摘要
DNA聚合酶ε（Polε）是基因组复制和肿瘤抑制所必需的。它支持复制体组装和前导链合成。但是，其潜在机制仍有待阐明。在这里我们报告说，Polε催化核心内的保守结构域会影响发芽酵母中的这些复制步骤。在此域中对与癌症相关的突变进行建模揭示了其在复制体组装过程中将Polε掺入四元预载复合物中的意想不到的效果。此外，遗传和生化数据表明所检查的域支持Polε催化活性和复制叉的对称运动。与先前表征的Polε癌症变体相反，所检查的突变体导致基因组超重排而不是超突变。
真核基因组复制需要三种保守的复制聚合酶。其中，DNA聚合酶的ε-（POLε）进行批量的前导链合成1，2，3，4，5。其大亚基，POLE在哺乳动物和POL2在芽殖酵母，供给催化活性和它的其他三个亚基具有结构作用6，7，8，9，10。Pol2及其直系同源物由于其核苷酸选择性和核酸外切酶（EXO）域介导的校对，因此可以高保真地合成DNA 11。Pol2家族酶的大小几乎是其他复制性聚合酶（Polα和δ）的催化亚基大小的两倍，表明除DNA聚合外还具有其他作用。数据对哺乳动物POLE是有限的，但酵母的研究表明，POL2是其在复制体在S期和复制检查点的活化在基因毒性应激参与组件复制聚合酶中是唯一的12，13，14。阐明Pol2如何执行这些重要和独特的作用对于对基因组遗传的机械理解至关重要。
当前模型假定带有聚合酶和EXO域的Pol2 N末端一半（Pol2-NT）进行链合成，而其他DNA聚合酶中未发现的C末端结构一半（Pol2-CT）支持复制体组装和检查点激活。 （补充图 1A）15，16，17。有趣的是，Pol2-NT包含其他DNA聚合酶中不存在的几个高度保守的结构域，到目前为止仅检查了其中一个（P结构域）18。此外，Pol2-NT与Pol2-CT不同，它采用动态构象，这就提出了一个问题，即该区域内Pol2家族特异性结构域是否在复制的不同阶段有助于不同的任务17，19，20。鉴于Pol2及其直系同源物在基因组复制中的根本重要性，解决这个问题对于推导真核复制模型至关重要。
在这里，我们检查由Pol2直系同源物唯一拥有的一个未表征的Pol2催化核心区域。为了解决该区域的扰动如何影响DNA复制的问题，我们基于以下原理对在那里发现的与癌症相关的复发性POLE突变进行了建模。众所周知，在EXO突变POLE可以驱动超突变的癌症的肿瘤发生21，22，23，24。然而，最近的分析发现非超突变型癌症中非EXO POLE突变的频繁发生以及对这些癌症的病因的潜在POLE贡献，这证明了非EXO POLE的重要性在肿瘤发生中的变体23，24。鉴于非EXO POLE变体仍未经测试，我们认为在酵母中对它们进行建模不仅可以增进我们对野生型Polε功能的了解，而且可以使我们了解非EXO Polε突变的基因组破坏潜力。
在我们的研究中应用这种策略会产生一些见解。我们的分子，遗传和生化数据表明，Pol2催化核心在复制体组装中具有结构性作用。此外，我们发现Pol2家族蛋白特有的检查区域对DNA链合成具有以前无法识别的作用。有趣的是，我们发现了可诱导大型基因组变化而不影响突变率的Pol2变异体。这项工作阐明了复制体组装和复制性DNA合成的机制，并扩大了我们对POLE的肿瘤抑制潜力的看法。
我们检查了位于Pol2催化核心外围的68个氨基酸区域，远离其DNA结合和活性位点（补充图 1a）18。该区域显示出酵母Pol2和人POLE之间71％的序列同源性，但在其他类型的DNA聚合酶中却未发现（图 1a和补充图 1a）。此后，我们将该区域称为POPS（特定于POl2家族的催化核心外围子域）。为了解决POPS的功能，我们通过建模POLE引入保守残基的突变改变癌细胞（补充图发现 1A和表 1）22，23。同时置换五个残基（R567C，K593C，S595P，E611K，L621F）会在质粒改组实验中造成致命性，这表明POPS是必不可少的（补充图 1b）。当仅三个POPS残基发生突变（R567C，E611K，L621F）时，细胞在较低的温度下仍能存活，但在37°C的温度下却没有（补充图 1b）。我们使用取代野生型POL2的pol2-R567C，E611K，L621F（pol2-REL）整合等位基因证实了这一点（图 1b）。我们发现不影响Pol2蛋白水平的pol2-REL减慢了S期的进入和进展（图 1c和补充图 1c）。）。这些数据表明，POPS对于DNA复制至关重要。
复制聚合酶中POPS与相邻区域的序列比对。POPS的序列用蓝色框表示发芽的酵母Pol2（ScPol2）和人POLE（hsPOLE），而DNA聚合酶α（ScPol1，HsPolA）和δ（ScPol3，HsPolD）的催化亚基中不存在。与POPS相邻的区域（包括PALM域）在所有复制性聚合酶之间共享同源性。星号和点分别标记保守残基和相似残基。三角形突出显示pol2-REL中的突变。b pol2-REL细胞显示出生长障碍。将生物学复制物中突变和野生型（WT）细胞的十倍系列稀释液点在板上，并在指定的温度下生长。c流式细胞仪分析表明存在复制缺陷pol2-REL细胞。通过在24°C下通过异步培养（Asyn）的α因子处理实现G1同步。流式细胞仪监测从G1释放到24°C或37°C循环中的细胞DNA含量。d基于基因组测序结果的相对DNA拷贝数的荟萃分析。如面板c所示，在24°C的G1释放后30'和40'处检测野生型和pol2-REL细胞。从早期起源（n = 97，左）或晚期起源（n = 174，右）的任一侧求出二十千个碱基的平均值，并将其相对于起源的相对位置作图。虚线表示原点的中点。Ë二维（2D）凝胶分析揭示了pol2-REL细胞中有缺陷的复制起始和进展。测试了来自图d的样品，并且显示了包含晚起源ARS1212或早起源ARS305的〜6kb区域的2D凝胶结果。限制片段中来源（钻石）的中点定位显示在侧面。蓝色箭头表示pol2-REL细胞中的Y形复制中间体（RI），黑色箭头表示气泡状RI。WT和pol2-REL细胞中气泡和Y形RI的定量显示在底部。对于前者，将WT中20'（对于ARS305）或30'（对于ARS1212）的气泡状RI的水平设置为1。pol2-REL细胞在使用附加孢子分离株的多个试验中可重复检测。将气泡结构的信号标准化为1N DNA，以得出所有时间点的气泡结构百分比。源数据作为源数据文件提供。
