冠状病毒家族成员SARS-CoV-2已被确定为大流行性病毒性肺炎疾病COVID-19的病原体。目前，尚无疫苗可用于控制疾病的进一步传播。我们之前已经设计出了针对MERS冠状病毒Spike（S）蛋白（一种冠状病毒的主要表面抗原）的合成DNA疫苗，目前正在临床研究中。在这里，我们基于先前的经验来生成针对SARS-CoV-2 S蛋白的基于DNA的合成疫苗候选物。工程化的构建体INO-4800可在体外强烈表达S蛋白。用INO-4800免疫小鼠和豚鼠后，我们测量了抗原特异性T细胞反应，中和SARS-CoV-2感染并阻断Spike蛋白与ACE2受体结合的功能性抗体，SARS-CoV-2靶向抗体在肺中的合成和生物分布。该初步数据集将INO-4800识别为潜在的COVID-19疫苗候选者，支持进一步的翻译研究。
COVID-19，以前称为2019-nCoV肺炎或疾病，已成为一种全球性公共卫生危机，与严重的急性呼吸综合症（SARS）和中东呼吸综合症（MERS）并入了越来越多的与冠状病毒相关的疾病，从动物跳到人。至少有七种已确定的冠状病毒感染人类。2019年12月，中国武汉市成为新型冠状病毒SARS-CoV-2爆发的震中。SARS-COV-2分离出来，并从被感染的病人从人的呼吸道上皮细胞测序1，2。疾病症状从轻度流感样到严重的危及生命的肺炎病例3。全球局势正在动态变化，世界卫生组织于2020年1月30日宣布COVID-19为国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC），并于2020年3月11日被宣布为全球大流行病。截至2020年5月1日，已确诊3,321,402人，死亡237,180人4。感染已扩散到多个大洲。在多个国家中已观察到人与人之间的传播，并且缺乏一次性个人防护设备5，并且无生命表面上的冠状病毒生存时间延长6。，已经使这种本来就很棘手的情况更加复杂，并增加了医院感染的风险。必须同时开展高级研究活动，以推进保护方式，以保护全球数十亿弱势群体。当前，没有许可的预防性疫苗可用于COVID-19。
为了解决迫切需要的医疗对策，以防止SARS-CoV-2的进一步传播，我们采用了基于DNA的合成疫苗方法。合成DNA疫苗因能够快速设计用于临床前测试的多种候选药物，可扩展地生产大量药物产品以及利用已建立的监管途径进入临床的可能性而适合加快研发进度。合成DNA温度稳定且无冷链，这是传递到资源有限的环境7的重要特征。特别是对于COVID-19候选疫苗的开发，我们利用了以前开发SARS-CoV 8疫苗方法的经验，以及我们自己开发MERS-CoV疫苗（INO-4700）的经验9，10，以及利用我们的疫苗设计的优势和生产之前使用的兹卡候选疫苗途径，GLS-5700 11，这是根据7个月推进到临床英寸 INO-4700和GLS-5700疫苗目前正在临床测试中。
在此之前的工作已经证明，对SARS和MERS的DNA的方法可以驱动的中和抗体（NAB）应答和挑战模式提供保护8，10。我们以前的研究表明，用编码MERS-CoV穗状病毒（S）蛋白的DNA疫苗对大小动物模型进行免疫接种可提供保护，以抵抗由匹配病毒引起的疾病。在接受INO-4700（MERS-CoV S蛋白DNA疫苗）免疫的受试者中，测定了持久的中和抗体（nAbs）和T细胞免疫反应，并且在大多数研究志愿者中观察到其血清转化率为96％，并且免疫了60周9。韩国正在继续进行INO-4700 1 / 2a期测试，并且计划在中东开始进行更大的2期研究，这两个地区都受到MERS感染的影响最大。
SARS-CoV-2刺突的序列和结构与SARS-CoV刺突蛋白12最相似，并且与MERS-CoV刺突蛋白共享全局蛋白质折叠结构（图 1），这使我们能够构建先前的疫苗构建体设计10。与艾滋病毒和流感的糖蛋白不同，冠状病毒三聚体突峰的预融合形式具有构象动态性，很少会完全暴露受体结合位点13。受体结合位点是nAbs的易受攻击靶标。实际上，针对受体结合结构域（RBD）的MERS nAb倾向于比其他表位14具有更高的中和潜能。最近的报告表明抗SARS抗体可以与SARS-CoV-2的RBD发生交叉反应。15。这些数据表明SARS-CoV-2 RBD是疫苗开发的重要目标。最近的数据显示，SARS-CoV-2 S蛋白与SARS-CoV S蛋白 12结合相同的宿主受体，即血管紧张素转化酶2（ACE2）。
冠状病毒刺突蛋白的氨基酸比对，包括11个带有突变的SARS-CoV-2序列（GISAID）。灰色条表示相同的氨基酸，彩色条表示相对于Wu-Hu-1的突变。RBD，切割位点，融合肽和跨膜结构域以红色表示。b SARS-CoV-2，SARS和MERS的结构模型掺入糖蛋白，其中一条链表示为卡通，两条链表示为表面。SARS-CoV-2的RBD涂成黄色。
在这里，我们描述了COVID-19合成DNA疫苗候选物的设计和临床前测试。我们分别显示了候选疫苗在体外转染COS-7和293T细胞后SARS-CoV-2 S抗原RNA和蛋白的表达。我们通过选择的免疫原在小鼠和豚鼠中诱导免疫，测量血清和肺液中SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体的水平，并通过竞争性抑制ACE2结合，假病毒和活病毒来抑制抗体功能中和。INO-4800疫苗诱导细胞和体液宿主免疫反应，可以在单次免疫后几天内观察到，包括针对SARS-CoV的交叉反应性反应。
