尽管人们越来越了解MLL重排白血病的生物学特征，但针对这种白血病的靶向治疗仍然难以捉摸，临床结果仍然令人沮丧。MBNL1，一种参与选择性剪接的蛋白质，在MLL重排的白血病中一直过表达。我们发现MBNL1丢失显着损害鼠类和人类MLL重排的白血病的体外和体内传播。通过对我们的实验系统进行转录组分析，我们发现在白血病细胞中，MBNL1调节几种基因的替代剪接（主要是内含子排斥），包括MLL重排的白血病发生所必需的那些基因，例如DOT1L和SETD1A。我们最终表明，使用MBNL1的小分子抑制剂可以实现选择性白血病细胞死亡。这些发现为MLL重排的白血病中的新治疗靶标提供了基础，并进一步证实了靶向治疗中的新兴范式，即通过靶向选择性必需的RNA结合蛋白来破坏癌症特异性剪接程序。
的混合系白血病（的倒数染色体易位MLL有超过70融合配偶体之一）的基因在侵蚀性白血病，包括婴儿白血病的子集，通常发现，并且与不良预后相关联1，2，3。无论融合伴侣和白血病的类型（急性髓性白血病（AML）或急性淋巴细胞白血病（ALL））所有MLL重排的白血病共享共同的基因的表达谱是从非的不同- MLL重排的白血病4，5。对MLL重新排列的特征进行分析后发现，肌肉盲样1（MBNL1）是MLL重排的白血病中最一致过表达基因相比其它白血病之一3，4，5，6。
的muscleblind样1（MBNL1）是已被证明是调节RNA剪接，本地化和完整性的RNA结合蛋白7，8，9，10，11。前mRNA的可变剪接是通过扩大基因组编码多样性来调节真核基因表达的关键机制。以前已经证明MBNL1可以调节心脏，肌肉和大脑在胎儿到成人过渡过程中的可变剪接9。由于与营养不良性肌强直蛋白激酶（DMPK）中扩展的poly-CUG重复结合而导致MBNL1的隔离mRNA是1型强直性肌营养不良症（DM1）发病机理的主要贡献者，该综合征以肌肉无力，心脏异常，智力残疾和白内障为特征。MBNL1的隔离导致靶标mRNA的错配，导致临床特征12。此外，已知MBNL1和MBNL2在调节控制胚胎细胞多能性13的可变剪接事件的模式中起着核心作用。小鼠胎儿肝细胞中的Mbnl1敲低导致Ndel1 mRNA 14选择性剪接的解除，从而导致终末红细胞生成受阻。
在RNA加工，特别是剪接异常，已与癌症相关，包括AML和ALL）剪接突变独立15，16，17，18，19。上述在MLL重排的白血病中MBNL1表达的增加，以及MLL融合复合物直接结合MBNL1启动子20的证据，表明MBNL1介导的RNA剪接可能对MLL重排的白血病的发病机理很重要。然而，在MLL重排的白血病发生过程中MBNL1的作用机理和必需程度尚不清楚。
在本报告中，通过功能基因组学研究，药理学抑制作用和替代剪接的综合分析相结合，我们证明了MBNL1在MLL重排的白血病中是必需的。
以确认的相关性MBNL1表达MLL重排的白血病，我们首先相比鉴定差异表达之间MLL重排的和MLL-野生型白血病基因的多个基因表达研究4，6，21，22。我们首先检查了这些基因表达特征的交集，发现MBNL1表达是跨越急性髓样和淋巴细胞白血病的这些特征的共同特征（图 1a）。我们进一步检查了评估AML和ALL的两个主要原发性患者数据集的MBNL1表达，并始终发现MBNL1高MLL重排的患者样品中表达23，24，25，26，27，28（补充图 1A-C ）。随后，我们通过定量RT-PCR（qRT-PCR）分析了人白血病细胞系中MBNL1的表达水平。我们在所有测试的白血病细胞系中发现了MBNL1表达，在MLL重排的细胞系中MBNL1表达最高（图 1b）。此外，与正常CD34 +相比，用MLL-AF9（MA9）癌基因转化的人CD34 +脐带血显示更高水平的MBNL1表达脐血细胞（补充图 1D）。在用MA9逆转录病毒转导的Lin-小鼠骨髓细胞中观察到了类似的现象（补充图 1E）。MBNL1最近被证明是源自患者的ALL细胞系和MLL-AF4融合蛋白的直接靶标。实验逆转录病毒模型20，29。