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造血干细胞和祖细胞限制的Cdx2表达诱导转化为骨髓增生异常和急性白血病

二维码

发表时间：2020-06-18 11:32作者：武汉新启迪生物Xinqidibio来源：www.qidibio.com

摘要

尾端相关的同源盒转录因子CDX2在白血病细胞中表达，但在正常血液形成过程中不表达。Cdx2的逆转录病毒过度表达在小鼠中诱导AML，但是CDX2发挥其作用的发育阶段尚不清楚。我们开发了条件诱导型Cdx2小鼠模型，以确定在造血干细胞和祖细胞（HSPC）中体内诱导型Cdx2表达的影响。Cdx2转基因小鼠发展成骨髓增生异常综合症，并发展为急性白血病，并伴有其他驱动程序突变。表达Cdx2的HSPCs富集与促分化转录因子相关的造血特异性增强子。此外，用阿扎胞苷治疗Cdx2 AML可减少白血病负担。与间歇性的高剂量阿扎胞苷相比，低剂量的阿扎胞苷的延长调度显示出更大的疗效，后者与更具体的表观遗传调控有关。HSPC中的条件性Cdx2表达是新生白血病转化的诱导模型，可用于优化高危AML的治疗。

介绍

尾相关的同源盒基因CDX2没有在正常的造血干细胞（HSC）中表达，但是在〜表示90％的急性粒细胞性白血病（AML）患者的1，2，以及那些具有高风险的骨髓增生异常综合征（MDS ）和晚期慢性粒细胞白血病（CML）。逆转录病毒Cdx2的骨髓（BM）祖细胞有助于在体外的自我更新和表达导致在体内移植串联AML 1，2，3。CDX2被认为是白血病生长所必需的，因为人类CDX2的敲低由慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）会损害AML细胞系的生长并降低体外克隆性1。这些数据表明异常Cdx2表达可能促进HSC转化为白血病干细胞（LSCs）。

CDX2起着胚胎发育和早期发展造血关键作用，4，5，6。鼠胚泡中Cdx2的损失会导致死后 3.5天的致死率7。Cdx2是滋养外胚层的关键调节剂，是第一个在哺乳动物胚胎中分化的细胞谱系8。胚胎干细胞（ESC）中Cdx2的下调会引起多能性标记Oct4和Nanog的异位表达，而Cdx2的上调会触发滋养层分化。Cdx2也是在体外滋养层干细胞的自我更新，这表明对于一个关键作用必不可少Cdx2的在ESC命运说明书7，8，9，10。在发育造血，CDX2和其他尾相关的家族成员（CDX1和CDX4）是同源框（的转录调节HOX）基因11，12，13。HOX基因功能与ESC和HSC中的自我更新途径以及异常HOX对这些途径的激活密切相关表达已经牵涉在白血病14，15，16，17。尽管这种关联，之间的直接相互作用的证据CDX2和HOX集群缺乏18，19。CDX2也可以经由非HOX途径，包括通过下调作用KLF4 20，21。因此，了解CDX2在血液恶性肿瘤中的靶标和转化机制可能为治疗白血病患者提供新的机会。

肿瘤发生的逆转录病毒过表达模型为研究遗传突变的功能后果提供了强大的工具。但是，这些模型也有局限性，包括离体操作细胞和优先增殖性祖细胞的转导，而不是长期的HSC。为了克服这些障碍并了解HSC体内转化的机制，我们在造血干细胞和祖细胞（HSPC）中生成了Cdx2过表达的转基因模型，以描述转录失调的细胞动力学。异位Cdx2HSPC中的表达会导致致命的MDS，其特征是血细胞计数异常，异常性粒细胞减少和血小板减少，然后在存活小鼠的百分比中二次转化为急性白血病（AL）。这取决于HSPC中Cdx2的表达，因为髓样限制的Cdx2的表达减弱了表型。出乎意料的是，我们观察到Cdx2 HSPC 中Hox簇基因的表达减少和分化因子的上调，这表明非Hox介导的途径驱动了这些血液疾病。Cdx2驱动的白血病对阿扎胞苷敏感，与在较短的时间表中服用较高剂量的药物相比，在延长的时间表中服用较低剂量的药物敏感性更高。这项工作提供了逐步向AML转化的MDS模型，可用于为MDS和AML多谱系异常增生的患者提供临床相关信息。

结果

Cdx2的异位表达改变了HSPC的功能

为了检查Cdx2表达在成人造血中的作用，我们通过在小鼠CAG启动子和loxP侧翼终止盒的下游插入Cdx2（NCBI基因ID：12591）和mCherry（Clontech）开放阅读框来产生转基因小鼠C57BL / 6 ES细胞（LSL- Cdx2- mCherry，TaconicArtemis）的Rosa26基因座。Cdx2和mCherry cDNA由T2A自切割肽隔开，该肽在Crex切除loxP位点之间的终止盒后允许两种蛋白的共表达。因此，mCherry报告了Cdx2的表达在Cre重组酶介导的激活后细胞中表达（补充图 1a）。所述LSL- Cdx2的 -mCherry小鼠杂交以硬皮病 -CreER Ť小鼠22产生后代可诱导地表达Cdx2的-mCherry的在HSC中以下他莫昔芬曝光（SCL：Cdx2的;补充图 1b中）。给Scl：Cdx2和对照小鼠（Ctrl;由基因型的小鼠：C57BL / 6野生型[WT]，Scl-CreER T和LSL-Cdx2-mCherry组成）喂食含有他莫昔芬（400 mg / kg）两个星期。Cdx2通过在整个BM上的蛋白质印迹和定量逆转录酶PCR（qRT-PCR），在mCherry阳性BM细胞中证实了其表达（补充图 1c，d）。Scl：Cdx2小鼠在两周时通过流式细胞仪显示了mCherry的表达，而在他莫昔芬治疗后的四周中它进一步上升（图 1a）。为了评估先前发表的逆转录病毒模型1和Scl：Cdx2转基因细胞之间的Cdx2表达差异，我们用MSCV-IRES-GFP（MIG）-Cdx2和MIG-Empty逆转录病毒转导了Scl - CreER T谱系阴性BM。逆转录病毒CDX2过表达导致CDX2表达比Scl：Cdx2转基因细胞高约900倍，这可能解释了表型差异（补充图。 1d）。

