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单克隆抗体制备-全菌抗原、全细胞抗原、抗体捕捉ELISA试验

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发表时间:2019-07-12 17:17作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com
单克隆抗体制备-全菌抗原、全细胞抗原、抗体捕捉ELISA试验

   单克隆抗体制备-全菌抗原的ELISA

a. 新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮,并调整细菌浓度至1×108/ml。必须指出,对于人畜共患病病原体需注意安全操作,最好是灭活处理。

b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液(0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml),37作用2小时,蒸馏水洗涤3次;加上述细菌悬液50ul/孔;37-56烘干;每孔加200ul封闭液4过夜或37 2小时封闭。

c. 步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液,37-56烘干,然后用-20预冷的无水甲醇室温作用15分钟,蒸馏水洗涤3次;每孔加200ul封闭液4过夜或37 2小时封闭。

d. 洗涤液洗3次;此时包被板可在-204保存备用。

单克隆抗体制备-用全细胞抗原的ELISA

a. 按常规方法培养细胞,接种病毒,收获感染细胞和未感染细胞,进行细胞计数,用PBS制成适当浓度悬液。

b. 淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后,滴加于淋巴细胞分离液之上,1500rpm离心30分钟,吸取界面细胞洗涤二次,即为新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞,离心后加0.83%的氯化铵溶液,室温10分钟,洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。

c. 每孔加100ul上述ab的细胞悬液,使每孔含细胞5×104个;1500r/min 15分钟,甩去上清;室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇(114固定10分钟;可4-20保存备用。

单克隆抗体制备-抗体捕捉ELISA试验

本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb,再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法是常用的ELISA中较理想的一种;其操作步骤如下:

a. 以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板,每孔加100ul37 2小时或4过夜。

b. 洗涤、拍干后加待测的McAb样品,37 1-2小时。

c. 洗涤后加适量的抗原,37 1-2小时。

d. 洗涤后加入酶标多克隆抗体,37 1-2小时。洗涤后加底物显色,判定结果。


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