我们对pol2-REL细胞进行了广泛的测定，以确定POPS扰动的分子后果。如后面部分所述，还检查了该等位基因中的每个突变，以确定与癌症相关的突变的影响。我们首先生成使用深度测序同步S期的细胞的DNA的复制型材和拷贝数的测量25，26。即使在pol2-REL的容许温度（24°C）下，与野生型细胞相比，突变体中整个基因组的DNA合成也减少了（补充图 1d）。我们注意到pol2-REL细胞中复制起点的使用和时间没有改变（补充图 1d）。为了获得早期和较晚起源行为的全局视图，我们对> 200个复制起源进行了荟萃分析。在pol2-REL细胞中同时包含早期和晚期起源的区域发现DNA合成减少，后者表现出更大的缺陷（图 1d）。这些发现表明，POPS对于整个基因组中的DNA合成很重要。
为了进一步描述POPS对DNA复制的影响，我们进行了二维琼脂糖凝胶电泳（2D凝胶，补充图 2a）。我们首先检查了位于受测限制性酶切片段中点的较晚起源ARS1212，以便在那里进行的双向复制有望产生气泡状复制中间体（RI）（补充图 2b，顶部）。当野生型细胞在24°C下从G1释放释放进入S期时，在30分钟时检测到气泡RI，在40-50分钟达到峰值，在60分钟时消失（图 1e）。但是，pol2-REL细胞中气泡RI形成的时间模式可再现地延迟（图 1e）。）。这种缺陷提示复制起始缺陷。
令人惊讶的是，我们观察到pol2-REL而非野生型细胞表现出大量的大Y形RI信号，这与ARS1212处的复制起始相吻合（图 1e）。对于包含中心定位起源的DNA片段，可通过姐妹复制叉的不对称运动生成大的Y形RI（补充图 2b，底部）。我们注意到，野生型和pol2-REL细胞中从邻近来源被动复制产生的小Y形RI在可比水平上与突变体中正常来源使用和时机一致（图 1e和补充图 1d）。）。此外，我们观察到，即使在pol2-REL细胞中G1释放后120分钟，气泡和大的Y形RI仍然存在，而野生型复制在60分钟时已基本完成（图 1e和补充图 2c），这表明 pol2-REL细胞遭受叉运动缺陷。
接下来，我们评估了在较早起源中是否也发现了缺陷复制特征。为此，通过剥离膜并重新探测两个早期起源ARS305和ARS315，对上述检查的DNA样品的早期起源行为进行了分析。复制起始延迟仅在ARS315处可见（图 1e和补充图 2d），这与显示在早期起源处总体轻度缺陷的复制谱数据一致（图 1d）。重要的是，pol2-REL的两个早期起源都具有大量的Y形信号，而野生型细胞则没有（图 1e和补充图 2d）。），这表明不管启动延迟如何，叉的不对称运动都在早期发生。
总而言之，复制谱和2D凝胶分析表明pol2-REL导致延迟复制优先在晚期起点发生，而非对称复制叉（或叉子）在早期起点和晚期起源移动。这些独特的功能突显了pol2-REL在理解复制起始和延伸过程中的实用性。
接下来，我们讨论了POPS如何促进复制启动。复制起始的标志是复制体的从头组装，包括将C dc45，M cm2-7和G INS复合物（Psf1-3和Sld5）组装成CMG复制解旋酶。使用免疫共沉淀（共-IP），我们证实了在S采用MCM同时CDC45和PSF1关联，但在野生型细胞中G1期样品（图中未 2A和补充图 2E）27。值得注意的是，在37°C和24°C的pol2-REL细胞中，这种结合都减少了，前一种情况会导致更强的缺陷（图 2a和补充图 2e））。受损的CMG水平与如上所述在pol2-REL细胞中观察到的复制起始缺陷一致，并指出POPS在CMG组装中的潜在作用。
野生型和pol2-REL细胞中的 CMG水平。细胞在24°C的G1中同步，并在37°C释放到S期。标记带标志的Mcm4被免疫沉淀（IP），并检查了Mcm2，Cdc45和Psf1的共纯化。提出了代表性的蛋白质印迹，IP馏分中Cdc45和Psf1水平相对于Mcm2的定量（右）显示，与野生型细胞相比，pol2-REL细胞减少了。b检查LC前水平。标记了Sld2的是IP，来自24℃G1或S期细胞中蛋白质提取物，并检测了共纯化的Pol2，Dpb11和Psf1。星号表示IP中使用的抗体的轻链。WCE：全细胞提取物。污点用作加载控件。C检查Pol2与Dpb11和Dpb2的关联。如面板b中那样进行实验，除了HA标记的Pol2是IP并且检查了Dpb11和Dpb2。对于所有面板，每个基因型使用至少两个独立的菌株可获得相似的结果。源数据作为源数据文件提供。
Polε通过形成四元预载复合物（pre-LC）参与了CMG组装，该复合物还包括Dpb11和Sld2支架蛋白以及GINS 28。根据当前模型，前置LC将Polε和GINS传递到原点绑定的MCM和Cdc45，从而导致CMG的组装以及Polε与它的关联，而Dpb11和Sld2被回收以形成其他前置LCs 13，29。尚不清楚这些蛋白是否还可以通过前LC以外的其他方式支持CMG的形成。
我们首先检查了pol2-REL是否会影响LC前的形成。我们证实，在野生型细胞中，Sld2在S期共免疫沉淀了pre-LC成员Pol2，Dpb11和Psf1，而在G1期则没有（图 2b）28。令人惊讶的是，即使Dpb11和Psf1被有效地拉低，Sld2在S期也仅拉低了Pol2-REL蛋白（图 2b）。在Pol2 co-IP实验中也观察到Pol2-REL和Dpb11之间的相互作用不良（图 2c）。相反，Polε亚基Dpb2通常与Pol2-REL相关联（图 2c）。而且，化学计量亚基在纯化聚合酶ε不受影响REL（补充图 2F）。因此，Pol2-REL能够形成Polε，但是在与其他前LC成分相互作用时存在缺陷。该表型表明POPS影响LC前的形成。pol2-REL细胞中降低的pre-LC和CMG水平的相关性支持该模型，即pre-LC对CMG组装至关重要，但不排除Polε可能影响CMG组装的其他方式。
鉴于在pol2-REL细胞中见到的pre-LC形成受损，我们询问增加特定pre-LC成员的剂量是否可以挽救pol2-REL缺陷。令人惊讶的是，Dpb11的过量表达而非Sld2的过量表达抑制了37°C时pol2-REL的致死性（图 3a和补充图 3a）。如分别通过2D凝胶和FACS分析评估，这种拯救与复制起始和基因组复制的改善相关（图 3b和补充图 3b）。改善也与CMG水平的挽救相关（图 3c）。明显地，增加的Dpb11剂量将其与Pol2-REL的结合恢复到与野生型Pol2所观察到的相似的水平（图 3d）。这些发现的最简单解释是，恢复与Dpb11的Pol2-REL相互作用可改善CMG的形成，并因此改善复制的起始和生长。
