免疫检查站封锁疗法已成为对抗癌症的主要武器。诸如抗PD-1和抗PD-L1之类的抗体药物显示出明显的优势，例如在各种癌症类型中具有广泛的适用性，并且在治疗有效时具有持久的临床反应。但是，总的反应率仍然不令人满意，特别是对于突变负担低的癌症。此外，在某些临床应用中，诸如自身免疫症状和肿瘤过度发展的不利影响呈现出明显的缺点。这些挑战反映了迫切需要充分了解免疫检查点的基本生物学。在这篇综述中，我们讨论了免疫检查点信号在多个水平上的调节，以概述我们目前对检查点生物学的理解。主题包括通过表面递送，内在化，再循环和降解来调节已知免疫检查点蛋白的表面表达水平。到达水面时，检查站会同时进行反式也顺相互作用与配体诱导信号和调节免疫反应。除了经典的检查点封锁外，针对这些途径的新型治疗策略最近已经出现并在临床前模型中进行了测试，为开发下一代免疫疗法提供了新途径。
肿瘤微环境（TME）浸入了许多类型的先天性和适应性免疫细胞，其免疫监视功能通常被多种机制以上下文相关的方式抑制。1，2信号抑制和代谢抑制表示免疫抑制的两个主要原因，并且在现有将在这里讨论。肿瘤细胞下调刺激性免疫受体的活性而上调抑制性免疫受体的活性的方式反映了信号抑制。以T细胞为例，肿瘤细胞可以通过下调表面MHC-1水平来调低T细胞受体（TCR）介导的刺激信号。3另一方面，肿瘤细胞可以通过上调表面PD-L1水平来调节PD-1介导的抑制性信号传导。4实验证明了阻断抑制性免疫受体活化可以增强免疫细胞抗肿瘤功能的概念，并在临床上转化为多种癌症的治疗方法。5，6
在过去的几十年中，已经在癌症中鉴定和研究了许多抑制性免疫受体，包括但不限于PD-1，CTLA-4，LAG3，TIM3，TIGIT和BTLA。它们被称为“免疫检查点”，是指充当免疫反应守门员的分子。在进化过程中，免疫检查点已与刺激性免疫受体共同进化，最早出现在鱼类中。7这些受体通常使用单酪氨酸信号基序，例如基于免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIM）和基于免疫受体酪氨酸的开关基序（ITSM），来传递抑制信号。作为表面分子，可通过阻断阻止配体-受体结合的抗体轻松抑制其活性。最成功的免疫检查点封锁疗法是抗PD-1 / PD-L1疗法，该疗法已被批准用于治疗多种癌症，例如血液，皮肤，肺癌，肝癌，膀胱癌和肾癌。6免疫检查站封锁疗法通常比化学疗法或靶向疗法导致更持久的反应，这可能反映了免疫系统的记忆功能。然而，随着临床数据在世界范围内积累，缺点和副作用已经开始显现出来。免疫检查点封锁疗法的主要瓶颈是在大多数癌症中其低响应率，范围为10％–30％。6对于一些主要的癌症类型，例如具有微卫星稳定性的结直肠癌，抗PD-1 / PD-L1治疗几乎没有效果。8对无反应性的机制进行了广泛的研究，发现许多相关因素，例如肿瘤突变负担，PD-L1表达水平，IFN信号传导和MHC-1丢失。9，10，11，12然而，忠实地预测疗效的生物标记仍然缺乏。因此，迫切需要更好地了解检查点生物学，以设计下一代疗法并改善当前疗法的临床方案。
近年来，许多生化和生物物理研究已经揭示了检查点表面表达的复杂调节。配体结合后，不同的检查点显示出独特的信号传导机制来抑制抗肿瘤免疫力。在这里，我们回顾了这些基本发现，并重点介绍了具有临床翻译潜力的新靶向策略。
高检查点的表面水平是TME的标志，但是对潜在机制的了解却很少。作为膜蛋白，免疫检查点在内质网（ER）中表达，然后传递至细胞表面以发挥其抑制功能，这涉及蛋白质分选系统通过高尔基体和分泌囊泡的顺序运输。在表面递送期间，糖基化用作质量控制，以确保仅将成熟和功能性的免疫检查点递送至细胞表面。13，14到达细胞表面后，免疫检查点进行内化和再循环，这提供了一个快速调节途径来调节它们的表面的水平。15，16泛素介导的蛋白质降解是控制蛋白质水平的另一个关键机制，免疫检查点可以泛素化并分类为蛋白酶体或溶酶体进行降解。这些细胞过程共同决定了免疫检查点的表面水平，以塑造细胞信号传导（图 1）。