从在GISAID（共享所有流感数据全球倡议）上发布的前四个可用的SARS-CoV-2全基因组序列中检索出四个刺突蛋白序列。三个Spike序列100％匹配，其中一个被认为是离群值（与其他序列98.6％的序列同一性）。在进行序列比对后，产生SARS-CoV-2刺突糖蛋白序列，并添加N末端IgE前导序列。使用Inovio专有的计算机模拟基因优化算法创建了高度优化的编码SARS-CoV-2 IgE-spike的DNA序列，以增强表达和免疫原性。合成优化的DNA序列，用BamHI和XhoI消化，并在人巨细胞病毒立即早期启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号的控制下克隆到表达载体pGX0001中。得到的质粒被命名为pGX9501和pGX9503，被设计成分别从三个匹配的序列和离群序列编码SARS-CoV-2S蛋白（图 2a）。
一个 COVID-19合成的DNA疫苗构建体，pGX9501（匹配的）和pGX9503（离群值（OL）），其含有IgE前导序列和SARS-CoV的-2刺突蛋白插入件的示意图。bRT-PCR分析从pGX9501和pGX9503一式两份转染的COS-7细胞中提取的RNA。使用针对每个靶标和用作内部表达归一化基因的COS-7β-ActinmRNA设计的PCR试验，通过RT-PCR分析提取的RNA。德尔塔Ç Ť（ΔÇ Ť）计算的C Ť目标减去Ç Ťβ肌动蛋白的每个转染浓度和作图对日志的pDNA的质量的转染（绘制为平均值±SD）。C用Western blot分析pGX9501，pGX9503或MOCK质粒转染293T细胞后Spike蛋白的体外表达。将293T细胞裂解物在凝胶上溶解，并用多克隆抗SARS穗蛋白进行探测。剥离印迹，然后用抗β-肌动蛋白加载对照进行探测。d用3 µg /孔的pGX9501，pGX9503或pVax（空对照载体）转染的293T细胞的体外免疫荧光染色。用多克隆抗SARS穗蛋白IgG和抗IgG二级抗体（绿色）测量穗蛋白的表达。细胞核用DAPI（蓝色）复染。使用ImageXpress Pico自动细胞成像系统捕获图像。比例尺为80.15 µm（左），66.8 µm（中）和77.31 µm（右）。
我们在pGX9501和pGX9503转染的COS-7细胞中，在RNA水平上测量了编码的SARS-CoV-2尖峰转基因的表达。使用从转染的COS-7细胞中提取的总RNA，我们通过RT-PCR确认了穗转基因的表达（图 2b）。使用抗SARS-CoV S蛋白在细胞裂解液上的交叉反应抗体，通过Western印迹分析测量HEK-293T细胞中的体外加标蛋白表达。用pGX9501或pGX9503构建体转染的HEK-293T细胞裂解物的Western印迹显示，条带近似于预测的S蛋白分子量140–142 kDa，可能由于S蛋白中22种潜在的N-连接聚糖而略有变化（图 2c）。在免疫荧光研究中，在用pGX9501或pGX9503转染的293T细胞中检测到S蛋白（图 2d）。总之，体外研究揭示了用候选疫苗构建体转染细胞系后Spike蛋白在RNA和蛋白水平上的表达。
自候选设计以来，已观察到新发表的SARS-CoV-2 Spike蛋白序列与pGX9501的氨基酸序列同一性大于99.9％（补充数据 1）。因此，将pGX9501选择为疫苗构建体以进行免疫原性研究，因为与异常的pGX9503相比，它可能提供的覆盖范围更广。pGX9501随后被称为INO-4800。INO-4800的免疫原性是在BALB / c小鼠中评估的，给药后使用CELLECTRA®递送装置16对胫骨前肌进行免疫。测量了一组用INO-4800免疫的小鼠的血清对一组SARS-CoV-2和SARS-CoV抗原的反应性（图 3a））。分析显示，在INO-4800免疫小鼠的血清中，IgG与SARS-CoV-2 S蛋白抗原的结合具有有限的与SARS-CoV S蛋白抗原的交叉反应性。我们测量了针对重组SARS-CoV-2穗蛋白S1 + S2区（图3b，c）和重组SARS-CoV-2穗蛋白受体结合域（RBD）的pDNA免疫小鼠的血清IgG结合终点滴度（EPT）。 ）（图 3d，e）。用单剂量的INO-4800免疫后第14天，在小鼠血清中观察到EPT（图 3c，e）。
如方法中所述，在第0天用指定剂量的INO-4800或pVAX空载体免疫BALB / c小鼠。a。用25 µg INO-4800或pVAX免疫的小鼠在第14天以1:50和1：250血清稀释度的IgG结合蛋白抗原。显示的数据代表每组3只小鼠的OD450 nm平均值（平均值+ SD）。b在第14天从小鼠的连续血清稀释液中获得的IgG的SARS-CoV-2 S1 + 2或c SARS-CoV-2 RBD蛋白抗原与IgG的结合。显示的数据代表每组八只小鼠的OD450 nm平均值（平均值+ SD）。 （b，c）和五只小鼠（d，e）。血清IgG结合终点滴度为（c）SARS-CoV-2 S1 + 2和（e）SARS-CoV-2 RBD蛋白。数据代表两个独立的实验。所描绘的值是平均值+/- SD。P值由Mann-Whitney检验确定。
我们开发了一种基于pNL4-3.Luc.RE的伪病毒的中和测定法，该伪病毒展示了SARS-CoV-2 Spike蛋白。通过与相对荧光素酶单位（RLU）减少相比的中性滴度检测，与没有降低RLU信号的对照相比。在第0天和第14天，用INO-4800对BALB / c小鼠免疫两次，并在第二次免疫后的第7天收集血清。将伪病毒与连续稀释的小鼠血清一起温育，并将血清-病毒混合物添加至稳定表达人ACE2受体（ACE2-293T）的293T细胞中72小时。在经INO-4800免疫的小鼠中观察到的中和ID50平均滴度为92.2（图 4a，b）。对照动物未观察到RLU降低。另外通过PRNT测定法测量了针对两种野生型SARS-CoV-2病毒株的中和效价。来自INO-4800免疫BALB / c小鼠的血清中和了SARS-CoV-2 / WH-09 / human / 2020和SARS-CoV-2 / Australia / VIC01 / 2020病毒株，其平均ND50滴度分别为97.5和128.1（表 1）。遵循相同的INO-4800免疫方案，还在C57BL / 6小鼠中评估了活病毒中和效价。来自INO-4800免疫的C57BL / 6小鼠的血清中和了野生型SARS-CoV-2病毒，其平均ND50效价为340（表 1）。
