获得性的对PARP抑制剂（PARPi）的耐药性是高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）临床管理的主要挑战。在这里，我们证明了CX-5461是核糖体RNA基因（rDNA）的RNA聚合酶I转录的一流抑制剂，可诱导复制应激并激活DNA损伤反应。CX-5461与PARPi合作，可加剧复制压力并增强体内针对同源重组（HR）DNA修复缺陷的HGSOC患者衍生异种移植（PDX）的治疗功效。我们证明CX-5461对PARPi具有不同的敏感度谱，涉及MRE11依赖的复制叉降解。重要的是，CX-5461在HGSOC-PDX中表现出体内单药功效，并且通过克服复制叉保护而降低了对PARPi的敏感性。进一步，我们在原发性和复发性HGSOC中鉴定了CX-5461敏感性基因表达特征。我们提出，CX-5461是与PARPi联合用于HR缺乏型HGSOC的一种有前途的疗法，并且还可以作为治疗复发性疾病的单一药物。
卵巢癌（OVCA）是妇科癌症死亡的主要原因。高度浆液性卵巢癌（HGSOC）亚型占OVCA死亡的70-80％，几十年来总体存活率并未改变1。HGSOC几乎总是TP53突变体，其中 HGSOC的50％证实了DNA双链断裂（DSB）的同源重组（HR）DNA修复的缺陷，最常见的原因是BRCA1 / 2 2的突变。与HR缺乏（HRD）的肿瘤表现出化疗和聚- （ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂（PARPi）有利的反应2，3，4。PARP酶通过激活碱基切除修复（BER）和其他末端连接途径以及抑制非同源末端连接（NHEJ）途径参与DNA修复4。HR缺陷细胞至PARPi灵敏度依赖于NHEJ途径的过度使用，受损的DNA复制叉保护和未修复的折叠叉持久4，5，6。
PARPi现在在复发性HGSOC 7中对铂类化学疗法的全部或部分反应后用作维持疗法。最近，PARPi在新诊断为BRCA1 / 2突变的晚期OVCA的妇女中，无进展生存表现出了巨大的益处8。然而，为了PARPi电阻已经用多种机制，包括在参与DNA复制叉的HR途径和稳定的基因次级突变相关9，10，11。因此，开发克服对PARPi的抗性的策略将为HGSOC的治疗提供重大进展。
300核糖体RNA（rRNA）基因（rDNA）的300拷贝的RNA聚合酶I（Pol I）转录的过度激活是癌细胞12的一致特征。转录rDNA重复序列以产生47S pre-rRNA，其中包含核糖体的18S，5.8S和28S rRNA组件的序列。我们已经展示了使用小分子抑制剂CX-5461是用于癌症治疗的激动人心的方法靶向聚合酶I转录13，14，15。CX-5461在晚期血液系统癌症患者中的首次人类试验（Peter MacCallum癌症中心）已证明，TP53野生型和TP53突变性血液系统恶性肿瘤具有单药抗肿瘤活性16。CX-5461也在实体瘤的I期临床试验中（加拿大癌症试验小组，NCT02719977）17。
我们和其他人已经证明，CX-5461激活一个不依赖p53的DNA损伤应答（DDR），从而导致S期延迟和G2细胞周期阻滞17，18，19，20。我们已经显示，CX-5461在原代成纤维细胞中诱导ATM（急性共济失调的毛细血管扩张突变）和ATR（共济失调的毛细血管扩张和Rad3）激酶信号传导，然后检测跨基因组19的DNA损伤指标。我们还显示，CX-5461结合双重抑制ATM下游的检查点激酶1/2（CHK1 / 2）和ATR信号转导显着增强了体内p53空MYC驱动淋巴瘤的治疗效果19。最近，CX-5461被证明具有合成杀伤力。BRCA1 / 2缺乏症17。据报道，在HCT116结肠癌细胞中使用CX-5461进行长期治疗可诱导G四联体DNA（GQ）结构的稳定，从而导致DNA复制中的缺陷，这可能需要HR途径才能解决这些缺陷。但是，与PARPi olaparib相比，CX-5461在乳腺癌细胞株中表现出不同的细胞毒性谱17。这表明HR缺陷的其他机制是对CX-5461的敏感性的基础。最近，CX-5461的灵敏度分布显示出接近类似于拓扑异构酶II（TOP2）毒21，22。TOP2a是Pol I预初始化复合体的重要组成部分23尽管CX-5461表现出对Pol I转录起始的高度选择性抑制，但似乎可以通过将TOP2捕获在rDNA以及整个基因组中来实现。
在此报告中，我们证明了对CX-5461的敏感性与BRCA突变和MYC靶基因表达特征有关。我们显示CX-5461激活HR熟练的HGSOC细胞中的ATM / ATR信号和G2 / M细胞周期检查点，但它诱导HR缺乏的HGSOC细胞死亡。从机制上讲，我们表明CX-5461激活ATR，这与复制压力相关，并且不涉及先前提出的GQ结构的稳定化。ATR的CX-5461激活与整体复制压力和涉及MRE11依赖的DNA复制叉降解的DNA损伤有关。我们证明，作为单一代理，CX-5461和PARPi表现出使复制叉不稳定的不同机制。重要的是，CX-5461和PARPi的组合会加剧复制压力，DNA损伤，明显的细胞周期停滞和抑制HR熟练的HGSOC细胞的克隆形成存活，并且在HR缺乏的HGSOC细胞中显示出更大的功效。因此，我们的数据揭示了CX-5461 / PARPi和HRD合成杀伤力轴。此外，CX-5461和PARPi的组合可显着改善体内HR缺失的HGSOC-PDX肿瘤的消退。重要的是，我们还提供了证据表明CX-5461在HGSOC-PDX中具有显着的体内治疗优势，并且通过克服常见的PARPi耐药机制前叉保护作用，对olaparib的敏感性降低。在这里，我们还确定了原发性和复发性OVCA样本中CX-5461敏感性的预测特征，突出了CX-5461治疗潜在的原发性，化疗耐药和PARPi耐药的HGSOC的潜力。
使用一组32种已建立的人OVCA细胞系评估了CX-5461对人OVCA细胞的体外作用。选择这些细胞系以代表一系列组织学OVCA亚型（补充表 1）。使用浓度增加的CX-5461（1 nM–10μM）来评估在48小时（h）引起细胞增殖降低50％（GI 50）的药物浓度。GI 50值在各个细胞系之间变化，范围从OVCAR3的12 nM到OV90的5.17μM（图 1a）。如果GI 50低于363 nM的几何中值，则将细胞系定义为对CX-5461敏感。TP53之间无统计学意义的相关性突变状态和对CX-5461的敏感性（补充表 1，图 1b）。与抗性OVCA细胞系相比，CX-5461抑制生长的功效与敏感性中较高的基础rDNA转录速率相关（图 1c）。但是，CX-5461敏感和耐药细胞系在用CX-5461处理1小时后，对Pol I转录的抑制作用均相似，其浓度可抑制Pol I转录的50％（IC 50）在38至285 nM（图 1d和e）。数据显示CX-5461是基于目标的在剂量抑制聚合酶I转录比血浆浓度范围在阶段I CX-5461剂量递增研究中使用（584.1介于100nM-3.3μM）少10倍16。
一个 CX-5461的剂量诱导50％生长抑制（GI 50在48小时）。误差棒代表平均值±标准偏差（SD）。星号表示突变的TP53状态。细线表示几何平均GI 50剂量363 nM。有关每个细胞系来源，平均G1 50值，SD和N值的信息在补充表1中概述 。突出显示的12个CX-5461敏感性和11个CX-5461抵抗性细胞系用于鉴定图2a中的CX-5461敏感性基因表达特征 。b CX-5461 GI 50剂量的TP53野生型和TP53（a）中概述的突变OVCA细胞系。使用双面曼-惠特尼检验进行统计分析。误差棒代表平均值±SD。c OVCA细胞系的基线rDNA转录速率（列于（d）中），通过使用实时转录间隔区5'ETS（+ 413–521 bp）特异的引物通过定量实时PCR（qRT-PCR）分析确定到转录起始位点（TSS）。将每个细胞系中的表达水平相对于波形蛋白mRNA标准化，并表示为相对于TOV112D细胞的倍数变化。每个点代表 每个细胞系n = 3个生物学上独立的实验的平均值（补充数据4中提供了各个数据点） ）。误差棒代表平均值±SD。使用两尾不成对t检验进行统计分析。d通过定量RT-PCR测量的47S前体rRNA水平的剂量反应曲线。在收获RNA之前，用媒介物或递增浓度的CX-5461（0.001、0.01、0.03、0.1、0.3、1和3μM）处理OVCA细胞系1小时。将表达水平相对于波形蛋白mRNA标准化，并表示为相对于赋形剂处理的对照的倍数变化。显示的是 每个细胞系的n = 3个独立生物学实验的平均值。（补充数据4中提供了各个数据点 ）。e导致50％转录抑制的平均抑制浓度值（IC50）（从n = 3的每个细胞系生物学独立的实验）提出了D（在补充数据4中提供了单独的数据点 ）。误差棒代表平均值±SD。使用双面曼-惠特尼检验进行统计分析。