a提高Dpb11的水平，但不降低Sld2的水平，可在37°C时拯救pol2-REL杀伤力。在含半乳糖的培养基上检查有或没有由半乳糖诱导型启动子驱动的Dpb11或Sld2第二拷贝的细胞。b Dpb11过表达增加了pol2-REL细胞中的复制起始事件。在缺少半乳糖的培养基中生长的细胞在24°C时被α因子阻滞在G1期，然后通过添加半乳糖转移至37°C以诱导Dpb11过表达。通过FACS分析监测细胞从G1释放到S期（补充图 3b）。进行了二维（2D）凝胶数据定量，如图1e所示。 。我们注意到，在该实验设置中使用的半乳糖培养基中的S相缓慢发展和高温产生了连续的Y形RI结构，而不是如图1d所示的大Y形RI 。c Dpb11过表达增加pol2-REL细胞中的CMG水平。如补充图3b中那样收集样品 。实验和数据表示如图2a所示 。d Dpb11水平的提高改善了其与pol2-REL和Sld2的关联。如补充图3b所示收集细胞 并检查了120分钟时间点的样本。上图：IP标记HA标记的野生型或突变体Pol2，并检测到Dpb11的S期特异性共纯化。中：带有标志标签的Sld2是IP，并检查了Dpb11，Pol2和Psf1的共纯化。星号表示IP中使用的抗体的轻链。底部：全细胞提取物（WCE）。对于面板c和d，使用每个基因型至少两个独立的菌株可获得相似的结果。源数据作为源数据文件提供。
我们进一步测试了Dpb11过表达如何影响LC前组装。有趣的是，增加的Dpb11水平可促进Dpb11和Sld2的结合，但不足以增强Pol2-REL和Sld2之间或Dpb11和GINS之间的相互作用（图 3d和补充图 3c）。在不恢复LC前水平的情况下增强Pol2-REL和Dpb11的关联足以缓解pol2-REL缺陷，这表明至少在某些情况下，LC前的独立方法可支持CMG组装。
在阐明POPS对复制启动的影响之后，我们查询了它对复制叉行为的影响。我们考虑了pol2-REL细胞中不对称复制结构的积累的三种可能解释，并使用多种方法进行了测试。首先，由于复制起点处单个复制体的不对称组装，pol2-REL细胞中的低pre-LC水平可能导致单向起点激发。为了测试这种可能性，我们询问降低pre-LC 本身是否会导致不对称的复制结构，如pol2-REL中所示细胞。由于Dpb11参与LC前的形成，但不随复制叉移动，因此其在G1和S期的急性耗竭有望主要影响LC前的水平29。因此，我们在G1期和S期细胞中转录下调了Dpb11（图 4a）。不出所料，Dpb11丢失减少了ARS305和ARS1212的复制起始结构（气泡），并减慢了S期。然而，未观察到不对称的复制中间体（图 4b，c和补充图 4a）。这一发现表明，降低pre-LC 本身的水平并不会引起起始点的不对称激发，表明pol2-REL可能会影响复制叉的进程。
一个多西环素除了敏锐地减少Dpb11水平。蛋白质印迹法证实了Dpb11在G1阻滞细胞中的丢失，然后当用强力霉素（+ Dox）处理时，细胞释放进入S期，从而关闭了Tet启动子驱动的Dpb11表达56。b Dpb11耗尽会延迟原始触发，但不会生成不对称的复制中间体。显示了代表性的2D凝胶图片。细胞按照图a处理；进行了二维凝胶分析，数据如图1e所示 。c面板b中显示的气泡状复制中间体的定量。d在增加浓度的Polε的情况下，对pARS1（4.8 kb）进行了重组的DNA复制反应如图所示，WT（1-4道）或PolεREL（5-8道）。通过碱性琼脂糖凝胶电泳分析复制产物，并绘制32 P-dATP 的总掺入量（底部）。铅：领先股，滞后：滞后股。È引物延伸测定与提纯聚合酶ε WT（泳道1-7）或polε REL（泳道8-14）。用放射性标记的寡核苷酸引发单链M13mp18 DNA（7.2 kb），与RFC / PCNA孵育，并通过添加Polε和dNTPs引发反应。通过碱性琼脂糖凝胶电泳和放射自显影分析产物。FL：全长。f在15 nM Polε存在下重建的DNA复制反应的时程分析WT（通道1-5）或PolεREL（通道6-10）。如c中所述对复制产物进行分析和定量。对于面板a和b，使用每个基因型至少两个独立的菌株可获得相似的结果。对于图c，d从两个独立的实验中获得了相似的结果。源数据作为源数据文件提供。
然后，我们测试了PolεREL可能损害DNA链合成的第二种可能性。为此，我们采用了重构的依赖于起源的酵母DNA复制系统，进行了Polε滴定实验和时程分析30。当浓度高达30nM的溶液中加入聚合酶ε，叉进展率分别为通过聚合酶ε基本上不受影响REL，从与聚合酶ε得到的前导链产物的相似的长度分布明显重量或polε REL（图 4D和补充图。 4B）。然而，在更高的聚合酶ε浓度（60纳米），中度但前沿和后随链长度的可再现的减少被认为在含有聚合酶ε反应REL相比聚合酶ε 重量（图 4D和补充图 4B），表明一在存在聚合酶ε叉进展缺陷REL。此处看到的浓度依赖性效应可能是由于Polδ仅在PolεREL水平低时才补偿前导链合成缺陷30。为了进一步测试PolεREL是否对DNA合成有缺陷，我们评估了PolεREL使用涂有RPA的单链M13 DNA上的引物延伸分析检测其聚合酶活性（图 4e）。该分析显示，DNA合成通过聚合酶ε REL是相对于聚合酶ε缺陷重量，产生了〜50％减少的完全伸出产品的时间过程（图的端部 4e的）。我们得出结论，有效的Pol介导的链合成需要POPS。
重构的DNA复制系统上面描述也允许我们测试波尔ε是否REL直接影响复制起始。正如精通链延伸在聚合酶ε的低水平的可见REL，在这些条件下总的DNA合成成比例原点触发速率。事实上，时间过程在15nM的波尔分析ε表明，总的DNA合成减少了高达〜40％在波尔ε的存在REL与聚合酶ε相比重量，表示原点激活（图的缩小率 4F）。总而言之，我们的体外结果与体内数据一致，支持POPS在DNA聚合和复制起始中的作用。