BALB / c小鼠（Ñ的每组5只）中第0天免疫两次和INO-4800的14用10μg。在第二次免疫后第7天收集血清，将连续稀释液与显示SARS-CoV-2 Spike的假病毒一起孵育，并与ACE2-293T细胞共同孵育。a “初次免疫”和“ INO-4800”免疫小鼠的中和ID50（平均值±SD），b“未免疫”小鼠（绿色）和接种INO-4800（红色）的小鼠血清的相对发光单位（RLU），如“方法”所述。
我们在哈特利豚鼠模型中，皮内疫苗交付的建立的模型评价INO-4800的免疫原性，17，18。如方法部分所述，通过Mantoux注射将100微克pDNA施用至皮肤，然后在第0天通过递送设备施用。在第14天，通过ELISA测量血清抗体的抗穗蛋白结合。INO-4800的免疫反应显示出针对血清中SARS-CoV-2 S1 + 2蛋白结合IgG水平的免疫反应（图 5a，b）。在用100 µg INO-4800或pVAX（对照）治疗的豚鼠中，第14天的SARS-CoV-2 S蛋白结合终点滴度分别为10,530和21（图5b）。 ）。接下来，我们在豚鼠模型中评估了皮内INO-4800免疫后的抗体中和活性。在第0、14和28天用pVAX或INO-4800处理豚鼠，并在第35或42天收集血清样品，分别测量针对假病毒或野生型病毒的血清中和活性。对于经INO-4800免疫的豚鼠，观察到SARS-CoV-2假病毒中和活性，其平均ND50效价为573.5（表 1）。通过在所有动物中观察到的PRNT测定，在经ND-4滴度＞ 320的INO-4800免疫的豚鼠中也观察到野生型SARS-CoV-2病毒活性（表 1）。
按照方法中的描述，在第0天用100 µg INO-4800或pVAX空载体免疫Hartley豚鼠。在第0天和第14天以连续血清稀释液与IgG 的 SARS-CoV-2 S蛋白抗原结合。显示的数据代表五只豚鼠的平均OD450 nm值（平均值+ SD）。b在第14天时对SARS-CoV-2 S蛋白的血清IgG结合滴度（平均值±SD）。所示值为平均值±SD。P值由Mann-Whitney检验确定。
认为能够抑制宿主受体的Spike蛋白结合的抗体的诱导与SARS-CoV-2疫苗的开发有关。因此，我们检查了INO-4800诱导的抗体应答的受体抑制功能。我们最近开发了一种基于ELISA的ACE2抑制测定法，作为中和的替代方法。该测定在原理上类似于已验证冠状病毒19的其他替代中和测定。作为我们分析中的对照，我们显示ACE2可以以0.025 µg / ml 的EC 50结合SARS-CoV-2 Spike蛋白（图 6a）。）。在第0天和第14天用10 µg INO-4800免疫BALB / c小鼠，并在免疫后第21天纯化血清IgG，以确保抑制作用是抗体介导的。我们比较了从幼稚小鼠和INO-4800疫苗接种小鼠的血清IgG对Spike-ACE2相互作用的抑制作用（图 6b）。我们用五只免疫小鼠的一组重复了受体抑制试验，证明了INO-4800诱导的抗体与ACE2与SARS-CoV-2 Spike蛋白的结合竞争（图 6c和补充图 1）。）。在豚鼠模型中进一步评估了ACE2结合抑制作用。在ACE2浓度范围（0.25 µg / ml至4 µg / ml）范围内，从INO-4800免疫豚鼠收集的血清抑制SARS-CoV-2 Spike蛋白的结合（图 6d）。此外，血清稀释曲线显示从经INO-4800免疫的豚鼠收集的血清以稀释依赖的方式阻断了ACE2与SARS-CoV-2的结合（图 6e）。）。从经pVAX处理的动物收集的血清在抑制ACE2与病毒蛋白结合方面显示出微不足道的活性，在最高血清浓度下OD信号的降低被认为是该分析的基质效应。ACE2被认为是SARS-CoV-2细胞进入的主要受体，阻断这种相互作用表明INO-4800诱导的抗体被认为对预防宿主感染很重要。
一个可溶性ACE2受体结合于COV-2的全长刺突与EC 50的0.025微克/毫升。b用INO-4800进行第二次免疫后，从BALB / c小鼠中纯化的血清IgG（每组n个为5）在与ACE2受体的竞争中具有明显的竞争性。来自动物的血清IgG样品重复三次。在 用INO-4800进行第二次免疫后第7天从n = 5只小鼠中纯化得到的IgG 表现出对ACE2受体与SARS-CoV-2 S 1 + 2蛋白结合的显着竞争。用于竞争测定的可溶性ACE2浓度约为〜0.1 µg ml -1。条形图表示补充图1中显示的曲线的AUC平均值和标准偏差 。d按照方法中的描述，在第0天和第14天用100 µg INO-4800或pVAX空载体对哈特利豚鼠进行免疫。在添加连续稀释的ACE2蛋白之前，将第28天收集的血清（以1:20稀释）添加到SARS-CoV-2包被的孔中。测量了ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白结合的检测。从5只INO-4800治疗的动物和3只pVAX治疗的动物收集的血清用于该实验。e在添加ACE2蛋白之前，将在第21天收集的豚鼠血清的系列稀释液添加到SARS-CoV-2包被的孔中。测量了ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白结合的检测。从4只经INO-4800治疗和5只pVAX治疗的豚鼠收集的血清用于该实验。