为了询问OVCA中CX-5461敏感性的分子机制，生成了12个CX-5461敏感和11耐药细胞系的基因表达谱（图 1a）。基因集富集分析（GSEA）鉴定出BRCA1突变，而MYC靶向基因表达特征，与体外对CX-5461的敏感性相关（图 2a，补充图 1）。实际上，我们在CX-5461敏感细胞系中观察到了HRD基因表达签名24的显着富集（图 2b）。然而，在整个HGSOC细胞系中CX-5461和PARPi敏感性之间的相关性并不明显（补充图 2）。），表明HRD的其他机制赋予了CX-5461敏感性。BRCA1突变（BRCAm-sig）和致癌MYC（MYC_UP-sig）基因表达特征的水平在Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopaedia（CCLE）的独立数据集中准确区分了CX-5461敏感和耐药细胞系（图 2c）。我们发现，使用BRCAm-sig和MYC_UP-sig基因表达签名比使用BRCAm-sig作为唯一预测因子提供了更大的预测CX-5461敏感性的能力（ANOVA卡方检验p值= 0.026557）。实际上，对CX-5461的敏感性也与高基础速率的Pol I转录有关（图 1c）。由于已知高MYC活性可在多个水平上驱动Pol I转录25的数据与提高MYC活性对CX-5461的敏感性一致。总之，我们的数据表明CX-5461可归类为功能MYC活性升高和无进展生存期差高MYCN HGSOC亚型提供治疗益处 26，27。
图 12a是12个对CX-5461敏感的细胞和11个对CX-5461耐药的细胞系的微阵列表达数据的GSEA（图 1a）。显示了鉴定为在CX-5461敏感细胞系中富集的基因集的富集图。b利用单个样本GSEA（ssGSEA）获得单个样本中HRD基因表达签名24的活性水平。根据每个样本中的基因表达水平对它们进行排名，并根据经验累积分布函数生成每个途径的得分，以反映排名列表中基因的高低。 图1a中n = 32个细胞系 箱形图-中，上，下铰链分别对应于第一和第三四分位数（第25和第75个百分位数）。上晶须的最大值不超过1.5 * IQR（IQR =四分位间距）。下晶须在1.5 * IQR处扩展到最小值。晶须末端以外的数据绘制为单个点。使用双面Wilcoxon检验获得统计学显着性。c使用ssGSEA在来自Broad Institute CCLE的RNA表达数据中计算MYC目标基因（MYC_UP-sig）和BRCA1突变（BRCAm-sig）基因标记的表达水平。与抗药组相比，CX-5461敏感组的MYC_UP-sig和BRCAm-sig基因表达特征更高（单侧Wilcoxon试验p值分别为0.004762和0.009524）。dOVCAR4细胞中CX-5461和靶向HR基因的siRNA的组合可协同抑制增殖。每个基因四个单独的siRNA双链体被反向转染24 h，然后用CX-5461（80 nM）或溶媒处理48 h。使用DAPI染色测量细胞计数，并使用Cellomics成像。n = 4，每个数据点代表单个siRNA双链体。误差棒代表平均值±SEM（平均值的标准误差）。使用双面单向方差分析（Tukey的多重比较检验）进行统计分析（调整后的p-值显示）。伴随图（右）是极乐图，每个点代表一个单独的siRNA双链体。CI <1的组合指数表示协同作用，CI> 1表示拮抗作用，CI = 1表示加和作用。
为了确认CX-5461与HRD的合成致死性相互作用，我们测试了靶向HR基因的短干扰RNA（siRNA）对CX-5461功效的影响，并证明了HGSOC OVCAR4细胞具有强的协同抑制作用，据报道与HGSOC OVCAR4细胞的基因组图谱非常相似HGSOC肿瘤28（图 2d）。此外，我们测试了CX-5461在等基因匹配的HR熟练的OVCAR8细胞和衍生的HR缺乏的RAD51C敲除（KO）OVCAR8细胞系中的生长抑制作用，该细胞系以前的特征是缺乏响应电离辐射形成RAD51灶的能力（ IR）29（补充图 3a–c。与OVCAR8细胞相比，在10和100 nM的低剂量下，HR缺乏细胞系对CX-5461的生长抑制表现出更高的敏感性（图 3a）。在HR熟练的OVCAR8细胞中，CX-5461介导的增殖抑制与通过BrdU / PI染色（图3b和补充图 3D）和使用FUCCI报告系统（图3b）测量的明显的G2 / M细胞周期阻滞有关。 。 图3c和补充图 3E）。用CX-5461处理的OVCAR8细胞也表现出胞质分裂失败和多核化（8 N DNA含量）（图 3d和补充图 3D）），这表明在染色体分离可能归因于持续的DNA复制应力和有丝分裂中的DNA损伤CX-5461诱导的缺陷30。相比之下，缺乏HR的RAD51C KO OVCAR8细胞在100 nM和1μMCX-5461处发生细胞死亡，进一步证实了合成致死性CX-5461 / HRD相互作用（图 3d和补充图 3D）。
一个体外CX-5461的剂量反应增殖的时间过程，通过使用OVCAR8的INCUCYTE ZOOM和OVCAR8 RAD51C KO细胞系细胞汇合进行评估。两次生物学独立实验的代表。误差棒代表n = 5次技术重复的平均值±SEM 。b在收获前，用溶媒，100 nM或1μMCX-5461处理48小时和72小时并用BrdU标记30分钟的细胞的细胞周期分析。进行了BrdU掺入随DNA含量变化的FACS分析（代表性图和门控策略显示在补充图 3D中）。直方图显示G0 / G1（蓝色）和G2M（绿色）和S期BrdU标记（红色）细胞群的百分比。误差棒代表平均值±SEMn = 3个生物学独立的实验。c使用载剂，100 nM或1μMCX-5461处理FUCCI标记的细胞48和72 h定量细胞周期图。补充图3E中显示了代表性的流式细胞仪配置文件和门控策略 。误差棒代表n ＝ 3个生物学独立实验的平均值±SEM 。d直方图显示与> 4N DNA含量（上图）和子G0 /通过BrdU检测到G1细胞群（下图）的细胞的百分比/ PI细胞周期分析中（描述b）和补充图 3D，（Ñ = 3个生物学独立的实验，n 对于用媒介物或1μMCX-5461处理72小时的OVCAR8和OVCA8 RAD51C KO细胞= 7，误差线表示平均值±SEM。使用双向单向方差分析（Tukey的多重比较测试）进行BD中的统计分析（显示了调整后的p值）。È用载体处理的细胞，100nM或1μM的CX-5461为6和24小时的Western印迹分析。代表性的Ñ = 3生物独立的实验。显示的印迹是源自同一实验的样品，并进行了平行处理。通过重新探测印迹来处理上样对照Vinculin和Actin。补充图10提供了Western blot的全尺寸扫描 。
