心理困扰会诱发氧化应激并改变神经和免疫系统中的线粒体代谢。心理困扰以与缺乏内源性PTEN诱导的激酶1（PINK1）的帕金森病大鼠相似的方式促进野生型（WT）大鼠脑代谢和神经化学的改变，帕金森氏病是一种以隐性形式的帕金森氏病突变的丝氨酸/苏氨酸激酶。PINK1已在脑中进行了广泛研究，但尚不清楚其在外周组织中的生理作用以及与神经免疫轴相交的程度。我们推测，PINK1在基础条件下或在促进氧化应激作为心理困扰的情况下调节外周血单核细胞（PBMC）的生物能。通过使用XF代谢生物分析仪，PINK1-KO-PBMC与WT细胞相比，氧化磷酸化和基础糖酵解显着增加，并且与运动功能障碍相关。此外，心理困扰增强了PINK1-KO-PBMCs的糖酵解能力，但没有增强WT-PBMCs的糖酵解能力。PINK1-KO-PBMCs中的抗氧化剂标记物和脑源性神经营养因子的水平发生了变化，并且受到了心理困扰。总而言之，我们的数据表明PINK1对于调节PBMC中的生物能和抗氧化反应至关重要，而PINK1的缺乏则对心理困扰引起的氧化应激反应上调了代偿性糖酵解。PINK1-KO-PBMCs中的抗氧化剂标记物和脑源性神经营养因子的水平发生了变化，并且受到了心理困扰。总而言之，我们的数据表明PINK1对于调节PBMC中的生物能和抗氧化反应至关重要，而PINK1的缺乏则对心理困扰引起的氧化应激反应上调了代偿性糖酵解。PINK1-KO-PBMCs中的抗氧化剂标记物和脑源性神经营养因子的水平发生了变化，并且受到了心理困扰。总而言之，我们的数据表明PINK1对于调节PBMC中的生物能和抗氧化反应至关重要，而PINK1的缺乏则可调节代偿性糖酵解，以应对由心理困扰引起的氧化应激。
长期暴露于心理困扰中会改变暴露于高浓度皮质类固醇1的组织中下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的反馈抑制途径。近年来，我们对线粒体在能够感知细胞环境变化，整合多种信号通路以及适应氧化应激以响应动物在稳态条件下和心理困扰下的心理状态的生理贡献的理解2。在大脑中，患有心理困扰的动物的中脑线粒体含量减少，前额叶皮层的氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解3减少，氧化应激增加4，5，和升高的神经炎症 6。在外周组织中，我们已经观察到心理压力诱导的外周血单核细胞（PBMC）显著氧化损伤 7，8。心理痛苦的长期病理效应已与智力和神经退行性疾病，包括主要的临床抑郁症，精神分裂症，帕金森病（PD），阿尔茨海默氏症或痴呆相关的 1，9。
线粒体功能障碍和炎症在慢性疾病如糖尿病10，心血管疾病11或神经退行性疾病12的发病机理中起着核心作用。线粒体生物发生与线粒体之间的平衡对于维持适当的细胞能量代谢至关重要，因为它维持了神经元生存所需的最低水平的功能性和高质量线粒体13。在另一方面，改变这种平衡不利事件改变线粒体动力学中，线粒体功能和维护3，13，14。
磷酸酶和张力蛋白同源物诱导的激酶1（PINK1）是一种大型的非典型丝氨酸/苏氨酸（ser / thr）激酶，位于神经元的线粒体和胞质区室。PINK1支配线粒体的质量控制，枝晶生长和神经元存活15，16，17。PINK1和E3泛素蛋白连接酶Parkin在刺激线粒体和线粒体Ca 2+内流调节中起着至关重要的作用。这个途径导致线粒体功能障碍和神经退行性病变的破坏，早发PD隐性关联细胞学事件14，18。然而，最近的体内研究表明，在需要高能量需求的不同组织中，基底线粒体独立于PINK1 19。此外，线粒体通过其他途径包括丝氨酸/苏氨酸激酶AKT途径20进行调控。如在PD患者，PINK1敲除（PINK1-KO）大鼠忠实清单进行性运动和非运动症状21，22，在多巴胺能神经元的显著损失黑质（SN）22，23，线粒体缺陷24，25，26，27和抗氧化蛋白的改变25在大脑中从3岁开始两个月。与其他细胞类型相反，神经元对PINK1缺乏症极易发生神经退行性变。在PD中，中脑多巴胺神经元的选择性脆弱性可能归因于该选择的神经元亚群的固有特性（例如L型钙通道的存在），以及由于其线粒体含量低而导致线粒体摄取过量钙的能力降低28。。
线粒体功能障碍是PINK1功能丧失的结果，可能是由PINK1-KO小鼠胚胎成纤维细胞中观察到的呼吸链缺陷引起的29。在免疫系统细胞中，PINK1调节病毒感染30期间的先天免疫反应，参与线粒体抗原呈递途径，而PINK1的耗尽可引起炎症性自身免疫反应31。此外，PINK1调节神经胶质细胞的先天免疫应答，抑制神经炎症过程中的凋亡途径32，并控制通过MAPK途径介导的肝细胞中活性氧（ROS）的产生33。此外，相对于野生型（WT）细胞，PINK1缺陷型心肌细胞具有较高的线粒体膜电位（MMP）。与缺乏PINK1的神经元一样，缺乏PINK1的心肌细胞也具有较高的糖酵解速率，并显示线粒体呼吸功能受损34。
脑源性神经营养因子（BDNF）是一种涉及神经元分化，发育，保护和维持的神经肽35。BDNF的血清和脑中的低电平与PD的进展相关，推测是由于BDNF在维持神经元存活和树突树在多巴胺能神经元来自SN的复杂性的能力36，37，38，39。这个概念，在SN低水平胞内BDNF的一致是在死后脑组织中观察到从PD患者36，39。此外，年轻的帕金森氏症（PINK1-KO）大鼠表现出适度的运动功能障碍，但与野生型WT大鼠相比，SN神经元发生明显的神经退行性变，表明中脑3中细胞内BDNF的表达明显减少。此外，血浆BDNF水平的降低与运动协调能力受损40有关，而BDNF的血清水平低与PD的主要临床抑郁症41或精神病如精神分裂症42或双相情感障碍43的发作有关。由于BDNF具有穿越血脑屏障的高能力，因此它被认为是可以指示神经元代谢状态的生物标志物44，特别是考虑到免疫系统细胞显示高水平的BDNF表达45。