一个 FUT8-介导的核心岩藻糖化途径所需的PD-1表面表达。内在的PD-1被FBXO38泛素化以用于蛋白酶体降解，也可以借助TOX在肝癌微环境中再循环至表面。b STT3催化的N-糖基化可稳定PD-L1表面表达。P-S195诱导的PD-L1糖基化异常导致ERAD。内在的PD-L1可以通过HIP1R分类到溶酶体进行降解，也可以在CMTM6 / 4的帮助下循环到细胞表面。PD-L1在不同情况下被不同的E3连接酶（HRD1，Cullin3-SPOP，β-TrCP和STUB1）泛素化，并被CNS5泛素化。DHHC3对PD-L1进行棕榈酰化可抑制其单泛素化和溶酶体降解。CMgat1介导CTLA-4 N-糖基化和表面保留。CTLA-4向细胞表面的运输依赖于TRIM / LAX / Rab8复合物和PLD / ARF1依赖性胞吐作用。AP-2与未磷酸化的YVKM基序的结合介导了快速的CTLA-4内在化。内在的CTLA-4在溶酶体中被降解，或者被LRBA再循环到细胞表面。TGN中的CTLA-4也可以通过AP-1结合传递至溶酶体进行降解。
人PD-1在其细胞外IgV域中包含四个N-连接的糖基化位点：N49，N58（小鼠PD-1中的N54），N74和N116。PD-1的结构表明N58处的聚糖由两个N'乙酰氨基葡萄糖和一个岩藻糖组成。17此外，全基因组CRISPR筛选确定核心岩藻糖基化途径直接调节PD-1表面水平。18质谱分析表明，所有四个N-糖基化位点均具有核心岩藻糖修饰。N49或N74的突变引起表面PD-1水平的急剧下降。核心岩藻糖基转移酶8（Fut8）的遗传消融降低了PD-1表面水平并增强了T细胞活化。18岁糖基化如何调节PD-1表达水平仍然未知。糖基可能会调节PD-1的折叠，从而影响内质网的质量控制过程。糖基化的另一个可能的作用是调节配体结合。19不同的微环境提示（例如缺氧20和营养胁迫21）可能会导致PD-1的糖基化方式不同，进而影响PD-1的功能。将来有必要进行更多的质谱研究，以了解PD-1的“糖代码”及其在特定疾病背景下的功能含义。
表面PD-1的内在化已经通过荧光成像22观察到，但是尚不清楚常规网格蛋白介导的内吞作用是否参与PD-1内在化。内在的PD-1分子可以循环回到细胞表面，也可以泛素化并分类为蛋白酶体进行降解（图 1a）。在浸润CD8 + T细胞的肝癌中，胸腺细胞选择相关的高迁移率族盒蛋白（Tox）是T细胞衰竭的主要转录因子，显示23在细胞质中发挥与PD-1结合的非常规功能，并且促进PD-1回收。24Tox是否在其他情况下也调节PD-1的回收还没有经过测试。PD-1的一种特定的E3泛素连接酶，称为F-box蛋白38（FBXO38），已经通过生化和动物实验进行了鉴定。作为包含Skp，Cullin，F-box的复合物（SCF复合物）的一部分，FBXO38可以在保守的赖氨酸位点（人PD-1中的K233）介导K48多聚泛素化。有趣的是，将多泛素化的PD-1分选到蛋白酶体而不是溶酶体进行降解。这是不寻常的，因为大多数膜蛋白通过溶酶体被内在化和降解。在TME中，由于FBXO38的转录水平较低，因此FBXO38介导的PD-1降解途径不足。发现没有伴随的CD28信号传导的TCR信号传导是FBXO38下调的原因。22持久暴露于肿瘤抗原和肿瘤细胞25上CD80 / 86的低表达可以解释TILs中FBXO38表达的降低。此外，IL-2是T细胞的主要生长因子，它可以通过STAT5介导的转录调控来拯救肿瘤浸润T细胞中的FBXO38水平。22值得注意的是，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中的FBXO38表达水平甚至比单纯T细胞低。慢性TCR信号如何下调FBXO38转录仍是一个悬而未决的问题。
确实，总体上，关于PD-1分子内在化以及随之而来的降解或再循环的过程仍知之甚少。几个有趣的问题值得进一步研究，例如PD-1内在化是否依赖信号传导以及哪个信号决定内在化的PD-1的命运，是否将其传递至蛋白酶体进行降解或再循环回细胞表面以备将来使用。这些问题对于癌细胞中的PD-L1更好理解，如以下部分所述。
