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单克隆抗体制备-主要试剂

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发表时间:2019-07-05 16:54作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

单克隆抗体制备主要试剂的配制

a、 细胞培养基 杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640DMEMDulberco Modified Eagles Medium)两种基础培养基,具体配制方法按厂家规定的程序,配好后过滤除菌(0.22um),分装,4保存。不完全RPMI-1640培养基:RPMI-1640培养基原液96ml;100×L.G.溶液1ml;双抗溶液1ml;7.5% NaHCO3溶液1-2ml;HEPES溶液1ml;不完全DMEM,DMEM 13.37g;超纯水或四蒸水980ml;NaHCO3 3.7g;双抗溶液10ml;100×L.G.溶液10ml;1N HCl调试PH7.2-7.4,过滤除菌,分装4保存。完全RPMI-1640DMEM培养基:不完全RPMI-1640DMEM培养基80ml;小牛血清15-20ml;用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。HT培养基:完全RPMI-1640DMEM培养基99ml;HT贮存液1ml;•HAT培养基:完全RPMI-1640DMEM培养基98ml;HT贮存液1ml;A贮存液1ml;

b、 氨基喋呤(A)贮存液(100×4×10-5mol/L: 称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin MW 440.4),溶于90ml超纯水或四蒸水中,滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和,再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20保存。

c、 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10-2mol/LT1.6×10-3mol/L): 称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2),加超纯水或四蒸水至100ml,置45-50水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20冻存。用前可置37加温助溶。

dL-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×0.2mol/L: 称取2.92g L-谷氨酰胺(L-glutamineMW 146.15),用100ml不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20冻存。

e、 青、链霉素(双抗)溶液(100×: 取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g,溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20冻存。

f7.5% NaHCO3溶液 : 称取分析纯NaHCO3 7.5g,溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),盖紧瓶塞,4保存。

gHEPES溶液(1mol/L: 称取23.83g HEPESN-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acidN-2-羟乙基哌嗪- N-2-乙基磺酸,MW 238.3)溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),4保存。

h8-氮鸟嘌呤贮存液(100×: 称取200mg 8-氮鸟嘌呤(8-azaguanineMW 152.1),加入4mol/L NaOH 1ml,待其溶解后,加入超纯水或四蒸水99ml,过滤除菌;分装小瓶,-20冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中(即终浓度为20ug/ml)。

g. 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分钟,然后用自来水洗去染液,自然干燥。(Giemsa染液配方:Giemsa0.5g,甘油33ml55-60保温2小时,加甲醇33ml混匀,保存于棕色瓶内作为原液;取原液1份,加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份,即成10% Giemsa染液)。

h. 镜检:选择染色体分散好,无重叠,无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞,并注意观察是否有标志染色体。

i50% PEG: 称取PEG 1000 4000 20-50g于三角瓶中,盖紧,60-80水浴融化,0.6ml分装于青霉素小瓶中,盖紧,8磅高压蒸汽15分钟,-20存放备用。临用前加热融化,加等量不完全培养基,用少许7.5% NaHCO3PH8.0,或购买SigmaGibco公司现成产品。   


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