免疫系统细胞不同亚群的功能受损可能与PD的病因有关。实际上，外周和神经中枢系统中免疫细胞的慢性活化与PD 46的发作和发展有关。此外，暴露于慢性心理痛苦诱导激素和神经递质的释放47，导致在PBMC中的生化轮廓的变化，大概是作为一种代偿性反应，适应氧化应激，其7，8，和诱导的氧化应激和神经炎症在最后区和其他脑区域3，5，6。与其他细胞类型不同，PBMC需要高能量需求来调节无数的代谢需求过程，包括通过细胞因子和肿瘤坏死因子α（TNFα）48调节HPA轴。在真核细胞中，需要充分平衡利用“燃料”（例如氨基酸，脂质或葡萄糖）来增强OXPHOS和糖酵解，从而维持体内稳态49。在其静止状态产生ATP，免疫系统细胞主要依靠OXPHOS但是当它们被激活时，从PBMC中通过OXPHOS现象转移到有氧糖酵解增殖称为氧化应激期间“Warburg效应” 50，51，52。有氧糖酵解可提供维持MMP并防止细胞凋亡所需的ATP。确实，白细胞可以通过过度刺激戊糖磷酸途径，增强葡萄糖摄取并减少OXPHOS的活性，从OXPHOS到糖酵解的生物能转换，从而导致活性氧（ROS）的水平增加，随后释放到体内。细胞外空间作为促进杀菌活性的机制53。尽管相对于OXPHOS而言，这不是一个能源上有利的过程-因为从一分子葡萄糖中生成了两分子ATP，但由于糖酵解的快速酶促能力/活性，增氧性细胞（例如癌细胞）仍优先选择好氧性糖酵解酶产生ATP。实际上，从OXPHOS到糖酵解的转变使免疫系统细胞能够在低氧环境中适应并繁衍生息。此外，葡萄糖摄取的增加可以增强代谢产物如NADPH的产生，与免疫细胞的活化和生长有关54。
通过使用XF代谢生物分析仪，一些研究已经开发出方法来测量PBMC的生物能，作为评估疾病进展和整体健康的代理和预后工具，包括患有自闭症谱系障碍和肌病性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征（ME）的人/ CFS）55，56，57。
在本研究中，我们显示PINK1的耗竭能强烈增强线粒体呼吸和糖酵解，同时PBMC中BDNF的表达随之降低，这表型反映了先前在PINK1-KO脑中观察到的神经化学变化3。虽然暴露于心理困扰对他们的OXPHOS状态没有累加作用，但源自PINK-KO大鼠的PBMC（PINK1-KO-PBMC）响应于心理困扰所引起的氧化应激，经历了从OXPHOS到糖酵解的显着代谢转换。在应激大鼠的PINK1-KO-PBMCs中观察到的糖酵解升高与抗氧化剂蛋白，超氧化物歧化酶（SOD）2和DJ1的水平增加有关，推测是由于心理引起的线粒体功能障碍而维持了相同的ATP水平。窘迫介导的氧化应激。此外，在未接受治疗或遭受心理困扰的PINK1-KO和WT大鼠的同一队列中，PBMC中的生物能改变与运动症状的发作相吻合。
我们先前已经观察到，心理压力可诱导深刻改变在线粒体中，抗氧化反应的系统和神经营养因子的，其与生物能的改变一致的水平，这可能是由于高电平由心理痛苦诱导的氧化应激的3，6，7，8。同样，为了确定由PINK1缺失和心理困扰引起的氧化应激对同一动物群PBMC中线粒体功能和抗氧化反应途径的影响，我们评估了线粒体含量（外膜20的转位酶） （TOM20）和抗氧化剂标记（DJ-1，SOD1和SOD2），方法是对未经处理或遭受心理困扰的WT和PINK1-KO大鼠的PBMC裂解物进行蛋白质印迹（WB）。应激暴露后7天，WB分析显示PINK1-KO-PBMC中线粒体含量显着增加（TOM20增加，p≤0.01，图 1a），抗氧化能力增强（SOD2和DJ1的水平增加，p≤0.05）。 ，图 1b，d）。此外，WT-PBMCs暴露于心理困扰后，线粒体含量和SOD2水平显着下降（p≤0.001，图 1）。
PINK1-KO-PBMC中的线粒体抗氧化剂水平和线粒体含量会因心理困扰而升高。（a）源自PINK1-KO和WT大鼠的PBMC中的线粒体含量（TOM20水平），（b）DJ-1水平，（c）SOD1水平，（d）SOD2水平。将原始WB图像作为补充图S1添加 到补充数据文件中。相对于WT S-组，对每种蛋白质标记物的免疫反应性的光密度分析进行了标准化。对于对照组（S-），n = 13，每种表型，4只雌性和9雄性，对于在第3天处死的应激组（S +），n = 9，每种表型，4女性和5雄性，在第10天，n = 4 WT雄性和5 PINK1-KO雄性。数据表示为平均值±平均值的标准误（SEM）；* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001，**** p≤0.0001，两尾学生t检验。