PD-L1（也称为CD127，B7-H1）还包含四个N-糖基化位点：N35，N192（鼠标PD-L1中的N191），N200（鼠标PD-L1中的N199）和N219（鼠标PD中的N218） -L1）。这些修饰对于PD-L1蛋白稳定性很重要。STT3是与ER相关的N-糖基转移酶，可催化蛋白质N-糖基化的第一步。在癌干样细胞中，STT3依赖性N-糖基化稳定并上调了PD-L1的水平，这是上皮-间质转化（EMT）诱导的PD-L1富集所必需的。26相反，AMP激活的蛋白激酶（AMPK）将PD-L1 S195磷酸化会诱导PD-L1异常糖基化，并阻止其ER向高尔基体转运，从而导致ER相关降解（ERAD）。27在某些癌细胞的情况下，聚糖修饰使得传统抗体无法检测到PD-L1，从而导致对PD-L1表面水平的误解。28去除N-糖基化导致更忠实地检测PD-L1表面水平。28这一发现反映了以下事实：PD-L1的糖基化模式可能在不同的癌细胞中发生变化，这可能是由于它们的微环境不同所致，[ 29]并且某些模式阻止了常规抗体的结合。
表面PD-L1经过不断的内在化，然后循环或降解（图1b）。伴侣蛋白，含有6个（CKTM6）的类似CKLF的MARVEL跨膜结构域（属于八个具有以前未知功能的包含MARVEL结构域的蛋白的家族），调节着PD-L1的循环。CMTM6在质膜和内体均与PD-L1缔合，以利于再循环，并且还抑制了溶酶体的泛素化和降解。CMTM6缺乏的肿瘤细胞显示PD-L1循环和表面水平降低，从而导致对T细胞活性的抑制作用降低。30 CMTM4（类似于CMTM6）也具有类似的功能。31CMTM6 / 4如何支持PD-L1回收仍然不确定。鉴定出多种蛋白来调节PD-L1的溶酶体降解。HIP1R带有溶酶体分选基序，它与PD-L1的结合在AP复合物和ALIX / ESCRT的帮助下将PD-L1靶向溶酶体。32建议STUB1 E3泛素连接酶可以介导PD-L1在溶酶体中的降解。30，31STUB1是否与HIP1R合作尚不清楚。根据几个小组的工作，蛋白酶体也参与了PD-L1的降解。据报道，Cullin 3-SPOP，β-TrCP和HRD1 E3连接酶调节PD-L1泛素化和蛋白酶体降解，并且它们似乎在不同情况下调节PD-L1降解。在细胞循环过程中，PD-L1表面水平显示出明显的波动，在M和早期G1期达到峰值，而在G1和S后期则迅速下降。这种波动是由细胞周期蛋白D-CDK4-SPOP-FZR1信号通路调节的。CDK4磷酸化并稳定了SPOP，SPOP是基于Cullin 3的E3泛素连接酶复合体中的衔接蛋白，可介导PD-L1多泛素化和蛋白酶体降解。33有趣的是，糖基化可通过β-TrCP和HRD1直接影响PD-L1泛素化和降解。当PD-L1未糖基化时，它可以在T180和S184处被糖原合酶激酶3β（GSK3β）磷酸化，并募集β-TrCP来介导PD-L1泛素化和降解。34另一方面，S195磷酸化导致PD-L1异常糖基化，导致募集HRD1触发ER相关降解。27
也存在拮抗PD-L1泛素化和降解的复杂机制。据报道，COP9信号小体5（CSN5）使泛素化PD-L1，从而抑制PD-L1降解。TNF-α激活的NF-κB途径可诱导CSN5表达稳定癌细胞中PD-L1的表达。35 DHHC3在C272处将PD-L1棕榈酰化可阻止PD-L1的单泛素化，随后阻止ESCRT介导的向多囊泡体（MVB）的运输，从而抑制PD-L1溶酶体降解。36
与主要位于质膜上的PD-1不同，CTLA-4主要位于细胞内区室中。T细胞活化后，CTLA-4易位至细胞表面以介导其抑制功能。从反式高尔基体网络（TGN）到细胞表面的CTLA-4转运需要37个 T细胞受体相互作用分子（TRIM）。TRIM敲低导致CTLA-4保留在TGN中。38随后的研究表明，CTLA-4 / TRIM / LAX / Rab8复合物对于这种贩运途径至关重要。39磷脂酶D（PLD）-和ADP核糖基化因子-1（ARF1）依赖的胞吐作用也据报道触发了CTLA-4向细胞表面的运输。40
表面CTLA-4分子被快速内在化以维持相对较低的表面水平（图1c）。网格蛋白相关的适配器复合物AP-2与CTLA-4胞质域中的YVKM基序结合以介导内部化，这可以通过YVKM磷酸化来防止41。但是，另一项研究表明，在T细胞活化过程中，YVKM介导的CTLA-4内在化没有受到损害，因此表明YVKM磷酸化可能不会直接调节CTLA-4的内在化。42另一种网格蛋白衔接子复合物AP-1也与YVKM基序结合，但不同之处在于它将CTLA-4从TGN穿梭到溶酶体进行降解。43此外，CTLA-4的内在化率也受N-糖基化作用的调节。维生素D3处理可增强N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶I（Mgat1）的表达和N-聚糖的分支，从而导致T细胞内在化和CTLA-4表面水平降低。