供，而人IL-6和TNF-αELISA DuoSet试剂盒则从英国R＆D Systems Europe Ltd英国购买。带有或不带有鼠类LPCAT-2插入片段，抗FLAG抗体和Alpha-Gold感受态细菌的True ORF Gold质粒由美国Origene提供。除从BioSera（由英国Labtech International Ltd.提供）获得的胎牛血清外，所有细胞培养耗材均来自Lonza Ltd（英国）。总活性氧（ROS）检测试剂盒由ENZO Life Sciences（UK）提供，而人IL-6和TNF-αELISA DuoSet试剂盒则从英国R＆D Systems Europe Ltd英国购买。带有或不带有鼠类LPCAT-2插入片段，抗FLAG抗体和Alpha-Gold感受态细菌的True ORF Gold质粒由美国Origene提供。除从BioSera（由英国Labtech International Ltd.提供）获得的胎牛血清外，所有细胞培养耗材均来自Lonza Ltd（英国）。总活性氧（ROS）检测试剂盒由ENZO Life Sciences（UK）提供，而人IL-6和TNF-αELISA DuoSet试剂盒则从英国R＆D Systems Europe Ltd英国购买。
RAW264.7鼠巨噬细胞系来自ECCAC（由英国公共卫生的Culture Collection提供）。人单核细胞系MonoMac 6（MM6）从德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ，德国）获得。将RAW264.7细胞在添加了10％胎牛血清（FBS）和2 mM谷氨酰胺（DMEM完全培养基）的DMEM培养基中，在5％CO 2湿润的气氛中于37°C培养。在补充了10％FBS，1％2 mM L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸和1％丙酮酸钠的RPMI-1640培养基中，于5％CO 2湿润的气氛中，于37°C培养MM6细胞。
从C57BL / 6小鼠品系收获腹膜巨噬细胞。小鼠在当地繁殖，并在6至8周龄之间使用。所有实验方案均已通过普利茅斯大学的规定获得英国内政部许可，并且所有方法均根据相关的指南和规定进行。将所有小鼠维持在普利茅斯大学动物护理设施。给动物饲喂标准的饲料颗粒饲料，并自由饮水。将所有动物维持在12小时光照，12小时黑暗周期。在CO 2安乐死后，按照Zhang 等人（2008）23的描述收集和分离常驻腹膜巨噬细胞。
根据供应商的说明，使用Alpha-Gold感受态细菌扩增带有卡那霉素抗性基因（带有和不带有鼠类LPCAT2插入片段）的True ORF Gold质粒。简短地; 将1 µg / mL的质粒与10 µL的细菌在冰上孵育30分钟，然后在42°C孵育45秒。通过在含有25 µg / ml卡那霉素的LB平板上培养细菌来选择转化的细菌菌落。将菌落转移到含有浓度为60μg/ mL的卡那霉素的LB肉汤中，并摇动孵育12小时。使用GenEluteTM质粒Miniprep试剂盒根据供应商的说明纯化质粒。
将浓度为10 6个细胞/孔的RAW264.7细胞接种在6孔板（2.5 mL DMEM培养基）中并孵育过夜。然后在9 µL Lipofectamine2000 TM存在下，使用OPTI-MEM培养基，用含有LPCAT2插入片段（2.5 µg）的载体或质粒转染细胞。24小时后，更换完全的DMEM培养基，并将细胞进一步温育24小时。通过RT-PCR和蛋白质印迹检查过表达。
将RAW264.7细胞以2×10 5个细胞/2.5 mL /孔（用于RT-PCR）或7×10 4个细胞/ 1 mL /孔（用于多重细胞因子蛋白测定）接种到6孔或12孔板上分别在DMEM完全培养基中孵育24小时。一次分离的主要腹膜巨噬细胞以0.25×10 6细胞/ mL的密度接种到25 cm 2上将含有青霉素/链霉素和抗真菌剂的DMEM完全培养基中的烧瓶（4 mL）孵育24小时。然后将细胞在无血清OPTI-MEM培养基中转染，其对照阴性siRNA（Ambion）或针对LPCAT1的siRNA（Ambion siRNA ID s102346）或LPCAT2的siRNA（Ambion siRNA ID s114512），终浓度为5 nM（对于RAW264） .7）和使用INTERFERin转染试剂的10 nM（腹膜巨噬细胞）。24小时后，更换培养基并加入完全的DMEM培养基，并用细菌激动剂刺激细胞。对于shRNA实验，从序列验证的靶向LPCAT2基因的慢病毒质粒载体pLK0.1-TRC-shRNA -puro产生的慢病毒颗粒购自Sigma Aldrich UK（TRC shRNA TRCN0000055780）。作为对照，shRNA缺陷型pLK0。使用了1-TRC-嘌呤慢病毒颗粒。MM6细胞以1.6×10的密度接种在96孔板中，每孔4孔，并在感染有50倍感染（MOI）的情况下，在存在溴化己二胺的情况下，用表达pLK0.1-TRC-shRNA –puro的慢病毒或pLK0.1-TRC-puro对照慢病毒进行转导。在选择嘌呤霉素（0.5 µg / ml）的shRNA表达细胞之前，先定期更换培养基72小时。