考虑到心理困扰显着破坏了野生型和帕金森病大鼠不同大脑区域的能量代谢3，我们假设心理困扰改变了PBMC中的生物能状态，PBMC是一种公认的外周组织，用于评估几种慢性疾病的进展并报告动物的总体健康/人7，8，55，56，57。通过使用XF代谢生物分析仪测量PBMC的生物能（OXPHOS和糖酵解），我们观察到未暴露于压力下的PINK1-KO-PBMC标准化为蛋白质含量时显示出耗氧率（OCR）的强劲增加（参见补充图。 补充数据文件（S2）中的S2，这是通过OXPHOS相对于源自WT大鼠的PBMC（WT-PBMC）的两倍增加所证明的。考虑到长期的心理困扰会改变PBMC中的线粒体水平（图 1a），我们还通过执行WB分析通过测量外部线粒体膜蛋白TOM20的水平来将OCRs值标准化为线粒体含量的水平（图 2）。因此，通过将OCR标准化为线粒体含量，PINK1-KO-PBMCs显着增加了非线粒体耗氧量（p≤0.05，图 2b），增强了线粒体基础呼吸作用（p≤0.01，图2c），最大线粒体含量 增加呼吸（p≤0.05，图 2d），质子泄漏增加（p≤0.05，图 2f）和ATP依赖性OCR（p≤0.01，图 2g），以及与WT-PBMC相比增加的基础糖酵解（p≤0.001，图 3b）。与它在维持线粒体结构/功能中的作用一致，我们的数据表明，缺少PINK1而不是暴露于心理困扰会增加PBMC中的OXPHOS和糖酵解。另一方面，长期的心理困扰（暴露于心理困扰后7天）使PINK1-KO-PBMCs中的上述OCR参数降低到与线粒体含量正常化时源自无压力动物的WT-PBMC相似的程度（图。 图2b-G ），但不是当标准化为蛋白含量（参见补充图 S2在补充数据文件中）。这些结果表明，心理困扰使线粒体总量增加了两倍，这表明OXPHOS的水平与野生型线粒体相似（当将OCR标准化为线粒体含量时），大概是对氧化应激的补偿性反应，以维持相似的水平。能源生产水平。有趣的是，心理困扰并没有破坏WT-PBMCs的能量代谢，但是它增强了PINK1-KO-PBMCs的糖酵解能力（p = 0.052，图 3c），表明长期的困扰改变了线粒体的代谢，同时增强了线粒体的代谢。 PINK1-KO-PBMC中的糖酵解。
PBMC显示出OXPHOS相对于WT-PBMC增长了两倍。（a）将OCR数据归一化为来自不受压力的PINK1-KO和WT大鼠的PBMC的线粒体含量，（b）非线粒体耗氧量，（c）基础呼吸，（d）最大呼吸，（e）备用呼吸能力，（f）H +（质子）泄漏（g）通过XF代谢生物分析仪测量的ATP产量。对于每种OXPHOS分析，在细胞中以以下最终浓度使用以下化合物：1 µM寡霉素，1.5 µM羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯基hydr（FCCP），1 µM抗霉素，100 nM鱼藤酮。对于对照组（S-），在第3天牺牲的压力组（S +），n = 14–15（每组5头女性和9–10男性），n = 10（每组5头女性和5男性）。 10每组n = 4–5个男性。对于每个队列/实验组，OCRs数据表示为相对于WT S-组时间0的百分比平均值±SEM，并通过光密度分析TOM20水平将其标准化为总蛋白质含量和线粒体含量；* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001，**** p≤0.0001，两尾学生t检验。
相对于WT-PBMC，PINK1-KO-PBMCs的基础糖酵解显着增加，而心理困扰增加了糖酵解能力。（a）在未应激的PINK1-KO和WT大鼠的PBMC中分析了细胞外酸化率（ ECAR）数据，（b）基础糖酵解，（c）的糖酵解能力。对于每个ECAR分析，在细胞中以以下最终浓度使用以下化合物：1 µM寡霉素，1.5 µM FCCP，1 µM抗霉素，100 nM鱼藤酮。对于对照组（S-），n = 14–15（每组5名女性和9–10男性），对于在第3天牺牲的压力组（S +）（每组n = 10、5名女性和5男性），以及第10天，每组n = 4-5名男性。对于每个队列/实验条件，ECAR数据表示为相对于WT S-组时间0的平均百分比±SEM，并标准化为总蛋白质含量；* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001，**** p≤0.0001，两尾学生t检验。
此外，为了了解在PINK1-KO-PBMC中哪种生物能途径（糖酵解或OXPHOS）受到更大的影响，我们绘制了基础状态下OCR与ECAR的比率（基础OCR / ECAR比，图 4a）以及何时MMP 对于每个队列和实验条件，通过暴露于FCCP（最大OCR / ECAR，图4b）而使α-β折叠 。总的来说，我们观察到与糖酵解相比，PINK1-KO-PBMCs适度地更多地依赖于OXPHOS（基础值和最大OCR / ECAR值> 1）（图 4）。与此观察结果一致，WT-PBMC中主要在糖酵解作为能量主要来源依赖当FCCP注射（图 4B），如在以前的研究报告50，54。然而，源自长期处于心理困扰的PINK1-KO大鼠的PBMC将燃料利用转向了糖酵解，尽管这种变化不明显（p = 0.07，图 4），但在WT-PBMC中却没有。
PINK1-KO-PBMCs相对于糖酵解显示出较高的OXPHOS率。（a）PINK1-KO和WT大鼠的基础OCR / ECAR和（b）最大OCR / ECAR。对于每个队列/实验组，OCRs数据表示为相对于WT S-组时间0的百分比平均值±SEM，并通过光密度分析TOM20水平将其标准化为总蛋白质含量和线粒体含量；对于每个相应的队列/实验条件，ECAR数据表示为相对于WT S组时间0的平均百分比±SEM，并相对于总蛋白质含量进行了标准化。对于对照组（S-），n = 14–15（每组5名女性和9–10男性），对于在第3天牺牲的应激组（S +），n = 10（每组5名女性和5男性），并且在第10天，每组n = 4–5个雄性。* p≤0.05，** p≤0.01，两尾学生t检验。
