摘要
生殖细胞肿瘤（GCT）是年轻男性中最常见的实体恶性肿瘤。尽管可以达到较高的治愈率，但是转移，对基于顺铂的疗法的耐药性和晚期毒性仍然代表着致命的威胁，因此需要新的治疗选择。在这项研究中，我们分析了细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4 / 6）抑制剂palbociclib和ribociclib（PaRi）作为分子药物治疗顺铂耐药和敏感的儿科和成人GCT的潜力。
用PaRi处理十个GCT细胞系，包括顺铂抗性亚克隆和非恶性对照，并筛选了活力的变化（三苯基氯化四唑（XTT）测定），凋亡率（流式细胞仪，胱天蛋白酶测定），细胞周期（流式细胞仪），转录组（RNA测序，定量逆转录酶-聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质水平（western印迹）。在儿童和成人GCT组织（表达微阵列，qRT-PCR，免疫组织化学，“癌症基因组图谱”数据库）。
我们证明成人GCTs高表达CDK4，而儿科GCTs强烈表达CDK6。因此，两种GCT类型都可能被PaRi治疗。GCT对PaRi高度敏感，从而导致活力降低，细胞周期停滞和凋亡。尽管GCT主要停滞在G1 / G0期，但某些胚胎癌细胞系能够绕过G1 / S检查点并发展到G2 / M期。我们发现CDK3的上调和许多有丝分裂调节因子的下调，例如HAUS基因，可能分别负责绕过G1 / S检查点和终止有丝分裂。我们假定GCT细胞不能耐受细胞周期中的这些变化，并最终诱导细胞凋亡。
我们的研究突出了PaRi作为顺铂耐药和敏感性小儿及成人GCT的治疗选择。
睾丸II型生殖细胞肿瘤（GCT）细分为精原细胞瘤和非精原细胞瘤，是由原发性病变生殖细胞原位瘤形成（GCNIS）引起的，其本身是原始生殖细胞发育缺陷的结果。1，2，3，4 II型GCTS表示的年龄17-45岁的年轻男性中最常见的肿瘤，因此是青春期或后青春期类型。1，2，4特别是在西方国家，发病率正在稳步上升。5另外，GCTs可在新生儿和婴儿中发现，这些青春期前肿瘤被称为I型GCT，主要表现为畸胎瘤或卵黄囊肿瘤。1个，2，4相反II型GCTS，I型GCTS而从一个有缺陷或错误路由的早期原始生殖细胞发展，而不是从一个GCNIS前驱病变。
通常，II型GCT通过睾丸切除术然后化学疗法或放射疗法进行治疗。尽管在所有阶段中治愈率均超过90％，但尽管有足够的多模式一线和首创治疗方法，但仍有约10-15％的晚期疾病患者复发，被认为是难治性的。6，7，8这样的病人通常不能治愈的和面对一个可怕的预后的只有几个月预期寿命。6，7，8
细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）已被定义为几种癌症实体中细胞周期进程的关键驱动因素。细胞周期的停滞导致抑制的肿瘤生长以及转移。因此，通过选择性药理抑制作用靶向细胞周期是一种有前途的治疗选择。先前的研究证明CDK4 / 6途径在实体瘤（例如脂肪肉瘤，横纹肌肉瘤，非小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，食道癌，黑色素瘤和乳腺癌）中具有活性。9在数个1、2或3期研究中，正在评估最杰出的CDK4 / 6抑制剂palbociclib（Ibrance），ribociclib（Kisqali）和abemaciclib（Verzenio）在单一疗法和联合疗法中的作用。Palbociclib和ribociclib（PaRi）是可逆的口服活性吡啶并嘧啶，与两个CyclinD（CCND）依赖性激酶的三磷酸腺苷结合位点结合。10项试验观察到palbociclib和ribociclib之间的临床结果几乎没有区别。112017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准PaRi与芳香酶抑制剂和abemaciclib加氟维司群联合使用，作为激素受体阳性，人表皮生长因子受体2阴性，晚期或转移性乳腺癌女性的初始内分泌治疗药物。这些抑制剂最终会阻断CCND–CDK4 / 6复合物，导致视网膜母细胞瘤（RB）蛋白的磷酸化过低。12结果，转录因子E2F无法从RB复合物上切下，参与细胞周期进程的基因转录减少，导致细胞周期停滞在G1 / G0期。10，13在GCT中，已经描述了CDK4 / 6-RB1途径内缺陷的“非常规”谱，即在所有半实体和非精原GCT中，信使RNA（mRNA）水平上的RB1表达，但可检测到的RB1表达仅在畸胎瘤中的蛋白质水平，RBNIS的频繁缺失和GCNIS，精原细胞瘤和胚胎癌（EC）中P16INK4A的低表达以及CyclinD2（CCND2）的过表达，以及CDNIS在CDNIS和侵袭性GCT中的表达。14，15，16，17，18，19
在这项研究中，我们调查了CDK4 / 6抑制在顺铂耐药和敏感的儿科和成人GCT中的治疗潜力。