为了确定该观察结果是否适用于带有不同MLL融合伴侣的白血病细胞，我们分析了MLL融合蛋白（MLL-N和融合伴侣C末端，如果适用）和H3K79me2染色质免疫沉淀，然后进行了深度测序（ChIP-seq）数据集THP-1 30和ML-2 31细胞系（分别带有MLL-AF9和MLL-AF6），以及来自带有MLL-AF4融合体的MV4; 11 30，RS4; 11 32和SEM 33细胞系。我们发现MLL-N / fusion-C与MBNL1启动子和基因体结合的证据，以及所有研究的细胞系中H3K79me2富集的现象（图 1c）。为了在实验上验证MLL融合蛋白之间的观察到的互动MBNL1，我们使用转化的人CD34 +细胞轴承阻抑MA9致癌基因，其中多西环素治疗阻抑MA9表达34，35。以不同间隔分离的核提取物显示MBNL1减少表达与MA9下调直接相关（图 1d）。
a与其他MLL野生型白血病相比，已发表的基因表达特征的交集，其中包括在MLL重排的AML和ALL中过表达的基因。b的相对表达MBNL1非MLL重排的（霞-1，HL60和K562）细胞系和MLL重排的（THP-1，RS4; 11，MOLM13和MV4; 11），归一化到CD34 +脐带血表达。数据来自三个生物学重复。条显示平均值±SD。c表达不同MLL融合蛋白的人AML和ALL细胞系的ChIP-seq轨迹。ChIP-seq数据是从ML-2的GSE95511，MV4; 11和THP-1的GSE79899，RS4; 11的GSE38403和SEM的GSE38338获得的。d免疫印迹法分析MLL-AF9 Tet-off人类CD34 中MBNL1的水平+细胞。在强力霉素治疗后的第0、2和6天分析了核蛋白水平。Lamin B1用作加载控件。显示了代表性的蛋白质印迹，进行了两次生物学重复。
然后，我们在人白血病细胞系中进行了MBNL1的短发夹RNA（shRNA）敲低研究，以测试其对白血病细胞生长的需求。我们筛选了可商购的慢病毒shRNA，并选择了两种表现出最一致和最有效的MBNL1 mRNA（补充图 2A）和蛋白质（图 2a）敲低的功能，以下分别称为shMBNL1-64和-65。在液体培养（图2b–d）和集落形成单位（CFU）分析（补充图 2B–C）中，MBNL1敲低后 ，MLL重组细胞系均具有明显的生长抑制作用。但是，MBNL1尽管有效的敲除，敲除并没有显着影响携带多种不同的肿瘤灌注（K562中的BCR-ABL，Kasumi-1的RUNX1-RUNXT1）的非MLL重排的白血病细胞（图 2e–g）的生长（补充图 2D） –H）。
使用两个不同的shRNA（shMBNL1-64，shMBNL1-65）进行MBNL1敲低的蛋白质水平作用。显示了代表性的蛋白质印迹，进行了两次生物学重复。b – g敲除MBNL1的 shRNA后白血病细胞的体外生长。数据来自三个技术重复。显示的数据适用于MOLM13（b），RS4; 11（c），MV4; 11（d），Kasumi-1（e），HL-60（f）和K562（g）细胞。第0天是指通过分选分离转导的细胞的天。通过使用锥虫蓝计数活细胞来评估细胞生长。数据代表平均值±SD。MBNL1通过qRT-PCR确认了基因敲低（补充图 2A，D–H）。h非靶向（NT）和MBNL1基因敲除（MBNL1-64）移植的MLL-AF9和MLL-AF10原代患者细胞的移植结果（散点图，平均±SD）。骨髓细胞收集来自小鼠的（Ñ = 4在MLL-AF9 shMBNL1-64组小鼠，Ñ 在所有其它基团= 5只小鼠）在白血病病的时间。左边的图显示了人CD45 +细胞的百分比，右边的图显示了CD45 +馏分中维纳斯阳性细胞的百分比。P值表示通过未配对的两尾t检验在shNT和shMBNL1条件之间的比较。一世用赋形剂或500 µM小分子抑制剂处理CD34 +脐血细胞和MV4; 11人白血病细胞18 h，并评估其凋亡。代表性的密度图显示了活细胞上膜联蛋白V和7-AAD染色门控的流式细胞仪分析。j图表显示了在不同细胞系中抑制剂对赋形剂处理后18 h，通过流式细胞术（Annexin V / 7AAD）的相对细胞活力。在赋形剂处理的细胞中，生存力标准化为100％。数据代表3-5个生物学重复。误差棒显示平均值±SD。* p = 0.0465；◆ p = 0.0173；∇ p = 5.47e-5; • p = 4.57e–6，不成对的两尾t试验比较每种细胞系的媒介物与抑制剂。