鉴于OXPHOS和糖酵解在本质上是相互联系的（Warburg效应），我们绘制了每个动物组相对于基础ECAR的平均基础OCR相对于每个队列/治疗PBMC的生物能态的总体度量。简而言之，我们观察到，相对于WT-PBMC，PINK1-KO-PBMC显示出显着增加的OCR和ECAR，这表明PINK1的缺乏增强了这些细胞的基线生物能状态。然而，心理困扰并未进一步改变PINK1-KO-PBMC中的基线OCR或ECAR（图 5a）。
心理困扰增加了野生型动物的滑倒次数，而没有改变PBMC中的生物能参数。压力和非压力WT大鼠（分别为WT S +和WT S-）以及压力和非压力PINK1-KO大鼠（分别为PINK1-KO S +和PINK1-KO S-）的PBMCs的生物能参数与运动功能障碍相关如同一组动物在光束平衡测试中的打滑次数（打滑数量，n轴，x轴）所表示。通过允许动物越过2 m长的楔形梁与地面成15°角，该测试用于测量精细的运动协调性。对大鼠进行了一次训练，随后进行了三项试验，它们之间休息了1-2分钟，如前所述3。（一个）基础糖酵解与基础呼吸的关系，（b）ATP产量与玻片数量，（c）基础呼吸与玻片数量，（d）基础糖酵解与玻片数量，以及（e）糖酵解能力与玻片数量。应激组代表在第3天和第10天均获得的样品。OCRs数据表示为每个队列/实验组相对于WT S-组时间0的均值±SEM百分比，并通过光密度法对总蛋白质含量和线粒体含量进行标准化TOM20水平；对于每个相应的队列/实验条件，ECAR数据表示为相对于WT S组时间0的平均百分比±SEM，并相对于总蛋白质含量进行了标准化。
为了将在同一群动物中未治疗或暴露于心理困扰的PINK-KO大鼠的PBMC中观察到的生物能改变与运动症状相关联，在分析中分析了不同的生物能参数（ATP产生，基础呼吸，基础糖酵解和糖酵解能力）。通过计算束平衡测试中的脚滑次数，将PBMC与运动症状进行对照，如先前报道3。在野生型动物中，即使在PBMC中ATP依赖性OCR的变化不明显，暴露于心理困扰的脚的滑倒和摔倒的次数也几乎翻了一番（图 5b）。）。另一方面，相对于野生型，PINK1-KO大鼠的滑倒次数增加了三倍，与ATP依赖性OCR和基础呼吸产生的1.5倍增加呈正相关（图 5b， c，p ＜0.01）。因此，缺少PINK1会导致PBMC中的生物能改变，这种改变与运动症状呈正相关。此外，在PINK1-KO大鼠中观察到的脚滑次数的增加也与PINK1-KO-PBMC中糖酵解的增强有关（图 5d，e）。
鉴于在BDNF和其它神经营养因子的水平的降低已在从PD患者和在PD的动物模型中的死后脑组织和血清中观察到36，37，38，39，我们推测，BDNF的PBMC中的水平将也可以减少，这与PD病理学是一致的。实际上，PINK1-KO-PBMCs的细胞内BDNF水平显着降低（p≤0.01，图 6）。另一方面，心理困扰并未改变WT和PINK1-KO细胞中的BDNF水平。鉴于BDNF已上报调节白细胞线粒体代谢和功能45，58，59，我们的WB数据提出了在PINK1-KO-PBMC中观察到的低细胞内BDNF水平可能导致线粒体功能降低的可能性。
PINK1-KO-PBMCs的BDNF水平显着降低。将每个队列/治疗的BDNF成熟形式的密度分析（mBDNF）标准化为WT S-组。n = 10（每组5名女性和5名男性）。立即处死动物以暴露于应激（第3天）。数据表示为平均值±SEM；** p≤0.01，两尾学生t检验。
本研究揭示了PINK1在调节生理条件和病理条件下，在心理困扰引起的氧化应激和PD 3大鼠模型中，在调节PBMC的生物能状态中所起的重要作用。
的确，从年轻PINK1-KO鼠的PBMC显示，同时进行文本识别一个显著增加两倍和基底糖酵解相比于WT大鼠（图 2 - 3）。在不同的细胞类型，先前的研究已经表明，PINK1缺乏诱导线粒体代谢慢性破坏，推测是由于PINK1的自噬在调节规范作用和在控制线粒体功能和结构14，16，18，29，60。考虑到PINK1在调节线粒体对钙的适当调节中的关键作用，缺乏PINK1会引起线粒体中钙的病理性蓄积，从而刺激自由基的产生，进而导致线粒体功能障碍61。在神经元中，PINK1是一种细胞保护性丝氨酸/苏氨酸激酶，因为缺少PINK1会促进线粒体功能障碍，线粒体片段化并加速神经元的凋亡。但是，尚未阐明神经元相对于其他细胞类型的选择性脆弱性的分子机制。确实，缺少PINK1功能会在不同细胞类型中诱导对线粒体结构/功能的不同影响。例如，相对于WT细胞，PINK1-KO肌细胞表现出较高的MMP，而PINK1-KO神经元表现出较低的MMP。此外，相对于PINK1-KO神经元，PINK1-KO心肌细胞显示出更高的糖酵解能力，而两种细胞类型均显示出呼吸功能受损34。就像在PINK1-KO心肌细胞中一样34，我们在PBMC中的生物能数据表明PINK1-KO-PBMC表现出明显的糖酵解增强。与神经元不同，这些已发表的观察结果表明，非神经组织可能显示出增强的糖酵解作用，这是对线粒体功能障碍的补偿性反应，这归因于PINK1功能的缺乏，与神经元相比，PINK1功能可以赋予它们抵抗毒性侵害的能力。