总之，在小鼠和豚鼠中进行的体液免疫原性测试表明，候选COVID-19疫苗INO-4800能够引发针对SARS-CoV-2穗突蛋白的功能性封闭抗体反应。
下呼吸道疾病（LRD）与COVID-19的严重病例有关。靶向SARS-CoV-2的肺粘膜抗体的存在可能会介导针对LRD的保护。因此，我们评估了免疫小鼠和豚鼠肺中SARS-CoV-2特异性抗体的存在。在第0天和第14天或第0、14和28天分别用INO-4800或pVAX对照pDNA免疫BALB / c小鼠和Hartley豚鼠。处死后收集支气管肺泡灌洗液（BAL），并进行SARS-CoV-2 S蛋白ELISA。与接受pVAX对照的动物相比，在接受INO-4800的BALB / c和Hartley豚鼠中，我们测量了BAL液中SARS-CoV-2 S蛋白结合IgG的统计学显着增加（图 7a–d）。综上所述，这些数据证明了用INO-4800免疫后肺中存在抗SARS-CoV-2特异性抗体。
在第0天和第14天，用INO-4800或pVAX免疫BALB / c小鼠（每组5只），在第21天（a，b）进行免疫。在第0、14和21天，用INO-4800或pVAX和第42天收集的BAL对Hartley豚鼠（每组5 只n）进行免疫（c，d）。通过ELISA一式两份地测定支气管肺泡灌洗液的SARS-CoV-2 Spike蛋白特异性IgG抗体。数据显示为终点滴度（a，c）和原始OD 450 nm值（b，d）的BAL稀释曲线。一，Ç条形代表每组的平均值，误差条代表标准偏差。** 根据Mann–Whitney U检验p <0.01 。
我们通过IFN-γELISpot分析了针对SARS-CoV-2，SARS-CoV和MERS-CoV S抗原的T细胞应答。在INO-4800给药后第4、7或10天处死BALB / c小鼠组（2.5或10μgpDNA），收获脾细胞，并用15个池刺激单细胞悬液20小时跨SARS-CoV-2，SARS-CoV和MERS-CoV刺突蛋白的多聚体重叠肽。INO-4800给药后第7天，我们分别针对2.5和10 µg剂量测量了每10 6个脾细胞针对SARS-CoV-2 的205和552 SFU的T细胞反应（图 8a）。每10 6更高的852和2193 SFU幅度响应在INO-4800施用后第10天观察到针对SARS-CoV-2的脾细胞。此外，我们分析了INO-4800对SARS-CoV引起的细胞反应的交叉反应性，观察到在第7天（74 [2.5 µg剂量]和140 [10 µg剂量] SFU均可检测到，尽管较低的T细胞反应）每10 6脾细胞）和第10天给药后（242 [2.5微克剂量]和588 [10微克剂量]每10个SFU 6脾细胞）（图 8B）。有趣的是，未观察到针对MERS-CoV肽的交叉反应性T细胞应答（图 8c）。补充图2提供了IFN-γELISpot板的代表性图像。 。我们着手鉴定产生IFN-γ的T细胞群。在单次INO-4800免疫后第14天，对从BALB / c小鼠收获的脾细胞进行流式细胞仪分析，发现SARS-CoV-2抗原刺激后，T细胞区室包含0.04％CD4 +和0.32％CD8 +IFN-γ+ T细胞。 （补充图 3）。
用2.5或10 µg INO-4800免疫BALB / c小鼠（n = 5 /组）。在动物的T细胞反应的第4、7、10天分析a和b，在第14天分析c。用IFN-γELISpot测量跨SARS-CoV-2（a），SARS-CoV（b）或MERS-CoV（c）Spike蛋白的重叠肽库刺激20小时的脾细胞中的T细胞反应。条形代表平均值+ SD。来自个体小鼠的数据显示在补充数据 2中。
我们对接受10 µg INO-4800剂量的BALB / c小鼠的脾细胞进行了抗原表位作图。使用三十个矩阵作图池刺激脾细胞20小时，并在多个肽池中检测到免疫显性反应（图 9a）。对反应进行反卷积以鉴定在受体结合结构域和S2结构域中的几个表位（H2-K d）聚簇（图 9b）。有趣的是，观察到一个SARS-CoV-2 H2-K d表位，PHGVVFLHV与SARS-CoV人HLA-A2限制性表位VVFLHVTYV 20重叠且相邻。
用SARS-CoV-2肽基质库刺激脾细胞20小时。基质映射SARS-CoV-2肽库刺激后的T细胞反应。条形代表五只小鼠的平均值±SD。b SARS-CoV-2 Spike蛋白的图谱以及BALB / c小鼠中免疫显性肽的鉴定。为了比较，包括已知的免疫优势SARS-CoV HLA-A2表位。
总之，在用INO-4800免疫的小鼠中检测到针对SARS-CoV-2 S蛋白表位的T细胞应答。
新型冠状病毒，SARS-CoV-2和相关的COVID-19疾病已成为全球大流行病，其发病率和死亡率均很高。当前，没有可用的COVID-19疫苗，SARS-CoV-2的全球传播可能会继续进行，直到人群中的牛群免疫力很高。在这里，我们描述了基于合成DNA的COVID-19疫苗INO-4800的临床前开发，以对抗这种新兴的传染病。在SARS-CoV-2基因组序列于2020年1月11日公开发布后，立即开始合成DNA疫苗的设计和合成。我们的数据支持INO-4800合成DNA疫苗候选物在多种动物模型中的表达和免疫原性。在小鼠中观察到体液和T细胞反应。在豚鼠中，我们采用了临床分娩参数，并观察了来自INO-4800治疗的动物的血清样品中SARS-CoV-2 S蛋白结合抗体的效价和ACE2 / SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的阻断。在两个物种中也测量了nAb。
