摘要
H5亚型的高致病性禽流感病毒（HPAIV）是全世界家禽饲养的主要威胁，在这里尤其是人畜共患的亚洲H5N1病毒。这些高致病性禽流感造成了500多次致命的从家禽到人类的外溢感染，通过建立人与人之间的传播途径，迫近了新的大流行危险。除了在流行地区的受感染农场采取扑杀措施外，接种疫苗也是预防HPAIV的主要手段。然而，主要使用的灭活制剂具有一些局限性，例如通过注射应用于个体动物和降低的效率。在这里，我们提出了一种改良的活流感疫苗原型，该原型基于H17N10蝙蝠流感病毒。新型嵌合疫苗菌株R65 mono/ H17N10能够提供全面保护，防止幼年和亚成年鸡以及口鼻免疫后的雪貂被HPAIV H5N1致死性攻毒感染。此外，H5疫苗原型无法与禽流感病毒重配，因此是对抗HPAIV H5感染的有前途的工具，从而为有效的疾病控制提供了新的疫苗接种策略。
禽流感（AI）可以影响100多种不同的禽类和所有类型的家禽，而野生水禽代表着天然水库1。病原体是甲型流感病毒（IAV），它是一种正粘病毒，具有八个负义单链RNA基因组片段，编码至少13种蛋白质2。根据对IAV膜糖蛋白血凝素（H1-18）和神经氨酸酶（N1-11）特异的抗体（Ab）的交叉反应性，将病毒分为不同的亚型。由于其遗传和系统发育发散，蝙蝠特异性H17N10和H18N11构成流感A属中一个特殊的群体，导致的术语“A型流感样病毒” 3，4。这些差异包括蝙蝠流感病毒包装序列（PS）与常规IAV 5的不相容性。
在鸡只禽类中，H5和H7亚型的HPAIV可以引起全身性疾病，死亡率高达100％，有时是唯一可识别的临床征兆。所有HPAIV的特征是HA蛋白6中的一个多元蛋白水解切割位点。1997年，出现了第一种HPAIV H5N1病毒，除家禽外，还感染了包括致命病例在内的人类7。随着时间的流逝，原始的H5N1病毒进一步多样化，并且通过将N1编码基因片段通过重新排列为N2，N3，N5，N6，N8或N9基因片段8替代了N1编码基因片段，从而出现了新的病毒。在2013年1月至2018年8月之间，几种HPAIV亚型在全球范围内造成了1.22亿只家禽损失，其中H5N1占有很大份额9。由于高致病性禽流感病毒目前在许多国家流行10，11，造成相当大的经济损失，人畜共患外溢事件的风险是杰出的12，13。
在大多数国家，控制禽类中AI的主要策略依赖于通过严格的生物安全措施进行的预防，如果发生暴发，则应实施限制区并减少受影响农场的人口11。与这些措施造成的经济损失9相比，有效的疫苗接种可以帮助防止疾病传播和进一步的人畜共患性外溢感染14。HPAIV流行的国家，例如中国，埃及或印度尼西亚，已经使用了灭活流感疫苗（IIV）或媒介疫苗，主要是在紧急情况下10。最近一个成功的例子是针对H7N9高致病性禽流感病毒的疫苗接种活动，其在中国出现在2017年15，16。中国使用重组H5 / H7二价二价禽流感疫苗进行大规模疫苗接种，导致人类外溢感染从2016/2017年度的1567例（615致命）下降到2017/2018年度的仅三例报告病例14。
然而，也有实验表明该流感活疫苗可以“相比，在IIV 1日龄雏鸡引起更高水平的先天反应，粘膜IgA抗体，和异源保护” 17。改良的活流感疫苗（MLIV）能够诱导广泛的体液（全身和粘膜）和细胞免疫应答。模仿自然感染和更广泛地刺激免疫系统是用于MLIVs有利17，18。禽类IIV抗体的应答主要基于全身性IgY（与哺乳动物IgG相对应的禽类），而MLIV还可诱导上呼吸道粘膜IgA分泌，从而提高其效率18。MLIVs的主要优点是口服应用，可以方便地大规模疫苗接种作为其他活疫苗，如鸡新城疫完成的可能性19，20。当前的MLIV基于致病性流感病毒，并且减毒例如通过使用截短的NS1蛋白21或由于冷适应22或将弹性蛋白酶特异性切割位点引入HA前体蛋白23而限制的复制能力来实现。尽管经过冷适应的MLIV已获许可用于人类多年，但尚未获得许可用于禽类的MLIV，市场上只有两种基于载体的活疫苗18。这些基于载体的疫苗比IIV可以诱导更广泛的保护，但是仍然很难在载体主链中表达超过HA蛋白的蛋白，因为众所周知，神经氨酸酶（NA），基质蛋白（M2）和核蛋白（NP）有益于更广泛，更有效的免疫力24。此外，对所用载体病毒的先前免疫限制了这些疫苗的效力17。当然，apathogenicity和鸡苗MLIVs的效果是一个问题17，25，主要是由于他们的不成熟的免疫系统26，27。但是，早期免疫增加了预防感染的机会。因此，鸡苗的疫苗接种是一个非常有趣的应用程序，它已经表明，MLIVs比IIVS为年轻个体的免疫更有效的17，28。