在我们先前的研究中，两个半月大的PINK1-KO大鼠表现出轻度运动障碍，脑能量代谢无明显改变，但SN神经元有中等但明显的神经退行性变。有趣的是，年轻的PINK1-KO大鼠在前额叶皮层3中显示出明显的生物能改变（OXPHOS和糖酵解）。但是，PINK1-KO大鼠在22岁8个月时表现出严重的运动缺陷和神经退行性变。我们的研究首次报道了来自年轻PINK1-KO大鼠的PBMC的代谢变化，与同一组中脑多巴胺神经元中观察到的运动缺陷，BDNF水平降低，线粒体含量降低和抗氧化能力一致3。
基于我们的集体数据，我们提供了以下概念模型，PINK1通过该模型来调节PBMC的生物能状态。首先，在PINK1-KO-PBMCs中观察到的生物能变化可能是内在的（由于线粒体功能障碍）或可以由外部因素（例如，氧化应激增加和血流中皮质醇水平升高）诱导/加重。伴有神经变性和运动症状。在PINK1-KO-PBMC中观察到较高的OCR和ECAR，表明能量需求增加，这与过度活跃的免疫反应相一致，进而可以通过刺激慢性炎症和氧化应激而导致PD病理46。但是，我们认识到PINK1-KO-PBMCs中能量代谢的增加并不是PD特有的，因为在其他慢性疾病中已经观察到这种情况。例如，在源自糖尿病患者的PBMC中观察到了线粒体来源的OCR的增加，这种现象与氧化应激的增加有关62。同样，来自ME / CFS患者的PBMC显示线粒体呼吸改变，包括ATP产生增加57。同样，在自闭症谱系障碍患者PBMC中观察到最大呼吸和线粒体储备能力显着增加55。此外，我们观察到PBMC的生物能状态与运动功能障碍之间存在高度相关性（图 5）。）。因此，PBMC中的高能量产生可归因于神经免疫轴的损伤或高氧化应激状态（例如神经元和免疫细胞中线粒体功能的破坏），这与帕金森氏样运动的发展高度相关症状。
在静止状态下，WT-PBMC依赖于OXPHOS和糖酵解产生能量，而暴露于心理困扰并没有改变WT-PBMC的生物能状态（图 5a）。最大OCR / ECAR比值的降低（图 5b）表明，当质子梯度和MMP被FCCP 53破坏时，WT-PBMC优先使用糖酵解作为主要燃料。该数据与先前的研究一致，这些研究表明在急性感染过程中，基础OXPHOS转移至PBMC中的糖酵解，推测是成功进行免疫反应的生理机制51。在有氧条件下增强的糖酵解是炎症反应的标志，但是，由于OCR和ECAR均同等增加，因此在PINK1-KO-PBMC中并未发生（图 4b）。我们的数据表明，PINK1的耗竭或缺乏PINK1功能会降低免疫系统对抗外来抗原或炎症刺激的能力。值得注意的是，我们的数据与以前的研究暗示PINK1的关键作用，调节免疫反应一致30，31。
在我们最近发表的研究中，观察大脑中的能量代谢受心理困扰的不利影响，因为两者同时进行文本识别和ECARs前额皮质显著减少，在SN随之增加来自两个年轻强调WT和PINK1-KO鼠3。此外，脂质过氧化，DNA损伤和蛋白质结构的改变在从心理上苦恼大鼠的PBMC中观察到7，8。但是，心理困扰并未显着改变WT-PBMC的整体生物能状态，而PINK1-KO细胞则表现出糖酵解能力的增强（图 3）。）。基础OCR / ECAR比值表明，相对于处于静止状态的WT细胞，PINK1-KO-PBMC主要使用OXPHOS（图 4a）。但是，当用呼吸解偶联剂（最大OCAR / ECAR比）处理线粒体时，压力PINK1-KO细胞会适度地从OXPHOS转变为糖酵解（图 4b）。），表明PINK1的耗尽会降低心理困扰引发的氧化应激期间的线粒体效率。虽然短期或长期心理困扰适度影响PBMC的生物能状态，但我们的WB数据显示，短期心理困扰显着降低了线粒体含量以及SOD2和DJ-1（两种主要的线粒体抗氧化剂）的水平。此外，我们的WB数据表明，长期而非短期的心理困扰导致线粒体（TOM20）水平和抗氧化能力显着增加（图1）。 ），提示PINK1缺乏和心理困扰引起的氧化应激可能会刺激线粒体的生物发生，并增加线粒体来源的抗氧化剂的代偿性增加。然而，心理困扰的PINK1-KO大鼠的PBMC中线粒体水平的增加与糖酵解增强相吻合。因此，我们的数据表明，在PINK1-KO-PBMC中，心理困扰会刺激糖酵解，并同时降低较大线粒体中的OXPHOS。我们汇编的生物能数据表明，与未受压的PINK1-KO-PBMC相比，长期受压的PINK1-KO-PBMC的线粒体效率低下。因此，63。此外，根据现有的生物能数据，WT和PINK1-KO之间以及心理困扰之前/之后的活跃线粒体百分比对于所有不同的实验组和条件都可能是相似的，前提是需要产生OCR的百分比不论动物是否遭受心理困扰，PINK1-KO-PBMC中的ATP（ATP依赖性OCR）都比WT-PBMC中的ATP高约40％（图 2）。虽然我们编制的数据显示，由于缺乏PINK1和暴露于心理困扰可能的生物能量状态和抗氧化反应中外周血单个核细胞（图产生不利影响。 2 - 5），需要进一步研究PBMC中氧化还原状态（ROS种类的水平）和线粒体的跨膜电位，以证实这些观察结果。尽管如此，这项研究为进行更多的实验铺平了道路，以更多地了解WT与PINK1-KO受心理困扰的动物的PBMC产生的特定氧化还原物质。尽管我们无法准确确定何时暴露于遭受心理困扰的动物的PBMC中氧化应激（例如，超氧化物，过氧化氢和羟基自由基的增加）增强，但我们先前已经发表了心理困扰导致大量脂质，蛋白质和DNA氧化的分析（通过SR分析） -μFTIR 7，8，在后应激暴露五天从WT大鼠的PBMC。