遏制迅速出现的传染病需要全球卫生界的精心策划，并需要改进策略以加速疫苗开发。为了应对2019/2020年冠状病毒的爆发，我们采用了合成DNA医学平台。这种合成DNA疫苗的设计和制造代表了即插即用的过程，其中我们将目标抗原序列插入到高度表征和经过临床测试的质粒载体主链（pGX0001）中。该构建体的设计和工程参数已经用于体内基因表达的最优化，并且预先施加到MERS，EBOV，寨卡，和拉沙DNA疫苗构建体，其都正在进行临床试验7，9，11，21，22。
根据我们先前开发的抗MERS冠状病毒疫苗的经验以及先前发表的SARS疫苗研究，选择SARS-CoV-2 S蛋白作为抗原靶标。SARS-CoV-2 S蛋白是I类膜融合蛋白，是冠状病毒表面的主要包膜蛋白。已经进行了初步研究，表明SARS-CoV-2与其宿主受体（ACE2）的相互作用可以被抗体23阻断。在小鼠和豚鼠模型中的体内免疫原性研究表明，经INO-4800免疫的动物血清中S蛋白反应性IgG的水平。除全长S1 + S2和S1外，INO-4800免疫诱导的RBD结合抗体（图3）是已知是SARS-CoV康复患者nAb靶标的结构域。 24，25。我们进一步证明了这些抗体的功能是通过中和SARS-CoV-2野生型病毒和假病毒（表 1），以及在来自INO的血清存在下竞争性抑制SARS-CoV-2穗蛋白与ACE2受体的结合而实现的-4800免疫的动物（图 6）。重要的是，在INO-4800免疫的小鼠和豚鼠的肺洗液中检测到抗SARS-CoV-2结合抗体（图 7）。这些抗体在肺中的存在具有防止感染这些组织和预防LRD的潜力，而LRD与COVID-19的严重病例有关。除体液反应外，已显示细胞免疫反应与MERS-CoV感染中更有利的恢复相关26，并且可能对SARS-CoV感染很重要27。在这里，我们显示了最早在接种疫苗后第7天就诱导了针对SARS-CoV-2的T细胞反应的诱导。快速的细胞反应具有降低病毒载量的潜力，并有可能减少SARS-CoV-2和相关COVID-19疾病的传播。
我们相信合成DNA医学平台具有多种协同特性，可以很好地应对疾病爆发，例如COVID-19。如前所述，设计和立即合成候选疫苗构建体的能力意味着体外和体内测试可能会在收到病毒序列后的几天内开始。DNA质粒的生产过程可实现可扩展的药物产品生产，这有可能规避蛋或细胞培养中常规疫苗生产的复杂性。此外，我们还发布了通过使用我们优化的DNA配方为这些产品提供的稳定性概况7。稳定性特征意味着我们的DNA药物产品是非冷冻的，可以在2-8°C下保存4.5+年，在室温（RT）下在37°C下保存1年和1个月，同时在较高温度下仍保持效力60°C。在大流行暴发的背景下，疫苗的稳定性直接影响其以有效和可执行的方式进行部署和储存的能力。在这项研究中，我们在豚鼠中一次皮内注射INO-4800后观察到血清转化（图 6）。在临床试验中将研究单次免疫对人体是否足够。
尽管已提出疫苗诱导的免疫病理学是SARS和MERS候选疫苗以及SARS-CoV-2疫苗的潜在隐患，但这些隐患可能取决于疫苗平台，迄今为止，尚无免疫发病机理的证据。报道了小鼠或非人类灵长类动物模型中的MERS DNA疫苗10或小鼠中的SARS DNA疫苗8。肺的免疫病理学特征在于由Th2相关的嗜酸性粒细胞已被报道用于灭活全病毒（IV），重组蛋白，肽和/或重组病毒载体疫苗以下SARS-CoV的挑战28，29，30，31，32，以及最近在MERS-CoV挑战模型33。然而，在大多数的研究没有肺的免疫病理学保护效力已被报道用于SARS-CoV的和MERS-CoV的疫苗8，10，34，35，36，37，38，39，40。重要的是要注意，大多数证明CoV疫苗诱导的免疫病理学的研究都使用了BALB / c小鼠，BALB / c小鼠是一种优先发展Th2型应答的模型。DNA疫苗平台可诱导Th1型免疫反应，并且在包括SARS-CoV 8，MERS-CoV 10和RSV 41在内的呼吸道感染模型中已证明具有免疫病理学的功效。SARS-CoV-2动物攻击研究将评估INO-4800介导的针对疾病和疫苗增强疾病的保护作用。
这里，我们报告使用SARS-CoV的-2假病毒试验（图INO-4800免疫血清的功能中和 4，表 1），并测定PRNT针对两种SARS-CoV的-2的野生型菌株（表 1）。同样，我们使用替代中和测定法显示，INO-4800诱导的抗体阻断SARS-CoV-2 Spike与宿主受体ACE2的结合（图 6）。这项研究强调了INO-4800的免疫原性，进一步的动物研究将测试对感染的保护作用。
总而言之，这些描述COVID-19候选疫苗INO-4800免疫原性的初步结果很有希望，特别令人鼓舞的是在多种动物模型中测量功能性抗体和T细胞应答。这项研究支持对INO-4800作为COVID-19候选疫苗的进一步评估。
HEK-293T（ATCC®CRL-3216™）和非洲绿猴肾COS-7（ATCC®CRL-1651™）细胞系获自ATCC（Old Town Manassas，VA）。将所有细胞系维持在补充有10％胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素的DMEM中。
