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单克隆抗体制备-髓瘤细胞、脾淋巴细胞、饲养细胞的准备

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发表时间:2019-07-12 16:59作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

髓瘤细胞、脾淋巴细胞、饲养细胞的准备
       融合前骨髓瘤细胞维持的方式,对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长,融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态,长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中,方法是用6个装5ml培养基的培养瓶,接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14-16小时。
    骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下:
    a、 于融合前48-36小时,将骨髓细胞扩大培养(一般按一块96孔板的融合试验约需2-3100ml培养瓶培养的细胞进行准备)。
    b、 融合当天,用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下,收集于50ml离心管或融合管内。
    c1000r/min离心5-10分钟,弃去上清。
    d、 加入30ml不完全培养基,同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基,混匀。
    e、 取骨髓瘤细胞悬液,加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时,取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中,混匀,用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为:每毫升细胞数=4个大方格细胞数×105/4;或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×106/2

脾淋巴细胞的准备
    取已经免疫的BALB/c小鼠,摘除眼球采血,并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠,浸泡于75%酒精中5分钟,于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤,可看到脾脏,换眼科剪镊,在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜,取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中,轻轻洗涤,并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中,用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏),使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次,制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块,可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液,1000r/min离心5-10分钟,用不完全培养基离心洗涤1-2次,然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀,取上述悬液,加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108个脾细胞,每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。

饲养细胞(Feeder cells)的制备
    在细胞融合后选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常必须加入其他活细胞使之繁殖,这种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了,一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子,为杂交瘤细胞提供必要的生长条件;也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
    常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便,且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用,因此使用最为普遍。其制备方法如下:
按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后,用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔,注意避免穿入肠管。右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟,随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟,弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮,根据细胞计数结果,补加HAT培养基,使细胞浓度为2×105/ml,备用。通常对巨噬细胞来说,96孔培养板每孔需2×104个细胞,24孔板每孔需105细胞。每只小鼠可得3-5×106个细胞,因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞,这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。做法是,将上述细胞悬液加入96孔板,每孔0.1ml(相当于2滴),然后置37 6% CO2的培养箱中培养。


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