在这项研究中，使用了以下GCT细胞系：TCam-2（浆液瘤），2102EP，NCCIT，NT2 / D1（所有EC），JAR，JEG3和BeWo（所有绒毛膜癌）。在顺铂耐药的GCT亚细胞系2102EP-R，NCCIT-R和NT2 / D1-R中，随着亚致死顺铂浓度的增加，这些EC细胞系经过长时间培养会引起顺铂耐药。20，21的所有GCT细胞系，MPAF成纤维细胞和FS1 Sertoli细胞如前所述进行培养。22，23在Dulbecco改良的Eagle培养基（10％胎牛血清（FCS），1％青霉素/链霉素）和THP-1细胞在RPMI培养基（10％FCS，1％青霉素/链霉素）中培养HaCat，HEK293和VHF成纤维细胞系，200 mM L-谷氨酰胺）在37°C和5％CO 2下。定期检查所有细胞系的短串联重复序列，可应要求提供。为了抑制CDK4 / 6，将PaRi分别溶于蒸馏水（pH 3）或二甲基亚砜中。
如前所述进行三苯基氯化四唑（XTT）测定。23总之，在施用PaRi或溶剂之前24小时，将4000个细胞接种到96孔板上。在总共96小时内，每天通过添加50μlXTT（1 mg / ml）加0.5μl吩嗪硫酸甲酯（1.25 mM）（均来自德国陶克基兴的Sigma-Aldrich）并在4 h后测量吸光度来筛选生存力紫外可见光谱仪（450 vs. 650 nm，BMG Labtech，德国奥滕贝格）。每个时间点/浓度一式四份进行测量。LD 50 使用GraphPad Prism软件版本6计算（致命剂量，50％）剂量。通过Caspase-Glo-3 / 7分析和CellTiter-Glo发光细胞活力测量，将相对Caspase-3 / 7活性调整为相对细胞活力。分析（分别是美国威斯康星州麦迪逊市的Promega，Promega两家公司），并按照制造商的规程进行。
流式细胞术分析细胞凋亡率和细胞周期分布，分别通过Annexin V /碘化丙锭（PI）或PI染色进行。简而言之，对于PI流式细胞术，将细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，用Nicoletti缓冲液（溶于PBS的0.1％Triton-X100，0.1％柠檬酸钠脱水）固定，并用50μg/ ml PI染色（Sigma-Aldrich）在室温（RT）下放置10分钟。为了测量细胞凋亡，将细胞用膜联蛋白V结合缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM氯化钠，5 mM氯化钾，5 mM氯化镁，1.6 mM氯化钙溶解在H 2中）洗涤一次。O），然后与5μlAnnexin V（ImmunoTools，Friesoythe，德国）和50μg/ ml PI（Sigma-Aldrich）孵育。对于磷酸化H3（pH3）抗体染色，在室温下与pH3抗体孵育1小时之前，先用0.5％Triton X-100透化细胞。随后在流式细胞仪测量之前添加二抗和50μg/ ml PI。有关抗体的详细信息，请参见表 1。所有流式细胞仪分析均使用MACSQuant分析仪（Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫）进行。每个样品/实验总共测量了50,000个细胞。
根据手册，使用RNAeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）分离RNA（包括DNase I酶切）。
用含有10％蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich）的RIPA缓冲液提取蛋白质。通过BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Dreieich，德国）评估蛋白质浓度。
将二十微克全蛋白裂解物用于蛋白质印迹。用丽春红S溶液染色（Sigma-Aldrich）; 0.5％的5％乙酸溶液）确认正确的膜转移。将膜在PBS + 1％Tween-20（PBST）中的5％脱脂牛奶或5％牛血清白蛋白（BSA）中封闭1小时，然后与一抗在4°C下孵育过夜。辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二级抗体在室温下孵育1小时。使用ChemiDoc成像系统（德国杜塞尔多夫的Bio-Rad）进行成像。有关抗体的详细信息，请参见表 1。
将细胞接种到96孔板中，并用4％甲醛固定（10分钟），然后用0.2％Triton X-100的PBS透化（5分钟），随后封闭1％BSA，5％山羊血清，0.3 M甘氨酸PBS中的0.1％Tween-20（1小时）。Ki-67抗体在4°C孵育过夜，然后添加第二抗体（1 h），并用0.5μg4'，6-diamidino-2-phenylindole（5分钟）复染。有关抗体的详细信息，请参见表 1。
免疫组织化学反应是在4-μm福尔马林固定和石蜡包埋的组织切片上进行的，如先前所发表的。24在乙二胺四乙酸缓冲液（pH 9； 20分钟）中于98°C进行抗原回收。一抗在室温下孵育30分钟。之后，将切片与HRP标记的二抗在室温下孵育25分钟。应用底物“ DAB +色原”系统可视化目标抗原（Dako，德国汉堡）。有关抗体的详细信息，请参见表 1。