除了降低的DNA聚合，在非对称看到复制结构POL2-REL细胞也可以通过聚合酶ε的能力受到损害引起REL应付非均匀分布的模板块。为了测试这种第三种可能性，我们集中在R环作为模板障碍的一个例子，因为R环的水平可以通过改变R环去除酶31进行实验性调节。因此，我们询问是否POL2-REL细胞在不存在的RNA的R-循环水平的增加敏感/ DNA螺旋森1或核酸酶RNA酶的H 2 32，33。实际上，pol2-REL对任一突变体均显示出合成杀伤力（图 5a和补充图5）。 5a）。尽管RNase H2还促进了DNA中错误结合的核糖核苷酸的切除，但是pol2-REL和rnh201∆之间的合成致死性与核糖核苷酸的切除修复无关，因为此功能缺陷的突变体（rnh201-RED）不影响pol2-REL的生长（图 5a和补充图 5a）34。我们还发现，过表达另一条R-循环清除酶，RNA酶H1，部分地救出POL2-REL到喜树碱灵敏度，一个基因毒素，可以增加R-循环水平（图 5B）31，35，36。总的来说，这些基因数据认为含有聚合酶ε复制体REL是R-循环水平敏感。
一个 POL 2-REL是综合生病sen1-1和rnh201Δ，但不rnh201-RED。显示了来自对pol2-REL杂合的二倍体的代表性四倍体和经测试的突变（补充图5a中的更多 四倍体）。b RNase H1过表达可改善pol2-REL细胞在含CPT的培养基上的生长。将具有（O / E）或不具有（-）Gal启动子驱动的RNaseH1构建体的细胞以连续10倍的稀释液点样到含有2 µg ml –1 CPT的半乳糖培养基上。c pol2-REL细胞在合成Chr XII中表现出优先缺陷。如图1c所示，在释放到细胞周期之前将细胞停滞在G1中， 除了添加诺考达唑以防止其退出第一个细胞周期。通过PFGE检查样品，以捕获孔中的复制染色体，并允许完全复制的染色体进入凝胶。显示了使用特异于Chr XII或IV的探针进行Southern印迹的代表性结果（左）。绘制了两个独立实验中的染色体带信号相对于孔中信号的相对比率，并将其标准化为150分钟和210分钟样品的野生型值（右）。显示了均值和标准差，并且突变率和野生型值之间的统计学差异通过p的两尾Student t检验确定。 150分钟 = 0.07，210 分钟p = 0.004。每个基因型使用两个独立的菌株获得了相似的结果。d pol2-REL细胞表现出更高的GCR率。进行了两尾曼恩-惠特尼检验以进行统计分析。*** p ＜0.001。误差线表示95％置信区间。数据表示为每个基因型来自两个生物学重复的至少七个培养物的中值速率。Ë POL 2-REL不影响CAN1正向突变率。误差线表示95％置信区间。数据表示为从每种基因型的72种培养物和两次生物学重复中确定的平均比率。源数据作为源数据文件提供。
上述结论的预测是聚合酶ε REL将在复制染色体XII（CHR XII），其在核糖体DNA基因座富集了R-循环和其他模板障碍少精通37，38，39。我们使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）测试了这种预测，以将进入凝胶的完全复制的染色体与捕获在孔中的不完全复制的分支染色体分开。随后，通过Southern印迹探测Chr XII，以得出凝胶带中Chr XII信号与孔中信号之比。使用大小相似的IV号染色体（Chr IV）进行比较。尽管两个染色体均显示出延迟的复制完成，但是Chr XII在pol2-REL细胞：在G1释放后的150–210分钟内，突变体中的Chr XII复制仅达到野生型水平的30–60％，而在这些时间点，Chr IV复制约为野生型水平的65–95％ （图 5c）。因此，pol2-REL细胞在复制富集了模板屏障的染色体上更加严重缺乏。由于Chr XII除R环外还含有大量其他类型的屏障，因此我们的数据与POPS在应对DNA阻滞中发挥更广泛作用的想法是兼容的。支持此观点的是，去除清除蛋白质屏障的Rrm3解旋酶会导致pol2-REL细胞致死（补充图 5a）。）。因此，我们的数据表明POPS有助于克服货叉在模板壁障处的停顿。
我们继续评估POPS突变对基因组稳定性的影响。我们首先检查了总染色体重排（GCR）。引人注目的是，pol2-REL导致半容许温度下GCR速率增加350倍，而容许温度下GCR速率增加6倍（图 5d和补充图 5b）。这与通过CAN1基因功能的丧失所测定的在任一温度下pol2-REL细胞中缺乏突变率增加形成鲜明对比（图 5e和补充图 5c）。作为对照，我们确认Pol2 EXO突变体pol2-4显示出较高的突变率（补充图 5c）。我们的发现与非超突变癌细胞中存在POPS突变是一致的。与pol2-REL相反，pol2-4显示出野生型的GCR率（补充图 5b）。我们的发现表明，存在于不同域中的不同Polε功能限制了不同形式的基因组不稳定。
以上数据表明pol2-REL是影响特定Pol2角色的功能分离等位基因。为了进一步检验该概念，我们检查了Pol2在复制检查点激活中的作用。经复制应激剂甲磺酸甲酯（MMS）处理后，pol2-REL表现出野生型，产生Rad53检查点激酶的磷酸化形式并延迟了S期进程，而影响Pol2-CT 的检查点受损的pol2-11等位基因表明两种检测方法均存在缺陷（补充图 5d）12。一个时程实验证实了在MMS存在下pol2-REL诱导Rad53磷酸化的能力（补充图 5e））。这些数据支持Pol2-REL维护复制检查点功能的概念。
在正常的S期，pol2-REL也表现得像野生型，没有可检测到的Rad53磷酸化，也没有诱导检查点靶标Rnr4（补充图5f）。因此，pol2-REL不会在S阶段对检查点过度激活产生不利影响。正如其他复制缺陷型突变体所见，pol2-REL细胞的确在G2-M期显示出关卡激活，这表明在细胞周期的这一阶段，关卡可以检测到它的缺陷（补充图 5f）。我们的数据表明pol2-REL对于检查点激活和避免突变总体上是熟练的。
由于每个检查的POPS突变均单独发生在癌细胞中，因此我们查询了单点突变的后果。当以单点突变形式出现时，pol2-REL，R567C和L621F的三个变化中的两个概括了pol2-REL表型。首先，像pol2-REL一样，pol2-R567C和-L621F被另一个Polε亚基Dpb2的突变所致敏。 pol2-REL和pol2-R567C还因Polδ亚基Pol32的缺失而致敏（图 6a和补充图 6a）。其次，pol2-R567C和-L621F在整体基因组合成中显示出严重到中度的延迟（补充图 6b）。也就是说 pol2-4没有显示出这些缺陷进一步从POPS的突变体（图区分POL2 EXO突变体 6A和补充图 6C）。第三，pol2-R567C细胞积累了大的Y形DNA分子，表明单个POPS突变足以产生不对称的复制结构（图 6b和补充图 6d）。最后，我们发现pol2-R567C与野生型细胞相比，这些细胞的GCR率提高了四倍，这表明单个POPS突变可以适度增加基因组重排（图 6c）。