体外RNA表达（qRT-PCR）通过用连续稀释的质粒转染COS-7，然后使用逆转录和PCR分析从细胞中提取的总RNA，证明了质粒的体外mRNA表达。使用FuGENE®6转染试剂（Promega）进行四种浓度的质粒转染，最终质量为每孔80至10 ng。一式两份进行转染。温育18至26小时后，将细胞用RLT缓冲液（Qiagen）裂解。按照试剂盒说明，使用Qiagen RNeasy试剂盒从每个孔中分离总RNA。通过OD 260/280确定所得的RNA浓度然后将RNA样品稀释至10 ng / µL。然后按照试剂盒说明使用高容量cDNA反转录（RevT）试剂盒（Applied Biosystems）将一百纳克RNA转换为cDNA。包含RNA但无逆转录酶（负RT）的RevT反应作为质粒DNA或细胞基因组DNA样品污染的对照。然后使用特异于靶序列的引物和探针对8微升样品cDNA进行PCR（pGX9501正向– CAGGCAGGATTTGGGAGAAA； pGX9501反向– CAGGCAGGATTTGGGAGAAA； pGX9501反向探针– ACCCATCAAGGACTTTGGAGGGG； pGX9503正向– AGGACAGAAGAG； pGX9503正向– AGGACAGAAGAG – ACACCACCCATCAAGGACTTTGGA）。在另一个反应中 使用引物和设计用于COS-7细胞系β-肌动蛋白序列的探针（β-肌动蛋白正向– GTGACGTGGACATCCGTAAA；β-肌动蛋白反向-CAGGGCAGTAATCTCCTTCTGTG；β-肌动蛋白探针– TACCCTGGCATTGCTGACAGGATG）对等量的样品cDNA进行PCR。引物和探针由Integrated DNA Technologies，Inc.合成，并用56-FAM和Black Hole Quencher 1标记。反应使用ABI Fast Advance 2x（目录号4444557），带有最终的正向和反向引物浓度为1 µM，探针浓度为0.3 µM。使用QuantStudio 7 Flex实时PCR Studio系统（Applied Biosystems），首先将样品在95°C下保持1分钟，然后进行40个PCR循环，每个循环包括在95°C下1 s和在95°C下20 s。 60°C。PCR后，扩增结果分析如下。仔细检查阴性转染对照，负RevT对照和NTC各自的适应症。阈值循环（C使用自动阈值设置从QuantStudio软件生成INO-4800 COVID-19目标mRNA和β-肌动蛋白mRNA每种转染浓度的T）。如果与阴性转染对照相比，任何质粒转染的孔中的表达均大于5 C T，则认为该质粒对mRNA表达具有活性。
如先前所述42培养和转染人类胚胎肾细胞293T 。遵循制造商的方案，使用TurboFectin8.0（OriGene）转染试剂用pDNA转染293T细胞。48小时后，使用改良的RIPA细胞裂解缓冲液收获细胞裂解液。在4–12％BIS-TRIS凝胶（ThermoFisher Scientific）上分离蛋白质，然后转移，将印迹与抗SARS-CoV穗状蛋白多克隆抗体（Novus Biologicals）一起孵育，然后与辣根过氧化物酶（HRP）结合后观察抗小鼠IgG（GE Amersham）。
为了对Spike蛋白表达进行体外染色，将293T细胞培养在4孔载玻片（Lab-Tek）上，并按照制造商的规程使用TurboFectin8.0（OriGene）转染试剂每孔pDNA用3 µg转染。在室温下用10％中性缓冲的福尔马林（BBC Biochemical，Washington State）转染10分钟后，将细胞固定48小时，然后用PBS洗涤。染色前，将室温玻片用PBS中的0.3％（v / v）Triton-X（Sigma），2％（v / v）驴血清封闭1小时。细胞用稀释于1％（w / v）BSA（Sigma），2％（v / v）驴血清，0.3％（v / v）的兔抗SARS-CoV刺突蛋白多克隆抗体（Novus Biologicals）染色Triton-X（Sigma）和0.025％（v / v）1克毫升-1室温下于PBS中的叠氮化钠（Sigma）2 h。将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，然后在室温下用驴抗兔IgG AF488（lifetechnologies，A21206）染色1小时。再次洗涤载玻片并固定，并用DAPI-Fluoromount（SouthernBiotech）覆盖。
6周大的C57 / BL6和BALB / c雌性小鼠购自Charles River Laboratories（宾夕法尼亚州Malvern）和Jackson实验室（Bar Harbor，ME）。8周大的Hartley豚鼠是从Elm Hill Labs（马萨诸塞州切姆斯福德）购买的。所有动物均饲养在Wistar Institute动物设施或Acculab Life Sciences（加利福尼亚州圣地亚哥）的动物设施中。所有动物测试和研究均符合所有相关的道德规范和研究，均已获得Wistar研究所或Acculab机构动物护理和使用委员会（IACUC）的道德认可。对于小鼠研究，在第0天，通过针头注射然后在体内电穿孔（EP）对胫骨前（TA）肌肉施用2.5、10或25 µg pDNA剂量。CELLECTRA®EP交付包括两组具有0.2 Amp恒定电流的脉冲。第二个脉冲集延迟3 s。每组中有两个52 ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198 ms。在第0天和第14天，收集血液。在免疫后第4、7和10天连续处死平行组的小鼠以分析细胞免疫应答。对于豚鼠研究，在第0天，通过Mantoux注射，然后在体内进行体内注射，向皮肤施用100 µg pDNA。