与对照小鼠相比，Scl：Cdx2小鼠的PB中B220阳性B细胞和CD3阳性T细胞减少，同时Gr1阳性髓样细胞增加（图 1b），并且与总PB白细胞计数无关（补充图 1e）。在BM中，HSC中Cdx2表达不受普通淋巴样祖细胞（CLP;谱系低 IL7Rα +）的影响（补充图 1f），双重阴性T细胞群体（DN1-4补充图1g）也不受其影响。但是，观察到B细胞祖细胞大量丢失（补充图 1h），表明Scl：Cdx2 BM中存在B淋巴细胞分化阻滞。此外，mCherry阳性细胞在富含HSC的LKS +（谱系低 c-Kit + Sca-1 +）和粒细胞巨噬细胞祖细胞（GMP；谱系低 c-Kit + Sca-1 − CD16 / 32 + CD34 +）中突出。降低巨核细胞红细胞祖先（MEP;谱系低的c-Kit +的Sca-1 - CD16 / 32 - CD34 - ）和更成熟谱系低细胞（图 1C）。与对照组相比，Scl：Cdx2小鼠中GMP的频率增加，而普通髓系祖细胞（CMP;谱系低 c-Kit+ Sca-1 – CD16 / 32 中 CD34 +）和MEPs明显降低（图 1d–g）。尽管Scl：Cdx2 BM是常细胞的，但在Scl：Cdx2 BM中也观察到了绝对CMP和MEP细胞计数的减少（补充图 1i-1）。这些数据验证了该模型，表明Cdx2在未成熟的HSPC亚组中优先表达，从而导致向粒细胞谱系倾斜。

CDX2在HSPC表达也导致长期造血干细胞（LTHSCs [LKS的耗尽+ CD150 +CD48 - ]）和短期的HSC（STHSCs [LKS + CD150 - CD48 - ]）在SCL中：CDX2 BM（图 1h，i，补充图 1m）。他莫昔芬诱导后四周用BM细胞进行体外集落形成细胞（CFC）分析表明，两周后，集落形成增强（图 1j），每次传代都富含mCherry阳性细胞（补充图 1n），但Cdx2表达超过两周不能促进体外连续重铺。这些LTHSC仅具有自我更新的潜能23，这表明LTHSC衰竭的细胞机制可能涉及强制的细胞周期进入和静止性丧失。为了验证这一假设，我们使用来自未诱导（幼稚）小鼠的Scl-CreER T或Scl：Cdx2供体BM（表达CD45.2）进行了体内竞争性BM移植，并与先天性标记的竞争对手野生型（WT）BM（表达CD45）混合.1）（图 1k）。在不存在他莫昔芬的情况下，移植后四周，两种基因型的供体细胞均被等效移植。Cdx2的诱导腹膜内（IP）注射5 mg他莫昔芬后的表达引起PB嵌合性的逐步丧失（图 1l），这与Scl：Cdx2 BM移植的诱导小鼠的BM HSPC群体（LKS +和LTHSC）减少有关（补充图）。。 1O-R ）。总之，这些数据表明，Cdx2的细胞内在表达损害了HSC功能，降低了维持长期造血的能力（图 1m）。

HSPC中的Cdx2表达诱导MDS和AL

在他莫昔芬诱导Cre重组酶后，Scl：Cdx2小鼠发生了多种血液系统疾病，包括MDS，骨髓增生性肿瘤（MPN）和AL（图 2a，b）。Scl：Cdx2小鼠的中位生存期为43周，而在Scl-CreER T对照中未见任何疾病（图2a，b，补充图 2a）。通过减少血细胞计数以及网状细胞增多症，红细胞破碎，异嗜单核细胞增多症和中性粒细胞发育不良来证明MDS（图 2a）。MPN的特征是白细胞增多，网状细胞增多和中性粒细胞过度分裂（图 2a，c，d）。AL通过PB和BM中的爆炸> 20％来诊断（图 2a，补充图 2b）），白细胞增多，脾肿大和贫血（图 2c，d，g）。与对照组相比，所有垂死的小鼠血红蛋白均减少（图 2e），而所有Scl：Cdx2小鼠（无论健康状况如何）均显示轻度至严重的血小板减少症（图 2f，补充图 2c）。与Scl-CreER T对照相比，所有Scl：Cdx2小鼠均表现出嗜中性粒细胞过度分裂的倾向，Gr1阳性骨髓细胞的扩增和B220 B细胞的减少（补充图 2d）。除了血小板减少症和嗜中性粒细胞异常增生外，大约20％的Scl：Cdx2小鼠未发生明显的血液病（图 2b）。