一个 POPS突变体，但不是pol2-4，与综合生病dpb2-1和pol32Δ。显示了来自指示基因型的二倍体的代表性四倍体（补充图6a中的更多四倍体 ）。b pol2-R567C导致复制起始和进程减少。进行实验，数据如图1e所示 。显示了代表性的凝胶及其定量。c pol2-R567C增加GCR速率。进行实验，数据如图5d所示 。进行了两尾曼恩-惠特尼检验以进行统计分析。*** p <0.001。误差线表示95％置信区间。数据表示为每个基因型来自两个生物学重复的至少七个培养物的中值速率。d一个提议的模型，用于在基因组复制过程中Pol2催化核心及其POPS的动态作用。简而言之，我们的数据表明，POPS可使有效的Polε掺入pre-LC中，从而促进CMG的形成和复制的启动。复制开始后，POPS将支持最佳的DNA聚合活性和克服模板障碍的能力。在癌细胞中观察到的POPS突变可导致CMG的形成和复制起始减少，以及复制进展缓慢，从而导致基因组重排增加（有关详细信息，请参见文本）。
通过在酵母直向同源物Pol2中模拟人POLE与癌症相关的突变，我们获得了与天然和癌症相关的Polε功能的见识。我们的数据表明，Pol2催化核心通过使Polε整合到pre-LC中，在复制体组装过程中发挥了结构性作用。此外，POPS促进Polε介导的DNA合成和叉通过模板屏障。POPS在DNA复制的不同阶段的独特作用突出了Polε催化核心的动态功能。重要的是，我们证明了POPS功能的扰动会增加基因组的重排，从而揭示癌症中人类POLE POPS变异体的潜在基因组后果。
全基因组复制概况和pol2-REL细胞的2D凝胶分析表明复制起始减少，尤其是在较晚起源时。由于pol2-REL细胞不会不利地打开DNA复制检查点，因此不太可能出现检查点介导的对晚期起源放电的抑制。虽然我们不能排除这样的可能性关卡激活低于我们测定的检测限可能部分有助于起源后期烧制缺陷POL 2-REL细胞，我们的体外重建试验表明，波尔ε REL也妨碍复制起始在没有检查点蛋白。此外，我们的生化分析发现pol2-REL中的 CMG水平降低细胞。这些数据支持了一个模型，其中Pol2催化核心至少部分通过促进CMG组装而有助于复制起始（图 6d）。
已经提出了前LC，以在CMG形成过程28中将GINS递送至原发地结合的MCM和Cdc45 。但是，尚未报告测试该模型的重要预测，即较低的LC前水平会导致CMG水平降低。我们在pol2-REL细胞中这一点的证明填补了这一空白，并为上述理论提供了支持。随着Dpb11剂量的增加在非容许温度下挽救pol2-REL细胞的致死性并恢复CMG水平和复制起始，POPS对pre-LC的作用与Dpb11相关。考虑到POL2-CT也有助于预LC和复制体组件和及其突变体生长缺陷是由Dpb11过表达救出40，41，我们建议在这个重要的复制步骤中，Pol2作为与Dpb11协作的中央支架。该pol2-REL细胞显示出迟发源性放电的优先损害证实了以下观点：迟发性源具有减少的复制起始因子募集能力，因此对其水平的变化更敏感29。这一发现将Pol2添加到了不断增长的可选择性影响不同基因座基因组复制起始的因素列表中。
在支持pre-LC在CMG组装中的重要作用的同时，我们的数据揭示了pre-LC因子在CMG组装中以前未曾认识到的特征和功能灵活性。我们发现Dpb11，GINS和Sld2也可以在没有Polε的情况下关联。假定Dpb11可以直接与MCM相关的Sld3绑定，我们数据的一种解释是“三元”亚复合物可以通过这种相互作用将GINS递送至MCM 42。Dpb11和Sld3的相互作用也可以使Polε传递到MCM，而无需形成pre-LC。GINS和Polε的单独传递方式可能比pre-LC的效率低，但在pol2-REL细胞中可能仍然有效。这种解释可以解释pol2-REL中复制起始的恢复。Dpb11过表达引起的细胞与增强的Dpb11-Polε相互作用有关，但与更多的前LC无关。从这一想法推断，预LC变体低效形式可以是能够以考虑在看到复制体组装缺陷POL2-NTΔ突变体17，43。CMG组装前LC无关的手段的进一步研究将加深我们对复制体形成途径可塑性的了解。
我们的数据表明，有效的Polε介导的链合成依赖于POPS的完整性。我们发现pol2-REL细胞中的POPS缺陷导致早期和晚期起源的不对称复制结构和持久复制中间体。2D凝胶数据和全基因组复制概况表明，这些结构不是由相邻来源的被动复制引起的，而是反映了复制叉的进展缺陷。该发现表明pol2-REL细胞中两个姐妹复制叉高度解偶联。虽然pol2-REL细胞具有较低的前LC水平，我们证明这种缺陷本身不会引起不对称的复制结构。由于POPS仅在复制聚合酶中的Polε中发现，因此我们的发现揭示了Pol介导的链合成特有的重要特征（图 6d）。
我们的引物延伸和重构复制测定表明，聚合酶ε REL表现出减少的DNA合成相对于聚合酶ε的速率WT。在细胞中，pol2-REL导致对温度敏感的表型。但是，由于高温抑制了重组系统中DNA的复制，因此我们无法在体外的限制性温度下测试PolεREL活性，这可能可以解释此测定法中观察到的相对温和但可重现的缺陷。值得注意的是，在复制起始和延伸造成的波尔ε双重效果REL在干扰此实验设置中的其他复制因子后，还没有发现，这再次表明在这些不同步骤中对Polε的独特要求。POPS可以通过几种可能的方式促进Polε介导的DNA合成，例如促进DNA缔合，促进dNTP转换或提高生产能力。PolεREL合成缺陷的详细酶学表征将在将来区分这些可能性。此外，这将是有趣的，以确定持久性有机污染物的功能如何被SUMO化修饰，这是最近报道的在这一地区发生的调节44，45。
我们的数据还表明波尔ε的倾向增加REL复制体在模板障碍失速。Polε对POPS的特殊要求可能反映了在前导链延伸过程中合成长链DNA的独特挑战，这要求高的合成能力和遇到许多模板障碍时恢复合成的能力。Pol2家族蛋白获得这些属性的一种方式可能是通过获得其他域。Pol2催化核心内的P结构域通过结合模板DNA 18来提高Polε合成能力。需要进一步的研究来阐明POPS可以促进Polε活性及其与P结构域相互作用的潜在机制。