接下来，我们研究了HGSOC细胞系中CX-5461介导的ATM / ATR信号激活（图 3e）。与我们先前的发现19一致，CX-5461诱导了ATM / ATR信号转导，如ATR T1989，ATM S1981，CHK1 S345，CHK2 T68的磷酸化增加和两种细胞系中γH2AX水平的低诱导所表明。在100 nM和1μMCX-5461之后的HR缺陷细胞中，与HR熟练的OVCAR8细胞相比，观察到在保护HR的细胞中RPA32（复制蛋白A）的S4 / S8磷酸化增加更大，这与HR熟练的OVCAR8细胞相比复制叉31因此，CX-5461在HR熟练的细胞中诱导复制压力，这与多核细胞百分比增加有关，而HR缺乏的细胞由于加剧的复制压力而在CX-5461处理后经历细胞死亡。总而言之，这些发现表明CX-5461在OVCA细胞中表现出强大的抗增殖作用，并且HR缺陷使HGSOC细胞对CX-5461介导的细胞死亡敏感，这与BRCA1突变和HRD基因表达签名预测了OVCA细胞对CX- 5461（图 2a，b）。
为了检查ATM / ATR信号激活的机制，我们研究了CX-5461处理对OVCAR8，OVCAR8 RAD51C KO和OVCAR4细胞中GQ结构形成的影响（图 4a，b和补充图 4A–D）。 。与善意GQ稳定剂（TMPyP4）在治疗后1小时，3小时和24小时相比，CX-5461在HR熟练的OVCAR8或OVCAR4细胞或HR缺乏的OVCAR8 RAD51C KO细胞中均未诱导GQ稳定。有趣的是，用CX-5461处理3小时的OVCAR8细胞的GQ染色显着降低。此外，与CX-5461处理相反，TMPyP4在处理后1小时未激活DDR，此时观察到GQ稳定性显着增加（补充图 4C-E）。我们的数据清楚地表明CX-5461介导的DDR激活与GQ稳定无关。这一发现与结肠癌细胞17中的先前报道相矛盾，该报道表明CX-5461介导的对GQ稳定的作用可能是细胞类型依赖性的。
GQ DNA和UBF作为核仁标志物的共免疫荧光（Co-IF）在OVCAR8细胞和OVCAR8 RAD51C KO细胞中用载体，1μMCX-5461或10μMTMPyP4处理3 h。三个生物学上独立的实验的代表性图像。b GQ DNA免疫荧光定量。使用CellProfiler分析信号强度。误差棒代表平均值±SD， 在三个独立实验中检查的每种治疗状况，n＝ 200个细胞。c用溶媒或1μMCX-5461处理3 h的细胞中R环和UBF的Co-IF分析。两个生物学上独立的实验的代表性图像。d使用CellProfiler对R环信号强度进行定量。ñ 在两个独立的实验中检查了每种治疗条件= 230个细胞。将积分强度标准化为OVCAR8载体对照的相应中值。（b）和（d）中的统计分析使用单向单因素方差分析，Kruskal-wallis多重比较检验（显示了调整后的p值）进行。（ns）表示大于0.05 的非显着p值。e用溶媒，100 nM或1μMCX-5461处理细胞3小时。提取RNA，并使用对pre-rRNA 5'ETS特异的引物测定47S rRNA前体水平。将表达水平相对于NONO mRNA标准化，并表示为相对于溶媒的倍数变化（n ＝ 3个生物学独立的实验），误差棒代表平均值±SEM，使用双面单向方差分析，Tukey多重比较检验（显示调整的p值）进行统计分析。
接下来，我们检查了RNA：DNA杂种（R环）的形成，这是Pol I转录的副产物。已知由DNA-RNA杂合体和置换的ssDNA构成的核酸三链结构的稳定会阻碍DNA复制并激活DDR 32。最近，已证明R环稳定与轻度低渗应激后33的Pol I转录抑制和核仁DDR的激活相吻合。要标记核仁R-循环我们进行共IF为上游结合转录因子（UBF），其定位于解聚的rDNA染色质34，35。观察到了核仁R环染色的显着变化，从对照OVCAR8和OVCAR4中的弱和弥散到在CX-5461处理的细胞中病灶模式具有更强的病灶（图 4c，d和补充图 5A–C）。 。这表明，从rDNA的启动子CX-5461诱导的聚合酶I位移19，36与R-环路的稳定化，这可能是由于起始的抑制与抑制前体rRNA的导致R-环路的稳定化从转录物已经处理的一致相关联通过延长Pol I分子产生的。有趣的是，RAD51C KO OVCAR8细胞表现出高水平的共转录R环（图 4c，d）与亲本细胞相比具有较高的rDNA转录基础率（图 4e）。因此，数据暗示RAD51C和/或HR活性与Pol I转录的负调控有关。但是，与CX-5461处理的OVCAR8细胞相比，RAD51C耗竭与100 nM或1μMCX-5461处理在进一步减少rDNA转录或增强核仁R环的积累方面没有协同作用。
为了评估在rDNA处的复制压力，我们检查了CX-5461是否在核仁处诱导ATR（图 5a）。实际上，在CX-5461处理核仁R环的周围并与UBF共同定位后，pATR T1989在CX-5461处理的HR熟练的OVCAR8和OVCAR4细胞中与UBF共同定位（图 5a，b，补充图 5d– f和补充图 6a）。ATR在核仁外围的定位与受损rDNA到核仁外围的锚定点的特征充分的运动相一致，在锚定点处DNA修复因子更易接近37。响应CX-5461的ATR激活并不限制S期细胞的核仁，而是在EdU阴性和EdU阳性HR缺陷细胞群中被诱导（图 5a，b）。这些数据表明，ATR响应于CX-5461诱导的DNA复制缺陷而被激活，这种缺陷发生在S期，并且响应于与细胞周期无关的其他缺陷。为了检查CX-5461介导的生长抑制是否需要激活非复制细胞中的DDR，我们分析了CX-5461处理对分选的G1，S和G2 FUCCI标记的OVCAR8和RAD51C KO OVCAR8细胞的影响（补充图） 。 6B）。不论细胞周期的阶段如何，CX-5461的治疗均导致G2细胞周期停滞。由于OVCAR8细胞中缺乏p53活性，G2检查点停滞似乎是对CX-5461的主要反应，表明DNA复制是CX-5461生长抑制作用所必需的。
对用EdU标记并用溶媒或1μMCX-5461处理3 h的细胞中pATR（T1989）和UBF 的Co-IF分析。三个生物学上独立的实验的代表性图像。b使用CellProfiler对pATR / UBF共定位区域和总pATR的信号强度进行定量，并标准化为媒介物处理的对照组的中位数。 在三个生物学独立的实验中检查的每种治疗条件下，n = 464 EdU阳性细胞和n = 250 EdU阴性细胞。误差棒代表平均值±SD。使用双向单向方差分析（Kruskal-wallis多重比较检验）进行统计分析（显示调整后的p值）。C用EdU标记并用溶媒或1μMCX-5461处理3 h的细胞中pRPA32（S33）和UBF的Co-IF分析。三个生物学上独立的实验的代表性图像。d使用CellProfiler对pRPA / UBF共定位区域和总pRPA的信号强度进行定量，并标准化为媒介物处理的对照组的中位数。 在三个独立的实验中检查了每种治疗条件下的n = 216 EdU阳性细胞和n = 270 EdU阴性细胞。误差棒代表平均值±SD。使用单向单因素方差分析，Kruskal-wallis多重比较检验（显示了调整后的p值）进行统计分析。
RPA涂层的ssDNA募集并激活了许多DNA修复和细胞周期检查点调节剂，包括ATR。在前叉失速31之后，ATR在S33处使RPA32磷酸化。因此，我们研究了CX-5461处理后RPA32的S33磷酸化，并观察到HR熟练和HR缺乏的细胞中pRPA32 S33在核仁上的显着定位（图 5c–d）。CX-5461介导的RPA的S33磷酸化与细胞周期阶段无关，并且不限于HR缺陷细胞中的核仁。因此，在经CX-5461处理的细胞中形成ssDNA结构可导致复制叉停滞和HRD激活ATR，从而加剧了CX-5461介导的复制压力，这可能巩固了CX-5461与HRD的合成致死相互作用。
接下来，我们通过过表达核糖核酸酶H 1（RNase H）评估R环稳定对CX-5461介导的毒性的作用，该酶特异性降解RNA：DNA杂种38中的RNA部分，以防止RAD51C KO OVCAR8细胞中R环稳定（补充图7A）。与媒介物对照相比，RNAse H的过表达降低了用CX-5461处理的OVCAR8 RAD51C KO细胞中核仁R环的水平，但是，这并没有阻止CX-5461介导的RPA的S33磷酸化，表明存在ssDNA和叉子失速（补充图 7B，C）。在CX-5461处理后24小时，RNAse H的过表达部分减轻了以RPA32 S4 / S8磷酸化为标志的整体复制压力，但是，这不能挽救CX-5461的生长抑制作用（补充图 7D，E）。总而言之，我们的数据暗示CX-5461在rDNA上诱导ssDNA结构和复制压力，R环的稳定表明rDNA上的染色质有缺陷，并有助于CX-5461介导的DDR，但对于CX-5461功效不是必需的。