进行ELISA以确定血清抗体结合滴度。Nunc ELISA板在4°C下在Dulbecco的磷酸盐缓冲液（DPBS）中涂有1 µg ml -1重组蛋白抗原，过夜。将板洗涤3次，然后在37°C下用含0.05％Tween 20的DPBS中的3％牛血清白蛋白（BSA）封闭2小时。然后洗涤板，并与系列稀释的小鼠或豚鼠血清一起孵育，并在37°C孵育2小时。再次洗涤板，然后与1：10,000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗豚鼠IgG二抗（Sigma-Aldrich，cat。A7289）或（HRP）结合的抗小鼠IgG二次抗体（Sigma- Aldrich），并在室温下孵育1小时。在使用SureBlue TM冲洗最终的洗板后TMB 1-组分过氧化物酶底物（KPL，目录号52-00-03），并用TMB终止溶液（KPL，目录号50-85-06）终止反应。使用Synergy HTX（BioTek Instruments，Highland Park，VT）在30分钟内以450 nm波长读取板。如先前所述43计算结合抗体EPT 。测试的结合抗原包括SARS-CoV-2抗原：S1穗蛋白（Sino Biological 40591-V08H），S1 + S2 ECD穗蛋白（Sino Biological 40589-V08B1），RBD（德克萨斯大学，奥斯汀分校（麦克莱伦实验室））。 ）; SARS-COV抗原：Spike S1蛋白（Sino Biological 40150-V08B1），S（1-1190）（Immune Tech IT-002-001P）和Spike C末端（Meridian Life Science R18572）。
对于小鼠研究，进行ELISA以确定血清IgG抗体对具有人Fc标签的人ACE2的竞争。将Nunc ELISA平板在1x PBS 中用1 µg mL -1兔抗His6X包被，在室温下放置4-6小时，然后用洗涤缓冲液（1x PBS和0.05％Tween 20）洗涤四次。用封闭缓冲液（1x PBS，0.05％Tween 20、5％淡奶和1％FBS）在4°C封闭平板过夜。将板用洗涤缓冲液洗涤四次，然后与含有C端His标签的全长（S1 + S2）突突蛋白（Sino Biologics，cat。40589-V08B1）在10 µg mL -1下温育1小时。洗涤板，然后将纯化的小鼠IgG的系列稀释液与0.1 µg mL -1混合将带有人Fc标签的重组人ACE2（ACE2-IgHu）在室温下孵育1-2小时。再次洗涤板，然后与1：10,000稀释的HRP缀合的抗人IgG二抗（Bethyl，目录号A80-304P）一起孵育，并在室温孵育1小时。用1-Step Ultra TMB-ELISA底物（Thermo，目录号34029）显影最终的洗涤板后，用1 M硫酸终止反应。使用SpectraMax Plus 384酶标仪（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）在30分钟内以450 nm波长读取板。绘制竞争曲线，并使用具有多个t检验的Prism 8分析软件计算曲线下面积（AUC），以确定统计显着性。
对于豚鼠研究，每孔5微克mL -1用25微升包被96孔半面积测定板（Costar）1倍DPBS（Thermofisher）中稀释的SARS-CoV-2穗S1 + S2蛋白（Sino Biological）在4°C过夜。用具有0.05％TWEEN（Sigma）的1×PBS缓冲液洗涤板。加入每孔百微升3％（w / v）BSA（Sigma）的1x PBS，含0.05％TWEEN的溶液，并在37°C下孵育1小时。将血清样品在含0.05％TWEEN的1x PBS中的1％（w / v）BSA中按1:20稀释。洗涤测定板后，加入25 µl /孔的稀释血清，并在37°C下孵育1 h。将人重组ACE2-Fc-tag（Sinobiologic）直接添加到稀释的血清中，然后在37°C下孵育1 h。洗涤板，并将每孔25μl的1：10,000稀释的山羊抗-hu Fc片段抗体HRP（Bethyl，A80-304P）添加至测定板。将板在RT温育1小时。为了进行开发，使用了SureBlue / TMB Stop Solution（KPL，MD），并使用了OD
使用IgE-SARS-CoV-2 S质粒（Genscript）和pNL4-3.Luc.RE-质粒（NIH AIDS试剂）转染了GeneJammer（Agilent）的HEK293T细胞，产生了SARS-CoV-2假型病毒： 1个比例。转染后48小时，收集转染上清液，将FBS浓缩至最终体积的12％，进行立体过滤（Millipore Sigma），并分装以在-80°C储存。感染72小时后，对SARS-CoV-2假型病毒进行了滴定，相对于单独的细胞产生的相对发光单位（RLU）的> 50倍。将来自INO-4800疫苗接种组和幼稚组的小鼠血清在56°C加热灭活15分钟，并从1:10稀释液开始连续稀释3倍进行分析。将血清与固定量的SARS-Cov-2假型病毒孵育90分钟。2）72小时。感染后，使用水铁矿加发光报告基因分析系统（Perkin Elmer目录号6066769）裂解细胞，并使用Biotek读板仪测量RLU。中和效价（ID 50）计算为减去细胞对照孔中的背景RLU之后，病毒对照孔中的RLU与病毒对照孔相比降低了50％的血清稀释度。