MLIV的主要缺点是可能会与野生型IAV发生重配。由于存在重新分类的风险，世界动物卫生组织（OIE）不建议使用流感活疫苗29。有不同的研究尝试来产生不重配的不兼容疫苗：构建了嵌合型B型流感病毒（IBV），它携带带有IBV包装序列（PS）的IAV的HA片段，因此不与IAV进行重配30。这些嵌合病毒有效保护小鼠免受致命的IAV感染30。在第二种方法中，将PS在HA和非结构蛋白（NS）基因片段之间切换。防止这些段的重新组合31。到目前为止，还没有在家禽或雪貂中测试过这些方法。默认情况下，鸡用于家禽的致病性和疫苗功效研究32。雪貂是哺乳动物的对应物，用于疫苗安全性评估33。
蝙蝠发起H17N10 34示出了蝙蝠流感PS与常规IAVs不相容5，和蝙蝠流感和AIV之间重配，因此事件是不可能的5，34。PS位于每个IAV基因组片段的5'和3'末端，并通过它们之间的相互作用负责正确包装RNA片段。Juozapaitis等。已经表明，H17N10骨干允许的嵌合病毒与编码具有H17N10特异性适于包装信号的IAV糖蛋白片段的结构5，34。带有免疫原性AIV糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的嵌合H17N10甲型流感病毒不会与其他“非蝙蝠” IAV重组。
基于此知识，我们创建了一个带有NA和HA（从多元碱基到一元碱基的修饰切割位点）的H17N10嵌合病毒，其H5N1 A / swan / Germany / R65 / 2006（R65 / 06）的35个基因组片段旁接H17N10 PS被称为R65 mono / H17N10 的6 + 2嵌合病毒。通过用R65 mono / H17N10 MLIV 对不同年龄和雪貂的鸡进行口鼻初免-加强免疫，并使用以下方法评估保护水平，来评估嵌合H17N10病毒是否能在禽类或哺乳动物物种中用作新型的无重组重排MLIV：同源HPAIV攻击感染。
为了评估R65 mono / H17N10 MLIV 是否能复制并能保护鸡免受同源病毒的致命攻击，对4周龄的鸡（亚成年组）和1天龄的鸡（未成年组）进行了感染，并使用标准临床评分。值得注意的是，用于这些研究的R65 mono / H17N10 MLIV在鸡蛋和日间雏鸡中传了几次，从而在HA中获得了另外三个突变（A201E，V273A和G339R），在M1中获得了一个突变（D156N），可能反映了对禽细胞的适应。但是，在初次免疫（PI）和加强免疫（BI）之后，在亚成人和青少年组中均未观察到临床体征。幼年组的一只动物在PI后2天死亡，原因不明（图。1a）。该特定动物的器官样品通过RT-qPCR检测流感病毒RNA阴性，因此我们认为该动物的死亡与免疫无关。
4周龄（亚成体组）和1日龄（少年组）鸡为一组，一个与R65免疫两次单 / H17N10 MLIV候选和b与同源HPAIV挑战。每组五个幼稚的接触控制（前哨）。从第d23天起，以三个天真的对照作为阴性对照，以验证攻击感染为阳性对照。
R65 mono / H17N10在亚成年和幼年鸡中没有引起任何临床体征或死亡率（一只无关的死亡），因此被认为对不同年龄的鸡具有致病性。为了分析免疫针对同源HPAIV H5N1攻击感染（CI）的保护作用，在CI后监测临床评分和存活率。尽管所有幼稚攻击对照鸡均在3天内死于CI，但所有接种疫苗的动物以及幼稚前哨动物都存活了下来，没有任何临床体征（图1b）。因此，R65 mono / H17N10可保护成年和未成年鸡免受由同源HPAIV H5N1引起的临床体征和死亡率。
在雪貂中使用R65 mono / H17N10进行的免疫未引起任何临床体征或体温升高（图2a）。攻击感染后，免疫雪貂没有表现出任何临床迹象，而一个鼬显示略微增加体温度在dpc5，第二天（图这降低2 B）。PI后，四分之二的免疫雪貂体重减轻，但是，天真的对照动物（天真直到d22，以后用作CI的阳性对照）在PI后体重也不断减轻（图2c）。攻击感染后，两只免疫动物的dpc6体重减轻最小（攻击前体重的-2.1和-1.4％，图2d）。相反，幼稚的阳性对照表现出更高的体重减轻（挑战前体重的-9.1％和-3.8％），并且响应于攻击感染而体温升高（图2b，d）。雌性阳性雪貂在dpc3处表现出后腿嗜睡和瘫痪，因此达到了人类终点标准。