我们发现Pol2-REL在很大程度上避免了突变和检查点激活（图 6d）。尽管抑制原点射击与检查点激活有关，但可以想象，突变体对正常生长条件下原点射击的影响不是MMS条件下Pol2介导的检查点激活的主要因素，这需要Pol2-CT功能。因此，我们的数据表明，POL2-REL支持从先前研究的突变体POL2不同的表型43，46。
我们表明，完整的POPS是遏制基因组重排所必需的，而不是突变率，表明它以不同于Pol2 EXO域的方式影响基因组不稳定性（图 6d）。鉴于POPS的保守性质，人POPS可以赋予肿瘤抑制作用而不会影响突变率。该理论与POLE缺陷促成非高诱变性肿瘤24的最新建议一致。值得注意的是，pol2-12检查点缺陷等位基因还导致GCR水平升高47。由于大多数非EXO癌症相关的POLE突变的致病意义仍然未知，我们的工作表明，在酵母中对这些突变进行建模可以提供一种有效的方法，以区分DNA超重排与超突变之间的基因组不稳定性效应。
中癌症相关的突变检测，POL2-R567C表现最强的缺陷，同时POL2-L621F表现出更温和的表型和POL2-E611K有基本上正常的行为。这一发现与对突变效应的计算评估有所不同，后者通常认为保守残基化学性质的最剧烈变化对蛋白质功能的破坏性最大。因此，我们的发现突出了酵母研究的价值，该研究揭示了无法通过计算机分析准确预测的癌细胞中点突变的独特体内效应。我们注意到，与pol2-REL相比，pol2-R567C表现出的严重缺陷更少但是，引起影响细胞增殖的基因组累积变化可能仍然足够。我们的工作还提出了对酵母中的POPS突变体敏感的化学物质和条件。这可以指导选择性杀死具有POPS突变的癌细胞的设计。
酵母菌株在补充表1中列出， 是W303的RAD5变体W1588-4C的衍生物（MAT a ade2-1 can1-100 ura3-1 his3-11,15 leu2-3，112 trp1-1 rad5-535）48。每个基因型中至少检查了两个菌株，并且在补充表1中仅列出了每个基因型中的 一个。使用基于PCR的标准方法生成整合的等位基因，并在内源基因座处向蛋白质添加标签，然后进行DNA测序验证。质粒列于补充表 2。使用标准分子方法进行克隆，然后进行序列验证。培养基的制备按照标准程序进行。四元分析（图5a，6a和补充图 5a和6a）的基因分型方法如下：（i）使用标准药物选择或自养标志物选择对POPS突变（用KAN标记），pol32∆（用HYG）和sen1-1（以HIS3标记），（ii）dpb2-1，pol2-4和rnh201-RED分别使用SfcI，SfcI和ApaI限制酶通过PCR结合特异性限制性酶切对DNA进行评分，（iii）通过基因两侧的PCR引物对rhn201∆和rrm3∆进行评分。引物序列在补充表3中列出 。
使用标准方案可实现酵母培养物的G1阻滞。简而言之，将对数期培养物用α因子（5 µg ml -1）处理，直到> 90％的细胞表现出G1阻滞。对于涉及温度变化的实验，将G1阻滞细胞移至37°C 1 h。300 µg毫升-1然后将链霉蛋白酶（Millipore）添加到G1阻滞的培养物中以释放细胞。在多个时间点收集样品进行检查。对于涉及半乳糖诱导的实验，将2％的棉子糖用于对数期培养，并添加2％的半乳糖以诱导基因表达。使用标准程序进行流式细胞仪分析。简而言之，将乙醇固定的酵母细胞用柠檬酸钠溶液洗涤并重悬于柠檬酸钠溶液中。依次添加RNase和蛋白酶K，以去除RNA和蛋白质。然后，将Sytox green用于对DNA染色。使用BD LSRII流式细胞仪进行流式细胞术，并使用FlowJo软件分析数据。选通策略在补充图7中进行了描述 。
使用标准方案49进行二维（2D）凝胶分析。用酶解酶处理酵母细胞以产生原生质球。经过细胞裂解和蛋白酶K处理以降解蛋白质后，通过CsCl梯度离心和沉淀纯化DNA。提取的DNA通过Eco RI 消化，并通过琼脂糖凝胶电泳在二维上分离。然后将DNA转移到Hybond-XL膜（GE Healthcare）上，并使用与ARS305，ARS1212或ARS315特异性杂交的探针通过Southern blot分析。补充表3中列出了用于探针扩增的引物 。为了定量，从较短的曝光中获得了1N DNA的信号，而从较长的曝光中获得了DNA中间体的信号，以确保这两种信号均落在PhosphorImager的检测线性范围内。
PFGE使用标准协议50进行。简而言之，将细胞包埋在琼脂糖塞中，球囊化并脱蛋白。将塞子装入0.5X TBE凝胶中，并在Bio-Rad CHEF-DR III PFGE系统上运行15 h，以实现染色体分离。使用标准的毛细管转移技术将染色体转移到Hybond-XL膜（GE Healthcare）上，并使用与XII或IV染色体特异性杂交的探针通过Southern blot分析膜。补充表3中列出了用于探针扩增的引物 。我们注意到，在每个同步的S期时间点检查了相同数量的细胞，并且从图5c中野生型细胞中相似数量的Chr XII和IV可见稳定的负载 。由于染色体复制是通过进入凝胶的染色体信号比率（完全复制）与保留在孔中的信号比率（不完全复制）来评估的，因此结果不受较小的上样量差异的影响。
基因组测序和拷贝数计算使用标准方案进行26。简而言之，野生型和pol2-REL在24°C的G1和S期收集细胞。总之，每个样品的1.5μg基因组DNA均通过KAPA文库试剂盒（iGO设施，Memorial Sloan Kettering癌症中心）生成文库，并通过HiSeq 2500（Illumina）进行测序。每个样品至少产生1000万个50 bp的配对末端读数。将读数定位到S288c参考基因组（SGD，SacCer2），并在排除重复序列后使用Genome Brower将其总计为1 kb的条带。将给定基因座的S期样品的装箱读数除以G1样品的装箱读数，并归一化为总读数的比值，得到全基因组平均值1。从FACS拟合曲线得出S相（图 1c）到特定基因座的相对拷贝数。调整后的副本数图使用LOESS功能进行了平滑处理。为了对DNA起源进行荟萃分析，将DNA序列的拷贝数平均为49，该序列跨越早期起源和晚期起源的上游和下游20 kb 。将原点两侧的未复制区域（副本编号图上的“标记区域”）设置为基线（副本编号= 1）。
