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伴侣DNAJA1和DNAJB6对于调节聚谷氨酰胺聚集至关重要

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发表时间:2020-05-19 11:41作者:武汉新启迪生物Xinqidibio来源:www.qidibio.com

伴侣DNAJA1和DNAJB6对于调节聚谷氨酰胺聚集至关重要

摘要

亨廷顿舞蹈病(HD)是由亨廷顿基因中的CAG重复扩增引起的。编码蛋白的扩展聚谷氨酰胺(polyQ)重复序列导致蛋白错误折叠和聚集,从而导致神经元细胞死亡增加。DNAJ分子伴侣在将错误折叠/未折叠的蛋白质转移到HSP70分子伴侣中起关键作用,后者对蛋白质折叠起着至关重要的作用。在这里,我们调查了三个单独的DNAJ基因敲除(KO)在表达多谷氨酰胺74exon1亨廷顿蛋白(polyQ74htt)的HEK293细胞中的作用。荧光显微镜分析表明,DNAJB6的KO导致polyQ74htt聚集增加5倍,而DNAJA1 KO导致polyQ74htt聚集减少4倍。DNAJB1的KO并没有改变polyQ74htt在细胞中聚集的倾向。这些发现均通过荧光显微镜分析和过滤阱分析(FTA)证实。DNAJB6 KO细胞通过台盼蓝排除法和碘化丙锭(PI)摄取分析评估显示出更高的细胞死亡率。这些结果表明DNAJ蛋白DNAJA1和DNAJB6可以以相反的方式调节polyQ聚集,因此微调DNAJ蛋白的细胞水平对于抑制polyQ聚集和细胞存活至关重要。

介绍

PolyQ疾病的特征是CAG重复序列的扩展区域,在蛋白质1的N端编码polyQ延伸这些疾病之一是亨廷顿舞蹈病(HD),其特征是大脑皮质和基底神经节的神经变性,导致运动控制的逐步丧失以及认知症状2导致疾病进展的polyQ扩增的长度随目标基因的不同而不同。在高清中,亨廷顿蛋白一个等位基因中至少扩展了40个CAG三联体足以触发该疾病3不幸的是,到目前为止,尚无针对HD的可用治疗方法,只有对症药物不能阻止疾病的进展4

70 kDa热激蛋白(HSP70s)在维持细胞中蛋白质稳态5中起着重要作用HSP70s参与了一系列机制,例如新合成的蛋白质的折叠,错误折叠的蛋白质的重新折叠以及针对蛋白质的降解6但是,HSP70分子伴侣需要辅助分子伴侣的帮助才能发挥其功能。这种伴侣蛋白的一个主要类别是DNAJ家族的蛋白质,它由40多个不同的成员组成7这些蛋白质可以募集错误折叠或未折叠的蛋白质,并以ATP依赖性方式将其转移至HSP70蛋白质8因此,DNAJ蛋白对于调节蛋白稳态是重要的。事实上,已经显示出几个基因DNAJ已经链接到涉及错折叠蛋白的积累,其包括神经退化性疾病,其中淀粉样蛋白的聚集体形成的疾病91011

有趣的是,Kampinga实验室和其他人以前的工作表明,有些DNAJ蛋白,特别是DNAJB6和DNAJB8可能是抑制的polyQ蛋白聚集重要的1213然而,这些研究是由DNAJ蛋白质过度表达限于评价1213和DNAJB8的进一步内源性表达主要局限于睾丸14在这项研究中,我们调查如果CRISPR / CAS9介导的基因敲除的3个选择DNAJ基因(KO),即把所有被链接到淀粉样蛋白聚集,DNAJB6之前1516,DNAJB1 17和DNAJA1 18将调制polyQ74htt聚合。在这里,我们证明了这些基因中的两个,DNAJB6和DNAJA1,以相反的作用影响polyQ聚集,而DNAJB6的KO上看到的聚集增加导致细胞死亡增加。