接下来，我们检查了用CX-5461处理3小时后γH2AX灶的形成，此时检测到了ATR和RPA的磷酸化。CX-5461仅在HR熟练的OVCAR8细胞的EdU阳性群体中诱导了整体γH2AX病灶，表明CX-5461诱导的DNA损伤与DNA复制有关（图 6a，b）。用CX-5461处理的HR缺失的RAD51C KO OVCAR8细胞在EdU阳性和阴性人群中均表现出高水平的ATR激活（图 5b）和γH2AX病灶（图 6a，b）。该数据表明复制应激不是CX-5461诱导的DNA损伤的唯一原因。然而，我们的数据利用FUCCI系统利用分类的G1细胞（补充图 6b）证明CX-5461诱导的DDR对G1细胞没有作用，而G1细胞在停滞前发展为G2，表明CX-5461生长抑制作用需要DNA复制。
对用EdU标记并用溶媒或1μMCX-5461处理3小时的细胞中γH2AX 的 Co-IF分析。三个生物学上独立的实验的代表性图像。b使用CellProfiler对病灶计数进行定量。 在三个独立的实验中检查了每种治疗条件下的n = 250 EdU阳性细胞和n = 220 EdU阴性细胞。误差棒代表平均值±SD。CCX-5461通过依赖MRE11的机制来减少IdU轨道长度。使用的CIdU和IdU脉冲标记方法的示意图（上）。依次标记OVCAR8细胞，并用1μMCX-5461、50 mM mirin或两者的组合处理或处理3 h。处理纤维以进行DNA纤维分析。根据使用ImageJ软件测得的各个IdU磁道的长度，计算出复制叉的长度。IdU轨道长度（以μm为单位）被转换为kb（1 kb = 2.59μm）。 通过两个生物学独立的实验分析了n = 150个复制轨迹。误差棒代表平均值±SD。d如示意图所示（上图），用100 nM CX-5461、100 nM BMN-673或组合预处理的OVCAR8细胞的DNA纤维分析，洗涤后依次用CldU和IdU标记。如上所述处理和分析纤维。 在两个独立的实验中分析了n = 150个复制轨迹。误差棒代表平均值±SD。统计分析（b - d），使用双面单向ANOVA进行，秩和检验多重比较检验（调整p -值被示出）。NS表示非显着的p值> 0.05。
BRCA1 / 2和RAD51在复制应激后通过防止核酸酶MRE11 39抑制复制叉的核酸降解而在复制叉稳定中起主要作用。因此，我们进行了DNA纤维分析，以研究CX-5461对货叉稳定性的影响（图 6c和补充图 8A））在OVCAR8细胞中。新生复制径迹先后用CldU和IdU标记，然后用CX-5461处理3小时。CX-5461处理会导致轨道长度整体减少，这表明CX-5461诱导DDR时复制叉的降解。通过与MRE11抑制剂mirin共同治疗挽救了这一点，证实了对MRE11核酸酶的抑制作用可以挽救CX-5461介导的叉不稳定。接下来，我们通过用CX-5461对细胞进行预处理24小时，然后用两种类似物进行脉冲标记，来评估CX-5461处理诱导的DNA损伤是否影响叉子的进展（图 6d）。用CX-5461进行的预处理对货叉长度没有影响，这表明CX-5461不会引起任何可能影响货叉重新启动或前进的损伤。另一方面，PARPi talazoparib（BMN-673）增加了叉子的前进，这与最近的报道一致，该报道暗示了PARPi介导的叉子延伸的加速是复制压力和DNA损伤的一种机制40。因此，我们的数据表明CX-5461和PARPi通过对叉不稳定的不同作用引起复制应激，表明与HRD的独立合成致死相互作用。此外，CX-5461和BMN-673的组合导致HR熟练和HR缺乏的细胞中γH2AX灶的形成显着增加（图 7a，b）暗示他们在加剧复制压力和DNA损伤方面的合作。由于需要通过稳定失速的复制叉来抵抗复制压力的HR途径，我们还研究了CX-5461处理后的HR途径激活。我们发现CX-5461诱导RAD51灶形成，这表明RAD51装载到DSB上，而CX-5461和BMN-673的组合导致RAD51灶形成进一步增强（图 7a，b）。因此，直到RAD51加载阶段，CX-5461介导的DDR激活了HR，并且它与BMN-673的合作加剧了复制压力，从而增强了HR通路的激活。此外，与CX-5461激活MRE11介导的叉子降解相一致，CX-5461诱导了pRPA S4 / S8，这是HR熟练的停滞的复制叉子的标记，但在HR缺乏的RAD51C KO OVCAR8细胞中更稳定（图 7C）。另外，CX-5461与BMN-673协同诱导HR缺失的OVCAR8 RAD51C KO细胞中的pRPA S4 / S8水平。因此，CX-5461，PARPi和HRD共同增强复制压力。综上所述，我们的数据与模型一致（图 7DCX-5461通过抑制Pol I募集而导致rDNA染色质缺陷，包括ssDNA的形成和rDNA的复制压力。CX-5461还通过MRE11活性引起与复制叉的失速和不稳定有关的整体复制压力，从而导致DNA损伤。HRD增强了CX-5461介导的复制压力。CX-5461和PARPi的组合进一步加剧了复制压力，这巩固了PARPi / CX-5461 / HRD合成致死性相互作用（图 7d）。
将 OVCAR8细胞与10μMEdU孵育，然后用溶媒，100 nM CX-5461、100 nM BMN-673或两者的组合处理24小时。对γH2AX和RAD51进行了Co-IF。将细胞在室温下用Click-IT反应孵育30分钟，用PBS洗涤，然后用DAPI复染。三个生物学上独立的实验的代表性图像。b γH2AX定量灶计数。 通过三个生物学独立的实验分析了每种处理条件下的n = 554 OVCAR8细胞和n = 708 OVCAR8 RAD51C KO细胞。误差棒代表平均值±SD。EdU阳性细胞中RAD51病灶计数的定量。n = 223个EdU + ve OVCAR8细胞和n 通过三个独立的实验分析了每种治疗条件= 221 OVCAR8 RAD51C KO细胞。误差棒代表平均值±SD。使用双面单向方差分析（Tukey的多重比较检验）进行统计分析（显示调整后的p值）。c对（a）中处理的细胞进行蛋白质印迹分析。代表性的Ñ = 2生物独立的实验。显示的印迹是源自同一实验的样品，并进行了平行处理。补充图10提供了蛋白质印迹的完整扫描尺寸 。d对CX-5461的分子反应示意图。CX-5461通过与选择性复合物1（SL-1）结合并阻止Pol I与rRNA基因启动子结合来抑制Pol I转录复合物。Pol I的置换和Pol I转录起始的抑制与R环稳定，RPA募集到单链rDNA，rDNA复制压力以及核仁处DDR的激活有关。CX-5461还通过MRE11活性诱导与复制叉的失速和不稳定相关的整体复制压力，导致DNA损伤，S期和G2 / M细胞周期停滞。HR途径和PARP活性是抵消DNA复制压力所必需的。CX-5461与HRD合作，抑制PARP活性，加剧复制压力和DNA损伤，促进细胞死亡。