44 N-糖基化对于CTLA-4表面递送也是必不可少的。信号肽中的T17A多态性导致糖基化不足和CTLA-4表面水平降低。45 TCR信号显示增加己糖胺代谢和N-聚糖分支途径，因此增加CTLA-4糖基化和表面表达。46内体中的内在CTLA-4可以循环回到细胞表面。42LPS响应性米色样锚定蛋白（LRBA）与CTLA-4共定位在回收内体中，以协助其回收。人类患者的LRBA突变降低了调节性T细胞和常规T细胞中的CTLA-4水平，这导致了自身免疫，淋巴增生和体液免疫缺陷的表型。47
免疫检查点的抑制功能通常取决于配体诱导的信号传导。在这里，我们总结了几个研究充分的免疫检查点的配体相互作用和信号传导机制（图 2）。
一个 PD-L1和PD-L2是PD-1配体。PD-1通过磷酸化的ITSM / ITIM募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2 / SHP1，进而抑制TCR和CD28信号传导。SAP抑制SHP2活性以抑制PD-1信号传导。两个PD-1和CD80相互作用与PD-L1在顺式，以限制它的反式 PD-1的结扎。b CTLA-4与CD28竞争与CD80 / 86的结合，从而抑制CD28信号传导。CTLA-4的磷酸化YVKM基序募集了SHP2以抑制RAS。CTLA-4还通过PP2A抑制AKT活性。CTLA-4在调节性T细胞减少了对被APC CD80 / 86 反式 -endocytosis，这需要KxxKKR基序和PKCη。CTIM3在T细胞和先天免疫细胞中均表达。已鉴定出四个已知的配体：Ceacam1，Galectin9，HMBG1和PS。Galectin9与T细胞中TIM3的糖基化IgV结构域结合。Ceacam1具有顺式和反式相互作用。Ceacam1与TIM3的顺式相互作用对于T细胞中TIM3表面表达至关重要。在不存在配体的情况下，Bat3与TIM3细胞质结构域中的未磷酸化Y256 / 263结合，并募集活性Lck以在T细胞中传递刺激信号。与Galectin9 / Ceacam1的相互作用导致TIM3 Y256 / 263的磷酸化和随后Bat3结合的取消，从而将TIM3从刺激性分子转化为抑制性分子。DC中的TIM3与PS和HMBG1结合以调节先天免疫力。dLAG3结合MHC-II抑制CD4依赖的T细胞功能及其胞质结构域。TME衍生的Galectin3，LSECtin和FGL1与LAG3结合以抑制T细胞功能，这需要在LAG3细胞质域中具有KIEELE基序。TCR信号转导上调ADAM10和ADAM17的活性，后者会在细胞外域切割LAG3，以消除其对T细胞信号转导的抑制作用。È TIGIT和CD226结合相同的配体，CD112和CD155。CD226是一种共刺激受体，而TIGIT是一种共抑制受体。TIGIT以比CD226高的亲和力与CD112 / CD155结合，并通过募集SHIP1抑制PI3K，MAPK和NF-κB途径。˚F BTLA相互作用既在HVEM 反式及顺。该顺BTLA和HVEM的相互作用抑制反式由LIGHT HVEM的5'-连接，从而抑制HVEM刺激信号通过光结合而触发。BTLA中的ITIM和ITSM募集SHP1 / SHP2以抑制TCR和CD28信号传导。
PD-1信号传导可通过其与配体PD-L1和PD-L2的结合来触发。通常，在抗原呈递细胞或肿瘤细胞表面表达的PD-L1或PD-L2与在T细胞表面表达的PD-1 进行反式相互作用以诱导抑制性信号传导。48，49，50的肿瘤细胞也可以分泌PD-L1含有-细胞外囊泡，主要是在外来体的形式，以激活PD-1途径。这些外泌体PD-L1分子主要抑制引流淋巴结中的T细胞活性。对抗PD-1治疗无反应的黑色素瘤患者的外泌体PD-L1水平高于对反应者。51，52最近的研究表明，PD-1 / PD-L1相互作用也可以顺式发生。PD-L1和PD-1在APC上的共表达和相互作用阻止了PD-1 的转运，从而降低了T细胞PD-1的抑制功能。53除了PD-1，PD-L1可以与CD80相互作用以顺式，54，55，56，其可以破坏PD-L1 / PD-1和CD80-CTLA-4的相互作用，但保留CD80的能力，以激活CD28信令。56，57因此，顺式 PD-L1-CD80相互作用以通过抑制PD-1和CTLA-4的功能的抗肿瘤免疫起着积极的作用。