材料和方法

细胞培养,转染,质粒和基因组编辑

使用200 µg / ml G418选择标记并转染polyQ74htt表达,可在人胚肾293(HEK293)细胞中生成与74 polyQ重复序列(PolyQ74)融合的亨廷顿编码基因外显子1的绿色荧光蛋白(GFP)稳定表达。质粒(addgene#40262)。将这些细胞维持在含有GlutaMAX-I(Thermo Fisher Scientific)和10%FBS(Thermo Fisher Scientific)和1%青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)的DMEM中。

使用Sanger程序设计了DNAJA1,DNAJB1和DNAJB6基因的CRISPR / Cas9靶向序列:http : //www.sanger.ac.uk/htgt/wge/find_CRISPRs用于生成具有2个不同引导序列的DNAJA1 KO的序列是5'caccgcaacttactacgatgttttgg3',5'aaaccaaaacatcgtagtaagttgc3',5'caccgggtcaaacccaatgctactc 3'和5'aaacgagtagcattgggtcccggcggcc3':用于生成DNAB的序列分别是2' 5'aaaccggcgcgtcggacgaggaga3',5'caccgcgggtcgctgagcacgtcgt3'和5'aaacacgacgtgctcagcgacccgc3':用于指导DNAJB6 KO 5'caccgttacgccggtcgtcgtgtgtgtgt3t3'和5'aaacaggtactccctccctctccctctccctctccctccctctccctctccctctctctccctgt3t3',5' 根据19中所述的方案克隆到Cas9-Cherry构建体(衍生自Cas9-GFP构建体,Addgene:目录号48138)中,并转化(HEK293)-polyQ74细胞。孵育36小时后,将Cherry-Cas9阳性细胞单细胞分选到96孔板中,并通过蛋白质印迹分析分析单细胞克隆的Cas9诱导的KO。

为了将DNAJB6或DNAJA1重新引入细胞,我们表达了与DNAJA1共表达的Cherry-DNAJB6b或Cherry。pcDNA3载体中编码人V5标签的DNAJB6b和DNAJA1的cDNA是Harm Kampinga实验室(荷兰格罗宁根大学)的礼物。关于DNAJB6 cDNA,我们将cDNA插入了其中Cherry替换了GFP的pACGFP-C1载体(clontech)。对于DNAJB6插入到该载体中,我们放大DNAJB6通过PCR和插入中的cDNA通过使用含有XhoI和BamHI(5'tcgaggatccctagtgattgcctttggtcgacttcttc 3'和5'gtcaggatccttacttgttatccaagcgcagcagctg 3')的限制酶突出端侧翼引物。

SDS-PAGE蛋白质印迹,抗体和试剂

10000,Sigma-Aldrich;目录号A3854)。所有与抗体的孵育均在PBS-T中2-3%的牛奶中进行。在室温下于4°C过夜孵育带有一抗的印迹,然后用PBS-T洗涤3 x 5分钟,最后与抗兔HRP偶联的二抗(1:5000,Dako cat#P0448)孵育1小时。室内温度。用PBS-T洗涤后,使用ImmunoCruz Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology)分析膜。来自膜的发光信号通过使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad)成像。然后用PBS-T洗涤3 x 5分钟,最后在室温下与抗兔HRP偶联的二抗(1:5000,Dako cat#P0448)孵育1小时。用PBS-T洗涤后,使用ImmunoCruz Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology)分析膜。来自膜的发光信号通过使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad)成像。然后用PBS-T洗涤3 x 5分钟,最后在室温下与抗兔HRP偶联的二抗(1:5000,Dako cat#P0448)孵育1小时。用PBS-T洗涤后,使用ImmunoCruz Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology)分析膜。来自膜的发光信号通过使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad)成像。