在发展为AL的小鼠中，我们观察到双相性疾病，最初是MDS（发育异常，白细胞减少和血小板减少；补充图 2h，i），随后是白细胞增多，贫血以及PB中mCherry +和c-Kit +细胞增加的后期发作（补充图 2j–m）。免疫分型显示出独特的白血病谱系承诺（图 2h）。Scl：Cdx2＃252显示c-Kit + B220 int CD3 int细胞的克隆扩增（补充图 2e），Scl：Cdx2＃882 PB白血病细胞为c-Kit + CD3 + mCherry +，代表急性T细胞白血病（补充图 2f），但大多数小鼠（＃2259，＃2261和＃472）开发急性骨髓性/赤型-骨髓性白血病具有的c-Kit +的mCherry +人口主要的Gr1 +细胞CD11b - 。（补充图 2克）。MDS在Scl：Cdx2小鼠（补充图2h-j）中随着表达mCherry的c-Kit +细胞的扩增（补充图2k-m）向AL的进化很可能是由于转化事件的获得，并且是一致的MDS后观察到继发白血病的患者。白血病是可移植的，因为在所有情况下，经辐照的受体小鼠表皮复制主要供体（图2i中的示例），并且与原始环境相比存活时间缩短（图 2j）），说明白血病克隆的迅速扩增。综上所述，这些数据表明Cdx2能够将HSPC种群原位转化为具有继发性AML的MDS忠实模型。

继发性遗传病变与Cdx2表达协同

AML转化是通过基因中的合作突变介导的，这些突变赋予细胞增殖优势以及主要损害细胞分化的途径24。为了确定合作突变是否有助于Scl：Cdx2 HSPC完全转化，我们对3个AL样品和1个MPN样品进行了全外显子组测序（WES）。WES在来自移植的白血病小鼠的CD45.2分选的细胞（即供体细胞）的基因组DNA上进行。肿瘤样品来自mCherry阳性供体细胞，并与mCherry阴性供体细胞的种系样品进行比较。我们在已知的肿瘤相关基因中发现了许多移码和非同义的体细胞突变，包括正调控（Jak1，Raf1，Zap70）和负调控（信号转导的Pten，Cgref1），细胞粘附分子（Fat1），转录因子（Etv6，Ikzf1，Trp53）和DNA结合蛋白（Nabp2）（补充表 1）。PTEN是一个已知的肿瘤抑制在人AML通常改变25，并在SCL中被突变：Cdx2的AML沿ETV6，具有经常性的融合配偶CDX2 2，26。在Fat1和Raf1中未发现其他AML单核苷酸变体（SNV）。钙粘蛋白样蛋白Fat1的功能丧失和Ras中的突变效应Raf1的也先前在AML描述27，28。Bilineage ALL细胞窝藏在移码插入IKZF1锌指蛋白，其在人B-ALL和在T-ALL在较小程度上频繁突变29，30，31，32。在酪氨酸激酶的突变JAK1（样品＃252），在T-ALL要比B-ALL更为普遍，并与不良预后相关33，34。最后，Cdx2诱导的红系骨髓性白血病＃472在通常突变的抑癌基因Trp53中隐藏了杂合性（LOH）事件的丧失。。为了进一步确定这些SNV的重要性，我们确认了它们在人类直向同源物35中与致病性SNV相似的功能蛋白结构域中的存在（示例在补充图 3a，补充数据 1中显示）。

我们未在Scl：Cdx2 MPN BM的癌症相关基因（如MSK-HemePACT癌症专栏和COSMIC 36中列出）中观察到任何SNV，表明仅在AL中发现了次级突变。

使用Beat AML试验队列37，我们发现与FLT3-ITD阴性样品相比，AML患者CDX2和FLT3显着共表达，并且FLT3内部串联重复（ITD）阳性样品中CDX2表达增加。图 3b，c）。因此，我们与携带Flt3-ITD （AML 38中常见的癌基因）的小鼠杂交时，测试了Scl：Cdx2小鼠是否会加速AML的发展（图 3a）。与单独的Scl：Cdx2小鼠和单独的Scl / Flt3 ITD / +相比，Scl：Cdx2 / Flt3 ITD / +双重突变小鼠的生存和疾病潜伏期短（图 3b）。在某些Scl：Cdx2 / Flt3 ITD / +中有白细胞增多的趋势小鼠与对照相比（图 3c，补充图 3d）。血红蛋白水平在生物学复制中表现出很大的差异，但是Scl：Cdx2 / Flt3 ITD / +与对照之间没有显着差异（图 3d）。SCL：Cdx2的/ Flt3的ITD / +双突变体显示出严重的血小板减少症（图 3E），并屈服于先进MPN（图 3B），其特征在于脾肿大（图 3F），并在Gr1的增加-与对照或比较阳性髓样细胞在PB单个敲入Cdx2小鼠（图 3g）。Scl：Cdx2 / Flt3 ITD / +中明显的髓样偏斜仅在他莫昔芬诱导后才观察到小鼠（补充图 3e，f）。尽管Scl：Cdx2 / Flt3 ITD / +小鼠具有单核细胞增多症，粒细胞增多和中性粒细胞过度分裂（图 3h），但它们并未发展为AML。总体而言，这些数据表明，异位Cdx2表达与造血细胞中的Flt3 ITD / +协同作用可加速致死性髓样疾病的发生，但不足以进行AML转化。

