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单克隆抗体制备-杂交瘤细胞筛选

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发表时间:2019-07-12 17:11作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

单克隆抗体制备杂交瘤细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来,通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多,通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便,便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果,以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来,在融合之前就必须建立好抗体检测方法,并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的动力学范围,即检出背景以上的最强与最弱信号之比,依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的,100%的抗原参与反应,一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面,如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原,检测系统可能需要能测出微弱信号,则动力学范围至少应为101,最好为1001。另外,检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体,就要用结合蛋白A的检测方法。

下面简要介绍几种常用的抗体检测方法:

免疫酶技术

免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强,灵敏度高,现已广泛用于筛选和鉴定单抗。

A、器材和试剂

a. 包被缓冲液:

碳酸盐缓冲液:取0.2mol/L Na2CO3 8ml0.2mol/L NaHCO3 17ml混合,再加75ml蒸馏水,调PH9.6

Tris-HCl缓冲液(PH8.00.02mol/L):取0.1mol/L Tris 100ml0.1mol/L HCl 58.4ml混合,加蒸馏水至1000ml

b. 洗涤缓冲液(PH7.2PBS):KH2PO4 0.2gKCl 0.2gNa2HPO4•12H2O 2.9gNaCl 8.0gTween-20 0.5ml,加蒸馏水至1000ml

c. 稀释液和封闭液:牛血清白蛋白(BSA0.1g,加洗涤液至100ml;或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。

d. 酶反应终止液(2mol/L H2SO4):取蒸馏水178.3ml,滴加浓硫酸(98%21.7ml

e. 底物缓冲液(PH5.0,磷酸盐-柠檬酸缓冲液):取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml0.1ml/L柠檬酸24.3ml,再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定,易形成沉淀,因此一次不宜配制过多。

f. 底物使用液:

OPD底物使用液(测490nmOD值):OPD 5mg,底物缓冲液10ml3% H2O2 0.15ml

TMBSTMB底物使用液(测450nmOD值):TMBSTMB1mg/ml1.0ml,底物缓冲液10ml1% H2O2 25ul

ABTS底物使用液(测410nmOD值):ABTS 0.5mg,底物缓冲液1ml3% H2O2 2ul

g. 抗体对照:以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照,以免疫鼠血清作为阳性血清。

h. 抗原: 可溶性抗原:尽量纯化,以获得高特异性。

病毒感染的传代细胞或全菌抗原。

淋巴细胞等悬液。

i. 酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。

j. 细胞固定液:-20丙酮;或丙酮-甲醛固定液:Na2HPO4 100mgKH2PO4 500mg,蒸馏水150ml,丙酮225ml,甲醛125ml;或丙酮-甲醛溶液(1;1);或-20甲醇。

k. 聚苯乙烯微孔板:40孔、96孔、或条孔;硬板或软板均可使用。

l. 酶联免疫阅读仪;或光镜。

        m. 吸管、加样器及水浴箱、离心机等。


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