使用1 µl dNTP-Mix（10 mM），1 µl Oligo（dT）18引物（0.5 µg / µl），4 µl RT Buffer（5×），1 µl将1 µg RNA体外转录为互补DNA（cDNA）。在S1000循环仪（Bio-Rad）上，在50°C的条件下，将µl Maxima H负逆转录酶（200 U / µl）和0.5 µl RiboLock RNase抑制剂（40 U / µl）（全部为Thermo Fisher Scientific）放置30分钟。此外，在384孔C1000循环仪（均为Bio-Rad）上进行定量逆转录酶-聚合酶链反应（qRT-PCR）。一般而言，所有样品均按技术三次重复进行分析，每个重复使用7.34 ng cDNA和基于SYBR-green的Luna Universal qPCR Master Mix（新英格兰生物实验室，法兰克福，德国）。在每次运行结束时，进行熔解曲线分析。寡核苷酸序列在表2中给出 。
先前进行了GCT组织的Affymetrix表达阵列分析（GCNIS，n = 3；精原细胞瘤，n = 4； ECs，n = 3；畸胎瘤，n = 3；正常睾丸组织（NTT），n = 4），然后重新在本研究的背景下进行了分析。25个亲本GCT细胞系的Illumina微阵列表达数据（TCam-2，n = 5; 2102EP，n = 5，NCCIT，n = 4; JAR，n = 2; FS1，n = 4; MPAF，n = 4）摘自可通过基因表达综合（GEO，ncbi.nlm.nih.gov/geo/）（GSE71239，GSE71269，GSE79065，GSE60698）获得的先前研究。23，26，27，28，29是在先前的研究中产生的的Illumina 450K DNA甲基化阵列和在该研究中（GSE76709）的上下文中重新分析。30
对用于转录组分析的RNA样品进行定量（Qubit RNA HS分析，Thermo Fisher Scientific），并使用Fragment Analyzer和“ Total RNA Standard Sensitivity Assay”（美国圣克拉拉，Agilent Technologies Inc.）通过毛细管电泳测量质量。文库的制备根据制造商的方案（VAHTS链式mRNA-Seq文库制备试剂盒）进行。300纳克的总RNA用于mRNA捕获，片段化，cDNA合成，衔接子连接和文库扩增。将珠纯化的文库标准化，最后在HiSeq 3000/4000系统（Illumina Inc.，圣地亚哥，美国）上进行测序，读取设置为1×150个碱基对（bp）。bcl2fastq工具也用于将bcl文件转换为fastq文件，以进行适配器修整和解复用。使用CLC Genomics Workbench（版本12.0.2，Qiagen）对fastq文件进行数据分析。所有探针的读数均为衔接子（Illumina TruSeq），并进行了质量修整（使用默认参数：从读数末尾修整Q13以下的碱基，最多2个核苷酸）。映射是针对智人（hg38）（2017年5月25日）基因组序列。使用“两组差异表达”工具（1.02版）确定统计差异表达测试。通过错误发现率和Bonferroni校正对得到的p值进行多次测试校正。一个p的≤0.05值被认为是显著。
使用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）生成Venn图。31 STRING算法用于根据RNA序列数据（https://string-db.org）预测交互式网络。DAVID执行了32个功能注释分析（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）。33，34在中GCT细胞，只有类别（UP_Keywords）用至少五个成员和常用失调的基因功能注释分析p值≤0.05被认为显著。为了对每个GCT细胞系中失控的基因进行功能注释分析，仅类别（UP_Keywords）具有至少十个成员，且p值≤0.05被认为是显着的。仅包括与官方人类基因符号有关的基因。使用UCSC Xena浏览器（https://xena.ucsc.edu）和cBioPortal（https：/）分析了'癌症基因组图谱（TCGA）数据集的同工型/基因表达，DNA甲基化和拷贝数变化（CNA）/www.cbioportal.org）。35，36，37