此外，PINK1-KO-PBMCs的BDNF水平也发生了改变。相对于WT-PBMC，在PINK1-KO-PBMC中观察到细胞内BDNF的水平显着降低（图 6）。与我们在PBMC中获得的数据一致，在同一组年轻的PINK1-KO大鼠中，表现出运动功能障碍和焦虑感增加，在中脑中观察到细胞内BDNF水平显着降低3。然而，心理困扰并没有显着影响PBMCs中BDNF的细胞内水平，这表明心理困扰引起的氧化应激对脑和周围组织中BDNF的水平产生了不同的影响。BDNF参与维持神经元的神经元稳态，并调节免疫细胞中的某些生理功能。确实，以前的研究表明，这种神经营养因子调节神经免疫轴，并调节参与细胞存活，生长和功能的信号通路（例如Ras-PI3K-Akt和Ras-MAPK-Erk）64。BDNF是神经元的体内平衡中死后脑组织，外周血单个核细胞，血清或血浆从人BDNF的水平改变临界已经与主要的临床抑郁症和其他情绪紊乱的发作相关58，64或PD 36，37，38，39，40，41，65，66。PBMC是BDNF的重要来源，并表达高水平的相关受体酪氨酸蛋白激酶受体B（TrkB）。最近的研究已经表明，BDNF是用于调节免疫系统的BDNF结合TrkB激活临界的PBMC 45，58，59和调节连接神经和免疫系统 67的自分泌和旁分泌信号传导。此外，BDNF在B细胞中具有突出的自分泌功能，因为它在高氧化应激条件下在凋亡途径的调节中起着至关重要的作用 68。这种神经营养因子被认为是心境障碍，神经退行性疾病或脑损伤的潜在治疗标记 64，69，并且在剧烈的体育锻炼期间被升高 70。PBMC中BDNF含量的降低与多种慢性神经免疫疾病（包括多发性硬化症 71）或脑部炎症 45的神经病理学有关。。有趣的是，一些抗抑郁药66调节并改善血浆和免疫细胞中BDNF的水平。
尽管在大脑中已经广泛研究了PINK1与神经退行性病变的关系，但仍不清楚PINK1在外周组织中起什么生理作用，以及与神经免疫轴相交的程度。本研究表明，PINK1在调节碱性条件下PBMC的生物能状态中起着至关重要的作用，并且在能量需求增加和氧化应激的情况下。出乎意料的是，PINK1的消耗会导致PBMC（OXPHOS和糖酵解）中的能量消耗显着增加，并且神经营养因子（例如BDNF）和抗氧化剂反应途径的水平随之降低。来自应激动物的PBMC过度依赖糖酵解来补偿由于缺乏PINK1和心理困扰而可能引起的线粒体功能障碍。
为了研究生物能和线粒体健康PBMC的心理困扰的影响，年轻的野生型（WT）和帕金森大鼠（PINK1-KO）由如前所述使用捕食者诱发心理困扰模型强调连续三天3。简而言之，使用了两组动物：一组用于研究急性窘迫的影响或短期效应研究（在应力暴露后的第三天立即处死动物），其中包括10只WT和10只PINK1-KO雌性。 10 WT和10 PINK1-KO公头；另一个队列研究了长期心理困扰对PBMC生物能学的影响（在压力暴露后第7天，即第10天牺牲），该行为是由8个WT和10个PINK1-KO雄性形成的（图 7））。最后，使用了六个实验组：WT无压力大鼠（WT S-），在第3天处死的WT应激大鼠（WT S +），在第10天处死的WT应激大鼠，PINK1-KO无压力大鼠（PINK1-KO S-），在第3天处死的PINK1-KO应激大鼠（PINK1-KO S +），在第10天处死的PINK1-KO应激大鼠。为便于解释数据，对照组（WT S-和PINK1-KO S-）由急性并进行长期测定，每组的最终动物数量为：对于WT S-，n = 14只大鼠，对于在第3天处死的WT S +，n = 5，对于在第10天处死的WT S +， n = 4，对于PINK1-KO S-，n = 15，对于在第3天牺牲的PINK1-KO S +，n = 5，对于在第10天牺牲的PINK1-KO S +，n = 5。
学习规划。使用捕食者诱发的心理困扰模型（从第1天到第3天）连续三天对动物施加压力。使用两个队列的动物研究心理困扰对PBMCs生物能的影响。第一组由10 WT和10 PINK1-KO雌性，10 WT和10 PINK1-KO雄性组成，用于研究窘迫的短期影响，此后，在暴露于第3天后立即处死动物。第二批队列由8名WT和10名PINK1-KO雄性组成，用于研究遇险的长期影响，并在第10天处死动物。
XF代谢生物分析仪用于分析来自无压力和有压力的WT或PINK1-KO大鼠的PBMC的生物能谱（OXPHOS和糖酵解）。有关详细信息，请参见下面“材料/方法”部分的“ OXPHOS分析和糖酵解”。此外，为了将生物能改变与参与调节抗氧化剂反应途径和OXPHOS的关键线粒体定位分子参与者水平的变化相关联，进行了蛋白质印迹（WB）分析PBMCs包括细胞溶质超氧化物在内的细胞裂解物中的抗氧化剂蛋白水平。歧化酶（SOD1），线粒体超氧化物歧化酶（SOD2），DJ-1，线粒体含量（TOM20）和脑源性神经营养因子（BDNF）表达。
为了研究急性心理困扰对PBMCs生物能的影响，我们雇用了10 WT和10 PINK1-KO女性，以及10 WT和10 PINK1-KO男性。为了研究心理困扰对PBMC的生物能的长期影响，我们雇用了8名WT和10名PINK1-KO男性。由于在上述目标蛋白质中未观察到性别相关的差异，因此为了进行统计分析，针对每个队列和实验治疗方法对所有性别的所有数据进行了汇总。