配体结合后，PD-1被磷酸化以提供抑制功能（图 2a）。ITIM和ITSM存在于其胞质结构域中。磷酸化的ITSM可能更重要，因为ITSM中酪氨酸的突变而不是ITIM显着取消了PD-1的抑制功能。58，59，60磷酸ITSM主要募集SHP2去磷酸化关键信号分子downmodulate活化水平。61，62，63虽然ITIM通常被认为对PD-1的抑制功能是可有可无的，最近的研究表明，ITIM起着从无效转变至SHP2活性构象的作用。64，65信号表明淋巴细胞活化分子相关蛋白（SAP）会阻止SHP2与底物的相互作用，因此可以抑制PD-1信号。64尽管在大多数情况下SHP2对于PD-1抑制信号传导必不可少，但缺乏Shp2的T细胞仍然可以发挥功能障碍并对体内的α-PD-1治疗产生反应，这提示了另一种信号传导机制。62一些小组报告说，也可以通过磷酸化的PD-1 ITSM募集SHP1。59，66最近的一项研究施加质谱定量说明PD-1信号体组件。63他们发现SHP2主要是被PD-1募集，而SHP1则作为储备来补偿SHP2的损失，或者当SHP2受到限制时，这可能是PD-1高表达的慢性/休眠T细胞中的一种情况。 。[63]有趣的是，PD-1仍然通过Shp1 / 2双重敲除有效抑制原代T细胞的增殖和细胞因子产生，[ 67]暗示了PD-1抑制功能的未知机制。
已经显示PD-1同时抑制抗原和共刺激信号传导。58，60，61，63，66，68在活化的T细胞，PD-1易位至免疫突触，并因此是在靠近两个TCR和CD28。生化研究表明，SHP2对CD28的优先权高于TCR。61实际上，PD-1以ITSM依赖性和ITIM依赖性的方式抑制CD28的下游PI3K-AKT途径。58然而，PD-1信号传导也显示出抑制TCR和下游信号传导分子（如ZAP70）的磷酸化。60，66在早期T细胞活化过程中对PD-1调节基因表达的转录分析表明，PD-1主要抑制了由强TCR信号传导诱导的基因。69由磷酸化PD-1 ITSM募集的SHP2可能比TCR更喜欢CD28，但仍可以抑制TCR信号传导。除了其在T细胞信号转导中的抑制作用外，据报道SHP2还通过逆转CSK介导的LCK抑制性磷酸化来激活TCR信号转导。有证据表明，磷酸化的PD-1螯合SHP2会阻止SHP2刺激LCK活性，从而有助于抑制T细胞信号传导。70
相比CD28，CTLA-4结合CD80到/ 86具有更高的亲和力，71从而通过配体竞争抑制共刺激。此外，表达CTLA-4的T细胞可通过反吞噬作用减少APC上的CD80 / 86表达，从而导致CD28信号传导减少。72例如，具有组成型CTLA-4表达的调节性T（Treg）细胞可以通过这种跨内吞作用过程来介导树突状细胞（DC）的CD80 / 86下调，这是Treg细胞抑制功能所必需的。73如上所述，APC上的顺式 -CD80 / PD-L1异二聚体可保护CD80免受CTLA-4介导的反式吞噬作用。56虽然PD-L1和CD80之间的顺式相互作用破坏了PD-1和CTLA-4的抑制功能，肿瘤细胞通常具有低CD80表达，因此这种保护机制可能无效。
在T细胞活化后，CTLA-4易位至细胞表面并聚集成免疫突触。74，75在CTLA-4的YVKM基序的酪氨酸可以通过Src家族激酶或其它激酶，如JAK2和RLK被磷酸化76，77，78（图 2B）。酪氨酸磷酸化可防止CTLA-4与AP-2之间的相互作用，从而使CTLA-4保持在细胞表面上以传递抑制性信号。41另一方面，YVKM基序也可能募集SHP2来抑制T细胞活化。79此外，虽然通过CTLA-4 PP2A的直接招募仍在争论，75，80CTLA-4对AKT活性的抑制作用是PP2A依赖性的。58在Treg细胞中，PKCη被CTLA-4募集到免疫突触中。CTLA-4 /PKCη进一步募集了GIT2-αPIX-PAK复合物，该复合物促进Treg-APC相互作用，并且是Treg细胞接触依赖性抑制所必需的。81除了细胞质尾部介导的T细胞应答抑制外，CTLA-4还被认为以外在方式抑制T细胞信号转导。例如，CTLA-4通过如上所述的内吞作用或诱导肿瘤生长因子β（TGFβ）进而下调CD80 / 86，从而降低APC上CD80 / 86的表达。82CTLA-4还通过CD80 / 86的连接诱导DC中的吲哚胺2,3-二加氧酶（IDO）表达，从而导致色氨酸耗竭和T细胞抑制。83