初次加强免疫接种后（a，c）以及激发感染后（b，d）的直肠体温（灰色背景指示的正常范围，星号表示升高的值）和相对体重变化。
因此，雪貂的R65 mono / H17N10免疫接种不会导致任何临床体征或体温升高，而诱导了针对CI后的临床体征的完全保护作用。免疫和CI均未影响前哨动物的临床体征，体温或体重增加。
为了评估候选疫苗R65 mono / H17N10在鸡中的复制潜力，我们在PI和BI之后对口咽拭子进行了采样。PI（d1）后第一天的拭子样本显示，来自幼年鸡的9支拭子中有8支是病毒基因组阳性，此外，在10支来自成人鸡疫苗病毒RNA的拭子中，有3支被检出（图3a）。尽管来自成年亚鸡的口咽样本的病毒基因组得分未达到阳性，但接种疫苗的雏鸡的样本在d3的五个样本和d4的一个样本中显示了病毒RNA。在BI（d11）之后，所有样品均未检测出阳性。同样，没有直接接触的动物被测试为阳性（图3b），表明R65 mono的传播/ H17N10对幼稚的接触动物没有发生。总之，活疫苗的病毒RNA检测率在青少年中比在亚成人组中更高且更持久，并且仅限于在PI后的头几天。
我们在初次加强免疫接种后和攻毒感染后（c，d）检查了已接种鸡的口咽拭子样本（a）和相应的共居接触（b）。器官样本在dpc7（e，f）上取尸检。使用全流感PB1序列特异性RT-qPCR检查所有样品。
为了评估通过疫苗接种的动物对野生型挑战病毒的亚临床脱落，每天对口咽拭子进行分析。同源CI（dpc1）的第二天，亚成年组中9个少年中的4个以及一只动物的拭子样本Cq值非常弱（> 34.7）。然而，作为阳性对照的幼稚鸡表现出的病毒RNA载量比接种疫苗的个体略高（图3c）。在dpc2上，只有9个少年中有2个的Cq值非常弱（34.2和37.7），而其他所有（包括前哨）（图3d）得分均为阴性。那时，一只阳性对照动物还活着，相应的拭子样品测试呈强阳性（Cq 26.2；图3c）。dpc2上的橙色圆点）。CI后三天和四天，两组动物均显示弱阳性RNA负荷（> 33.3），直到从5 dpc开始所有样品均呈阴性（图3c）。CI后的病毒器官负荷可能表示正在进行但未被识别的感染。dpc7处死动物，并分别采集外耳组织，脑，心脏和肺样本。两组所有动物的脑，心脏和肺部样本均为阴性（图3e，f）。甲壳虫样本在两个成年鸡样本和一个少年组样本中显示出病毒RNA（图3e））。为了区分PCR阳性但非感染性样品和表现出感染性攻击病毒的样品，CI后收集的所有PCR阳性拭子和器官样品均使用SPF卵进行了培养尝试。仅从阳性对照组鸡的样本中恢复病毒是成功的，而接种疫苗的鸡的样本是非感染性的。总而言之，这些结果表明，在两个年龄段的接种鸡中均未发现HPAIV感染。
PI后，至少从第5天开始，来自免疫雪貂的鼻腔清洗样品RT-qPCR呈阳性（图4a）。另外，来自一个幼稚接触前哨雪貂的鼻液样品在d5时对病毒RNA评分为阳性（图4b）。BI后没有发现病毒分泌的迹象，已经表明存在保护性免疫（图4a）。作为CI的结果，两只对照动物直到dpc5都是阳性的，并且一只必须在dpc3处被杀死，而来自所有接种疫苗的动物的样品（图4c）得分为阴性。此外，所有接触动物的得分均为阴性（图4d）。CI后6天从尸检中检查了几个呼吸器官和神经元器官样本，发现免疫和前哨动物均未发现阳性组织（图4e，f）。相反，从被杀死的阳性对照动物中取样的大脑，外耳，肺和气管组织检测到HPAIV阳性（图4e）。此外，第二只阳性对照动物的肺组织样本在dpc6得分为Cq值为30.6（图4e）。总之，通过在雪貂中用候选疫苗R65 mono / H17N10 免疫，成功预防了CI后HPAIV的脱落，复制和全身感染。
在初免 -加强疫苗接种后（a，b）和激发感染后（c，d）采集鼻腔清洗样品。死后在dpc6上采集器官样品（e，f）（在dpc3上杀死的阳性对照动物）。使用全流感PB1序列特异性RT-qPCR检查所有样品。
在第0天（排卵日小鸡），第11天，第23天和第30天从每个实验组的鸟类收集血样，分离血清，并通过ELISA测定NP和HA抗体滴度（图5）。在PI后，亚成人组的NP特异性Ab水平（图5a）未达到血清阳性，而BI后12天，仅一只动物发生了血清转化。但是，平均信噪比水平却显着提高（p-值（0.0108），与亚成人组中BI后的初始值相比。CI后测试亚成年鸡达到了最高值。从少年组的个体中检测到的结果如下：在PI和BI后（d11和d23），所有小鸡都没有针对NP进行血清转换测试。CI后，只有一只幼小的动物被血清转化（d30）。在整个实验过程中，即使直接接触接种疫苗和攻击的动物，所有直接接触的前哨动物仍保持NP特异性抗体的血清阴性（图5b）。