在这项研究中，我们分析了CDK4和CDK6抑制剂palbociclib（PF-00080665，Pfizer Ltd.）和ribociclib（GST0000015996，Novartis Pharma AG）作为顺铂耐药和敏感性GCT治疗选择的潜力。首先，通过重新评估GCT组织和细胞系的微阵列数据，以及通过对GCT细胞系的蛋白质印迹分析，我们分别筛选了RNA和蛋白质水平上CDK4 / CDK4和CDK6 / CDK6的表达（图 1a）。 ，b）。CDK4 / CDK4在GCT组织（GCNIS，精原细胞瘤，EC，畸胎瘤）和细胞系（TCam-2，精原细胞瘤； 2102EP，NCCIT，两者均为EC； JAR，绒癌）中高表达（图 1a，b）。此外，CDK4在NTT，Sertoli细胞（FS1）和成纤维细胞（MPAF）中可检测到表达（图 1a）。相反，在所分析的所有组织和细胞系中，CDK6 / CDK6表达不存在或非常弱（图 1a，b）。有趣的是，在I型小儿GCT中，CDK6的表达高于CDK4（图 1a，上图中的嵌体）。我们还通过福尔马林固定石蜡包埋的GCT组织的免疫组织化学证实了CDK4在蛋白质水平上的表达，并发现精原细胞瘤（n = 8），EC（n = 7），卵黄囊肿瘤（n = 4）和畸胎瘤（n = 3）（图。 1c）。我们使用UCSC Xena浏览器，筛选了睾丸GCT组织的TCGA数据集，以了解CDK4 / 6及其在GCT组织中不同亚型的表达。36亚型CDK4-201（ENST00000257904.11）和CDK6-201（ENST00000265734.8）似乎是GCT（紫色）和正常睾丸组织（绿色）中主要表达的亚型（补充图 S1A，B）。我们将156个样本的TCGA数据集分层为一个精原细胞表达特征（SOX17，PRAME，PRDM1阳性；SOX2，DNMT3B和GAL阴性）和EC表达特征（SOX2，DNMT3B，GAL阳性；SOX17，PRAME，PRDM1否）（补充图 S1C）。此外，我们包括了AFP和β-hCG（CGB），表明AFP阳性与EC信号有关（表明卵黄囊肿瘤成分），而β-hCG阳性在两种表达信号中均存在（表明绒毛膜癌成分） EC签名和绒毛瘤签名中的绒毛膜癌/滋养层成分（补充图 S1C）。CDK4在精原细胞瘤和EC签名中均强烈表达，而CDK6表达则不如CDK4强烈。有趣的是，与CDK4相比，CDK6阳性显然与非精原细胞特征相关（补充图 S1C）。
对GCT组织（II型GCT，上图，Affymetrix微阵列; I型GCT，上嵌体，qRT-PCR）和细胞系（中图：Illumina微阵列;下图：RNA-seq）中CDK4 / 6表达的分析数据，RPKM =读取的每千百万个基数）。作为对照，包括正常睾丸组织（NTT），Sertoli细胞系FS1和成纤维细胞（MPAF）。标准偏差在条上方。b GCT细胞系和对照（成纤维细胞，支持细胞）中CDK4，CDK6，RB1和磷酸RB1（pRB1）蛋白水平的蛋白质印迹分析。HepG2和HeLa细胞充当CDK4和CDK6的阳性对照。GAPDH被用作管家并进行标准化。CGCT组织（浆液瘤，EC，卵黄囊瘤和畸胎瘤）中CDK4的免疫组织化学染色。比例尺：500μm。
我们询问了DNA甲基化是否会影响GCT中CDK4 / 6的表达（补充图 S2A）。在来自TCGA队列的CDK4阳性和阴性GCT组织中，我们主要在转录起始位点（TSS）和CDK4的基因体周围发现了低甲基化的CpG二核苷酸（补充图 S2A）。在CDK6阳性和阴性GCT组织中，TSS显示为低甲基化，而我们发现了一个区域，范围从基因体的中部到基因的3'末端，其中高DNA甲基化水平与CDK6高表达相关（并且反之亦然）（补充图 S2A， 黑盒子）。到目前为止，这一发现的结果仍然难以捉摸。这些甲基化动力学/特征也可以在GCT细胞系中找到（补充图 S2B）。总而言之，尽管CDK4基因位点看起来是低甲基化的，而CDK6基因体看起来是高甲基化的，但CDK4 / 6表达与DNA甲基化之间没有明显的相关性。至多，人们可能会推测，高CDK6基因体甲基化可能会限制CDK6的表达，并且可能与CDK4表达相比，可能导致GCT中CDK6的表达低。
在GCT细胞系中，我们还筛选了CDK4靶标RB1和磷酸化RB1（pRB1）的表达（图 1b）。在蛋白质水平上，在GCT细胞系中可高度检测到RB1和pRB1，而对照细胞仅显示中等RB1和弱pRB1水平（图 1b）。
我们筛选GCT组织在精原细胞瘤和非精原细胞瘤（TCGA泛癌症图谱，流水遗产常见的CNA（扩增和缺失）的三项研究35，36）（补充数据 S1A）。我们在精原细胞瘤和非精原细胞瘤组织中发现了11种常见的CNA，仅在精原细胞瘤中发现19种，仅在非精原细胞瘤中发现了24种（补充数据 S1A）。其中，我们发现了与细胞周期和CDK4 / 6相关的基因CCND2（精原细胞瘤9.8％，非精原细胞瘤16.8％），CDKN1B（P27；精原细胞瘤15.3％，非精原细胞瘤16.4％）和MDM2（精原细胞瘤4％，非精原细胞瘤3.6％）通常在精原细胞瘤和非精原细胞瘤中扩增（补充数据 S1A）。有趣的是，CDK6在2.6％的精原细胞瘤中被扩增，而CCND3（CyclinD3 ; 1.7％）和CHEK1（6.8％）在非半精原细胞瘤中被扩增或缺失（补充数据 S1A）。因此，在这些细胞周期和CDK4 / 6相关基因中具有突变的GCT患者与未突变患者相比，对CDK4 / 6抑制的反应可能不同。