Cdx2仅限于骨髓祖细胞可减轻疾病

HSPC中的Cdx2表达具有致白血病作用，并导致GMP扩展（图 1g，2a）。我们使用LysM -Cre（Lyz2- Cre）在GMP和终末分化的髓样细胞中表达Cdx2，但不使用HSC来测试仅髓样细胞中的Cdx2表达是否足以用于AML（图 4a）。从GMP阶段开始，mCherry的表达只对髓样细胞有效，而在没有髓样的CMP，HSC或MEP中则不是如此（图 4c）。此外，mCherry仅存在于PB的终末分化Gr1阳性细胞中，而在B220阳性和CD3阳性淋巴样细胞中则不存在（图 4b）。）。LysM：Cdx2小鼠死于长潜伏期MPN（图 4d，e）。与LysM-Cre对照（图4f，g）相比，LysM：Cdx2小鼠具有明显的嗜中性粒细胞过度分裂，伴有白细胞增多，贫血和脾肿大（图 4h-j），但与Scl：Cdx2小鼠不同，它没有血小板减少症（补充图 4a）并且没有发展出继发性AML。LysM：Cdx2小鼠的白细胞（WBC）计数显示，随着年龄的增长，进行性白细胞增多和髓样倾斜（补充图 4b-d）。在一起，这些数据表明Cdx2表达的起源细胞从根本上影响随后的血液学表型。

Cdx2推动差异化并削弱自我更新

为了深入了解Cdx2介导的HSPC转化的基本机制，我们对Scl-Cre，Scl：Cdx2，Scl / Flt3 ITD / +和Scl：Cdx2 / Flt3 ITD / +小鼠进行了RNA测序（RNA-Seq）（在补充表2补充数据 2中概述）。他莫昔芬后四周，对LKS +细胞进行流纯化（Scl：Cdx2小鼠中mCherry阳性，补充图 5a）。如预期的那样，最上调的基因是Cdx2（图 5a）。主成分分析（PCA）显示基于基因型的聚类（图 5b）。基因集富集分析（GSEA）显示Cdx2中自我更新标记39的缺失表达细胞（图 5c），表明Scl：Cdx2导致HSC功能丧失，增殖增加和祖细胞分化。与Scl-Cre相比，mCherry阳性Scl：Cdx2 HSPC中富集的祖细胞签名得到了支持（图 5d，e，补充表 3和4）。与以前的报道表明，LSC的生存依赖氧化磷酸化40一致，线粒体代谢途径和与恶性进展相关的途径丰富（图 5f–h，补充表 3）。）表明Scl：Cdx2细胞与LSC共有基本的细胞过程。此外，与对照样品相比，在Scl：Cdx2 LKS +细胞中的细胞周期分析表明，处于静止G 0期的细胞较少，而处于G 1期的细胞增加（图 5i，补充图 5b）。有趣的是，Scl：Cdx2 LKS +细胞凋亡较少（图 5j，补充图 5c）。总而言之，Cdx2在HSPC中驱动了一个显性基因表达程序，从而导致了增殖性祖细胞样表型。

出乎意料的是，Scl：Cdx2 HSPC中的Hox簇基因被下调（补充图 5d）。其它基团已经显示增加的表达的Hox基因强迫后Cdx2的表达1，3，然而，特定的Hox基因靶物不重叠。在正常HSC功能的上下文中，下降的Hox基因功能与自我更新的损失相关41，42和进行性下调的Hox基因被认为是在正常分化（补充图 5E）43。因此，我们假设Cdx2可能与调节骨髓分化的因子结合，从而导致干细胞群体中Hox基因的下调。为了理解Cdx2的罕见的HSPC，我们利用内的调节活性甲 SSAY用于Ť ransposase 甲 ccessible Ç hromatin与高通量测序（ATAC-SEQ）上纯化，硬皮病：Cdx2的HSPC的比对照（硬皮病 -CreER Ť单独的），以确定由Cdx2 44介导的染色质可及性的变化。在表达Cdx2的细胞中总共鉴定出62,711个峰，在Scl -CreER T中鉴定出28,282个峰。两组之间共有大部分染色质可及区域（26,099）。这些共同区域以启动子元件为主，而条件特异性区域则以远端元件为主（图 6a，补充图 6b）。在Scl：Cdx2特定的远端元件中，我们发现Cdx2基序（p = 1.6e -34）集中富集，并且还属于CCAAT /增强子结合蛋白家族（Cebpb [ p = 9.8e -89 ]，Cebpe [ p = 1.6e -89 ]，Cebpa [7.5e -83 ]，Cebpd [ p = 9.2e -89 ]）（图 6b）由另一种算法确认（HOMER；45补充图 6c）。我们还将我们的数据与在GMP中执行的可公开获得的CEBPαChIP-Seq数据集（GSM1187163）进行了比较，发现Scl：Cdx2 BM的峰有明显的重叠，但Scl- Cre对照样品的峰却没有重叠（图 6c，补充图 6d）。ATAC-Seq提供了Cdx2结合的表示，并表明Cdx2表达与染色质变化相关，染色质变化增加了CCAAT /增强子结合蛋白家族的前分化髓样转录因子结合位点的可及性。