据报道，TIM3有四个配体，即C型凝集素半乳凝素9（Galectin9），癌胚抗原细胞粘附分子1（Ceacam1），高迁移率族盒1（HMGB1）和非蛋白质配体磷脂酰丝氨酸（PS）（图。 2C）。Galectin9是具有两个碳水化合物识别域的可溶性蛋白。Galectin9与TIM3的结合需要TIM3的糖基化IgV结构域。84Ceacam1在顺式和反式都结合TIM3 。与Ceacam1 的共表达和顺式相互作用对于TIM3糖基化和表面表达至关重要，而反式相互作用介导的效应T细胞功能抑制。85其他两个配体主要调节先天免疫应答。HMGB1是可与TME分泌的非组蛋白染色质相关蛋白。HMGB1与肿瘤相关DC上的TIM3结合，以抑制释放的核酸从垂死的肿瘤细胞向DC内体的募集，从而抑制核酸诱导的先天免疫应答。86此外，TIM3通过直接PS结合对DC的胞吞作用进行调节，从而作用于已识别为胞吞作用的凋亡细胞。TIM3抗体抑制CD8 + DC 吞噬凋亡细胞，从而减少抗原交叉呈递。87，88
TIM3信号转导仍然存在争议，因为不同的研究小组报道了TIM3在T细胞效应子功能中的相反作用。在小鼠急性淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）感染模型中，TIM3表达促进了短暂的效应T细胞发育，并伴有增强的AKT / mTOR信号传导。89另一项研究表明，TIM3与免疫突触中的多个近端TCR信号分子相互作用，而TIM3阻断增强了TIM3 高 CD8 T细胞与靶细胞之间稳定的突触形成。90 TIM3在其胞质结构域中包含五个保守的酪氨酸残基，其中Y265（小鼠中的Y256）和Y272（小鼠中的Y263）可以被Src家族激酶磷酸化91或白介素2诱导性T细胞激酶（ITK）。92磷酸化后，这些酪氨酸残基可以募集p85来促进NFAT活化。91 Bat3充当TIM3诱导的Th1细胞死亡和衰竭的抑制剂。与未磷酸化的TIM3细胞质结构域结合后，Bat3特异性募集Lck的催化活性形式以促进TCR信号传导。TIM3与抗体或配体的结合可能导致Bat3的解离，很可能是通过Y265和Y272的磷酸化，并逆转了Bat3对TIM3功能的抑制作用。85，93因此有可能的是，虽然TIM3本身可能作为抑制性受体作用，它与BAT3协会将其转换为刺激在某些情况下。
LAG-3被鉴定为MHC-II的比CD4高亲和力的配体94，95，因此可能抑制CD4 +通过阻止CD4-MHC-II相互作用的T细胞活化。但是，其他研究表明，LAG3的抑制功能不依赖于CD4竞争，而是取决于其胞质域来传递抑制信号。96，97尽管如此，LAG-3的在CD8的抑制功能+ T细胞不涉及MHC-II，这表明其它配体可能存在对LAG-3。实际上，的LSECtin和Gelectin-3结合LAG-3和抑制T细胞功能在TME 98，99（图 2D）。LAG3是一种糖蛋白，在胞外域中具有四个潜在的N-联糖基化位点。94，100同时考虑的LSECtin和Gelectin-3是糖结合蛋白，其结合LAG-3可取决于LAG-3的糖基化。最近，纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）被确定为LAG3的新配体。通常，FGL1从肝脏以低水平释放到血液中。但是，在几种人类癌症中检测到上调的FGL1。阻断FGL1和LAG3之间的相互作用可以增强T细胞的抗肿瘤功能。101有趣的是，LAG3在Tregs中也表达抑制增殖和功能。102同时，Treg表达的LAG3在APC上连接MHC-II也抑制APC的功能。103，104因此，LAG-3的作用是复杂的，并使用LAG-3阻断进行认真研究癌症免疫治疗的需要，以提供临床益处。