在不溶级分蛋白质印迹实验中,将细胞溶解在NP40裂解缓冲液(0.5%NP40、50 mM Tris HCl,175 mM NaCl和5 mM EDTA,pH 8、1:100蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich; P8340)中)并将细胞裂解物在冰上孵育20分钟,将细胞沉淀在4°C下以15,000 g离心10分钟,收集上清液。用5%NP40裂解缓冲液+ Laemmli缓冲液+ 10%1 M DTT重悬沉淀。将20 µg的蛋白质上样到10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,然后使用Trans-Blot Turbo Transfer System(Bio-Rad)将其转移到PVDF膜上。将膜在含0.05%Tween(PBS-T)的PBS中的5%(w / v)脱脂奶中封闭1小时。使用的一抗是抗GFP(1:1000,ThermoFisher:MA5-15256)抗β-肌动蛋白(1:10000,Sigma-Aldrich; Cat#A3854)。所有与抗体的孵育均在PBS-T中2-3%的牛奶中进行。将一抗与印迹杂交后在4°C下孵育过夜,然后用PBS-T洗涤3 x 5分钟,最后与抗小鼠HRP偶联二抗(1:5000,Dako)在室温下孵育1小时。用PBS-T洗涤后,使用ImmunoCruz Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology)分析膜。来自膜的发光信号通过使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad)成像。用PBS-T洗涤后,使用ImmunoCruz Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology)分析膜。来自膜的发光信号通过使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad)成像。用PBS-T洗涤后,使用ImmunoCruz Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology)分析膜。来自膜的发光信号通过使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad)成像。

荧光显微镜和细胞系比较

用0.1 mg / ml聚L-赖氨酸将24孔板每个孔中的玻璃盖玻片包被20分钟。每孔播种约80,000个细胞并孵育过夜。用PBS冲洗细胞,并在4%多聚甲醛(PFA)中固定20分钟。然后将细胞用500 µl PBS洗涤3次。将盖玻片用含有DAPI(Vector Laboratories)的Vectashield固定介质固定在载玻片上。对于细胞系中的polyQ-74聚集体定量,使用尼康eclipse 80i显微镜以20x-60X放大倍数进行落射荧光显微镜对聚集体进行成像和计数。对于每个独立实验,至少计数200个细胞,并计算包含聚集体(GFP阳性点)的细胞百分比。实验既不是随机的也不是盲目的。

台盼蓝排除法和PI试验检测细胞凋亡

台盼蓝

对于每个DnaJKO细胞系,在5个独立的实验中,每孔播种80.000个细胞过夜。用胰蛋白酶消化细胞,以400 g离心1分钟,然后重悬于100 µL培养基中。随后,将10μl的细胞悬液与10μl的0.4%锥虫蓝染料(Bio-Rad; 450021)混合,并将10μl的该细胞/锥虫蓝悬浮液加入细胞计数载玻片(Bio-Rad)。细胞存活力是由TC20自动细胞计数器(Bio-Rad)分析的结果确定的。

PI

收集细胞,将其重悬于含有2 µl / ml PI(50 mg / ml,BD Pharmingen™)的细胞培养基中,并立即在流式细胞仪(FACS Aria III,BD FACS Diva软件8.0.1,BD Biosciences)上进行分析。 PI在561 nm处激发,并使用610/20带通滤光片检测,死细胞的百分比以PI +细胞计为单细胞。