为了确定体内白血病对MBNL1的需求，我们转导了两个带有shMBNL1-64或非靶向（NT）对照的带有MLL融合的主要患者AML样本（一个MLL-AF9和一个MLL-AF10）。转换效率为67％至85％（Venus +）。将大量细胞移植到免疫缺陷的NSGS小鼠中。在可见疾病发生时，所有小鼠的骨髓均显示出强大的人类细胞植入（MLL-AF9组为92.4％至99.4％，MLL-AF10组为7.6–40.2％）。移植了shNT转导细胞的小鼠的骨髓中含有金星+细胞（占所有人类细胞的6.9–78％），而大多数移植了shMBNL1-64的小鼠实际上没有金星+部分（图 2h））。一只移植有shMBNL1-64-转导的MLL-AF9患者细胞的小鼠的金星+为62.4％；在qRT-PCR分析显示缺少MBNL1敲除后，将该小鼠从分析中删除。为了显示敲除的广泛适用性，我们使用MLL-AF9 / NRAS G12D细胞系重复了该实验，结果相似（补充图 3A–C）36。这些数据表明MBNL1对于体内白血病的传播至关重要。
作为一种替代方法，我们测试了通过生物化学方法实现的MBNL1抑制作用。最近，在高通量筛选中发现了一种可抑制MBNL1与其靶标结合的MBNL1特异性抑制剂，可在强直性肌营养不良症中起作用37。我们测试了该化合物对MLL重排的（MV4; 11，MOLM13）和非MLL重排的白血病细胞系（HL-60，K562，Kasumi-1）以及正常CD34 +的作用脐带血细胞。将细胞与各种浓度的抑制剂孵育（基于先前的实验）。白血病细胞对抑制剂的治疗很敏感，这在各种白血病细胞系中都在18小时内细胞活力下降。尽管达到观察到的效果需要高浓度，但是MLL重排的白血病细胞显示出对该化合物的相对较高的敏感性（图 2i，j）。
作为表征MBNL1在MLL重排的白血病中必不可少的补充手段，我们使用了Mbnl1基因消融的小鼠模型。对于这些实验，我们使用了缺少Mbnl1外显子3（由Maurice Swanson博士提供）38的 Mbnl1 ∆E3 / ∆E3（Mbnl1 -/-）KO小鼠。我们转导了Mbnl1 -/-和同窝对照（Mbnl1 + / +）带有MLL-AF9 GFP的逆转录病毒34阴性的骨髓细胞。转导后四天，Mbnl1 + / +和Mbnl1 -/-将细胞在半固体培养物中接种至少两周，以选择转化的细胞，然后将其移植到经同基因辐照的小鼠中（图 3a）。根据脾脏肿大，外周血白细胞计数升高以及骨髓和脾脏中白血病细胞浸润的存在，将剖腹产动物定为白血病。在这些实验环境中，移植了转化的Mbnl1 + / +细胞的小鼠发生白血病，中位时间为84天。但是，移植了转化的Mbnl1 -/-细胞的小鼠在移植后123天表现出显着延长的潜伏期和无白血病存活（图 3b）。）。两组均显示出相当水平的脾肿大，高白细胞计数，贫血和血小板减少。为了表征Mbnl1丢失对体内白血病起始细胞的影响，我们使用了患病原代小鼠的脾细胞进行了二次移植到受辐射的宿主中。与我们的初次移植实验相似，与第二次移植Mbnl1 + / +白血病细胞的小鼠（49天）相比，Mbnl1 -/-白血病细胞的次要受体表现出更长的无白血病生存期（65 天）（图 3c）。Mbnl1 -/-的CFU活性的体外研究与Mbnl1 + / + MLL-AF9转化的细胞相比，在连续重铺试验中来自原代或次要受体的骨髓或脾脏的MLL-AF9转化的细胞显示菌落数无显着差异。这些结果表明，尽管逆转录病毒表达的MLL-AF9融合基因可以在缺乏Mbnl1的情况下引发白血病，但疾病的发展却大大延迟了。
一个小鼠白血病模型的方案。用表达MLL-AF9 GFP的逆转录病毒转导野生型（WT）或敲除（KO）谱系阴性骨髓细胞，然后在半固体培养基中进行连续重铺以选择MLL-AF9细胞。然后将选定的细胞移植到受辐照的原代受体小鼠中（ 每组n = 10）。b图代表原代受体小鼠的无白血病存活百分比。 通过双面对数秩（Mantel-Cox）测试，*** p = 0.0003。c处死受苦的移植后12周的原代小鼠，收集脾细胞并铺板进行CFU分析。在半固态培养中7天后，将脾细胞注射到第二次照射的受者中（n =每组5只小鼠）。该图描述了无白血病生存的百分比。** p = 0.0088，采用双面对数秩（Mantel-Cox）测试。