关于LAG3信号转导的知识仍然有限。CD3和LAG3的交联抑制了T细胞增殖和细胞因子的产生，这可能是由于近端TCR信号转导减弱所致，同时还观察到钙内流减少。105. LAG3的胞质结构域在人和小鼠中均包含三个保守区，一个丝氨酸磷酸化位点，KIEELE基序和多个EP重复序列。KIEELE序列对于LAG3在CD4 + T细胞中的抑制功能至关重要。96可通过两个可裂解LAG3的跨膜金属蛋白酶（一种含有Disintegrin和金属蛋白酶结构域的蛋白质10和17（ADAM10和ADAM17））的TCR信号传导来拮抗LAG3的功能。TCR信号通过不同的机制上调ADAM10和ADAM17的切割活性，从而允许有效的T细胞增殖和功能。106
CD155（PVR）和CD112（PVRL2）是TIGIT的两个配体，其中CD155的亲和力高于CD122。107 跨 TIGIT的结扎不仅通过TIGIT信令，提供在T和自然杀伤（NK）细胞抑制信号108，109，而且通过提高经由反向CD155信号传导IL-10产生的DC的抑制T细胞的功能。共刺激受体107 CD226与TIGIT共享相同的配体。110然而，TIGIT与其配体的亲和力高于CD226，因此TIGIT可以通过配体竞争抑制CD226介导的共刺激。111有趣的是，TIGIT也可以直接与CD226 顺式结合破坏其同二聚体的形成和共刺激功能。112
TIGIT的信号转导主要在NK细胞中进行。TIGIT胞质域包含一个ITIM基序和一个免疫球蛋白尾酪氨酸（ITT）样基序（图 2e）。不同的研究表明，ITIM基序或ITT样基序中的酪氨酸磷酸化对于TIGIT在人NK细胞中的抑制功能至关重要。108，113，114然而，在小鼠NK细胞这两种基序似乎是多余的。115据报道，ITT样结构域通过两个衔接蛋白Grb2和β-arrestin2募集SHIP1。Grb2募集的SHIP1主要抑制PI3K和MAPK信号传导，113而β-arrestin2募集的SHIP1主要损害TRAF6消除NF-κB的激活。114 然而，TIGIT中ITIM基序的下游信号仍不清楚。
BTLA和CD160共享相同的配体，即疱疹病毒进入介体（HVEM），以抑制T细胞功能。116，117，118然而，HVEM本身提供当与TNF超家族成员LIGHT或BTLA / CD160啮合共刺激信号。119，120，121 BTLA / CD160和LIGHT结合与BTLA / CD160与富含半胱氨酸的结构域1（CRD1）区域相互作用不同位点的HVEM。HVEM的CRD1截短不影响LIGHT绑定。117，122有趣的是，可溶的光来增强BTLA / HVEM相互作用，而与膜相关的LIGHT据称位移BTLA由于对HVEM其更高的亲和力。123 顺式共表达BTLA和HVEM时会发生相互作用，这会阻止HVEM通过转录激活。124
BTLA在其胞质结构域中包含ITIM和ITSM基序以及Grb2识别基序。116个在ITIM两个酪氨酸残基和ITSM可被磷酸化和招募SHP1 / SHP2到结扎后抑制T细胞功能116，117，125（图 2F）。BTLA和PD-1信号之间的进一步比较表明，与募集弱磷酸酶SHP2的PD-1相反，BTLA倾向于募集更有效的磷酸酶SHP1，以更有效地抑制TCR和CD28信号。63，126此外，当与B细胞表面表达的HVEM结合时，T卵泡辅助细胞（Tfh）上的BTLA将SHP1募集到免疫突触中，从而抑制TCR信号传导并抑制CD40L抑制B细胞增殖。127
使用抗体来阻断受体-配体相互作用的免疫检查点阻断疗法已获得广泛应用，并已被批准用于临床。但是，这些阻断抗体的总应答率仍然很低。5，6，10鉴于免疫检查点的抑制功能被临界可以通过表面表达和信号转导调节的，靶向这些途径可以提供用于免疫的新策略（表 1）。
许多开创性研究探索了靶向检查点糖基化和泛素化/降解途径的可能性。这些实验是在不同的系统中进行的，在这里我们将它们一起列出以突出此新方法的翻译潜力：（1）靶向检查点糖基化。适当的糖基化对于检查点的稳定表面表达是必需的。用岩藻糖基化抑制剂2-氟-L-岩藻糖（2F-Fuc）处理T细胞可降低岩藻糖基化和PD-1的表面水平。2F-Fuc处理的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在过继细胞转移（ACT）治疗期间显示出增强的抗肿瘤免疫力。18岁PD-L1糖基化受AMPK和EMT调节。二甲双胍是一种广泛用于2型糖尿病的药物，可激活AMPK诱导异常糖基化和PD-L1降解。依托泊苷，一种用于治疗各种癌症的化学疗法药物，抑制EMT诱导的PD-L1糖基化，从而使表面PD-L1不稳定。