在攻击后第0天，第11天，第23天和第7天（dpc7 = d30）从所有动物中采集血清样品，并使用针对核蛋白（NP）（a，b）或特异性的竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）进行评估血凝素H5结合抗体（c，d）。样品的测量的信噪比（S / N）％值降低表明存在特定的Ab。灰色条表示反应性响应，而较低的值表示血清阳性。星号表示组水平上不同时间点之间的统计差异，使用单向方差分析计算，然后进行事后Tukey检验。* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，****p ≤0.0001。误差线表示平均值的标准误差（SEM）。
如图5c所示，在亚成人组的PI后，H5特异性抗体的效价显着提高（p值0.0123）。BI后更明显（p值<0.0001）；但是，初免和加强H5抗体水平之间的增加并不明显。此外，在幼年动物组中，与PI后达到的水平相比，BI导致抗体效价显着提高（p值0.0005）。出于动物福利原因，未采集PI之前1天的幼稚血清。但是，从SPF卵中孵出的小鸡被认为是血清阴性的。尽管CI可以提高亚成年和幼年鸡的H5特异性抗体水平（图5c），值dpc7），与加强免疫后的抗体水平相比没有显着差异。
除了缺失的NP特异性体液免疫反应外，在任何时间点，所有前哨动物均未显示任何可检测到的H5特异性Ab（图5d）。
通过比较H5特异性和NP特异性抗体应答，很明显H5特异性反应比NP特异性Ab应答发生得更早，更明显。总之，R65 mono / H17N10诱导了中等水平的H5和非常低的NP特异性Ab水平。
如表1所示，大多数动物在两个免疫步骤后显示出阳性的血凝抑制（HI）滴度，只有两个少年组的动物在病毒中和（VN）测试中呈阳性。
但是，用HPAIV攻击后，除亚成人组中的两只外，几乎在所有动物中均观察到中和抗体。甚至在激发感染后7天，在VN和HI测定中，两组直接接触对照的阴性血清学也证实了诱导的免疫的高效率。的血清还针对一个最近HPAIV H5N8分离物（簇绒鸭德国2016）测试36由一个系统发生学上不同的H5分子和异源NA亚型，以及攻击感染之前可检测没有交叉反应性（补充表1）。另外，即使在攻击感染后收集的血清也仅表现出较小的反应：十分之一的反应（亚成年组）和九分之二的反应（幼年组）表现出较低的滴度反应（补充表1）。
最重要的是，接种疫苗的动物直接接触后7天，前哨反应呈血清阴性，这表明成功预防了感染后感染的任何传播事件。因此，通过初免-加强方法通过粘膜途径施用的R65 mono / H17N10可以诱导鸡的保护性免疫。
与用鸡肉进行的实验相反，对年龄较大（8.4个月至4.6岁）的雪貂进行了免疫分析，以分析疫苗原型在纯真但具有完全免疫能力的动物中的安全性和有效性。使用NP特异性ELISA试验，雪貂在第0天被证实对IAV抗体具有血清阴性作用（图6a，b）。PI（d10）十天后，所有接种的雪貂都显示出统计学上的显着（p值<0.0001）血清转化（图6a）。NP特异性抗体的水平在BI后12天（d22）和CI后6天（dpc6）也保持稳定。有趣的是，一个前哨雪貂在d22及以下时间点检测到血清反应阳性，而对于其他两个，S / N值明显下降（图6b）。）。BI后，接种雪貂的H5应答显着增强（p值0.0003），导致d22发生血清转化（图6c）。CI不会进一步影响接种动物的H5特异性抗体水平。尽管PI后10天所有前哨仍为血清阴性，但BI后12天（d22）一只动物被测试为阳性动物，CI后6天（dpc6）两只雪貂为阳性。与NP特异性应答相比，雪貂的H5特异性抗体应答表现出延迟的表型。这些结果表明，R65 单声道/ H17N10能够在雪貂第一次粘膜免疫后10天诱导明显的NP特异性免疫反应，而H5特异性反应仅在加强免疫后才延迟达到相当水平（图6c）。R65 mono / H17N10疫苗病毒从疫苗接种到前哨动物的传播通过以下事实证明：BI后8天，一个前哨对NP-和H5-Ab呈血清阳性（d22）（图6b，d）。