为了确定Mbnl1在正常小鼠造血中的作用，我们研究了Mbnl1 -/-小鼠。在稳定状态下，Mbnl1 -/-小鼠和Mbnl1 + / +对照表现出相当的外周血细胞计数，骨髓细胞密度以及祖细胞和干细胞计数。为了测试Mbnl1在应激性造血中的作用，我们向Mbnl1 -/- KO和Mbnl1 + / +野生型（WT）小鼠注射了一次致死剂量的5-氟尿嘧啶（5-FU）。与对照组相比，从Mbnl1 -/-小鼠恢复红细胞，血小板和白细胞的时间没有差异（图 4a））。接下来，我们测试了在连续（非竞争性）移植过程中，作为干细胞活性的函数，骨髓细胞重新注入致死性照射的受体的能力。移植后骨髓和外周血的分析未发现Mbnl1 + / +或Mbnl1 -/-骨髓的主要受体之间的供体嵌合性有任何显着差异（图 4b–d）。类似地，各组之间外周血中细胞谱系的分布是相同的（图 4e）。对继发接受者的骨髓分析还显示，Mbnl1 + / +和Mbnl1 -/-之间的供体嵌合水平没有差异。小鼠（图 4c）。总体而言，这些数据表明，在没有Mbnl1的情况下，鼠的造血系统在稳定状态下正常运行。
一个 MBNL1野生型（WT）和纯合的敲除（KO）小鼠（每组五只小鼠）用5-氟尿嘧啶（150毫克/千克）处理，并评估血细胞比容，WBC水平和血小板每4-5天。线图表示平均值±SD。b代表性密度图显示了非竞争性移植后12周（原门覆盖在CD45.2阳性CD45.1阴性供体细胞上）的主要受体骨髓供体嵌合的流式细胞仪分析。c移植后第12周，初次和二次移植受者的骨髓供体嵌合。条形显示平均值±SD（ 每组n = 5只小鼠）。d非竞争性移植后12周初次接受者的外周血供体嵌合性分析。条形显示平均值±SD（ 每组n = 5只小鼠）。e非竞争性移植后4或8周，流式细胞仪分析淋巴样（CD3e和B220）和髓样（GR-1）谱系中的外周血细胞。条形显示平均值±SD（ 每组n = 5只小鼠）。f代表性密度图显示了竞争性移植后12周（对CD45.2阳性的CD45.1阴性的供体细胞的门控）对供体嵌合体的流式细胞仪分析。g图代表随着时间（水平轴）竞争性移植后的外周血供体嵌合。线图表示平均值±SD（n =每组5只小鼠）。h竞争性移植后4周或16周，流式细胞仪分析淋巴样和髓样谱系中外周血细胞的表达。条形显示平均值±SD（ 每组n = 5只小鼠）。我在LSK-SLAM +群体MBNL1 WT VS KO小鼠，表示为所有分析的细胞的级分。（ 每组n = 4只小鼠。）* p = 0.0161，采用不成对的两尾t检验；误差棒表示平均值±SD。j实验组之间LSK-SLAM +定量的代表性流程图。
为了更严格地比较Mbnl1敲除和野生型造血功能，我们进行了竞争性移植实验。接受Leth照射的BoyJ受体小鼠以1：1的比例移植了Mbnl1 -/-或Mbnl1 + / +骨髓细胞（CD45.2）以及CD45.1竞争者骨髓细胞。移植后四周，通过外周血流式细胞术检测了移植细胞的CD45.1与45.2的再增殖能力。骨髓分析显示，在移植了Mbnl1 + / +或Mbnl1 -/-骨髓细胞的小鼠中，CD45.2供体嵌合率分别为73.8％和30.3％（图 4f））。每4周对外周血嵌合体进行的定期分析显示，移植了Mbnl1 + / +骨髓细胞的小鼠的供体嵌合性略有增加，而移植了Mbnl1 -/-骨髓细胞的小鼠的供体嵌合体则保持稳定（图 4g）。外周血谱系的分析表明，在竞争性移植中，Mbnl1 -/-骨髓产生T淋巴细胞的能力有所延迟，而Gr1 +髓样细胞的繁殖水平可与Mbnl1 + / +相当（图 4h）。这些数据表明Mbnl1的缺点-/-细胞在竞争性移植的应激条件下，在竞争性移植期间Mbnl1 -/-骨髓产生T淋巴细胞的能力存在特定缺陷。为了确定该观察结果的病因，我们对Mbnl1 -/-小鼠的HSC隔室进行了表征，发现Mbnl1 -/-小鼠的Lin - Sca1 + Kit + -SLAM +（CD41-CD48-CD150 +）HSC的比例与WT小鼠（图 4i，j）。尽管如此，这些实验证明这些处于稳态的小鼠没有出现严重的造血功能障碍，这表明正常造血过程中可以耐受Mbnl1的损失。