将长Evans雄性和雌性大鼠用于WT和PINK1-KO（Horizon Discovery），年龄为9至11周，体重为250 g至350 g。实验前三天，将动物分别关在笼子里，保持在25-26°C的控制温度下，在12/12 h的明暗周期内自由进食。
所有动物实验均根据动物研究：体内实验报告指南72进行，并使用美国内华达大学里诺分校的机构护理和使用委员会批准的动物实验方案（＃572）。
正如先前公布，9间到上午11点，将大鼠暴露于猫尿三天强调3，7。简要地，将动物在测试笼中适应20分钟，然后将其放回饲养笼中再休息20分钟，最后，将动物再次转移到测试笼中，在该测试笼中浸有尿布。绞死了 从三只不同的猫的膀胱中收集猫尿。在每块棉布上分配约0.5 mL的棉布，最后在-20°C下保存，直到使用7。
通过吸入5％异氟烷麻醉大鼠。然后使用含有7.2 mg K 2 EDTA的真空管经心脏穿刺抽出血液。血液，然后用1X PBS（137mM的氯化钠，8.2 mM的钠稀释2 HPO 4，1.5mM的KH 2 PO 4，3.2毫米氯化钾，pH 7.4）中和慢慢地转移到60％的Percoll溶液床。在30°C下以1,000×g离心30分钟后，保存沉淀中的PBMC，并用补充有25 mM葡萄糖和0.1％BSA的1X PBS 7洗涤两次（600×g进行10分钟）。然后将细胞沉淀重悬于补充有10％FBS和2 mM谷氨酰胺的温热DMEM中。
OXPHOS和PBMC中的电平从糖酵解衍生无应力，并强调WT和PINK1-KO鼠通过采用海马XF24胞外通量分析仪（安捷伦，圣克拉拉，CA）测量如先前公开的73，74，但进行了以下较小修改。简而言之，通过定量以下参数来监测实时的耗氧率（OCR）（它是OXPHOS的指标）和细胞外酸化率（ECAR）（它是糖酵解的间接测量值）：非线粒体耗氧量（注射鱼藤酮和抗霉素-A后测量的OCR），基础呼吸（将细胞暴露于ATP合酶抑制剂寡霉素之前测得的最后一个OCR），最大呼吸（接触细胞后获得的最大OCR率测量值）线粒体解偶联剂FCCP），质子（H +）泄漏（注射寡霉素后测得的残留OCR减去鱼藤酮/抗霉素A注射后获得的OCR），ATP的产生（基线OCR减去将细胞暴露于寡霉素后获得的OCR）和线粒体储备能力（最大OCR）减去基础OCR）。此外，还评估了以下ECARs参数：基础糖酵解（寡聚霉素注射前测量的最后ECAR）和糖酵解能力（FCCP注射后最大ECAR与寡聚霉素注射前的最后速率之间的差）。也，
分离PBMC后，对细胞进行计数，并稀释至终浓度为7×10 6个细胞/ mL，将其悬浮在预热的37°C DMEM中，其中补充有10％FBS和2 mM L-谷氨酰胺。接下来，将100 µL中的7×10 5个细胞接种到24孔XF细胞培养微孔板的每个孔中。每只动物一式五份接种细胞，每种条件最多接种4只动物。在37°C和5％CO 2下孵育2小时后，将细胞附着在孔的底部，并用补充了25 mM葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠的pH值的温XF培养基洗涤两次7.4。然后将细胞在非CO 2中于37°C孵育1小时孵育器，最终体积为630 µL。此外，通过细胞外通量分析仪注射药物，并将每个孔中的细胞暴露于终浓度为1 µM的寡霉素（1404-19-9，Sigma Aldrich），1.5 µM的羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯（（FCCP，370） -86-86，Sigma Aldrich），1 µM抗霉素A（1397-94-0，Sigma Aldrich）和100 nM鱼藤酮（R8875，Sigma Aldrich）在每孔的最终体积为860 µL，如先前所发表的73。每个微孔板有四个空白孔，用于评估OCR和ECAR的背景水平。为了评估XF代谢生物分析仪中的基线OCR，评估了四个周期，最多使用五个周期来评估ATP依赖性OCR，使用五个周期来评估最大的OCR，而使用三个周期来测量线粒体依赖性的OCR。 。将测量周期编程为包括3分钟的混合，3分钟的等待以及2分钟的OCR和ECAR测量。请注意，OCR和ECARs数据已标准化为蛋白质浓度（使用Bradford方法进行蛋白质定量75），分别为pmol的O 2 / min /μg和mpH / min /μg，如先前发布的3。。此外，通过使用WB分析获得的TOM20水平的光密度分析，将OCRs数据标准化为线粒体含量。