接下来，我们通过XTT分析分析了PaRi对GCT细胞系活力的影响。分析的所有GCT细胞系在单次施用PaRi后24-96 h均显示出活力的大幅降低（图 2和补充图S3）。详细地说，GCT细胞系呈现为给palbociclib更敏感（LD 50范围：2.76-24.85μM）比ribociclib（LD 50范围：14.58-43.65μM），以及不同的GCT实体之间，绒毛膜癌细胞系呈现为最不敏感到PaRi（palbociclib的平均LD 50：19.67μM; ribociclib的平均LD 50：40.02μM ）（图 2）。有趣的是，与它们的亲代细胞和所有其他测试细胞相比，顺铂耐药的EC亚克隆（-R）对PaRi的敏感性最高（图 2）。作为对照，包括成纤维细胞（VHF2，MPAF），支持细胞（FS1），单核细胞（THP-1），角质形成细胞（HaCat）和肾细胞（HEK293）。平均而言，对照细胞（palbociclib平均LD 50：22.62μM; ribociclib平均LD 50：44.96μM ）对PaRi的敏感性低于GCT细胞（palbociclib平均LD 50：12.39μM; ribociclib平均LD 50：34.05μM ）（图 2）。
基于GraphPad Prism的基于XTT数据的PaRi处理的GCT细胞系中LD 50剂量的计算（补充图 S3）。作为对照，包括成纤维细胞（VHF2，MPAF），支持细胞系FS1，单核细胞系THP-1，角化细胞系HaCat和肾细胞系HEK293。另外，包括乳腺癌细胞系MCF7。
我们问，与基于顺铂的单一疗法相比，PaRi和顺铂的联合应用是否可以提高治疗效果。因此，我们单独或与5μMpalbociclib或15μMribociclib联合使用顺铂（5μM/ 2.5μM）处理顺铂耐药和敏感的GCT细胞系2102EP（-R）和NT2 / D1（-R）。 3）。与顺铂或PaRi单药治疗相比，联合治疗降低的生存力更为明显。
单独或联合用palbociclib（5μM），ribociclib（15μM）或cisplatin（5 / 2.5μM）处理一次的顺铂耐药且敏感的GCT细胞系2102EP（-R）和NT27D1（-R）的XTT数据。在96小时内测量了生存力的变化（与溶剂处理的对照相比）。
我们还通过流式细胞术测量了PaRi对细胞周期和凋亡率的影响（图 4a，b）。作为CDK4 / 6抑制剂，PaRi应该通过阻断细胞周期从G1 / S期的转变来诱导半衰老状态。有趣的是，在PaRi（10μM/25μM）处理后16小时，大多数GCT细胞系（TCam-2，NCCIT（-R），JAR，JEG3，BeWo）聚集在细胞周期的G1 / G0期，但是有两个EC细胞系包括它们在G2 / M期积累的顺铂抗性亚克隆（2102EP（-R），NT2 / D1（-R））（图 4a）。palbo-和ribociclib对细胞周期的影响高度相似。在对照细胞中，细胞周期的相位分布受到的影响要弱得多（图 4a））。Ki-67免疫荧光染色证实了PaRi处理TCam-2、2012EP和JAR细胞后增殖率降低（图 S4）。为了测试，如果G2 / M期停滞的细胞系在G2期结束时被阻断或在PaRi处理下进入有丝分裂，我们将磷酸化的组蛋白H3阳性（pH3）细胞作为M期细胞的标志物（图 4b））。仅NT2 / D1细胞显示pH3阳性细胞增加，而所有其他GCT细胞系显示pH3阳性细胞减少。
a，b在PaRi处理（10μM/ 25μM）后16小时，对GCT细胞系和对照（成纤维细胞和支持细胞）中细胞周期相位分布（a）和凋亡率（b）进行基于流式细胞术的分析。c在溶剂和PaRi处理的GCT细胞中，通过流式细胞仪对磷酸化组蛋白H3阳性（pH3 +）细胞进行计数。差异以百分比给出。d用PaRi（10μM/ 25μM）处理16 h的GCT细胞系和MPAF成纤维细胞中PARP（总和裂解）蛋白水平的蛋白质印迹分析。只有长时间接触MPAF才能检测到整个PARP。β-肌动蛋白被用作管家并标准化。Ë 与溶剂处理的对照相比，PaRi处理后GCT细胞系中Caspase-3 / 7活性的变化（倍数变化）。
除了NCCIT（-R），PaRi大大诱导了GCT细胞系的凋亡（图 4c）。在对照细胞中，几乎没有观察到凋亡诱导（图 4c）。我们通过蛋白质印迹检测裂解的PARP证实了PaRi处理后GCT细胞系中的凋亡诱导（图 4d）。在MPAF成纤维细胞中，即使长时间暴露在膜下也无法检测到PARP裂解（图 4d）。另外，在施用PaRi之后，我们发现GCT细胞系中Caspase-3 / 7的活性增加（图 4e）。活性水平类似于膜联蛋白V / PI分析中发现的凋亡诱导水平（图 4c对 e）。
GCT细胞在细胞周期的G1 / G0或G2 / M期积累，并诱导凋亡，这是PaRi不同于标准CDK4-RB1轴的另一种作用方式，促使我们破译了分子方式PaRi在GCT细胞中的作用的详细信息。我们对用10μMpalbociclib处理16小时的GCT细胞（TCam-2、2102EP，NCCIT，JAR，JEG3和成纤维细胞（MPAF））进行了RNA测序（RNA-seq）分析，以测量整个转录组基因表达的变化。通过安捷伦片段分析仪验证了所有测序RNA的高质量（RNA质量数= 10）（补充图 S5A））。主成分分析表明，palbociclib导致绒毛膜癌细胞JEG3和JAR以及EC细胞2102EP和NCCIT的转录组差异最大，其次是TCam-2，而MPAF成纤维细胞的作用最弱（补充图 S5B）。 。