之一的MBNL家族蛋白的最佳已知的，并探索功能是靶mRNA的选择性剪接7，13，39，40，41。我们试图确定规范的MBNL1靶标是否在具有不同MBNL1表达程度的白血病细胞之间表现出不同的同工型使用模式。我们选择的基因ATP2A1和CD47，这已被证明是由MBNL1多能干细胞分化期间被调节41，以及INF2，这是由于在三核苷酸重复障碍Fuchs的内皮角膜营养不良MBNL1封存misspliced 42。在比较这些基因在MLL野生型和MLL重排的白血病之间的同工型表达谱时，我们发现了MBNL1表达高的MLL重排的白血病细胞株中同工型利用率的变化（图 5a）。此外，在MLL重排的细胞系中MBNL1敲低导致mRNA同工型表达的改变类似于MBNL1低细胞系的表达（图 5b）41。如上所述，用化合物1抑制MBNL1的药理作用导致MBNL1靶基因的可变剪接发生类似变化（图 5c））。有趣的是，这些结果表明，MBNL1的至少某些靶标是以组织不可知的方式剪接的，并且在白血病细胞中MBNL1敲低后，与高MBNL1表达相关的同工型表达模式被逆转。这些数据为我们的MBNL1抑制剂的靶向活性提供了进一步的证据。
一个的选择MBNL1调节的基因区域（的RT-PCR分析INF2，ATP2A1，和CD47）跨MLL重排的和野生型的白血病细胞的面板。b的RT-PCR分析INF2，ATP2A1，和CD47转录物证明在剪接模式变化MOLM13细胞后MBNL1击倒。标出了频段百分比（相对于每个单独的车道）。C在指定剂量的化合物1处理48小时后，显示了MBNL1目标基因的替代剪接模式。与相应频段相邻的以十进制表示的每个AS功能的相对比例。所有的凝胶都是两个生物学重复的代表性图像。
作为MBNL1活性的另一项衡量标准，我们研究了MBNL1本身中外显子利用的差异。具体而言，MBNL1促进其自身成熟转录本43中外显子5的排斥。因此，我们假设MBNL1的更高表达将与更大比例的MBNL1转录本相关，外显子5被排除在外。实际上，定量分析显示，与非MLL重排的白血病相比，MLL重排的白血病中外显子5排除的转录物比例更高（补充图 4A）。总体而言，这些数据表明，至少一些假定的MBNL1靶标在不同细胞类型之间是一致的，并且高MBNL1表达与MLL重排白血病中MBNL1选择性剪接增加有关。
为了确定MBNL1的特异性靶点，我们在MLL重排的两个白血病细胞系（MOLM13，MV4; 11）中对MBNL1进行了敲除，并将这些结果与MLL重排的Leucegene财团的数据进行了比较患者AML骨髓样本44。对于这些分析，我们比较了具有MLL肿瘤灌流的患者样本与细胞遗传学正常（CN）AML患者，以及非靶向shRNA对照与MBNL1基因敲除（NT）。与其他AML数据集相似，我们发现MBNL1在源自Leucegene队列和可比分类的健康对照造血祖细胞的RNA-seq中的MLL重排AML中诱导程度最高（图 6a）。
根据基因/细胞遗传学定义的亚型和分选的细胞群，成人AML患者样本中的MBNL1基因表达水平。b当比较Leucegene AML诊断患者的RNA-Seq样本与先前报道的MLL肿瘤同细胞遗传正常患者（CN-AML）进行比较时检测到的其他剪接事件类型的分类，或从带有MLL-AF9核型的MLM13 AML细胞转染获得的事件MBNL1（sh64）的短发夹RNA与shRNA对照（NT）的比较。分别显示了显示外显子包涵与外显子包涵增加的剪接事件。c SashimiPlot说明内含子保留增加和MLL相互作用蛋白的盒式剪接DOT1L，在MBNL1敲低细胞（shRNA构建体64）中产生替代的，可能的截短的亚型。外显子编号定义基于AltAnalyze Ensembl 72定义。d，e使用两个单独的针对MBNL1的短发夹RNA ，与来自两个不同的MLL重排的细胞系（MOLM13（d），MV4; 11（e））相比，来自MLL oncofusion患者样品的替代剪接事件重叠（sh64，sh65）。