将未经处理或患有心理困扰的WT或PINK1-KO大鼠的PBMC在冷RIPA缓冲液（150 mM NaCl，1％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，50mM Tris）中匀浆碱，2 mM苯甲基磺酰氟，pH 8.0）并在4°C下以19,000 xg离心20分钟。使用Bio-Rad minigel系统（Hercules，CA，美国），在100伏特的12％SDS-PAGE凝胶上对大约25–30μg细胞裂解物进行电泳。然后使用Bio-Rad半干转移设备（Hercules，CA，美国）将SDS-PAGE凝胶中包含的蛋白质在15 V下转移至PVDF膜1小时。简而言之，将PDVF膜在1％TBST（19.8 mM Tris，150 mM NaCl，0.05％Tween-20，pH 7.6）中的4％牛奶中封闭1小时，然后在4°C下与针对以下抗原的以下主要人类抗体孵育至少12小时：SOD1（Abcam，ab16831，1：2000，17 kDa），SOD2（Abcam，ab13533，1：5000，25 kDa ），DJ-1（Abcam，ab76008、1：5000、23 kDa），BDNF（Abcam，ab108319、1：500、14和28 kDa），TOM20（Santa Cruz，sc11415、1：500、17 kDa）或β -微管蛋白（Abcam，ab131205，1：5000，50 kDa）。然后将PDVF膜在1X TBST中充分洗涤（每次洗涤5-10分钟），并与各自的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗在室温（25°C）下孵育至少2 h：兔IgG（Invitrogen，65–6120，1：5000）和山羊抗小鼠IgG（Invitrogen，62–6520，1：5000），最后通过化学发光检测（ChemiDoc MP Imaging System 170–8280，Bio-Rad，先前发布的）SOD2（Abcam，ab13533、1：5000、25 kDa），DJ-1（Abcam，ab76008、1：5000、23 kDa），BDNF（Abcam，ab108319、1：500、14和28 kDa），TOM20（Santa Cruz ，sc11415、1：500、17 kDa）或β-微管蛋白（Abcam，ab131205，1：5000，50 kDa）。然后将PDVF膜在1X TBST中彻底洗涤（每次洗涤5-10分钟），并与各自的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗在室温（25°C）下孵育至少2 h：兔IgG（Invitrogen，65–6120，1：5000）和山羊抗小鼠IgG（Invitrogen，62–6520，1：5000），最后通过化学发光检测（ChemiDoc MP Imaging System 170–8280，Bio-Rad，先前发布的）SOD2（Abcam，ab13533、1：5000、25 kDa），DJ-1（Abcam，ab76008、1：5000、23 kDa），BDNF（Abcam，ab108319、1：500、14和28 kDa），TOM20（Santa Cruz ，sc11415、1：500、17 kDa）或β-微管蛋白（Abcam，ab131205、1：5000、50 kDa）。然后将PDVF膜在1X TBST中彻底洗涤（每次洗涤5-10分钟），并与各自的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗在室温（25°C）下孵育至少2 h：兔IgG（Invitrogen，65–6120，1：5000）和山羊抗小鼠IgG（Invitrogen，62–6520，1：5000），最后通过化学发光检测（ChemiDoc MP Imaging System 170–8280，Bio-Rad，先前发布的）17 kDa）或β-微管蛋白（Abcam，ab131205，1：5000，50 kDa）。然后将PDVF膜在1X TBST中彻底洗涤（每次洗涤5-10分钟），并与各自的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗在室温（25°C）下孵育至少2 h：兔IgG（Invitrogen，65–6120，1：5000）和山羊抗小鼠IgG（Invitrogen，62–6520，1：5000），最后通过化学发光检测（ChemiDoc MP Imaging System 170–8280，Bio-Rad，先前发布的）17 kDa）或β-微管蛋白（Abcam，ab131205，1：5000，50 kDa）。然后将PDVF膜在1X TBST中彻底洗涤（每次洗涤5-10分钟），并与各自的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗在室温（25°C）下孵育至少2 h：兔IgG（Invitrogen，65–6120，1：5000）和山羊抗小鼠IgG（Invitrogen，62–6520，1：5000），最后通过化学发光检测（ChemiDoc MP Imaging System 170–8280，Bio-Rad，先前发布的）3。
标准化为β微管蛋白，并通过使用25个像素的滚球半径用背景校正的通过使用ImageJ的NIH软件1.50i（贝塞斯达，MD）和为每个感兴趣的免疫反应条带的集成密度进行光密度分析3，15。
代谢数据表示为相对于无应激组（WT S-）的WT的平均百分比±SEM。WB数据表示为相对于WT S-组的平均值±SEM任意单位。GraphPad Prism软件（6.0版）用于Student的t检验（两尾）分析，p值小于0.05被认为具有统计学意义。
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