使用硫氰酸胍-苯酚-溴氯丙烷提取总RNA，并使用NanoVue分光光度计（英国GE Healthcare）测定总RNA浓度。通过检查在260至280 nm处的吸光度测量值的比率来评估纯度，而通过在1％变性琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳来评估完整性。根据生产商的说明，使用高容量RNA到DNA试剂盒对总RNA量为0.5 µg进行反转录。使用Power SYBR Green和StepOnePlus热循环仪（英国Applied Biosystems）进行实时定量PCR。LPCAT1，LPCAT2，TNF-α，IL-6，IL-10，GAPDH，CD14，TLR2和TLR4的引物（表 1）是使用Primer Express 3.0软件（英国Applied Biosystems）设计的，可扩增所有靶标的100 bp产品。
使用已知浓度的100 bp PCR产物（GAPDH）的相对标准曲线确定LPCAT1和2的拷贝数。使用该PCR产物，通过在0.8 ng / µL至5.12×10 -5范围内的系列稀释（1：5）制备了7点标准液 ng / µL。实时定量PCR使用引物组进行设计，该引物组设计用于从静止（原始）细胞的反转录生成的cDNA上产生LPCAT1和2的100 bp产物，以确定每个细胞中两个LPCAT的表达和确切拷贝数。使用公式10（Ct-b）/ m计算ng / µL中LPCAT1和2的量，其中Ct是阈值，b是y轴截距，m是斜率。然后通过将浓度乘以反应混合物的总体积来计算总反应混合物中PCR产物的总量。之后，使用mRNA的分子量（LPCAT1 = 33004.2 g / mol和LPCAT2 = 32564 g / mol），反应混合物中的实际质量，细胞密度和Avogadro数（6.02×10 23）追溯计算拷贝数。）。
根据制造商的说明，使用Milliplex MAP小鼠多重试剂盒测量细胞因子。通过在与培养上清液相同的培养基（含10％胎牛血清的DMEM培养基）中进行系列稀释来制备重组细胞因子标准品的校准曲线。包括每种细胞因子的高和低参考点，以确定细胞因子的回收率。每种测定的细胞因子的检测水平为3.2–10000 pg / mL。
为了确定LPCAT2基因表达降低对人单核细胞系中LPS响应的细胞因子产生的不同影响，在存在或不存在LPS的情况下，以0.5×10 6 / mL 的密度孵育对照和shRNA慢病毒转导的MM6细胞（ 100 ng / ml）4或18小时。孵育后，收集上清液并保存在–80°C。根据制造商的说明，通过ELISA对细胞培养上清液中的TNF-α和IL-6进行定量。
如先前所述，使用连续的去污剂萃取分离脂质筏，非脂质筏部分，胞质和核部分24稍作修改。简而言之，实验结束后，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，刮下并以160×g沉淀5分钟。将细胞重悬于含有150mM NaCl和蛋白酶抑制剂的冰冷的Tris缓冲液（50mM，pH ＝ 7.5）中，并使用HGM Cell Cracker（HGM，Heidelberg，德国）匀浆。将裂解物以500×g离心5分钟以沉淀细胞核，然后将上清液以20,000×g离心20分钟以分离胞质和膜级分。通过将膜部分重悬于含有150 mM NaCl的2-（N-吗啉代）-乙磺酸（MES）缓冲盐水（MBS）（25 mM MES（pH = 6.5）， 1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂）在冰上放置一个小时。
在预制的SDS-PAGE上分离具有等量蛋白质的细胞膜级分，并使用印迹模块（英国Life Technologies）将其印迹在PVDF膜上。用PBS-0.1％Tween20®中的0.1％低脂干脱脂奶粉封闭印迹，使用SNAP id TM蛋白检测系统（Millipore，英国）用一抗然后HRP偶联的二抗探测。使用Luminata Crescendo Western HRP底物（英国密理博）检测膜上的蛋白质，并使用ImageJ进行分析。
使用FACSAria III流式细胞仪（BD Biosciences，美国）进行流式细胞仪分析。将RAW264.7细胞门控，并使用前向和侧向散射图对细胞碎片进行打折，并使用BD FACSDivaTM软件（美国BD Biosciences）获取10,000个事件，并使用WinMDI 2.8软件[Joe Trotter，美国宾夕法尼亚州Pharmingen进行分析） ]。
使用总ROS检测试剂盒按照供应商的说明，通过流式细胞仪实时测量总活性氧（ROS）的产生。简短地说，0.5×10 6将细胞接种在完全DMEM培养基中的T25培养瓶上。温育24小时后，使用OPTI-MEM培养基用阴性或LPCAT2 siRNA转染细胞。刮下每个烧瓶中的细胞，并用1 µg / mL LPS或1 µM phorbol 12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）刺激。温育20分钟后，旋转细胞悬液，并用试剂盒提供的洗涤缓冲液洗涤细胞沉淀。然后将细胞重悬于ROS检测溶液中，并在黑暗中于37°C温育30分钟，并通过流式细胞仪进行分析。如Namgaladze et al。，2009 25所述，将转染LPCAT2 siRNA的刺激细胞与转染阴性siRNA的细胞的荧光中值进行了比较。
数据显示为至少两次重复进行的至少三个独立实验的平均值+ SE。使用GraphPad棱镜（GraphPad软件，美国加利福尼亚州拉荷亚）进行统计分析。使用方差分析或学生t检验比较数据，p值<0.05被认为具有统计学意义。
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