过滤阱分析

根据Waarde-Verhagen和Kampinga 20所描述的方案完成了过滤器捕集试验(FTA)简要地说:通过将1.000.000细胞接种在6孔板中制备蛋白质样品,然后孵育过夜。然后将细胞用1 ml PBS洗涤,然后加入200 µl裂解缓冲液(FTA缓冲液:(pH 8.0:10 mM Tris-Cl和150 mM NaCl)+ 2%SDS)。将细胞刮入Eppendorf小瓶中,然后用微尖端超声仪以50 W(振幅为33%)超声处理裂解液5秒钟。测量蛋白质浓度,然后在400 µl裂解缓冲液中将样品调至40 µg。向储备样品中添加1 M DTT至终浓度为50 mM,然后将样品加热至96°C 5分钟。从煮沸的原液样品中按1:5至1:25进行系列稀释,以达到400 µl的最终体积。将含有100 µg蛋白质提取物的样品上样,并通过0过滤。22 µm醋酸纤维素膜(Sterlitech Corporation;目录号CA022005),已使用洗涤缓冲液(FTA缓冲液+ 0.1%SDS)进行了预平衡。将缝隙用100μl洗涤缓冲液洗涤3次,然后将印迹装置拆开,取出膜并用0.1%PBS-T洗涤两次。在室温下,将膜用0.1%PBS-T中的5%脱脂奶粉封闭1小时,并在4°C下与小鼠GFP一抗(在0.1%PBS-T中与3%BSA进行1:5000孵育)过夜Fischer Scientific;目录号:MA5-15256)。第二天,将膜用0.1%PBS-T洗涤,然后在室温下与山羊抗小鼠IgG HRP偶联的二抗(1∶5000)DAKO cat#P0447)一起温育1小时。用PBS-T洗涤3 x 5分钟后,使用ImmunoCruz Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology; Cat#sc-2048),使用增强的化学发光(ECL)底物来检测polyQ蛋白。使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad)将结果可视化。条带的准确定量通过Image J软件(美国国立卫生研究院)完成。

统计分析

定量数据分析是通过使用GraphPad Prism(美国版本6)进行的。在所有情况下,数据均基于三个或更多独立实验得出的平均值±SE。统计学显着性使用单向方差分析(ANOVA)假设正态分布的分析来计算,然后事后Tukey检验,其中* P≤0.05, * * P≤0.01 * * * P≤0.001。另外,使用Mann-Whitney非参数检验对假设正态分布的所有通过单向方差分析(ANOVA)分析的数据进行统计分析,发现所有显着性差异* P≤0.05。方差分析。

结果

为了研究DNAJA1,DNAJB1和DNAJB6对polyQ聚合的影响,我们产生了稳定的HEK293细胞系,其组成型表达了74个谷氨酰胺残基,与亨廷顿外显子1和GFP(polyQ74htt-GFP)偶联。随后,我们使用CRISPR / CAS9技术创建了indel突变,从而为我们想要研究的基因生成了KO细胞系。潜在的KO细胞经过FACS分选,基因的KO's分别导致了它们编码的蛋白质表达的损失,通过Western blotting进行了验证(图   1a–c)。

图1
图1

Western blot分析显示DNAJ基因的敲除。通过分别用抗DNAJA1,抗DNAJB1和抗DNAJB6抗体探查膜来分析DNAJA1(A),DNAJB1(B)和DNAJB6(C)的KO。

为了分析这些KO对polyQ聚集的影响,我们使用荧光显微镜评估了带有polyQhtt-GFP聚集体(点)的细胞的频率(图   2A和补充图   1)。对这些KO进行分析,在每种情况下为两个独立的克隆,并与亲本对照细胞系进行比较。结果表明,尽管DNAJB6 KO导致聚集体数目增加约5倍,但DNAJA1的KO出乎意料地大大降低了约4倍的polyQhtt-GFP聚集体数量。对于DNAJB1 KO,与亲代细胞系相比,在聚集体数量上没有发现显着差异(图   2B–D)。为了验证通过荧光显微镜观察到的观察是由polyQhtt聚集的变化引起的,我们通过FTA分析了细胞裂解物。在FTA中,将来自细胞裂解液的polyQhtt-GFP聚集体捕获到膜上,然后将其用抗GFP抗体染色。结果证实,DNAJA1 KO导致polyQ74htt-GFP表达细胞中聚集体的数量大大减少,而DNAJB6 KO细胞中聚集体的数量则显着增加(图   3A,B)。我们观察到,通过FTA分析进行分析时,敲除DNAJB6的效果不如通过荧光显微镜观察到的明显,但我们认为,与荧光显微镜相比,通过FTA检测到的聚集体范围可能不同。可以解释这些差异。通过分离NP40不溶级分进行的进一步分析证实,DNAJA1 KO细胞的不溶性polyQ74htt比亲代细胞系少得多(补充图   2)。然而,当比较亲代和DNAJB6 KO细胞时,该分析没有差异(补充图   2)。