我们确定了与溶剂处理的细胞相比，palbociclib处理后，GCT细胞系中所有转录物均失控（p值≤0.05，倍数变化≥1.5 ）（补充数据 S1B）。其中，在所有测试的GCT细胞系中39个转录物被失调（图 5a，维恩图；补充数据 S1C）。31我们排除了所有无法与正式基因符号匹配且在GCT细胞系之间差异表达的转录本，最终得到23个通常被失调的基因，其中15个被上调而8个被下调（图 5a）。这些基因中的十个在MPAF成纤维细胞中也被解除调控（图 5a），红色标记的基因，倍数变化≥1.5）。我们使用STRING算法来识别推定的相互作用（图 5b）。32基本上，预测了三个交互网络：（1）由VLDLR，FOS，VEGFA和DDIT4组成；（2）由SLC7A11和SLC1A4组成；（3）由POLE2，KIF20A，AURKB，UHRF1和CDCA3组成。有趣的是，MPAF成纤维细胞中也被解除调控的基因（红色下划线）主要在网络中发现（3）。根据DAVID基因本体论（GO）分析，GCT细胞中通常被失调的基因可能与细胞生长过程（网络中的基因（3））相关（按频率排序），例如有丝分裂，细胞周期和增殖（浅蓝色） ），蛋白质调节过程（浅绿色），转录调节（红色），药物反应（黑色），发育过程（黄色），细胞表面（粉红色）和疾病（灰色）（图 5c和补充数据 S1D）。33，34因此，网络的下调（3）基因（SPC25，KIF20A，AURKB，UHRF1和CDCA3是GCT细胞系和成纤维细胞中常见的palbociclib反应，影响细胞周期。我们通过qRT-PCR分析证实了palbociclib处理的GCT细胞系和成纤维细胞中的FOS，DDIT4，VEGFA，UHFR1和AURKB的 RNA-seq数据（图 5d）。另外，我们通过蛋白质印迹证实了palbociclib治疗的，顺铂耐药和敏感的GCT细胞中AURKB的下调（图 5e）。重要的是，我们证明了在核糖体治疗GCT细胞和MPAF后，这些基因/蛋白以类似的方式被解除调节，进一步证明了CDK4 / 6抑制的共同作用（图2）。 5d，e）。
一个识别RNA-seq的在GCT细胞系16小时后10μMpalbociclib治疗通常失调的转录物。在MPAF对照细胞中，使用palbociclib（红色标记的基因）后，23个转录物中的10个也被失调（≥1.5倍变化）。b基于STRING的通常被解除调控的基因的相互作用预测。成纤维细胞中也被解除调控的基因被标记为红色。c基于DAVID的常用失调基因的GO分析。d通过qRT-PCR在经PaRi（10μM/ 25μM）处理16 h的GCT细胞系和MPAF成纤维细胞中验证RNA-seq数据。GAPDH被用作管家。数据以倍数变化给出（PaRi处理与溶剂对照）。标准偏差在条上方。Ë通过蛋白质印迹验证AURKB在蛋白质水平上的下调。GCT细胞用PaRi（10μM/ 25μM）处理16小时。β-ACTIN被用作管家。右侧给出了蛋白质印迹数据的光密度评估。
接下来，我们通过DAVID GO分析法分析了Palbociclib对每个GCT实体（血癌，EC，绒毛膜癌）和MPAF成纤维细胞的个体作用（补充图 S6和S7A）。同样，很明显，大多数与细胞周期相关的基因被解除了调控（补充图 S6和S7A; 标记为浅蓝色），这与由palbociclib介导的CDK4 / 6抑制（伪衰老细胞状态； G1 / S期阻滞）引起的预期分子效应相符。为了更详细地缩小细胞类型/肿瘤实体特异的作用，我们对与GO术语“细胞周期”有关的所有基因进行了STRING分析，最后得到了网络，推测是代表每个调控实体的关键因素/影响响应CDK4 / 6抑制的细胞周期（补充图 S6，补充数据 S1E）。
独立于设定的阈值，我们还筛选了细胞周期相关因子（如细胞周期蛋白，CDK，CDK抑制剂和必要的辅助因子）的表达（补充数据 S1F）。在这里，我们观察到CCND1 / 2/3，CDK6 / 7和E2F5上调的共同趋势，而CCNA2，CCNB1 / 2，CDK1，CDKN2D / 3，CDC2 / 3/4/7/20 / 25A / 25B / 25C和E2F1 / 2被下调（补充图 S7B）。大多数情况下，在MPAF成纤维细胞中观察到了相同的放松趋势（CCND2 / D3和CDK6除外））（补充图 S7B）。因此，PaRi在GCT和成纤维细胞的经典细胞周期调节剂中诱导出非常相似的失调。我们通过蛋白质印迹证实了PaRi处理的，顺铂耐药和敏感的GCT细胞系中CCNA2和CCNB1的下调（补充图 S7C）。与RNA水平的上调相反，在核糖体治疗的GCT细胞系中，CCND1 / D2的蛋白水平没有改变（补充图 S7C）。