协调的RNA-Seq和ATAC-Seq数据为白血病干细胞群体的转录和表观遗传重编程提供了证据。ATAC-Seq在白血病前样本中显示了丰富的早期髓样祖细胞程序，在红血球性白血病中逐渐获得定型的巨核红细胞类红血球祖细胞染色质结构，在淋巴样白血病中逐渐获得淋巴染色质结构，即使这些细胞保留了干细胞表面免疫表型（补充图 6e，f）。此外，我们使用每种表达Cdx2的白血病的RNA-Seq图谱来鉴定差异表达的基因，这些基因在T-ALL（＃882）和B / T-ALL（＃252）中上调，但在其他样品中未上调（补充数据 3）。这里使用工具Enrichr 46，47，我们发现在T淋巴细胞和T细胞白血病中转录因子改变后失控的基因显着富集（p <0.05），再次显示了干细胞群体中的淋巴启动（补充数据 4）。这些数据与Cdx2诱导的转录程序引发LKS +向祖细胞分化一致。支持这一点的是，RNA-Seq还显示了Scl：Cdx2 LKS +中的Cebp家族基因上调（代表白血病前的HSPC，补充图 5f），与骨髓分化保持一致。有趣的是，来自急性白血病小鼠的转化的Scl：Cdx2 LKS + BM细胞显示出相似或降低的Cebp水平与Cebpb相比，该基因转录本与对照细胞相比有所例外（补充图 5f），这表明这些白血病细胞下调了髓样作用的效应子，将其作为转化机制。

接下来，我们进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq），以鉴定造血细胞中的Cdx2结合位点。我们通过兔抗FLAG单克隆抗体的免疫沉淀法验证了标记有FLAG表位（Cdx2-FLAG）的MSCV-IRES-GFP-Cdx2 1并证实了BaAG / F3细胞中FLAG标记的Cdx2的表达和结合（补充图 6a）。接下来，我们用Cdx2-FLAG或空载体（EV）转导了世系阴性WT小鼠BM，并进行了ChIP-Seq。Cdx2-FLAG ChIP-Seq证实了在启动子和远端区域的峰中，Cdx2基序的强烈中央富集（图 6b））。为了克服表达Cdx2的HSPC的结合信号的任何稀释，我们试图将来自谱系阴性细胞的Cdx2-FLAG ChIP-Seq数据与LKS +上的ATAC-Seq和GMP上公开可用的CEBPαChIP-Seq进行整合。在Scl：Cdx2或Scl -Cre ATAC-Seq中获得的前1000个峰显示出与Cdx2-FLAG和CEBPαChIP-Seq峰相关（图 6c），表明尽管免疫表型不同，这些细胞群也具有相似的染色质同一性。为了进一步在功能上评估HSPC和髓样祖细胞中Scl：Cdx2获得或失去的远端可达染色质区域的相关性，我们分析了ATAC-Seq和与增强子（H3K4me1）和LKS +（或MPPs）的ChIP-Seq数据相关的组蛋白甲基化标记。，CMP和GMP 43。Scl：Cdx2 HSPC在调节LKS / MPP细胞命运的增强子区域（可访问ATAC的区域或具有H3K4me1修饰的组蛋白的区域）的可及性较低（图 6c，d；补充图 6g，h）。相反，Scl：Cdx2 HSPC显示出远端增强子峰的可及性增加，该峰可调节定型的骨髓祖细胞分化（图 6c，d；补充图 6g，h）。这些数据表明Cdx2导致远端增强子的染色质重塑，偏向于与髓样分化相关的增强子的可及性增加，而具有自我更新潜能的细胞类型的增强子的可及性降低。一致地，ChIP-Seq显示了Cdx2峰在HoxA和HoxB基因座与Cdx2结合（图6e）一致，并且与Hox家族基因的转录下调相关（补充图 5d）。这些数据加在一起表明Cdx2抑制某些Hox基因并引发HSPC进行髓样分化。

Cdx2白血病对髓样疾病治疗敏感

Scl：Cdx2诱导的MDS继发转化为AML（sAML）的MDS是由人类疾病中常见的致癌突变介导的，因此，该模型为检查抗白血病药物的临床前疗效提供了机会。sAML对标准化疗无效，并与不良生存率相关。我们进行了临床前研究，以评估5-氮杂胞苷（Aza）的活性和体内机制，这是一种临床批准的高危MDS和AML 48疗法。我们评估了已经从Scl：Cdx2 AML进行二次移植的小鼠，以及支持的WT BM细胞。一旦以每天2 mg / kg的IP注射建立供体植入并开始三周休息，就开始了Aza治疗（补充图 7a），这与临床时间表相似49。在一个治疗周期后，我们观察到在经Aza处理的小鼠中WBC计数显着降低，而在用媒介物处理的对照中则没有（图 7a）。Aza小鼠的PB中mCherry细胞的明显减少和c-Kit表达得到了支持（图 7b，c）。在所有实验中，白血病都在第一个周期结束时复发，但是第二个Aza剂量给药周期导致白血病负担减轻，总生存期显着改善（图 7d）。经Aza处理的Cdx2细胞凋亡增加，表明Aza对白血病细胞具有直接细胞毒性，而对WT支持细胞或媒介物处理的小鼠的影响却最小（图 7e，补充图 7b））。我们还比较了标准的7天治疗方案（2 mg / kg，每个周期共14 mg）与在28天周期中给药14天的较低剂量的Aza（1 mg / kg，每日一次，周一至周五，共14 mg）每循环）（补充图 7C），以模拟长期暴露于低水平的药物被认为是与口服给药氮杂50，51。有趣的是，与高暴露，有限持续时间（HE-LD）的Aza相比，接受低暴露，持续时间较长（A-Z）的小鼠接受了更大的改善（图 7f，g）。这些数据在同样由Cdx2（＃2261）驱动的独立髓样白血病模型中得到证实（图 7h，），表明剂量和计划安排可能与优化MDS / AML中对Aza的临床反应有关。