图2
图2

DNAJ基因的KO导致polyQ74htt聚集的变化。A)代表性的荧光显微镜图像显示了polyQ74htt聚集体,并在DNAJA1KO (B),DNAJB1KO(C)和DNAJB6KO(D)细胞中与亲本polyQ74htt HEK293对照细胞进行了比较,比例尺= 50 µm。*** p <0.001,通过单因素方差分析进行分析。(n = 3)。

图3
图3

过滤阱分析表明KO DNAJA1和DNAJB6改变了polyQ74htt-GFP的聚集。A)测定的代表性图像。B)5种过滤器捕获测定的数据分析,每个测定的强度带的值除以亲代带,以获得特定敲除细胞系的聚集体的倍数变化。通过用抗GFP抗体探测来分析膜。* p <0.05,*** p <0.001,通过单向方差分析进行分析。(n = 5)。

为了评估KO的作用是否特定于敲除我们想要靶向的基因,我们进行了抢救实验,将DNAJB6或DNAJA1重新引入这些KO细胞中。当我们将DNAJB6重新引入DNAJB6 KO细胞时,我们观察到带有polyQ74htt聚集体的细胞的频率从23%降至5%,这是亲代细胞的水平,这表明KO的作用确实是由于DNAJB6的特异性KO(图   4A)。当我们将DNAJA1重新引入DNAJA1 KO细胞时,与A1 KO细胞相比,这些细胞表现出强烈的聚集频率升高趋势,并且与亲代细胞系中的水平相比具有相当的聚集量(图   4B))。通过WB分析分别验证了DNAJB6和DNAJA1的重新导入的验证(图   4C,D)。

图4
图4

救援实验表明,用DNAJB6(A)或DNAJA1(B)的KO恢复细胞中单个蛋白质的表达,导致polyQ74htt聚集水平恢复到亲本对照细胞水平。验证分别将DNAJB6(C)或DNAJA1(D)分别导入DNAJB6 KO或DNAJA1 KO HEK293细胞。Emp:空矢量控件。* p <0.05,** p <0.01,通过单向方差分析进行分析。(n = 3)。

众所周知,polyQhtt聚集可导致疾病中受影响细胞的细胞死亡。为了测试观察到的增加的聚集是否会导致细胞死亡的增加,我们分别通过台盼蓝排除试验和PI摄取试验对此进行了分析。结果表明,在DNAJB6 KO细胞中发现的polyQ74htt聚集的大量增加与细胞死亡的大量增加之间也存在联系(图   5A,B和补充图   3)。这些结果进一步证实DNAJB6对于防止polyQhtt聚集和细胞死亡是重要的。

图5
图5

A)台盼蓝排除试验显示与对照细胞相比,B6-KO中细胞死亡的差异。B)使用PI摄取测定法通过流式细胞术分析的细胞死亡。通过单向方差分析分析,*** p <0.001。(n = 3)。

讨论区

错误折叠的聚集蛋白的积累可能是神经退行性疾病的原因,并因此导致疾病。DNAJ蛋白质是可以促进蛋白质清除或促进蛋白质折叠的伴侣蛋白,这是可以抵消蛋白质聚集体积累的机制。在HD的情况下,亨廷顿蛋白N末端的polyQ扩增是这种单基因疾病的原因。因此,我们想探讨三种DNAJ蛋白是否会改变polyQ74htt的聚集倾向。这些特定DNAJ蛋白质,DNAJA1,DNAJB1和DNAJB6,在那里,因为他们选择的先前已被证明修改polyQhtt或其它淀粉样蛋白的蛋白质聚集151718我们选择调查敲除表达polyQ74htt的HEK293细胞系中三种蛋白质的内源性水平将如何影响polyQ74htt的聚集状态。