值得注意的是，PaRi治疗导致大多数GCT细胞系中CDK4蛋白水平升高，但MPAF成纤维细胞却未升高，这表明GCT细胞系中公认的PaRi抵消机制（补充图 S7D）。
从细胞周期分析，我们观察到2102EP（-R）和NT2 / D1（-R）积累在细胞周期的G2 / M期而不是G1 / G0期（图 4a）。为了确定可能决定这一决定的因素，我们分析了与GO术语“细胞周期”相关的所有基因，并通过STRING算法在2102EP细胞中专门表达了这些基因（补充图 S8A，补充数据 S1G）。在这一组中，我们发现了参与细胞周期G2 / M过渡的基因（补充图 S8A）。两个基因（NAE1，HMGA2）与所有提到的GO类别相关，六个基因（CDC25C，CDC7，CNTRL，HAUS1，HAUS2，HAUS6）与五个检测到的类别中的四个相关，两个基因（CDK3，CHEK1）与五个类别中的三个相关，并且五个基因（TERF1，BORA，PPM1D，MASTL，PLK3）与两个相关五类（补充图 S8A）。在这15个基因中，有13个在表达中被下调，两个在CDK3和PLK3中上调（补充图 S8B）。有趣的是，CDK3能够以独立于RB1的方式促进G1 / S检查点转换。38
综上所述，一些EC细胞能够绕过PaRi诱导的G1 / S停滞并到达细胞周期的G2 / M期，但是过多的G2 / M期调节基因的下调会阻止细胞周期的完成，并且导致细胞凋亡。
在这项研究中，我们证明了CDK4 / 6抑制剂palbociclib和ribociclib在治疗顺铂耐药和敏感性GCT中的效用。GCT对PaRi的敏感性要高于分析后的对照细胞（包括MCF7乳腺癌细胞），从而为GCT患者打开了公认的治疗窗口。尽管必须提到的是，通过将GCT细胞系与一种乳腺癌细胞系进行比较而获得的这项研究结果不足以得出关于PaRi治疗的GCT与乳腺癌之间差异的可靠结论。将来，需要比较每个实体的大型肿瘤队列。
在不同的GCT实体中，绒毛膜癌细胞的敏感性最低，而EC细胞的敏感性最高。有趣的是，Schmidt等。18显示，在精原细胞瘤和非精原细胞瘤中，ECs表现出最高水平的CDK4表达，因此在ECs中，对CDK4 / 6抑制的敏感性与CDK4表达的高水平相关。18岁另外，在我们的研究中，与亲代细胞相比，顺铂耐药的EC亚克隆显示出更高的敏感性。这表明引起顺铂抗性的机制可能进而引起对抑制细胞周期调节剂的敏感性，即CDK4或PaRi的应用能够恢复顺铂抗性表型。顺便说一句，顺铂与PaRi的结合可能是治疗GCT患者的一种新的治疗选择，因为两种药物的结合大大提高了治疗效果。如果PaRi与顺铂联合使用会产生累加或协同作用，则仍然难以捉摸。
到目前为止，只有一项早期临床研究（2期，29位患者）测试了CDK4 / 6抑制剂palbociclib在治疗无法治愈的，难治的，表达RB1的GCT中的潜力。39在这项研究中，尤其是成熟的畸胎瘤（包括恶性转化病例）具有良好的24周无进展生存率。39在一项后续研究中，Narayan等人。40使用palbociclib治疗无法切除的成熟畸胎瘤患者队列的长期随访数据进行了回顾性分析，并证明在12例患者中palbociclib可能导致疾病相关临床事件的临床有意义的延迟。此外，一项随机，盲法和安慰剂对照的临床研究（NCT02300987）分析了ribociclib治疗近期进展的复发性，难治性，不可治愈的畸胎瘤的适用性。在本研究中，仅招募了10名参与者，因此人数非常有限（结果待定）。然而，CDK4 / 6抑制似乎有望用于治疗尤其成熟的畸胎瘤，包括具有恶性转化的畸胎瘤。39尽管如此，在沃恩等人的研究中。39，仅包括有限数量的患者以及仅表达RB1的GCT，并且仅测试了palbociclib。根据我们的研究结果，在GCT中，PaRi不仅通过经典的CDK4-RB1轴起作用，而且在细胞周期阻滞（即细胞凋亡）之外激发作用。因此，（a）筛查更大的I型和II型GCT患者队列（b）对RB1状态无限制，并且（c）包括ribociclib和abecmaclib（Lilly）作为palbociclib的替代品，将是有趣且有价值的。此外，我们发现PaRi治疗导致GCT细胞系CDK4上调，我们推测这可能抵消了PaRi的作用并可能引起耐药性。筛选由Vaughn等人治疗的患者将很有趣。39用于治疗中CDK4的上调。如果CDK4的上调仅限于非畸胎性GCT患者，则可以解释这些患者中Palbociclib活性降低。
在II型成年GCT细胞中，CDK4的表达很高，而CDK6的表达却很低，这证实了Schmidt等人的研究结果[ 18]，他还在41％的GCT中检测出高CDK4（在EC中最强），而CDK6的表达降低了64％。精原细胞瘤和23％的非精原细胞瘤。因此，在成年II型GCT中，CDK4似乎是PaRi的主要靶标。相反，在所有分析的I型儿科GCT中，CDK6的表达明显高于CDK4。总之，尽管PaRi靶分子的表达有所不同，但是PaRi可能是I型和II型GCT的治疗选择。