在用媒介物对HE-LD和LE-ED Aza处理的小鼠的mCherry阳性LKS +细胞上进行RNA-Seq（补充图 7d，补充数据 5）。LE-ED氮杂治疗富集与DNA低甲基化（图相关基因签名 7J），根据通过氮杂延长口服给药支撑机械变化50，51。相反，HE-LD Aza处理富含DNA损伤和凋亡信号，表明该方案具有细胞毒性（图 7k，补充图 7e，f）。两组经Aza处理的细胞均表现出Trp53的显着上调和Mycn的下调（图 7l），在细胞增殖的p53和抑制的诱导支撑氮杂的一般机构52，53。Aza处理后看到的基因表达变化模仿了在AML转化之前在Cdx2表达细胞中发现的特征（图 7m），这表明Aza可以将AML还原为白血病前状态，并上调Klf4（图 7l）。已知受Cdx2抑制的基因，并已显示在AML 21中具有肿瘤抑制功能。总而言之，这些数据证明了Aza在MDS / AML中的临床前疗效，并表明与标准方案相比，延长的低剂量治疗方案可能会改善疗效。

讨论区

转录失调是一种常见的白血病机制，被认为通过改变发育线索来干扰细胞的自我更新和分化。CDX2对于确定ESC的命运至关重要，并在髓系恶性肿瘤中异常表达。我们生成了Cdx2激活的条件转基因小鼠模型，并表征了各种造血亚群中Cdx2表达的从头表型。表达Cdx2的小鼠HSPC中的人会发展出具有MDS突出特征的致死性血液病，并随后转化为AL。AL的发展显示出长期的临床潜伏期，并逐步获得致癌突变，这表明Cdx2表达使细胞处于白血病前状态，并带有允许条件的协同次级遗传事件积累。这密切反映了人类MDS向AML的发展，其中逐步的基因突变发生在HPSC内，并将这些未成熟的群体确定为体内白血病启动活性的储库。重要的是，此模型允许对Cdx2进行时间控制在HSC中的表达，导致HSPC原位转化为LSC，从而消除了HSPC群体和逆转录病毒模型的离体操作的混杂影响。

在人类中，异位CDX2表达在AML中描述，而且大约80％的新诊断的ALL或小儿ALL的54，55，强调了该模型的临床相关性。出乎意料的是，我们的模型显示了完全转化的白血病中Hox因子的强烈下调，这与其他研究3相反，并表明Cdx2可以激活许多离散的致癌途径。我们建议CDX2表达在不同情况下与HOX表达有不同的相关性。例如，CDX2的表达水平在ALL和AML样品中相当3但是，HOX解除管制在ALL中比AML少得多。此外，在胚胎发生中，Cdx2通过不依赖Hox的机制协调后发展56。与其他出版物21一致，我们经常观察到在所有AL病例中均抑制Klf4。

当Cdx2在HSPCs中表达时，小鼠表现出发展继发突变的倾向，随后发展出一系列不同谱系的AL。相反，当LysM：Cdx2小鼠中Cdx2表达仅限于髓样细胞时，则表现出更为均一的表型，以粒细胞扩张，白细胞增多和脾肿大为特征，但没有血小板减少症，这是Scl：Cdx2小鼠的特征。在此模型中未观察到向白血病的转化，这与以下假设相一致：HSPCs代表了白血病的起始种子种群，而该种子种群需要完全的疾病渗透。

由于在LysM：Cdx2 MEP中未观察到mCherry，因此在这些小鼠中血小板数量不受影响。相比之下，LysM：Cdx2和Scl：Cdx2模型中均存在超节段的中性粒细胞，这表明GMP细胞内Cdx2表达是该表型的关键。另外，在HSPC水平上的Cdx2表达也被认为会影响淋巴样谱系，突出了Scl：Cdx2细胞的多能性。强调这一点，我们观察到异常Cdx2在常见的造血发育途径中的关键调控作用。

与对照组相比，濒死的白血病前Scl：Cdx2小鼠的BM表征显示MEP相对降低，GMP相对升高。该表型可能表示在该细胞水平上的分化停滞，并且与来自人类高危MDS患者57（例如具有过量母细胞的MDS）的报告一致。最初，我们观察到Scl：Cdx2 BM的体外菌落形成适度增加，但没有永生化。在竞争性BM移植试验中，Scl：Cdx2细胞具有细胞自主性HSC自我更新缺陷。这些数据表明，Cdx2会导致克隆性受损，这种性状与MDS突变的其他动物模型相似58。