由于CX-5461与BMN-673结合使用会导致DNA损伤增加，因此我们假设CX-5461与PARPi或其他DNA修复剂和DDR抑制剂（DDR治疗）联合使用可提高治疗HGSOC的功效。因此，我们在HR熟练的OVCAR4细胞中进行了聚焦/精品药物筛选，以进行DNA修复和DDR抑制剂，这些抑制剂可能与CX-5461协同作用以增强生长停滞（图 8a）。证明了ATM（ATMi：KU55933），ATR（ATRi：VE-821），PARP（BMN-673），铂类化疗药物顺铂，mTORC1抑制剂依维莫司和BCL-2 ABT-199选择性抑制剂的抑制剂作为单一药剂的生长抑制作用。但是，GI 20的组合与单药作用以及与其他化合物的组合相比，具有BMN-673和VE-821（ATRi）的CX-5461剂量显示出最强的增殖抑制作用（图 8a）。接下来，我们研究了CX-5461和BMN-673或ATRi在诱导另外三个HR精通的HGSOC细胞系中的细胞死亡方面的合作（补充图3C），并确定了BMN-673和CX-5461之间在诱导细胞死亡方面的强大而重要的相互作用与ATRi（VE-821）相比，细胞死亡（图 8b）。此外，在存在或不存在CX-5461的情况下BMN-673的剂量反应曲线证实了CX-5461与BMN-673的强相互作用（图 8c））。此外，CX-5461和BMN-673的组合导致增强的G2 / M细胞周期阻滞，增强的细胞增殖抑制作用（图 8d–e）并显着降低了HR熟练（OVCAR8和OV90）和HR的克隆形成存活率缺陷（OVCAR8 RAD51C KO）细胞。相比之下，在FT282永生化的人类输卵管上皮细胞中对单一药物及其组合的敏感性降低证明了这些治疗方法的明确治疗窗口（图 8f，g）。
一个在用增加剂量的顺铂（0-1.11μM），PARPi（BMN-673，0-0.11μM），ATMI（KU55933，0-1.11μM），ATRI（处理OVCAR4细胞赠送药物屏幕VE-821，O- 1.11μM），ABT-119（0-1.11μM）或依维莫司（0-0.11μM）±80 nM（GI 20）CX-5461。颜色编码表示通过DAPI染色和使用Cellomics成像所测量的增殖水平（绿色表示减少的增殖）。校正了单药治疗的剂量反应，以控制载体，并校正了联合用药对80 nM CX-5461的反应，给出了n = 5 的平均值。黄色框突出显示CX-5461与BMN-673或ATRi的组合。b通过对载体，100 nM CX-5461、1μMVE-821、100 nM BMN-673或组合处理7天的细胞进行PI染色，对SubG1 DNA含量进行定量（n = 3个生物学独立的实验）。误差棒代表平均值±SEM。流式细胞仪门控策略显示在补充图 3D中。C）代表性的BMN-673剂量反应曲线为±30nM CX-5461。在处理后5天使用SRB测定法测量细胞增殖。校正了BMN-673的剂量反应曲线以进行DMSO治疗控制，并校正了该组合物对30 nM CX-5461的反应。三个生物复制品的代表。误差棒代表n = 5次技术重复的平均值±SEM 。d如图3b和补充图 3D中所述，对用溶媒，1μMCX-5461、100 nM BMN-673或组合处理72小时的细胞进行BrdU细胞周期分析 。n = 3，平均值±SEM。e使用IncuCyte ZOOM通过细胞融合来评估体外增殖时程。代表ñ 的五个技术重复= 3次生物学重复，平均值±SEM。虚线表示补充了药物的媒体。f CX-5461和BMN-673在抑制克隆形成存活方面起着协同作用。n = OVCAR8和OVCAR8 RAD51C KO细胞和n的 6个生物学独立实验的代表图像 = FT282细胞的3个生物学重复，平均值±SEM。g OV90细胞的克隆检测。n = 3个技术重复。使用双面单向方差分析（Tukey的多重比较检验）进行统计分析（在b，d和f中）（显示调整后的p值）。
接下来，我们基于核仁PARP1参与了rDNA异染色质41的调节这一事实，研究了将CX-5461与BMN-673结合使用对Pol I转录速率的影响。用CX-5461处理3小时后，我们检测到rRNA前体水平显着下降（补充图 8B）。但是，与CX-5461处理的样品相比，CX-5461与BMN-673的组合并未进一步降低rRNA的丰度。因此，我们的数据表明，CX-5461与PARPi协同通过加剧复制压力和DNA损伤来诱导生长停滞和细胞死亡（图 7d），而不是增强对Pol I转录的抑制作用。
接下来，我们研究了铂处理HGSOC-PDX（＃19B）一系后BRCA2突变，HR缺乏的体内CX-5461和PARPi相互作用的潜力。CX-5461和olaparib作为单一药物的给药可产生稳定的疾病，并具有统计学显着的生存获益（CX-5461治疗53天，olaparib 67天和媒介物22天的平均收割时间（在伦理终点）（TTH）），与车辆相比，p值分别为0.00285和0.00285）（图 9a）。CX-5461和olaparib的共同治疗耐受性良好（补充图 9A）并导致戏剧性的持久性退化，肿瘤体积减少，表明部分缓解（定义为相对基线减少30％以上的肿瘤），生存期超过100天（中位TTH 113天，p值与CX-相比为0.00692） 5461单剂处理）。
一个在-铂后处理BRCA2突变PDX＃19 HGSOC-PDX和观察到的反应b PDX＃62与BRCA1启动子甲基化，以在体内CX-5461和奥拉帕尼治疗。携带PDX的接受小鼠随机接受媒介物治疗，每周两次40 mg / kg CX-5461，每天一次50 mg / kg olaparib或CX-5461 / olaparib联合治疗3周。在肿瘤体积为700mm 3的情况下收获PDX 。平均肿瘤体积（mm 3）（实线）±95％CI（阴影区域）和所有单个小鼠的肿瘤体积（虚线）和相应的Kaplan-Meier生存分析。被删减的事件由Kaplan-Meier图上的叉号表示。n表示个别小鼠。CCIdU和IdU脉冲标记的示意图（上）。顺序标记源自PDX＃62 29的 OVCAR8 RAD51C KO细胞或d WEHICS62细胞系，并用2 mM羟基脲（HU）±1μMCX-5461处理或处理3 h。处理纤维以进行DNA纤维分析。 在两个独立实验中分析的n = 102个OVCAR8 RAD51C KO细胞 复制轨迹，在三个独立实验中分析的n = 236个WEHICS62细胞复制轨迹。误差棒代表平均值±SD。（C）中的统计分析使用双面曼恩-惠特尼检验进行，而（d）中的统计分析使用双面单向方差分析（Tukey的多重比较检验）（调整后的p-值显示）。NS表示不重要的p值。e用载体或100 nM CX-5461处理24小时的WEHICS62细胞中pATR（T1989）和UBF的Co-IF分析。使用CellProfiler对共定位区域和总pATR的信号强度进行定量。 通过三个独立实验分析的每种条件下，n= 506个细胞，误差线代表平均值±SD。使用Mann-Whitney检验进行统计分析。f对用媒介物或1μMCX-5461处理72小时的WEHCS62细胞进行BrdU细胞周期分析（左图），n = 3次生物学重复，平均值±SEM。补充图3D显示了流式细胞术门控策略 。使用双面单向方差分析（Tukey的多重比较检验）进行统计分析（显示调整后的p值）。使用IncuCyte ZOOM评估了体外CX-5461剂量反应增殖时程。代表ñ 的五个技术重复= 3次生物学重复，平均值±SEM。
为了比较CX-5461与标准护理方法的体内疗效，我们检查了CX-5461在未经化学处理的HGSOC-PDX（＃62）中的活性，该化合物表现为BRCA1启动子过度甲基化，以前被表征为耐药/难治性对顺铂44有效，并且仅对高剂量（300 mg / kg）的PARPi rucaparib有反应。PDX＃62没有到150毫克/千克rucaparib响应29，42和不像PDX＃19B，也没到50响应毫克/公斤奥拉帕尼表示与在后8天的肿瘤体积增加的从基线> 20％的进行性疾病处理（图 9b）。相比之下，CX-5461疗法可导致疾病稳定并具有统计学上显着的生存获益（CX-5461治疗的TTH中位数为92天，而媒介物为32天和olaparib为36天，与媒介物和olaparib相比，p值分别为0.0004和0.0022） 。在较高剂量的奥拉帕尼（100 mg / kg）下，PDX＃62还显示出进行性疾病，证实了其对奥拉帕尼的反应降低（补充图 9B）。在两个PDX＃62生存实验中，CX-5461均显示出显着的单药治疗效果，但CX-5461和olaparib的组合未提供额外的生存益处。