在II型GCT细胞系中，PaRi诱导出假衰老状态，主要导致细胞在细胞周期的G1 / G0期积聚（图 6a）。然而，特别是EC细胞似乎能够逃避G1 / G0停滞并继续细胞周期（图 6b，c）。我们的结果表明，EC细胞系要么在G2期结束时积累，要么能够进入有丝分裂状态，但未完成此过程（图 6b，c）。
在GCT中，PaRi 通过三种方式影响细胞周期：a通过CDK4-pRB1轴诱导G1 / G0阻滞，b通过上调CDK3绕过G1 / S检查点并在G2期末诱导阻滞，或者c通过下调有丝分裂调节剂导致有丝分裂终止。GCT细胞不耐受所有描述的作用，最终导致细胞凋亡。
此外，PaRi在顺铂耐药和亲本GCT细胞系中诱导凋亡，但在所测试的对照细胞中却未诱导。在膀胱癌细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病中也已描述了PaRi后的凋亡诱导，而在胰腺导管腺癌细胞系中，仅CDK4 / 6抑制并不能诱导凋亡。41，42，43因此，响应于CDK4 / 6抑制细胞凋亡的诱导似乎是肿瘤类型相关的，但是是一般的益处在治疗应用方面。
在分子水平上，PaRi显着影响GCT细胞中与细胞周期相关的基因，但有趣的是，介导此反应的因子在GCT实体之间是不同的。尽管不同细胞周期阶段的调节剂在PaRi应用后变得失调，但GCT大多已经在G1 / G0阶段积累。G1 / 0期积累似乎是早期细胞周期相位调节剂E2F / 1，CDCA3，KIF20A，SPC25，UHRF1，CDKN2D和CDKN3下调的结果（图 6a）。
有趣的是，CDK3是能够促进在RB1独立的方式G1 / S期过渡38（图 6B）。因此，在EC细胞中，CDK3的上调可能使进展超出G1 / S期检查点，而独立于palbociclib抑制的CDK4-RB1轴（图 6b）。然后，EC细胞要么在G2期结束时停滞，要么进入有丝分裂状态，而未完成此过程（图 6b，c）。PLK3通过与CDC25C（被PLK3灭活）和CHEK1相互作用来调节细胞周期的M期。palbociclib处理后，PLK3在2102EP细胞中被上调，而CDC25C和CHEK1被下调（补充图。 S8A，B）。因此，PLK3的上调可能导致CDC25C和CHEK1的下调。另外，在6.8％的非精原细胞瘤中，CHEK1被删除，这表明CHEK1的缺失可能对CDK4 / 6抑制剂治疗非精原细胞瘤的疗效有所帮助（补充数据 S1A）。此外，人augmin复杂基因的下调HAUS1 / 2 / 6，从而起到在有丝分裂纺锤体和中心体的完整性中起重要作用，在后PARI应用（补充图观察 S8A，B）。这些作用加在一起可能会阻止EC细胞完成有丝分裂（图 6b，c）。不依赖于细胞周期状态，PaRi施用后在GCT细胞系中诱导了凋亡停止的细胞，这表明即使进入有丝分裂的细胞也不能完成该过程。我们得出的结论是，GCT细胞不能耐受假衰老状态（在G1 / S检查点或在G2期末积累时）或失调的有丝分裂，并在此后不久发生凋亡（图 6a–c）。因此，我们假设凋亡的诱导不是PaRi直接引起的，而是细胞无法忍受细胞周期延长变化的结果。
我们观察到PaRi治疗后CDK4在蛋白质水平上调。我们建议，GCT细胞试图通过上调CDK4的表达来抵消其对CDK4的抑制作用，从而导致产生新的CDK4。因此，随着时间的流逝，GCT细胞可能对PaRi治疗产生抗性，但我们发现CDK4下游靶标CCND1 / CCND2没有上调。响应于CDK4 / 6抑制的CCND上调已在几篇出版物中显示，并通过CyclinD1-CDK2介导的S期进入绕过细胞停滞作用而与获得性耐药相关。12，44，45GCT细胞系似乎绕过了这一机制，因为在PaRi处理后，GCT细胞系主要在细胞周期的G1 / G0期蓄积，蛋白质水平上的CyclinD1 / 2或RNA水平上的CDK2均未上调（补充图 S7C，补充数据 S1B）。
在对CNA的分析中，我们发现CCND2通常在精原细胞瘤和非精原细胞瘤中扩增（补充数据 S1A）。也许，与未CCND1扩增的患者相比，那些患者更容易产生对CDK4 / 6抑制的抗性。最近在乳腺癌和胶质母细胞瘤细胞系中引入了抑制CDK4 / 6的蛋白水解靶定性嵌合体（PROTAC）的进展，其中CDK4和CDK6蛋白的表达大大降低。46因此，如果对这些药物的耐药性可能成为问题，那么靶向CDK4 / 6的PROTAC可以替代PaRi。
总之，palbociclib和ribociclib为顺铂耐药和敏感的儿科和成人GCT提供了新的推定治疗选择。然而，将来必须证明在这项研究中在人造细胞系上发现和测量的机制和药物动力学/动力学是否可以反映到体内情况。因此，必须对大型I型和II型GCT队列进行详细分析。此外，进一步的实验将必须揭示GCT是否能够获得对PaRi的抗性，以及顺铂和PaRi的联合治疗是否可以使患者受益。到目前为止，对于CDK4 / 6抑制是否可以逆转顺铂耐药性表型，或者平行引起顺铂耐药性的机制是否使GCT细胞对干扰细胞周期的药物敏感，目前尚不清楚。
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