在攻击后第0天，第10天，第22天和第6天（dpc6 = d28）从所有动物中采集血清样品，并通过对核蛋白（NP）（a，b）或血凝素H5结合抗体（c，d）。样品的测量的信噪比（S / N）％值降低表明存在特定的Ab。灰色条表示反应性响应，而较低的值表示血清阳性。星号表示组水平上不同时间点之间的统计差异，使用单向方差分析计算，然后进行事后Tukey检验。* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。误差线表示平均值的标准误差（SEM）。
加强免疫后第十二天，几乎在所有免疫的雪貂中都可以检测到中和抗体，如表2所示。攻击感染后，效价仅略微增加，而对于某些动物，效价甚至降低。在攻击感染之前，四分之三的幼稚直接接触动物已经显示出较低的VN和HI滴度，表明接种过接触动物的早期传播事件。即使攻击感染后，第四只接触动物仍保持血清阴性。在针对异种簇绒鸭德国2016 HPAIV H5N8菌株的VN和HI测试中，所有血清均为阴性（补充表2）。
雪貂免疫实验的血清学结果表明，R65 mono / H17N10原型疫苗病毒诱导了中和抗体的明显免疫反应。随后的挑战性感染对VN和HI滴度的影响可忽略不计。尽管如此，R65 mono / H17N10疫苗病毒似乎已传播给幼稚的直接接触动物。
在这项研究中，我们成功地测试了一种新型的无重配MLIV（riMLIV）。在无创口鼻应用后，该疫苗原型在不同年龄类别的鸡以及雪貂中诱导出针对同源HPAIV感染的保护性免疫。我们的候选疫苗病毒由基于H17N10蝙蝠流感的遗传主链（PB2，PB1，PA，NP，NS，M）组成，其携带来自H5N1 AIV 的免疫原性糖蛋白HA（修饰为一元切割位点）35和NA（A /天鹅/德国/ R65 / 06），并在3'-和5'-段末端安装了蝙蝠适应PS。由于H17N10 PS的不相容性与常规IAVs 5，34与常规流感活疫苗方法的主要问题野生型病毒重配的风险可以忽略不计。因此，我们的新方法riMLIV是高效省略介绍H5（或H7）的基因组片段的风险成循环病毒30，37。
接种的鸡和直接接触的动物，与评估的年龄类别无关，在免疫或同源激发感染后均未显示出临床体征。无生命力的证明对活疫苗尤其是在幼小动物中具有重要意义25。就在最近，显示了H17N10骨架（此处带有H9N2糖蛋白）对禽类系统的适应性较差38。这巩固了我们不传播直接接触鸡的结果。通常，将减毒疫苗株的致病性恢复到致病表型是MLIV 39的重要困扰。R65 mono由脱落数据显示并经持续血清阴性的直接接触动物证实/ H17N10菌株已被指定为已在鸡中强烈减毒，因此进一步传播和恢复致病性的可能性极小。
总之，riMLIV符合AI疫苗的三个推荐特征，可获许可40：（a）安全；（b）有效且（c）易于管理。
除了将鸡作为测试疫苗原型的目标种群外，还进行了雪貂的实验接种。雪貂被认为是研究流感感染的致病性和传播性的最合适的动物模型33。因此，评估了riMLIV原型在这种合适的哺乳动物物种中的安全性和有效性。在短时间的初免-加强免疫方案后，雪貂还因缺乏临床体征或体温升高而引起R65 mono / H17N10的无源性。与鸡的结果相反，雪貂中的riMLIV被传播给直接接触的动物。进一步的安全机制，比如冷适应产生突变体41，42和/或引入物种特异性siRNA的靶向22，43，可以使用以改善原型作为用于哺乳动物物种的疫苗的适用性。
有趣的是，疫苗病毒基因组被记录在一个幼稚的直接接触哨兵的鼻腔冲洗液中，并且该特定动物在随后的时间点也发生了血清转化。此外，四分之三的前哨测试在攻击性感染之前中和抗体呈阳性。因此，显然有可能从雪貂上呼吸道复制和传播疫苗病毒原型。这些结果表明嵌合菌株R65 单/ H17N10可能是由于哺乳动物蝙蝠流感的主干，在哺乳动物中比在禽类动物中复制效率更高。但是，在攻击感染后，所有接种过的雪貂的鼻腔冲洗样品均未检测到阳性，在dpc6采集的任何器官样品也未检测到阳性。因此，将riMLIV初免-升压施用于雪貂还诱导了针对同源攻击感染的无菌免疫，即使单次施药后也有望获得良好的免疫，而交叉保护潜力似乎并不例外，如图所示。 H5N8通过体外交叉反应性研究。
使用商业化的ELISA系统分析血清样品，一种对（禽源）H5蛋白具有特异性的检测抗体以及一种针对NP保守表位的抗体检测方法在原则上是可行的。但是，通过将ELISA数据与VN和HI测试的结果进行比较，可以清楚地发现，在ELISA中低于阈值的一些血清在VN和/或HI测试中为阳性。这些差异可能是由于NP-ELISA对H17N10远距离相关NP蛋白的总体敏感性降低，或者嵌合病毒在鸡中的复制有限，导致诱导了比NP特异性抗体更高水平的HA-。