标注突出显示了Leucegene MLL与CN-AML和shMBNL1与shNT比较之间反一致发生的剪接事件的数目，或AS事件在相同方向上发生的事件（shMBNL1-64和-65重叠）。一致性百分比显示在每个重叠项的旁边。在两个维恩图之间指示了MV4; 11（sh64）和MOLM13（sh65）之间的一致性。f与不同的AML遗传/细胞遗传亚型相关的剪接标记，先前的剪接因子敲除标记和造血细胞类型相对于MBNL1敲除的无偏比较。使用同一管道确定MBNL1敲低和与MLL重排相关的剪接事件时使用了剪接签名。与之相似MBNL1组合式拼接签名（在MOLM13中特别是shMBNL1-64）以拼接一致的方式显示，类似于（d）和（e），表示Y轴上每个签名共有的拼接事件数。50％的一致性代表随机重叠。对于每组，n代表成对比较的次数（即，Leucegene融合/分子突变的AML与CN-AML，ENCODE的RBP敲除与非靶向对照，造血细胞类型与干/祖细胞或shMBNL1与非靶向控制g从CisBP-RNA数据库中统计定义的RNA结合蛋白RNA识别元件（基序）的统计富集（z得分），以与MBNL1基因敲除（sh64）交替拼接外显子和内含子区间，而差异基因表达的富集（z得分） ）。h Leucegene MLL与CN-AML中所有重叠的替代剪接事件的热图以及在MOLM13细胞中MBNL1（sh64）的敲低观察到的热图，并标出了与癌症相关的基因（ToppGene数据库）。红色对勾表示从MultiPath-PSI预测的内含子保留事件。
尽管主要患者样品的实验设置与细胞系中的敲低存在差异，但我们假设MBNL1的主要影响可能是转录本的选择性剪接，因为它在剪接调控中的作用已明确定义。我们申请剪接事件和内含子保留分析称为多径-PSI（AltAnalyze）对患者和最近开发的方法MBNL1敲除细胞系数据45，46。通过事件类型对这些数据集中的可变剪接和启动子事件进行分类，发现与CN-AML相比，MLL重排的白血病主要表现出保留内含子的排斥（图 6b）， 最佳）。我们观察到MBNL1敲除和对照之间的MOLM13细胞存在相似的差异，其中MBNL1的丢失主要与内含子保留增加和盒式外显子包涵体减少相关（图 6b，底部）。相对于Leucegene中明确定义的AML剪接因子突变和肿瘤融合，这种内含子保留排斥谱在MLL重排的白血病中占主导地位，而在核心结合因子重排（RUNX1，CBFB-MYH11）中程度较小（补充图。 5A）使用IGV 对MBNL1敲低的AS事件进行目视检查很容易证实了这些生物信息学预测（图 6c）。通过将MBNL1敲低发生的剪接变化与发生在MLL重新安排的患者队列中的AS事件进行比较，可以确定一组共同调控的事件。这些体内和体外比较的相交发现，MLL重排的患者样品与体外MBNL1敲低样品之间89％的共享AS事件呈负一致（例如，外显子/内含子内含物的对立模式），即保留了特定的替代特征在MBNL1剔除条件下排除了MLL重排的患者数据，反之亦然。在不同细胞系的AS事件中，多个针对MBNL1的短发夹表现出高度的一致性（> 96％）（图 6d，e；补充数据 1）。）。手动检查这些剪接事件证实了MBNL1敲除可以挽救与MLL融合相关的剪接和内含子保留事件（补充图 6A，B）。这些数据表明MBNL1丢失部分解释了发生在MLL重排白血病中的特定AS事件的变化。鉴于体内和体外重叠剪接事件的数量相对较低，我们更广泛地研究了主要的遗传/细胞遗传学定义的AML亚型中MBNL1敲低AS事件的一致性，包括K562或HepG2细胞中近500个剪接因子敲低（ENCODE; DNA元素百科全书）和正常的造血细胞类型。在这些比较中，MLL重排的AML被证明是与MBNL1高度反一致性的击倒，与非MLL 重新排列的MBNL1击倒（在K562细胞中）最为一致（图 6f；补充数据 2）。尽管其他RNA结合蛋白（RBP）的shRNA与MBNL1具有一致的AS，表明它们调控共同的靶标或受MBNL1下游调控，但MBNL1的结合位点在MBNL1敲除AS事件中最丰富，类似于MLL。 -重排的剪接事件（图 6g，补充图 5B）。