我们通过多种不同的方法验证了这种影响:我们通过包含GFP阳性点的细胞数量,过滤阱分析或通过将细胞级分分析为不溶和可溶级分进行分析。所有这些方法被广泛用于测定以评估polyQhtt聚合212223我们观察到,所有三种类型的测定均证实,与亲代细胞相比,DNAJA1 KO中检测到的聚集体数量减少了几倍,而与亲代细胞相比,DNAJB6 KO细胞中检测到的聚集体数量却大大增加了荧光显微镜分析和过滤截留测定而不是由不溶性级分(图的分析。   23和补充图   2)。尽管这些都是分析聚合的polyQhtt量的有效方法,但我们并不期望在所有这些方法中都能检测到相同范围的聚集体。此外,荧光显微镜分析能够分析单个细胞,而过滤器陷阱和不溶性组分分析仅能分析细胞总数。这就是为什么不能期望亲代细胞与KO细胞之间的倍数差异在两次检测之间是相同的。此外,一些研究通过危害Kampinga的实验室还得出结论,DNAJB6是的polyQ聚集支持这一研究结果的主要抑制因子1216

先前有几项研究调查了DNAJB6防止淀粉样蛋白聚集的潜力。具体地,在细胞中过表达时DNAJB6已显示polyQhtt的抑制聚合1224,甚至延迟HD像疾病进展在R6 / 2小鼠的脑过表达时16此外,我们已经表明,HEK293细胞中DNAJB6的KO导致α-突触核蛋白聚集的增加,并且DNAJB6可以在体外延迟α-突触核蛋白的聚集15,其他体外研究表明DNAJB6甚至可以延迟聚集的Abeta42淀粉样蛋白以及25这些结果表明DNAJB6可以抑制细胞中多种淀粉样蛋白的聚集。关于DNAJA1和DNAJB1,关于它们改变淀粉样蛋白聚集的潜力的报道较少,但是已经证明DNAJA1可以修饰细胞18中的 tau聚集,并且DNAJB1可以在体外分离α-突触核蛋白原纤维17

在这项研究中,当我们从过表达polyQ74htt的HEK293细胞中敲除DNAJB6时,我们观察到polyQ74htt聚集的增加(图   2A,D)。这与其他人的发现一致12,但是在这项研究中,我们通过敲除DNAJB6的内源性水平以及通过抢救实验来总结这些发现,而不是依靠过度表达。尽管DNAJB1 KO不会改变polyQ74htt的聚集,但我们发现DNAJA1的KO导致polyQhtt聚集体的数量急剧减少(图   2A,B)。

此前,其他人得出的结论是另一个DNAJ蛋白质,DNAJB8,也能够抑制的polyQ聚集1224但是,由于DNAJB8几乎仅在睾丸中表达,因此它不可能在HD中发挥作用。有数据支持DNAJB6可以抑制polyQhtt在细胞和动物模型以及细胞和体外模型中的聚集对于其他几种淀粉样蛋白,不能排除DNAJB6是多种淀粉样蛋白的淀粉样蛋白聚集的主要抑制剂。但是,不能排除某些DNAJ蛋白可能形成阻止淀粉样蛋白在不同细胞类型和/或细胞区室聚集的网络。在这方面,是值得大家注意的三个DNAJ基因,DNAJB2,DnaJC6启动和DNAJC13已被基因与帕金森病(PD)的罕见形式的91126这些可能会影响PD相关蛋白α-突触核蛋白的聚集,还是这些遗传联系与此无关,还有待探讨。

普遍认为,DNAJ蛋白的主要功能是充当HSP70蛋白的伴侣分子,这对于细胞中蛋白折叠至关重要。因此,尚不清楚DNAJ基因的KO如何导致polyQhtt聚集减少的直接证据。DNAJA1的作用可能是通过异源二聚作用或通过完全不同的机制对其他DNAJ蛋白产生显性负作用而引起的,这有待探索。此外,DNAJA1和DNAJB6属于DNAJ蛋白质家族27的不同亚类(A和B)(补充图   4)。),并且这些DNAJ子类之间可能存在一般的结构差异,这对于它们如何调节淀粉样蛋白聚集非常重要。总而言之,我们在这项研究中证明了DNAJ蛋白是polyQhtt聚集的重要调节剂。DNAJ蛋白可能会成为未来药物设计的良好靶标。




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