有趣的是，对鸡进行的基于ELISA的评估显示，鸡只对R65 mono / H17N10疫苗有中等程度的抗体反应。一个可能的解释是禽类系统中H17N10骨架的复制减少。尽管疫苗是在有胚的鸡蛋和日间雏鸡中传代数次，但该病毒对禽细胞的适应性仍然受到限制，口咽分泌物也很少。因此，血清反应似乎不太明显。相比之下，雪貂的血清学反应突出，在PI后，NP特异性水平较高，H5特异性抗体水平升高。结果解释是指哺乳动物适应的H17N10骨架，赋予雪貂组织中疫苗病毒复制能力。
关于以下事实：在攻击感染之前，有两只亚成年鸡和一只未成年鸡没有表现出中和抗体，并且两个亚成年只出现在H5-ELISA的可疑区域，而它们都在挑战感染中幸存下来，这引发了一个问题。哪种机制导致保护性免疫。众所周知，活流感疫苗可以在局部应用后通过诱导粘膜IgA以及CD4 +和CD8 + T细胞反应来诱导保护作用44。此外，已证明T细胞亚群和IgA，IgM和IgG位于鸡的鼻相关淋巴组织（NALT）内的粘膜表面45。。因此，保护的级别不能直接关联到体液抗体滴度17，46与经修饰的活病毒疫苗免疫后。这是相对于IIVS，其中保护是由体液应答仅介导17，47。此外，鸡苗不产生足够量的抗体，直到〜年龄7天26，27。知道这些限制，riMLIV原型对雏鸡的无菌保护尤其令人印象深刻。在这种情况下，有必要进一步研究非体液免疫。最后，我们以前不能排除抗病毒免疫反应有助于疫苗的保护作用，但是，这里的挑战性感染总是在第一次疫苗接种后几周和加强免疫后的几天。这种先天性免疫应答是宿主的短暂抗病毒对策，可能在以后的时间点不起作用。
此外，未来的研究将集中在使用riMILV的卵单次免疫中。这种策略特别适合在地方性情况下针对HPAIV进行疫苗接种，从而可以尽早诱导保护作用。一个进一步的优化方面是机会从疫苗接种的动物（DIVA）48血清学上区分感染。的ELISA系统，其中专门检测球棒流感病毒NP抗体，但不特异性抗体的普通AIV的发展，将覆盖该方面48，49，50，51。
总之，我们成功地在鸡和雪貂中成功测试了一种新型的基于蝙蝠流感的MLIV主链，该主链带有H5N1病毒的HA和NA，命名为R65 mono / H17N10。粘膜免疫后，这两个物种都得到了完全保护，并且没有将攻击病毒传播给未接触过的动物。该MLIV的最大优势在于，由于不兼容的PS，因此没有重新分配的风险。R65 mono / H17N10对雪貂甚至是成年雏鸡都具有致病性。未来的工作将针对卵内应用方案以及针对进一步相关的AIV亚型（包括高致病性H7病毒）来适应和评估这种方法。
支持嵌合疫苗病毒原型生成的PHW2000质粒如下：已建立的5 A /小黄肩蝙蝠/危地马拉/ 153/2009（H17N10）内部片段（GenBank登录号CY103877，CY103880，CY103874，CY103875（PA S550R），CY103873和CY103879（M1 D156N，M2 N31S; T70A））与pHW2000质粒组合，该质粒编码A /天鹅/德国/ R65 / 06（H5N1）HA，具有单碱基切割位点35和NA（GenBank登录号DQ464354 （HA A201E; V273A; G339R和RRKKK351T）和DQ464355）。为了使AIV HA和NA片段与基于H17N10的骨架兼容，将一元HA / R65片段的非编码区（NCR）替换为bat片段4序列的核苷酸1–131和1621–1782。为了生成NA拯救载体，R65 NA片段6的NCR被蝙蝠流感片段6序列的1–122和1254–1388核苷酸取代。另外，将HA和NA ORF的新插入的batflu包装序列的编码序列中的ATG密码子突变为ACG，以防止在这些位点开始翻译。