我们随后检查了一致的AS决策，并注意到它们在小GTPase介导的信号转导的调节剂（RHOC，RHPN1，DLG4，ARHGEF40，ARHGEF1，DENND4B，ARHGAP17，ARAP1，DNM2），Notch信号调节剂（NCOR2， NUMB，AA2）和介导膜运输和囊泡介导的转运的基因（BICD2，REPS1，SCARB1，SEC16A，DENND4B，AAK1，AP1G2，EXOC1，EXOC7，GOLGA2，DNM2）（图 6h）。此外，我们一致地确定了与MLL重排白血病的发病机制有关的关键基因（SETD1A和DOT1L）的错配（特别是内含子保留）（图 6h））。既DOT1L和SETD1A是已知在MLL白血病程序执行基本功能组蛋白甲基47，48，49。我们假设，该可变剪接的目标，我们确定，参与MLL重排的白血病的发病机制中的基因中断47，50例如DOT1L和SETD1A可以解释生长抑制，我们观察到。我们首先通过实验验证并分析了我们的分析所确定的剪接预测。的确，使用跨越预期剪接点的引物进行RT-PCR证实了我们RNA序列分析所预测的AS事件（图 7a）。）。我们还使用MBNL1特异性抗体进行了RNA免疫沉淀，发现与对照IgG相比，沉淀的RNA 中DOT1L和SETD1A转录物大量富集（图 7b），表明MBNL1直接与我们鉴定的差异剪接转录物相互作用。这些剪接变化导致蛋白质水平的影响，MBNL1敲低后，总蛋白质减少或DOT1L和SETD1A的蛋白质同工型发生变化（图 7c））可能主要归因于在保留的内含子中掺入过早终止密码子而引起的无义介导的衰变。我们随后在较晚的时间点对MBNL1敲低的MOLM13细胞进行了RNA测序，原因是如果在太早的时间点进行分析，组蛋白甲基转移酶的剪接变化和改变可能不会立即反映在基因表达中。我们在敲除后的第12天设法收集了足够的RNA进行分析，发现与4天的时间点相比，差异表达基因的数量显着增加（图 7d；补充数据 3）。通过基因集富集分析（GSEA）51在第12天的敲低信号中，我们发现与MLL白血病计划的中央介质（特别是HOXA9 52和糖原合酶激酶3）的摄动或破坏相关的基因集显着相应的双向富集，先前由Wang等人证明其是MLL白血病发生所必需的等 53，54（图 7E）。总之，这些结果表明，MLL重排的白血病中MBNL1的丧失导致了一种类似于MLL白血病程序主要成分的破坏状态，最终导致白血病细胞死亡。
一个 RT-PCR证明在替代剪接位点在内含子保留所述预测增加DOT1L和SETD1A之后转录在细胞MOLM13 MBNL1击倒。对于DOT1L，肌动蛋白用作加载对照，仅当保留内含子时才出现引物产物（“内含子内含带”）。显示了代表性的凝胶图像，进行了两次生物学重复。b来自RNA免疫沉淀测定的qRT-PCR结果评估了MBNL1沉淀的RNA 中DOT1L和SETD1A转录本的富集。误差棒显示平均值±SD。数据来自MOLM-13的三个生物学重复和RS4; 11的两个生物学重复。c敲低MBNL1后MOLM13和MV4; 11细胞的Western印迹，表明DOT1L和SETD1A蛋白水平发生了变化。显示了代表性的蛋白质印迹，进行了两次生物学重复。SETD1A图像代表在单独的印迹上并行运行和处理的相同样品。d敲除后第4天（左）和第12天（右）代表MOLM13细胞中差异表达基因的火山图。X轴阈值代表表达的1.5倍变化；Y轴阈值表示p ＜0.01。通过经验贝叶斯两尾调节的t检验确定差异表达的基因。Ë差异表达的基因显著正电和带负由GSEA对应与必要MLL白血病过程扰动的基因集富集的（即，HOXA9，上GSEA曲线; GSK3，低级地块）富集得分，p值和错误发现率q根据先前发布的计算值51。
上述我们的发现证明MBNL1对于MLL重排的白血病细胞生长至关重要，而对于正常的造血作用仅适中。我们还证明了使用新型生物信息学分析的是MLL重排的白血病表现出被部分时的敲低反转的mRNA同种型的利用的唯一模式MBNL1，表明MBNL1 -介导的选择性mRNA剪接模式有助于MLL重排的白血病的发病机制。