高危MDS细胞的病理变化可赋予细胞凋亡抗性，并提供生长和生存优势，导致白血病进展59。这与观察到的细胞凋亡率在低风险MDS和降低升高的高危MDS和AML一致的60，61。我们观察到Scl：Cdx2 HSPC中凋亡诱导的轻度异常，并且这些细胞易于增强循环。据认为，G 1的停滞（“增殖静止”）对于细胞命运的决定至关重要62，自我更新或增殖的决心由G 1细胞周期蛋白63在G 1期决定。。考虑到维持HSPC和LSC中自我更新与分化之间平衡的重要性，对Scl：Cdx2细胞中这些异常过程的彻底研究可能会确定白血病进化的关键调控因子。

我们没有观察到Scl：Cdx2和Flt3 ITD / +模型之间的白血病协同作用。已知癌基因的转基因单突变体模型被经常观察到不足以白血病转化64，65，66。携带杂合激活突变Flt3 ITD / +的小鼠发展出非致命性MPN，类似于慢性粒单核细胞白血病（CMML），而没有转化为AML 38。当与Scl：Cdx2小鼠杂交时，我们观察到双突变Scl：Cdx2 / Flt3 ITD / +显着加速了致死性MDS / MPN。我们推测Scl：Cdx2 / Flt3 ITD / +的疾病潜伏期较短小鼠潜在地影响在Scl：Cdx2对应物中看到的致癌进展的机会。

传统上，先进的MDS和白血病转化一直难以在动物中建模。因此，在MDS中使用阿扎胞苷的研究主要来自主要患者样本67。在Scl：Cdx2继发性白血病的移植实验中，我们发现与载体处理的对照相比，Aza延长了小鼠的存活期，并且Aza对Cdx2-mCherry阳性细胞具有优先毒性。使用给药方案相媲美CC-486口服氮杂方案在人类临床试验中使用的50，51与高剂量，有限时间表相比，低剂量，延长时间表中的Aza似乎对低甲基化基因更有效且更具特异性。这些临床前发现值得进行后续的临床试验，例如，通过对标准Aza无效的MDS患者使用延长的口服Aza时间表。我们的数据表明，单独的Aza不足以耗尽LSC，因为在1-2个疗程后所有小鼠均复发。这与临床情况是一致的，并且可能需要组合策略（例如，使用venetoclax 68）以诱导有意义的长期缓解。

总之，这项工作表征了条件性Cdx2表达模型，该模型证明了正常HSPC原位转化为MDS和AL。Cdx2改变HSPC的身份并赋予白血病前祖细胞特征，从而促进克隆进化与人类白血病的重要生物学相关性。该模型可用于研究Aza的临床疗效，并证明长期，低剂量的次甲基化剂可能会提高这些药物针对MDS和AML的特异性和功效。

方法

动物和表型分析

将实验动物维持在无病原体的动物设施中的C57BL / 6J品系上，并通过QIMR Berghofer动物伦理委员会（A11605M）批准程序。将小鼠关在干净的笼子里，用切碎的组织作为嵌套材料，并尽可能多地提供环境富集。将笼子保持在20–26°C的环境温度下，进行12小时的明/暗循环。LSL-Cdx2-mCherry小鼠由TaconicArtemis产生。Flt3 ITD / +小鼠38从珀斯的Wallace Langdon博士获得。Scl-CreER T小鼠22从墨尔本的Carl Walkley博士获得。LysM-Cre小鼠获自Jackson实验室。通过涡旋60秒将阿扎胞苷溶解在0.9％盐水中，并在两个小时内腹膜内注射。由于药物的短期稳定性，使用后将所有残留溶液丢弃。通过眼眶后静脉血液采样将外周血（PB）收集到EDTA涂层的试管中，并在Hemavet 950分析仪（Drew Scientific）上进行分析。制备PB涂片并根据制造商的方案用Wright-Giemsa（BioScientific）染色。用1 mL Pharmlyse（BD Biosciences）裂解二十微升新鲜的PB，并在4°C下用B220，CD33，Gr1，Mac1和c-Kit染色15–30分钟。使用BD FACSDiva软件（8.0.1版）在荧光激活的细胞分选仪LSRII Fortessa（BD Biosciences）上进行流式细胞仪数据收集，并使用FlowJo（9.9.6版）进行分析。除非另有说明，否则流式细胞仪抗体以1：100的稀释度使用（补充表 5）。通过冲洗股骨和胫骨来收集BM细胞。LKS +（沿袭低 cKit + Sca1 +）细胞如前所述进行染色69。简而言之，用包含生物素化抗体（B220，CD3e，CD5，Gr1，Mac1，Ter-119）的谱系混合物对细胞染色。然后将细胞用链霉亲和素，c-Kit和Sca1染色。通过添加CD34和CD16 / 32，可以鉴定出常见的骨髓祖细胞（CMP），粒细胞巨噬细胞祖细胞（GMP）和巨核细胞-类红细胞祖细胞（MEP）。短期（ST-）和长期造血干细胞（LTHSC）通过添加CD48和CD150进行染色。在4℃下孵育20-30分钟。为了分选，使用FACSAriaIII（BD Biosciences）纯化细胞。细胞周期分析是通过用LKS +的表面标记物对细胞进行染色，然后根据制造商的说明（Fix＆Perm试剂盒，Thermo Fisher）进行固定和通透性进行的。细胞用Ki-67（B56）染色（1：100）在通透缓冲液中于4°C放置30分钟。在流式细胞仪分析之前，将细胞洗涤并重悬于含有Hoechst 33342（20μg/ mL，Invitrogen）的PBS中。事件被捕获为<1000个事件/秒。通过对细胞进行LKS +标记染色并保持15分钟的孵育时间以最小化细胞死亡来进行凋亡分析。然后将洗涤的细胞在室温下黑暗中用50μLAnnexin V结合缓冲液（BD Biosciences）（1:20）中的2.5μLAnnexin V（Biolegend）染色15分钟。不洗涤细胞，并加入250μL的含有0.25μLSytox蓝的膜联蛋白V结合缓冲液（Invitrogen）。一小时内通过流式细胞仪分析细胞。事件被捕获为<1000个事件/秒。通过对细胞进行LKS +标记染色并保持15分钟的孵育时间以最小化细胞死亡来进行凋亡分析。然后将洗涤过的细胞在室温黑暗中于50μLAnnexin V结合缓冲液（BD Biosciences）（1:20）中用2.5μLAnnexin V（Biolegend）染色15分钟。不洗涤细胞，并加入250μL的含有0.25μLSytox蓝的膜联蛋白V结合缓冲液（Invitrogen）。一小时内通过流式细胞仪分析细胞。事件被捕获为<1000个事件/秒。通过对细胞进行LKS +标记染色并保持15分钟的孵育时间以最小化细胞死亡来进行凋亡分析。然后将洗涤过的细胞在室温黑暗中于50μLAnnexin V结合缓冲液（BD Biosciences）（1:20）中用2.5μLAnnexin V（Biolegend）染色15分钟。不洗涤细胞，并加入250μL的含有0.25μLSytox蓝的膜联蛋白V结合缓冲液（Invitrogen）。一小时内通过流式细胞仪分析细胞。不洗涤细胞，并加入250μL的含有0.25μLSytox蓝的膜联蛋白V结合缓冲液（Invitrogen）。一小时内通过流式细胞仪分析细胞。不洗涤细胞，并加入250μL的含有0.25μLSytox蓝的膜联蛋白V结合缓冲液（Invitrogen）。一小时内通过流式细胞仪分析细胞。