重组蝙蝠嵌合体疫苗原型病毒（命名为R65 mono / H17N10）由八个质粒反向遗传系统52产生。在6孔组织板中进行逆转录病毒的产生，其中10 6根据生产商的说明，使用表达单个片段的8个pHW2000质粒（每个300 ng）和Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad CA，美国），每孔HEK293T细胞（ATTC； CRL-3216）。8小时后，将DNA转染混合物替换为感染培养基（Dulbecco改良的Eagle培养基+ 1％青霉素/链霉素+ 0.2％牛血清白蛋白+ 1％谷氨酰胺）。30小时后，将TPCK-胰蛋白酶添加到感染培养基（0.2μL/ mL）中。48小时后，收集产生的病毒（上清液）。将拯救的重组病毒在MDCKII细胞上进行噬菌斑纯化，然后再次感染MDCKII细胞以繁殖病毒原种。在这里，HEK293T细胞和MDCKII细胞在补充有10％胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中保存，2。
然后，为了使禽细胞中足够的局部复制，将R65 mono / H17N10传代了几次。详细地讲，疫苗原型是通过在11日龄的胚卵中传代10次（持续96小时），然后从日龄雏鸡的外耳组织中再次分离而得到的，再通过11天龄的胚卵传代两次，在14天大的胚卵中一次（持续96小时），最后在18天大的胚卵中连续五次（持续48小时）。对于较老的胚卵（14和18日龄）中的传代，对均质的外耳组织取样并用于进一步传代。最后，使用胰蛋白酶补充剂在MDCKII细胞培养物中产生了疫苗病毒原种（兽医学中细胞系的收集CCLV-RIE-1061）。
为了挑战免疫动物，我们使用了致命的剂量的成熟同源德国野禽H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）指数分离株A /天鹅绒/德国/ R65 / 2006（H5N1）（“ R65”） 10 6 TCID 50 /动物鼻内27。
所有动物实验均在FLI的生物安全性3级围堵设施中进行，并根据德国动物福利法进行，该法已获得梅克伦堡-前波莫瑞州联邦动物实验伦理委员会的批准（注册和批准）编号LALLF MV / TSD / 7221.3-1-023 / 16）。
在实验中，1日龄和4周龄白来航鸡（鸡内金变种domesticus）使用。所有动物均由不含特定病原体（SPF）的卵（VALO BioMedia GmbH，Osterholz-Scharmbeck，德国）饲养。
从PEI和FLI内部育种计划中获得了年龄不同（8.4个月至4.6岁，平均年龄2.7岁）的健康和流行性感冒阴性的雪貂（鼬鼬）。
每天观察动物的临床症状，并根据OIE指南将其分类为健康（0），患病（1），重病（2）或死亡（3）53。轻度症状评分为0.5。当动物病得无法进食或饮水时，在下一个观察日将其杀死并计为死亡。
我们在初免-加强免疫中免疫了两组不同年龄的鸡（亚成年组（n = 10）-4周龄（d0），幼年组（n = 10）-日龄鸡（d0））。使用R65 mono / H17N10的方法。每只动物以100 µL体积经鼻内免疫接种，剂量为1×10 7.5 TCID 50。通过使用96孔板（Costar®96孔透明TC处理过的多孔板，康宁生命科学，德国威斯巴登，德国）中的MDCKII稀释一式两份，通过端点稀释计算每毫升50％的组织培养物感染剂量（TCID 50每毫升）值）。
在每组中，将五只相同年龄的幼稚直接接触动物（前哨）与接种的动物一起饲养。为了验证攻击病毒感染，每组同时对三只相同年龄的幼稚鸡进行了攻击。每天监测鸡的发病率和死亡率。使用致死剂量的每只动物10 6 TCID 50同源HPAIV 鼻内进行攻击感染。实验时间框架和采样方式如图7a所示。
用R65 mono / H17N10 免疫四只雪貂两次，并用同源HPAIV攻击。将四个接种过的雪貂中的每一个与一只幼稚的接触对照动物（前哨）共同饲养。在整个实验过程中，两个幼稚的雪貂作为环境对照，而在d22时，它们被攻击病毒感染，以验证攻击感染（CI）。每天监测雪貂的发病率和死亡率。实验时间框架和采样方案摘要如图7b所示。在麻醉的雪貂（吸入麻醉5％异氟烷）上进行采样程序，接种以及体重和直肠温度的测量。鼻内免疫接种剂量为1×10 7.5 TCID 50每只动物200 µL的体积。通过终点稀释使用接种在96孔板中的MDCKII一式两份地计算每mL 的50％组织培养物感染剂量（TCID 50每mL）值。类似于鸡实验进行挑战感染。
用于鸡（a）和雪貂（b）疫苗接种研究的时间范围和采样方式。由于动物的福利，在第0天没有从幼年组的鸡身上取血用于血清学评估。