收获G1期和S期细胞。请注意，在收获细胞之前，要使用标准规程28检查LC前LC的形成，包括一个温和的交联步骤。简而言之，将培养物与1％甲醛孵育20分钟，然后用120 mM甘氨酸淬灭5分钟。用裂解缓冲液中的玻璃珠打浆破坏细胞，并加入Benzonase消化核酸，然后以20,000 x g离心30分钟， 以获得全细胞提取物（WCE）。用于检查LC前形成的裂解缓冲液包括50 mM HEPES-KOH，pH 7.5、140 mM NaCl，1％TritonX- 100、2 mM MgCl 2和cOmplete TM超无EDTA的蛋白酶抑制剂（Roche）。其他实验中使用的裂解液包括50 mM HEPES-KOH pH 7.5、100 mM KOAc 1％TritonX-100、2 mM MgOAc，2 mM NaF，2 mMβ-甘油磷酸酯，10 mMβ-巯基乙醇和cOmplete TM Ultra EDTA游离蛋白酶抑制剂（Roche）。将WCE与预洗的磁珠（包括抗旗帜磁珠（A2220，Sigma-Aldrich），抗HA磁珠（ThermoFisher Scientific）或IgG Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare）一起在4°C下孵育2小时。对于图 2b顶面板和图 3d中图，Flag或HA抗体加Protein G珠用于IP。洗涤珠子后，用不含DTT的2x Laemmli缓冲液或洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8.0]，10 mM EDTA，1％SDS）洗脱与珠子结合的蛋白质。将蛋白质煮沸5分钟，然后在4-20％梯度凝胶（Bio-Rad）上进行SDS-PAGE，然后转移到硝酸纤维素膜（GE Healthcare）上进行蛋白质印迹。用于探测蛋白质印迹的抗体包括抗Dpb11和抗Cdc45（来自B. Stillman的礼物），抗Psf1（来自K. Labib的礼物），抗Dpb2（来自H. Araki的礼物），抗Mcm2（圣克鲁斯） ，sc-6680），抗Rad53（Abcam，ab104232），抗Flag（Sigma-Aldrich，F1804），抗Myc（Bio X Cell，BE0238），抗HA（Roche，11867423001），过氧化物酶抗过氧化物酶（Sigma-Aldrich，P1291），抗Rnr4（Abcam，抗Tubulin，ab6160）。
使用标准方案进行GCR测定并计算率51，52。为了确保所有实验都在相同的遗传背景下，我们将GCR分析移至W303背景53。对于每种基因型，至少检查了七个培养物。将细胞接种在SC + 5-FOA + Can（FC）和SC板上，以获得分别丢失URA3-CAN1盒和总存活菌落的菌落数。GCR率计算为米/ NT，其中米（1.24 + LN [M]） - NFC = 0 米：突变事件，NFC：菌落上FC板数，NT：形成在SC板菌落。然后得出上下95％的置信区间。该URA3-CAN1分别在dGCR和uGCR分析中将盒式磁带插入YEL072w和YEL068c。突变率是由波动测定法测定54，55。简而言之，将饱和的过夜培养物的稀释液用于确定每种培养物的细胞数，并将其铺板在含有黄花碱的培养基上。生长两天后对突变进行计数，并使用Ma–Sandri–Sarkar最大似然法计算突变率，并计算95％的置信区间。
RPA，RFC，PCNA和Polε使用标准协议30进行了纯化。反应在聚合缓冲液（25 mM Hepes-KOH pH 7.6、10 mM醋酸镁，0.02％NP-40S，60 mM醋酸乙酯，5％甘油）中于30°C进行。反应包含1 nM环状DNA模板（M13mp18 ssDNA，NEB），退火至放射性标记的寡核苷酸（32 P-5 32 -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG），60 nM PCNA，10 nM RFC，400 nM RPA，5 mM ATP，2.5 mM DTT， 0.1 mg ml -1 BSA和100 nM PolεWT或PolεREL。通过向混合物中添加dNTP（每个200μM）来引发聚合酶反应。通过取等分试样并加入50mM EDTA和0.4％SDS在指定的时间停止反应。在0.8％碱性琼脂糖凝胶（30 mM NaOH和2 mM EDTA）上分离反应产物，干燥，并使用Typhoon FLA 7000成像。凝胶图像的定量使用ImageJ软件进行。
使用pARS1（4.8 kb）作为模板进行反应，并如前所述纯化蛋白质30。复制测定的所有步骤均在30°C下进行。首先，通过在由25 mM HEPES-KOH（pH 7.6）组成的缓冲液中孵育10 nM质粒DNA模板，50 nM ORC，50 nM Cdc6和100 nM Cdt1·Mcm2-7，以10μl反应进行Mcm2-7加载。 ，0.02％NP-40、10 mM乙酸镁，5％甘油，100 mM乙酸钾，2 mM DTT和5 mM ATP处理15分钟。然后将DDK添加到125 nM，继续孵育15分钟。通过添加15μl复制蛋白预混液来启动DNA复制，最终浓度为60 nM Sld3·7、80 nM Cdc45、50 nM CDK，80 nM GINS，30 nM Dpb11、80 nM Sld2、120 nM RPA， 60 nM Polα，35 nM Ctf4、20 nM RFC，70 nM PCNA，4 nM Polδ，20 nM Csm3·Tof1、20 nM Mrc1、15 nM Mcm10、30 nM Top1和30 nM Top2。波尔ε浓度WT或polε REL为30nm在图 4e中，或如图1中所示。 4F。最终复制反应也包括0.2毫克毫升-1 BSA，40μM的dATP /的dGTP / dTTP的/的dCTP，200μM各GTP / CTP / UTP，66 nM的α 32 P-的dATP（3000次毫摩尔-1），16毫磷酸肌酸，0.04 mg ml -1肌酸激酶，190 nM乙酸钾，20 mM氯化钠和15 mM氯化钾。30分钟后，通过添加40 mM EDTA，1.6 U蛋白酶K和0.3％SDS终止反应，并将混合物在37°C孵育30分钟。通过苯酚/氯仿提取分离DNA，并用TE缓冲液平衡的G-50离心柱除去未结合的核苷酸。然后将样品在0.8％碱性琼脂糖凝胶（30 mM NaOH和2 mM EDTA）上分级分离，干燥，并使用Typhoon FLA 7000成像。凝胶图像的定量使用ImageJ软件进行。