由PDX＃62生成的先前表征的WEHICS62细胞系29显示出受损的HR容量（补充图 3A和B）。然而，DNA纤维分析显示，与在HR缺失的OVCAR8 RAD51C KO细胞中观察到的效应不同，被羟基脲（HU）阻滞的叉子在WEHICS62细胞中并未降解，表明叉子的保护作用（图 9c，d），这是与PARPi-相关的机制。缺乏BRCA1的癌细胞的耐药性43。CX-5461处理的前叉不稳定，与HU组合使用可增强前叉的不稳定性。因此，我们的数据表明CX-5461可以克服奥拉帕尼耐药细胞中的叉子保护作用。CX-5461对WEHICS62细胞的处理导致核仁R环的稳定，表明rDNA染色质缺陷（补充图 9C），但是RNA酶H的过表达仅部分降低了CX-5461对pRPA32 S4 / S8的诱导，并且无法拯救CX-5461生长抑制作用（补充图 9D和E）。值得注意的是，CX-5461诱导了ATR的激活，强健的G2 / M细胞周期停滞和增殖抑制（图 9e–f和补充图 9F）。重要的是，表征为对顺铂具有抗性/难治性的PDX＃62具有多个癌症相关基因的扩增，并且已知与铂类药物的抗性有关的细胞周期蛋白E和MYCN 42的表达增加。PDX＃62对CX-5461的治疗反应与MYC靶基因表达签名与对CX-5461的敏感性相关（图 2a）一致。总而言之，我们的数据表明CX-5461对治疗对olaparib耐药的OVCA的患者以及MYC活性高的肿瘤和临床效果差的患者具有重要的临床意义1。
为了评估CX-5461治疗在HGSOC治疗中的潜力，我们接下来检查了HGSOC肿瘤样品中CX-5461敏感性特征的普遍性（图 2a）。我们调查了81个原发性卵巢肿瘤样品（图 10a），其中21个（26％）表现出对CX-5461敏感的MYC_UP和BRCAm突变基因表达特征。这些III期和IV期肿瘤对化疗的反应不同：2例在接受化疗时进展，13例在治疗后复发（图 10a），这表明与我们的临床前数据一致，CX-5461对化疗的敏感性谱可能不同在诊所里。
来自国际癌症基因组协会（ICGC）[ https://dcc.icgc.org/ ] 的澳大利亚卵巢癌患者队列的81个原发性卵巢肿瘤样品的临床和RNA-seq基因表达数据（版本27）。使用单个样品中的ssGSEA计算CX-5461敏感性标记的表达水平。通过线性变换将ssGSEA分数标准化为0–1范围以进行比较。b ssGSEA分数按照（a）在ICGC复发患者的25个腹水样本中计算得出。Ç从复发患者细胞系腹水样品的聚类是基于使用MYC_UP-SIG和BRCAm-SIG签名ķ -means与ķ = 4 d中（该MYC_UP-SIG和BRCAm-SIG在三个复发样品3个匹配原发性肿瘤样品的分析C ^）与CX-5461灵敏度签名富集。È于E与基于使用MYC_UP-SIG和BRCAm-SIG签名细胞系样品的样品的聚类ķ -means与ķ = 4。
此外，我们调查了25个复发（腹水）样本，其中4个样本（16％）表现出CX-5461敏感性特征（图 10b，c）。因此，CX-5461作为一部分复发性OVCA的治疗选择具有令人兴奋的潜力。有趣的是，被预测对CX-5461有反应的三个复发肿瘤中，匹配的原发肿瘤没有CX-5461敏感性特征（图 10d，e）。因此，对化学疗法的抗性发展与促进CX-5461功效的变化有关。
之前我们已经证明了CX-5461有效地治疗MYC驱动的淋巴瘤13，14和p53状态AML独立15。虽然p53依赖的受损的核糖体合成检查站的感应是在p53野生型肿瘤CX-5461的功效的主要机制，DDR的激活是在p53空AML和淋巴瘤杀害的关键机制15，19。
在此报告中，我们证明CX-5461具有针对HR缺乏的HGSOC的单药治疗功效。重要的是，我们证明CX-5461对顺铂和奥拉帕尼耐药的HGSOC-PDX具有显着的治疗功效。我们已经确定BRCA突变和MYC靶基因表达签名作为对CX-5461敏感性的生物标记。此外，我们在26％的原发性OVCA样本和16％复发的OVCA样本中鉴定了CX-5461敏感性的预测特征，突显了CX-5461治疗在原发性和获得性化疗耐药和PARPi耐药的HGSOC中的潜力。具体来说，我们建议CX-5461将在HR缺陷HGSOC和在HGSOC肿瘤功效与升高MYC活性例如与预后不良相关联的高MYCN HGSOC亚型26，44。
在这里，我们还证明了CX-5461不能稳定HGSOC细胞中的GQ结构，而是表明通过抑制Pol I转录起始，CX-5461导致RPA募集到ssDNA和HR熟练细胞中核仁处的ATR激活。 。在缺乏HR的细胞中，观察到升高的核pRPA和pATR以及它们在核仁外围与UBF结合的rDNA区域的募集，而与细胞周期阶段无关，这表明除了rDNA停滞的复制叉以外，染色质缺陷还激活了ATR。从机制上讲，我们证明了HRD增强了CX-5461介导的DDR，从而确定了受损的HR依赖的全球复制压力的解析，这是CX-5461与HGSOC中的HRD合成致死相互作用的可能机制。此外，根据我们的数据，21，22。TOP2a是Pol I预启动复合体 23的重要组成部分，尽管我们的数据清楚地表明CX-5461抑制Pol I转录并激活核仁DDR，但可以通过将TOP2捕获在rDNA上来实现，这似乎是可行的，这可能影响TOP2的活性。整个基因组。
我们的数据还表明CX-5461通过MRE11活性引起复制叉的失速和不稳定，从而导致复制压力，DNA损伤和细胞周期进程的停止。CX-5461使整个基因组中的复制叉不稳定的净效应具有重要的临床意义。最近，失速叉保护装置的缺陷被确定为HGSOC患者类器官45的常见事件（60％）。因此，CX-5461可能在HGSOC的子集中具有复制叉保护功能缺陷的功效。此外，我们的数据表明，CX-5461诱导的DDR克服了HGSOC-PDX＃62衍生的细胞系对叉子的保护，对olaparib的敏感性降低，这是BRCA缺陷型癌细胞对olaparib的耐药性的良好机制11，43。这突出了CX-5461在治疗一部分复发的HGSOC中的潜力。
CX-5461和PARPi疗法的组合在缺乏HR的HGSOC中显示出强大的治疗益处，表明CX-5461与PARPi的相互作用可以显着改善缺乏HR的HGSOC的治疗。CX-5461与PARPi的组合导致复制压力增加，DNA损伤和细胞死亡，这与它们在破坏复制叉和诱导复制压力中的独特作用方式一致。在没有BRCA和RAD51的情况下，MRE11会严重破坏新生复制叉。因此，我们建议CX-5461加剧HRD介导的复制叉降解，从而导致复制压力增加和DNA损伤积累。因此，CX-5461的综合效果
总而言之，我们的数据提供了证据，表明将CX-5461和PARPi结合使用可改善HR不足的HGSOC的治疗方法。我们证明CX-5461增强了PARPi与HRD的合成致死相互作用，并清楚地表明CX-5461对PARPi具有不同的作用机理。重要的是，我们将BRCA突变和MYC靶基因标记定性为患者对CX-5461反应的预测因子。MYC驱动全基因组转录，但其主要目标之一是Pol I转录25。需要聚合酶I转录事实上，我们已经表明MYC上调带动恶变的Eμ-MYC淋巴瘤模型13，46。因此，我们的数据表明MYC驱动的Pol I转录和/或MYC驱动的全局转录和复制压力是对CX-5461的敏感性基础。由于在原发性和复发性卵巢肿瘤样品中鉴定出CX-5461敏感性特征，因此我们建议CX-5461作为具有HRD，复制叉不稳定或MYC活性高，通常临床结果较差的肿瘤患者的治疗选择具有令人兴奋的潜力和有限的有效治疗选择。
BMN-673，奥拉帕尼，KU55933，VE-821，ABT-199和依维莫司购自Selleckchem。CX-5461购自Synkinase。为了在体外使用，在50 mM NaH 2 PO 4中制备了10 mM CX-5461储备液；在DMSO中制备了10 mM BMN-673，olaparib，KU55933，VE-821和ABT-199的储备液。在100％乙醇中制备1 mM依维莫司储备液。