SARS-CoV-2 / Australia / VIC01 / 2020分离株中和测定是在英国公共卫生（英国Porton Down）进行的。在56°C加热30分钟后灭活的血清样品中测量中和病毒滴度。将SARS-CoV-2（澳大利亚/ VIC01 / 2020分离株44）稀释至933 pfu ml -1的浓度，并在含有25 mM HEPES缓冲液的1％FCS / MEM中以50:50的比例混合，并将血清稀释度从1:10加倍至1：320在96孔V型底板中。将板在加湿箱中于37°C孵育1 h，然后将病毒转移到用DPBS清洗两次的24孔板的孔中，该孔已于前一天以1.5×10 5接种。每孔含10％FCS / MEM的Vero E6细胞。使病毒在37°C下再吸附一个小时，并用噬菌斑检测叠加培养基（最终1x MEM / 1.5％CMC / 4％FCS）覆盖。在湿箱中于37°C孵育5天后，将板固定，染色并计数噬菌斑。使用Spearman-Karber公式相对于仅病毒对照孔测定中和中和效价（ND50）。
SARS-CoV-2 / WH-09 / human / 2020分离株中和试验是在中华人民共和国国家卫生委员会批准的中国医学科学院实验动物研究所（CAMS）上进行的。SARS-CoV-2种子库存（SARS-CoV-2 / WH-09 / human / 2020）在Vero E6细胞中进行了病毒分离研究，该细胞保存在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Invitrogen，卡尔斯巴德，美国）中补充了10％的胎牛血清（FBS），100 IU ml -1青霉素和100 µg ml -1链霉素，并在36.5°C，5％CO 2下孵育。使用标准的50％组织培养感染剂量（TCID50）测定法确定病毒滴度。从免疫动物收集的血清样品在56°C灭活30分钟，并用细胞培养基连续两次稀释。将稀释的样品与100 TCID 50的病毒悬浮液按1：1的比例混合在96孔板中，然后在36.5°C的5％CO 2培养箱中培养2小时。然后将1-2×10 4 Vero细胞添加到血清-病毒混合物中，并将平板在5％CO 2培养箱中于36.5°C孵育3–5天。在显微镜下记录每个孔的细胞病变效应（CPE），并通过50％保护条件的稀释数计算中和效价。
通过用700–1000μl冰冷的PBS洗涤安乐死和放血的小鼠的肺，收集BAL液，其中包含100μmEDTA，0.05％叠氮化钠，0.05％Tween-20和1x蛋白酶抑制剂（Pierce）（粘膜制备）用平头针刺溶液（MPS），将豚鼠肺通过插入气管的16 G导管用20 ml MPS洗涤，收集的BAL液在-20°C下保存直至测定。
在补充有10％FBS（R10）和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中分别收集小鼠的脾脏，并处理成单细胞悬液。将细胞沉淀重悬于5 mL ACK裂解缓冲液（加利福尼亚州卡尔斯巴德的Life Technologies公司）中RT 5分钟，然后加入PBS终止反应。再次将样品以1500× g离心 10分钟，将细胞沉淀重新悬浮在R10中，然后通过45 µm尼龙过滤器进行ELISpot分析。使用小鼠IFN-进行酶联免疫斑点测定γ酶联免疫斑点法PLUS板（MABTECH）。预涂捕获抗体的96孔ELISpot平板在4°C下用R10培养基封闭过夜。将200,000个小鼠脾细胞铺板到每个孔中，并用15-mer肽库与SARS-CoV-2，SARS-CoV或MERS-CoV Spike蛋白的9个氨基酸重叠（每个蛋白有5个肽库）刺激20小时。另外，在设计用于鉴定免疫优势反应的基质中使用肽库进行基质作图。在RPMI + 10％FBS（R10）中，每孔终浓度为5μL的每种肽刺激细胞。这些斑点是根据制造商的说明开发的。R10和细胞刺激性鸡尾酒（Invitrogen）分别用于阴性和阳性对照。通过ImmunoSpot CTL阅读器对斑点进行扫描和定量。
在37°C，5％CO 2的条件下，对跨过SARS-CoV-2 S蛋白的重叠肽刺激的BALB / c和C57BL / 6小鼠收获的脾细胞进行了细胞内细胞因子染色。。除非另有说明，否则用BD Biosciences的以下抗体对细胞进行染色，括号中注明稀释度：FITC抗小鼠CD107a（1：100），PerCP-Cy5.5抗小鼠CD4（1：100），APC抗小鼠CD8a（1：100），ViViD染料（1–40）（LIVE /DEAD®可固定的紫罗兰死细胞染色试剂盒； Invitrogen，L34955），APC-Cy7抗小鼠CD3e（1：100）和BV605抗小鼠IFN-γ（1:75）（eBiosciences）。醋酸肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）用作阳性对照，仅完全培养基用作阴性对照。洗涤，固定细胞，并使用FACS CANTO（BD Biosciences）获取细胞事件，然后进行FlowJo软件（FlowJo LLC，Ashland，OR）分析。
从PDB ID 6ACC和5×59构建SARS-CoV和MERS-CoV的结构模型，以便将所有三个RBD向下排列的预融合模型组装在一起。以SARS-CoV结构（PDB ID：6ACC）为模板，构建了SARS-CoV-2结构模型。使用Rosetta重塑模拟进行适当的氨基酸突变，并为SARS-CoV-2环建立从头构建模型，该环未在SARS-CoV结构中定义45。允许邻近环的氨基酸位置改变骨架构象以适应新环。结构图是使用PyMOL制作的。
所有统计分析均使用GraphPad Prism 7或8软件（加利福尼亚州拉霍亚）进行。如果p <0.05，则认为这些数据是显着的。所有图表中的线表示平均值，误差线表示标准偏差。没有样品或动物被排除在分析之外。没有对动物研究进行随机化。在进行每个实验之前，样品和动物均未致盲。
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