二甲双胍和依托泊苷对肿瘤细胞表面PD-L1的下调增强了抗CTLA-4和抗TIM疗法的功效。26，27 PD-L1的糖基化也由EGFR信号传导调节。吉非替尼是一种EGFR抑制剂，可在许多癌症中使用，也可抑制PD-L1糖基化，进而促进GSK3β介导的泛素化和降解，从而提高抗PD-1治疗的疗效。34（2）靶向检查点泛素化/降解。促进检查点的降级似乎是一个有趣的方向。IL-2是FDA批准的用于转移性黑色素瘤和肾癌的药物，它上调FBXO38介导的PD-1泛素化/降解。这可能代表了IL-2治疗癌症的几种工作机制之一。22合理设计的肽PD-LYSO，包含PD-L1结合序列和HIP1R的溶酶体分类信号序列，可以靶向PD-L1进行溶酶体降解。32姜黄素抑制CSN5的去泛素化活性，从而使PD-L1不稳定并有利于抗CTLA-4治疗。35如上所述，PD-L1棕榈酰化可以抑制单泛素化和降解以稳定表面表达。2-溴棕榈酸酯抑制PD-L1棕榈酰化以降低PD-L1表面水平，进而在鼠MC38肿瘤模型中增强抗肿瘤免疫力。36另一方面，在某些情况下，上调PD-L1表面水平也被证明是有益的。CDK4 / 6抑制剂palbociclib抑制细胞周期蛋白D-CDK4-SPOP-FZR1途径介导的PD-L1泛素化和降解，从而增加PD-L1水平并使CT26植入的肿瘤对抗PD-1治疗敏感。33最后，用于癌症免疫治疗的CTLA-4阻断抗体通常会引起严重的免疫治疗相关不良反应（irAEs）。128，129最近的一项研究表明，易irAE的CTLA-4阻断抗体诱导了CTLA-4的溶酶体降解，而不易irAE的抗体则允许CTLA-4以LBRA依赖性方式回收。易irAE的抗CTLA-4抗体的pH敏感性增加，可以防止抗体触发的CTLA-4溶酶体降解并减弱irAE。130
免疫检查点的抑制功能受表面表达水平，受体-配体相互作用和细胞内信号转导的严格调控。当前的免疫检查点封锁疗法旨在靶向受体-配体相互作用。除了这种成功的方法外，最近的研究表明，调节表面表达和细胞内信号传导可能代表了振兴抗肿瘤免疫力的其他令人兴奋的途径。尽管在该领域取得了令人振奋的进步，但未来的研究仍需要解决几个主题，以为下一代免疫治疗铺平道路：（1）免疫检查点的翻译后修饰（PTM）。当前的研究强调了糖基化，脂质修饰和泛素化在检查点功能中的重要性。然而，我们对检查点PTM的理解仍然非常有限。系统研究检查点修改将需要先进的质谱技术。（2）免疫检查点的周转过程。作为膜蛋白，免疫检查点的表面表达水平受几种细胞生物学过程的控制，包括表面传递，内在化，再循环和降解。到目前为止，对这些过程的了解甚少，因此需要鉴定涉及的关键调控蛋白。（3）免疫检查点的细胞内信号传导机制。大多数检查站都需要酪氨酸磷酸化来激活抑制性信号传导，但是磷酸化过程并未得到充分研究。此外，在检查点磷酸化时募集的效应分子也没有很好地表征。确实，似乎不同的检查点更喜欢不同的效应分子来执行其功能。例如，PD-1主要招募SHP2，而BTLA主要招募SHP1。这些不同特异性的潜在意义尚不清楚。SHP2和SHP1在免疫抑制中是否发挥不同的作用也还不完全清楚。因此，将来需要进行更多的实验来填补这些空白。（4）免疫检查点的上下文相关生物学。最近的发现强烈表明，免疫检查点受特定调节机制的影响，在不同的免疫和癌细胞环境中表现出独特的功能。肿瘤微环境中除了癌细胞以外，还囊括了多种细胞类型，包括T细胞，B细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，DC，髓样来源的抑制细胞，NK细胞和癌症相关的成纤维细胞。对于TME内这些不同细胞类型的检查点生物学有更完整的了解，这对基础研究人员和翻译研究人员都将非常感兴趣。例如，PD-1在效应子，调节性T细胞和记忆T细胞中的作用是复杂和多因素的。确实，PD-1阻滞可导致Treg过度反应并导致免疫抑制而不是免疫增强，这在接受PD-1阻滞疗法的某些黑素瘤患者中观察到过度进展性疾病。131
总之，基于检查点生物学的免疫疗法代表了癌症治疗的光明前景。扩大我们对免疫检查点生物学的了解将提高当前检查点封锁疗法的疗效，并为产生新的免疫疗法方法提供临床信息。
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