这项研究中使用的卵巢细胞系（在补充表1中列出）的身份和个性 通过使用6个STR基因座的基于短链重复序列（STR）的聚合酶链反应（PCR）分析得到常规证实。来自PDX＃62的WEHICS62细胞系和OVCAR8 RAD51C KO细胞系29由克莱尔·斯科特教授（澳大利亚沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所）提供。细胞系在5％CO 2中于37°C培养在潮湿的培养箱中培养最多8-10周。支原体检测通常通过PCR进行。OVCAR8，OVCAR4和OVCAR8 RAD51C KO细胞系在添加了HEPES，10％（v / v）胎牛血清（FBS），2 mM GlutaMAX（Gibco，35050061）和1％（v / v）的RPMI-1640培养基中生长抗生素/抗真菌药（Gibco，15240062）。WEHICS62细胞系在含有2 mM GlutaMAX，5μg/ ml胰岛素，50 ng / ml EGF和1μg/ ml氢化可的松的Dulbecco改良的Eagle / Ham F-12营养混合物（DMEM / F-12）中生长。在Ultroser G血清替代品（Biosepra，15950-017）存在的情况下，FT282细胞在不含HEPES的DMEM / F-12中生长。RNA酶H过表达构建体47由西班牙Josep Carreras白血病研究所的Sonia Guil博士提供。荧光泛素细胞周期指示剂（FUCCI）标记的细胞系通过pCSII-EF-mCherry-hCdt1（30/120）和pCSII-EF-mVenus-hGeminin（1/110）的慢病毒转导产生。日本RIKEN的宫崎淳（Atsushi Miyawaki）。
为了评估OVCA细胞对CX-5461的敏感性，通过在96孔板中铺板细胞，培养24小时，然后用溶媒或增加药物浓度（0，0.001）对每种细胞系生成剂量反应曲线。 （0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10和30μMCX-5461）放置48小时。使用IncuCyte ZOOM成像系统（Essen BioScience）评估细胞数。为了检测细胞增殖的时程分析，将细胞接种（在500个细胞中的OVCAR8；每孔2000个细胞的OVCAR8 RAD51C KO和WEHICS62）在96孔板上接种，孵育过夜，然后处理长达14天，并补充药物在7天。在此期间，每24小时测量一次汇合度。为了评估CX-5461和BMN-673的抗生长联合作用，使用磺基若丹明B（SRB）分析生成了单药的剂量反应曲线。简而言之，在药物处理（5天）后，将细胞用50％（v / v）三氯乙酸（TCA）固定，在4°C下保存1小时，用冷自来水洗涤，然后干燥过夜。然后在室温下加入0.4％（w / v）SRB溶液（Sigma-Aldrich，S1402）30分钟，用1％乙酸反复洗涤，然后将剩余的蛋白质结合染料溶解在10 mM Tris碱溶液中。使用iMark™微孔板吸光度仪（BioRad）定量在564 nm处的光密度。胃肠道剂量使用GraphPad Prism确定。为了检查针对HR基因的CX-5461和siRNA的合成杀伤力，使用单个siRNA双链体（Dharmacon，使用Dharmafect 4试剂（Dharmacon，GE lifesciences）将GE lifesciences反向转染到OVCAR4细胞中。24小时后，将转染培养基更改为CX-5461（80 nM）或含有媒介物的载体，并将细胞再孵育48小时。通过使用DAPI染色的细胞计数和使用Cellomics CX7的成像来测量细胞增殖。通过将组合的生存力（siRNA加CX-5461处理）除以个体生存力（仅siRNA或仅CX-5461处理）来计算Bliss组合指数。低于0.9的极乐综合指数被认为是协同效应。siOTP（ON-TARGETplus非靶向siRNA siRNA）和siRNA Dharmacon（目录编号siRAD54L（D-004592-17，D-004592-01，D-004592-02，D-004592-04）; siRAD51AP1（D-017166） -01，D-017166-02，D-017166-03，D-017166-04）; siBRCA2（D-003462-04，D-003462-01，
对于使用5-溴2'-脱氧尿苷（BrdU）掺入的细胞周期分析，将细胞用10μMBrdU（Sigma-Aldrich，B5002）脉冲标记30分钟，然后用PBS洗涤两次，收集，固定在80％冰冷乙醇，并在4°C下储存直至进一步处理。要进行染色，将固定细胞沉淀并在1 mL含0.5％（v / v）Triton X-100的2 N HCl中孵育30分钟，然后沉淀并在1 mL 0.1 M Na 2 B4O7.10H 2 O（ pH 8.5）。依次将细胞沉淀与抗BrdU和FITC抗小鼠IgG抗体孵育30分钟（补充表 2）在含有2％FBS和0.5％Tween-20的PBS中稀释。接下来，将细胞用含2％FBS的PBS洗涤，然后在室温下于10 µg / mL碘化丙啶（PI）溶液中孵育15分钟。最后，在FACSCanto II（BD Biosciences）上分析细胞，并使用Flowlogic软件（7.2.1版，Inivai Technologies）进行细胞周期分析。在FACSCanto II（BD Biosciences）上进行FUCCI标记的细胞系荧光蛋白信号的流式细胞术分析，并使用Flowlogic软件进行细胞周期分析。
使用PI染色，然后使用流式细胞仪（FACSCanto II）确定细胞死亡，并使用Flowlogic软件分析数据。
将细胞接种在6孔板中24小时。在药物温育5天后，吸出培养基，洗涤细胞，然后与无药物培养基温育7天。接下来，将细胞用100％甲醇固定1小时，用0.1％（w / v）结晶紫（Sigma-Aldrich，C6158）染色1小时，用H 2 O 洗涤并风干。使用立体显微镜手动计数菌落，或使用Chemidoc Imaging系统（BioRad）对其进行成像和定量。
通过SDS-PAGE解析二十至五十微克全细胞裂解物，电泳转移至Immobilon-P聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（MERCK Millipore，IPVH00010）上，并使用增强的化学发光（ECL）检测（GE Healthcare，RPN2106）进行分析。抗体的详细信息在补充表2中列出 。补充图10提供了Western blot的全尺寸扫描 。
对于逆转录qPCR分析，使用随机六聚体引物（Promega，C1181）和Superscript III（Invitrogen，18080044）裂解细胞，提取RNA，并合成第一链cDNA。使用FAST SYBR Green染料（Applied Biosystems，4385610）在StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）上一式两份进行定量PCR（qPCR ）。引物序列在（补充表3）中列出 。
本研究利用了我们小组提供的公开可用的OVCA细胞系基线基因表达微阵列数据（GSE43765）。OVCA细胞以50-80％的融合度收获（三个生物学重复）。提取RNA，进行体外转录，然后按照制造商的说明将生物素标记的cRNA片段化并与Affymetrix 1.0ST表达阵列杂交。在RMA归一化和背景校正后，使用Limma R软件包（3.3.2版）确定差异基因表达48。GSEA 1000分析中包括在抗性和敏感之间的表达变化> 1.4倍的基因，该分析使用默认的加权富集统计和信噪比度量，根据敏感和抗性细胞之间的差异表达对基因进行排名第49行。