用口咽拭子（Bakteriette，EM-TE Vertrieb，汉堡，德国）分析鸡中的病毒复制和脱落。将棉签悬浮在补充了恩诺沙星1 mg / mL，林可霉素1 mg / mL，庆大霉素0.05 mg / mL和两性霉素0.05 mg / mL的2 mL Dulbecco改良Eagle培养基中。为了检查病毒在器官组织中的扩散和负荷，检查了甲，肺，心脏和脑组织。因此，将器官样品（约8×8 mm）与1 mL Dulbecco改良的Eagle培养基（补充的青霉素/链霉素0.1 mg / mL（PenStrep®Gibco））一起加入2 mL收集管中，并加入一个不锈钢珠（∅5毫米）。随后，使用TissueLyser仪器（Qiagen，Hilden，德国）将器官样品均质化。
从雪貂收集鼻洗液，通过在每个鼻孔中加入1 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）来测量病毒复制。如对鸡所述，从大脑，小脑，外耳，肺（左和右），气管和球茎中提取器官样品。
使用VETkit（Macherey-Nagel，Düren，德国）与Biosprint 96平台（Qiagen）结合，从拭子，洗鼻液和器官样品中提取RNA。检测病毒RNA基因组，并通过实时逆转录聚合酶链反应（实时RT-qPCR）进行相对定量。使用一步式RT-qPCR试剂盒qScript™XLT一步式RT-qPCRToughMix®（Quantabio，美国贝弗利，美国）在CFX96热循环仪（Bio-Rad Laboratories，Hercules）上以12.5 µL体积进行所有RT-qPCR反应。 ， 美国）。扩增的靶序列是区段2序列36，其检测了嵌合疫苗病毒以及HPAIV攻击病毒的bat-IAV-主链。高于38的RT-qPCR Cq值被视为阴性。
通过对每个拭子样本接种三个SPF卵（10 µL /蛋），对鸡进行挑战感染后，从拭子样本进行病毒重新分离尝试。除了每天记录胚胎死亡外，完全按照所述方法测试收获的卵中尿囊液的病毒RNA。如果AF的Cq值低于初始接种物的Cq值，则假定为阳性再隔离。
从尺骨静脉穿刺（鸡）或大隐静脉穿刺（雪貂）在Monovette（德国萨尔施泰特，Nuembrecht，德国）或MultivetteR600®管（萨尔施泰特）中收集血清。血清在使用前储存在-80°C并在56°C灭活30分钟。为了有效地进行HI和VN测试，用PBS制备了包含血清稀释系列（2步对数）的母板，根据可用样品量，使用1：8或更高的稀释度。
使用竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）-试剂盒（ID-vet，Montpellier，France）根据制造商的说明使用ELISA阅读器Infinite M200PRO（Tecan （德国曼内多夫）。信噪比降低表明存在特定抗体。
通过使用1％鸡红细胞在微量滴定板中测定血凝活性。反应在室温（〜20°C）下在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行。如国际动物流行病学办公室（OIE）陆生动物诊断测试和疫苗手册53中所述进行血凝抑制试验，一式两份。HI-滴定度表示为最高血清稀释度的平均值，该血清最高稀释度导致完全抑制每个重复样本的4种HAU抗原的凝集。
病毒中和试验（VN）是在96孔板的50 µL细胞培养基中制备的三份连续稀释液进行的。将稀释的血清样品与等体积的含有HPAIV R65 / 06 10 3.3 TCID 50 /孔的培养基混合。在5％CO 2湿润的气氛中于37°C孵育1小时后，将每孔1.5×10 5的100μLMDCK细胞添加到每个孔中。将板在37℃在5％CO 2中温育3天。通过目测对细胞病变效应而不染色来评估病毒复制。通过与鸡/雪貂的阳性对照和阴性对照血清进行比较并通过滴定所用病毒稀释液来验证每种测定方法。
为了评估ELISA抗体效价在单因素方差分析中的统计学显着性，然后使用置信度为0.95的事后Tukey检验进行多组之间的比较（GraphPad软件版本7.04，美国加利福尼亚州圣地亚哥）被使用了。括号和星号表示显着（p = 0.01–0.05（*）），非常显着（p = 0.001–0.01（**））和极显着（p = 0.0001–0.001（***）和p <0.0001（**） **））统计差异。误差线表示平均值的标准误差（SEM）。
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