复制和引物延伸分析中使用的蛋白质经过纯化，接近均质。如下所述修改了以下蛋白质的纯化方案。在所有情况下，携带半乳糖诱导蛋白表达构建体的细胞均在30°C的YP-GL（YP + 2％甘油/ 2％乳酸）中生长至2-4×10 7细胞ml -1。然后加入半乳糖至2％，细胞生长持续4小时。对于Dpb11，通过添加100 ng ml -1将细胞停在G1期3 h在添加半乳糖之前使用α因子。通过离心收集细胞，并用1M山梨糖醇/ 25mM Hepes-KOH pH 7.6洗涤一次，然后如所示用缓冲液进行第二次洗涤。将洗涤过的细胞如所示重悬于0.5体积的各个缓冲液中，并逐滴冷冻在液氮中；所得的爆米花储存在-80°C。将冷冻的爆米花在冷冻机（SPEX CertiPrep 6850冷冻机/磨房）中以6分钟/秒的速度粉碎，以每秒15次撞击的速度进行2分钟。通过以195,000 x g离心45分钟（T647.5转子）将提取物澄清 ，并按照所述方法进行不同类型的纯化。所有蛋白质均等分储存在-80°C。
为了纯化Csm3和Tof1蛋白，将细胞用缓冲液C（25 mM Hepes-KOH pH 7.6 / 0.02％NP-40 S / 10％甘油/ 1 mM DTT）/ 100 mM NaCl洗涤，并重悬于½体积的缓冲液C / 100 mM NaCl /蛋白酶抑制剂，用于制备细胞爆米花。将细胞粉末在冰上解冻，加入一体积的缓冲液C / 100 mM NaCl，并在通过超速离心澄清提取物之前，将所得悬浮液补充200 mM NaCl。可溶性提取物补充有2 mM CaCl 2，并与钙调蛋白亲和珠在4°C下孵育3小时。用10 CV（柱体积）缓冲液C / 300 mM NaCl / 2 mM CaCl 2洗涤珠子，并用6 CV缓冲液C / 300 mM NaCl / 1 mM EDTA / 2 mM EGTA洗脱与珠子结合的蛋白质。合并洗脱液，用等体积的缓冲液C稀释，并在Mono C 5/50 GL色谱柱上使用150–1000 mM NaCl在30 CV上的梯度进行分馏。合并来自Mono Q步骤的峰馏分，并通过在缓冲液C / 300 mM KOA中平衡的Superdex 200凝胶过滤柱，收集峰馏分。
为了纯化Mrc1蛋白，将细胞用缓冲液M（25 mM Hepes-KOH pH 7.6 / 1 mM EGTA / 1 mM EDTA / 0.02％NP-40 S / 10％甘油/0.5 mM DTT）/ 100 mM NaCl洗涤并重悬在½体积的M / 100 mM NaCl /蛋白酶抑制剂缓冲液中制备爆米花。将细胞粉末在冰上解冻，加入一体积的M / 100 mM NaCl缓冲液，并在通过超速离心澄清提取物之前，向所得的悬浮液中补充300 mM NaCl。将澄清的提取物与M2-琼脂糖抗FLAG珠在4°C下孵育3小时。将小珠用10 CV的M / 400 mM NaCl缓冲液洗涤，重悬于M / 400 mM NaCl / 10 mM乙酸镁/ 1 mM ATP缓冲液中，并在4°C孵育10分钟，再用10 CV缓冲液洗涤M / 400 mM NaCl和结合蛋白，用1 CV缓冲液M / 400 mM NaCl / FLAG肽（0.5 mg ml-1），然后加入2 CV缓冲液M / 400 mM NaCl / FLAG肽（0.25 mg ml -1）。合并洗脱液，并用等体积的缓冲液M稀释，并在Mono Q色谱柱上以200–1000 mM NaCl的盐梯度在10 CV上分馏。合并来自Mono Q步骤的峰馏分，并针对25 mM Hepes-KOH pH 7.6 / 1 mM EDTA / 0.02％NP-40-S / 40％甘油/ 150 mM NaCl / 0.5 mM DTT透析。
为了纯化Dpb11蛋白，将细胞用缓冲液D（45 mM Hepes-KOH pH 7.6 / 0.02％NP-40 S / 10％甘油/ 1 mM DTT）/ 100 mM NaCl洗涤，并重悬于½体积的缓冲液D / 100中用于爆米花制备的mM NaCl /蛋白酶抑制剂。将细胞粉末在冰上解冻，加入一体积的缓冲液D / 100 mM NaCl，所得悬浮液补充了另外的200 mM NaCl和0.45％polymin P pH 7.3，并通过超速离心使提取物澄清。澄清的提取物补充有2 mM CaCl 2，并与钙调蛋白亲和珠在4°C下孵育6小时。珠子用10 CV缓冲液D / 300 mM NaCl / 2 mM CaCl 2洗涤，并用10 CV缓冲液D / 300 mM NaCl / 1 mM EDTA / 2 mM EGTA洗脱珠结合蛋白。合并峰级分，用缓冲液D / 150 mM NaCl透析，并在Mono C 5/50 GL色谱柱上分级，盐梯度在20 CV范围内为150-1000 mM NaCl。合并来自Mono Q步骤的峰馏分，旋转浓缩，并在缓冲液D / 300 mM KOAc中平衡的Superdex 200凝胶过滤柱上进行分馏，以收集峰馏分。
为了纯化Sld2蛋白，将细胞用缓冲液S（25 mM Hepes-KOH pH 7.6 / 0.02％NP-40 S / 10％甘油/ 1 mM EDTA / 1 mM DTT）/ 100 mM KCl洗涤，并重悬于½体积的S / 100 mM KCl /蛋白酶抑制剂缓冲液，用于爆米花制备。将碎的细胞粉末在冰上融化，加入一体积的S / 100 mM KCl缓冲液，并在通过超速离心澄清提取物之前，向所得悬浮液中补充400 mM KCl。将澄清的提取物与M2-琼脂糖抗FLAG磁珠在4°C孵育1小时。用10 CV缓冲液S / 500 mM KCl洗涤珠子，并用1 CV缓冲液S / 500 mM KCl / FLAG肽（0.5 mg ml -1）洗脱珠结合的蛋白，然后用2 CV缓冲液S / 500 mM洗脱。 KCl / FLAG肽（0.25 mg ml -1）。合并峰级分，用缓冲液S / 350 mM KCl透析，并等分保存。POLε WT如前所述纯化30而是从异步细胞。POLε REL相同地进行纯化，POLε WT。
|
|