竞争性BM移植

将来自6至8周大的Scl - CreER T或Scl：Cdx2小鼠的BM细胞（1×10 6个细胞，表达CD45.2）与相等数量的年龄匹配的Ptprca CD45.1同基因竞争性BM细胞合并，然后注入致死性照射的侧尾静脉内（共11 Gy，分别在至少3小时内分开两个小部分），接种6至8周龄的C57BL6 / J×Ptprca CD45.1 / CD45.2同基因受体雌性小鼠（动物来自西澳大利亚州动物资源中心）。

菌落形成试验

用PBS洗涤BM细胞，并在35×10 mm的培养皿（Corning）中接种到1 mL甲基纤维素（M3434； Stem Cell Technologies）中。将1×10 3个 BM细胞一式三份铺板并在37℃下培养。在传代前7天后对菌落计数。

实时定量PCR

使用Maxima H Minus First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher）将RNA转换为cDNA，并根据制造商的说明使用SYBR Green（Thermo Fisher）进行定量实时PCR（qRT-PCR）。从归一化到GAPDH（5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'）的分选PB和BM细胞中确定Cdx2（5'-CAAGGACGTGAGCATGTATCC-3'，5'-GTAACCACCGTAGTCCGGGTA-3'）信使RNA水平。

免疫印迹

使用小鼠抗CDX2单克隆抗体（CDX-88; Abcam）（1：1000）和小鼠抗β-肌动蛋白（BD Biosciences）（1：5000）对Scl- CreER T和Scl：Cdx2细胞进行免疫印迹。使用小鼠抗Flag标签单克隆抗体（8146，Cell Signaling）（1：1000）对兔抗Flag免疫沉淀的pMIG-Cdx2-Flag转导的Ba / F3细胞进行免疫沉淀。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《自然研究报告摘要》。

资料可用性

目前的研究过程中产生和分析的RNA测序数据集是在GEO数据库（可用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo下SuperSeries登录号）GSE133829（GSE133679，BM LKS四周后他莫昔芬治疗；GSE133680，用Azacitidine或媒介物治疗的Cdx2介导的AML；GSE133828，Cdx2介导的急性白血病（BM LKS）。Lara-Astiaso等人发布的可公开获得的数据集。从GEO数据库获得43个，登录号为GSE60101（RNA-Seq）和GSE59992（ATAC-Seq）。小鼠GMP上Cebpa ChIP-Seq的公开可用数据集来自GEO数据库，登录号GSM1187163。

在这项研究中生成的ChIP-Seq数据集可用于Cdx2-FLAG诱导的小鼠BM，登录号为GSE146598。他莫昔芬治疗后四周在BM LKS上执行的ATAC-Seq数据集可在此处访问：https：//genome.ucsc.edu/s/JasminS/VU_2019_CDX2_ATAC。在Cdx2小鼠BM上执行的全外显子组测序（WES）数据集可从序列读取档案（SRA）获得，登录号为PRJNA552223。补充图3a和补充表 1的完整外显子组测序数据可以在补充数据1中找到。图5a–h和补充图 5d–f的 RNA-Seq数据可以在补充数据2中找到。图7j–m，补充图 5f和补充图 7d–g的 RNA-Seq数据可在补充数据5中找到。支持本研究结果的所有其他数据均可在本文及其补充信息文件中找到，并应合理的要求从相应的作者处获得。