我们在R（版本3.3.2）中使用了来自GSVA 51软件包（版本1.20.0）中的ssGSEA 50，以获取单个样本中HRD基因签名24（补充数据 1）的活性水平。在此，根据每个样本中的基因表达水平对它们进行排名，并根据经验累积分布函数生成每个途径的得分，以反映在排名列表中找到途径基因的高低。使用双面Wilcoxon检验获得了不同细胞系类别（敏感或耐药）的ssGSEA得分的统计显着性。
对于与EdU标记结合的IF分析，在药物处理之前，首先将细胞与10μMEdU孵育30分钟。将细胞固定在4％多聚甲醛（PFA）中（室温下放置10分钟），用冰冷的0.3％Triton X-100的PBS溶液渗透10分钟，用PBS洗涤，然后用5％山羊血清和0.3％Triton封闭X-100在PBS中于室温放置30分钟。接下来，将细胞与一抗和二抗（补充表2）相继在37°C的潮湿箱中孵育 1小时。最后，将细胞在Click-IT反应（100 mM Tris pH 8.5，10 nM Alexa Fluor 647-叠氮化物（Invitrogen，A10277）中于室温孵育30分钟），1 mM CuSO4和100 mM抗坏血酸），然后用PBS洗涤。细胞核用含有DAPI的Vectashield安装介质复染。
为了使用1H6抗体进行IF检测GQ DNA，在封闭步骤之前，将细胞用40μg/ ml RNase A（Thermo Scientific，EN0531）处理1 h。对于使用S9.6（R-loops）抗体的IF，PFA固定后的细胞在冰上分别用100％甲醇渗透10分钟和100％丙酮渗透1分钟，在封闭步骤之前用PBS洗涤。使用UPlanAPO 60x，NA 1.2水浸物镜和Spot Advanced软件（版本5.6），在配备有Spot RT相机（型号25.4）的Olympus BX-61显微镜上获取图像。所有图像的采集后调整图像的设置（即伽玛调整和背景减法设置）都相同。使用Zeiss Elyra 63X放大倍率获取共焦图像。使用CellProfiler 3.1.9版（Broad Institute）分析图像。
将指数生长的细胞用50μMCldU（Sigma-Aldrich，C6891）脉冲标记20分钟，用温PBS洗涤3次，然后与250μMIdU（Sigma-Aldrich，17125）孵育20分钟。暴露于第二种核苷酸类似物后，再次在温热的PBS中洗涤细胞，并用1μMCX-5461、50μMMirin（Sigma-Aldrich，M9948）或两者的组合处理或处理3小时。用胰蛋白酶消化标记的细胞，并将其重悬于7.5×10 5的冰冷PBS中细胞/ mL。将两微升此悬浮液点到预先清洁的载玻片上，并在加湿室中用10μL铺展缓冲液（在200 mM Tris-HCl中的0.5％SDS，pH 7.4和50 mM EDTA）溶解。36分钟后，将玻片相对于水平线倾斜15°，使DNA向下扩散。将载玻片风干，在甲醇和乙酸（3：1）中固定10分钟，然后风干。在室温下用2.5 M HCl将DNA变性60分钟。然后将载玻片在PBS中冲洗两次，并在室温下在含0.1％Triton X-100（PBS-T）和1％BSA的PBS中封闭1小时。将大鼠抗BrdU（1：200，Abcam，ab6323）在4°C的潮湿室内过夜。然后将玻片用PBS洗涤，并与Alexa Fluor 488偶联的鸡抗大鼠抗体以1：200的稀释度孵育（Invitrogen，A21470）。用PBS洗涤玻片，并在室温下与小鼠抗BrdU（Becton Dickinson，347580）抗体以1:50稀释度孵育45分钟，以检测IdU轨迹。将载玻片在PBS中洗涤，并在室温下以1：300的稀释度用Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠抗体（Life Technologies，A-11030）染色30分钟。将载玻片在PBS中洗涤并固定在Prolong Diamond抗褪色剂（Invitrogen，P36961）中。复制轨迹在Deltavision显微镜上以60倍成像，并使用ImageJ软件（1.47v，NIH）测量。对于用CX-5461和BMN-673进行的研究，在用BrdU类似物标记细胞之前，先用单独的药物或联合用药将细胞处理24小时。图9d中的纤维分析 使用硅烷化盖玻片（Genomic Vision，COV-002）和来自Genomic Vision的分子梳理系统（MCS-001）（在补充方法中进行描述）进行。
涉及动物的所有实验均已获得沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所动物伦理委员会的批准。PDX是从参与澳大利亚卵巢癌研究的OVCA患者中产生的。从所有患者获得知情同意，并且所有实验均根据人类道德准则进行。伦理学批准已从皇家妇女医院的人类研究伦理学委员会以及沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所获得。
住房设施保持在21°C，相对湿度约为50％。亮/暗周期为14小时亮/ 10小时暗。如前所述，PDX的产生是通过将新鲜片段皮下移植到NOD / SCID /IL2Rγnull受体小鼠体内进行的（T1，第1代）42。简而言之，对于PDX＃19B，将新鲜的肿瘤片段皮下植入右胁下。对于PDX＃62 ，将来自先前通过的PDX 42的冷冻肿瘤片段解冻，并保存在DMSO补充培养基中，并在右胁下皮下植入。当肿瘤体积达到180-300 mm 3时，携带T4-T7（第4代至第7代）肿瘤的收件人小鼠被随机分配接受olaparib，CX-5461，组合或媒介物治疗。每天以50 mg / kg的剂量在媒介物（含有10％DMSO和10％2-羟基-丙基-β-环糊精的磷酸盐缓冲液（PBS））中腹膜内给予Olaparib一次。每周两次以管饲法以40 mg / kg的溶媒（25 mM NaH 2 PO 4 pH7.4）口服CX-5461 。每周两次测量肿瘤并记录在StudyLog软件（StudyLog Systems）中。一旦肿瘤体积达到700 mm 3或当小鼠达到伦理终点时，对小鼠实施安乐死。最低点（取为自开始治疗或0.2厘米记录的最小平均肿瘤体积3如果最低点是<0.2厘米3），收获时间（TTH）和治疗应答如参考文献中定义。42。通过包括PDX的检查事件来计算中位TTH，其中当肿瘤体积大于500 mm 3但小于600 mm 3时收获小鼠。如果两次或两次以上连续测量的平均肿瘤体积减少到50至140 mm 3（从最低点减少30％以上，分配为200 mm 3），则可实现部分响应。用SurvivalVolume v1.2 52生成肿瘤体积和生存图。
我们使用ssGSEA在来自Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）版本20180502的RNA表达数据中计算了MYC_UP（MYC致癌签名UP）和BRCAm（BRCA1突变的UP）签名的表达水平（补充数据 2＆3）[ https ：//portals.broadinstitute.org/ccle/data]。如果有多个输入相同的基因ID，则使用中位表达。为了确定是否包含MYC目标基因签名与BRCAm签名相比是否提供了更多的预测CX-5461敏感性的能力，我们建立了两个广义的线性模型，一个具有BRCAm签名，另一个包含两个签名。我们进行了ANOVA测试，以评估哪种模型在基因表达的CCLE数据集中具有更好的预测敏感性以及CX-5461药物敏感性。然后，从81个原发性实体瘤样品和25个来自国际癌症基因组联合会的澳大利亚OVCA患者队列的复发患者的腹水样品的RNAseq基因表达数据中，计算单个样品中信号的ssGSEA得分[ https：// dcc.icgc.org/]（版本27）。仅考虑编码基因，并且通过线性变换将分数归一化到0–1范围，以便在各个数据集之间进行比较。
复发样本与细胞系的聚类基于样本的BRCAm和MYC_UP签名，其中k均值为k = 4。
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