MBNL1是公知的调节RNA的可变剪接，本地化和衰减7，8，9，10，11，虽然它在疾病发病机理的作用的理解已经在很大程度上局限于DM1和Fuchs的角膜内皮营养不良42，55。最近，蛋白质MBNL已经报道了以控制的胚胎干细胞和胎儿红细胞生成终端的多能性，以及13，14，暗示它们的活性在一定程度上在造血系统。在检查MLL白血病的基因表达谱结果时，我们鉴定了MBNL1它是该家族中白血病家族中最一致表达的基因之一，无论其谱系如何，甚至比HOXA簇基因都高。这可能是由于这样的事实：即使在MLL重排的白血病HOXA基因表达可以是高度可变的，尤其是在预-B ALL 6，56，57。因为我们寻求在粒细胞白血病和淋巴细胞白血病中基因过表达的共性，所以这可以解释为什么HOXA簇基因在我们检查的每个数据集中都不能始终过量表达。
我们的RNA-seq和剪接分析结果表明MBNL1在MLL重排的白血病中的主要功能是通过选择性剪接，并且使用我们的方法鉴定出的许多选择性剪接基因与白血病发生有关，包括表观遗传调节子如H3K79甲基转移酶DOT1L和SET1组蛋白甲基转移酶复合成员和细胞周期蛋白K调节剂SETD1A。MBNL1敲低后的频繁剪接结果是内含子保留，而MBNL1敲低似乎通常会逆转内含子的排斥。我们的发现表明，通过MBNL1的 MLL融合蛋白过度表达，促进通常通过内含子保留引入的过早终止密码子抑制的蛋白质编码基因的表达。MBNL1基因敲低对细胞生长的负面影响很可能是多个转录物（及后续蛋白质）受到影响的净影响，而不是仅由单个基因产物的可变剪接引起的。最终，由于缺乏可量化这种作用的受控模型系统，量化MBNL1或其他剪接因子在体内介导特定致癌剪接程序的确切程度仍然具有挑战性。在我们的分析中，我们比较了MLL-将患者样本重新排列为CN-AML作为对照，但是即使在此比较中，也可能存在其他剪接差异，部分原因是诸如谱系偏斜58，在44以上分析的患者队列中共发生剪接体突变等现象，或其他原因-未确定的MLL融合特异性转录/剪接程序，因此在体外隔离核心剪接因子相关程序仅会保留在患者体内发现的分子程序的近似值。尽管如此，我们证明了MBNL1缺失与MLL融合相关的患者剪接之间高度的剪接不一致，表明我们对MBNL1介导的剪接事件的分析具有很高的特异性。
MBNL家族的所有三个成员在开发过程中均调控替代剪接。Mbnl1 -/-小鼠在心脏和骨骼肌中显示剪接缺陷，但没有DM1的临床特征。值得注意的是，发现Mbnl2可以补偿鼠组织中的Mbnl1 59。我们推测，尽管我们在人类细胞的基因敲除研究中抑制了白血病的生长，但类似的现象可能解释了Mbnl1 -/-小鼠白血病的最终发展。在Mbnl1 + / +和Mbnl1 -/-状态下，Mbnl2和Mbnl3它们在小鼠白血病细胞中稳定表达，但是在所检测的人类白血病细胞系中均没有有意义的表达（补充图 7A–B）。因此，在我们的白血病的最终发展一个可能的解释MBNL1 - / -小鼠模型是Mbnl2补偿了没有MBNL1，但目前还不清楚这是否补偿机制必然在人类细胞中的行为类似。或者，在小鼠逆转录病毒性白血病模型中发生的转化细胞中MBNL1的丢失（即白血病细胞系中的基因敲低）可能比从头重新转化的MBNL1缺陷细胞更有害。我们假设Mbnl1的转化可以想象-/-细胞可能参与替代的致癌途径，最终使白血病细胞存活，尽管关于MBLL1对MLL白血病的起始与繁殖的要求这一问题尚待进一步研究。
鉴于MLL重排的急性白血病患者的预后较差，在这一亚组患者中迫切需要更好的治疗方法。我们的数据表明，靶向MBNL1可能是MLL重排白血病的有效治疗途径。作为概念的证明，我们证明了针对MBNL1合理设计的小分子抑制剂可以优先杀死MLL重排的白血病细胞，同时保留正常的CD34 +造血干/祖细胞。另一种治疗方法可能涉及靶向MBNL1的成分转录本本身使用治疗性RNA抑制来专门针对造血或白血病细胞。具体而言，我们的数据表明，人类MLL重排的白血病细胞具有增加的表达MBNL1转录物排除外显子5这影响核VS MBNL1的细胞质定位14，43。我们假设MBNL1在促进MLL重排致癌程序的有效剪接中的作用可能部分由第5外显子排除。影响外显子利用的治疗药物（例如反义寡核苷酸）可能因此代表了破坏MBNL1功能的另一种方法。但是，排斥转录本的具体作用和相关的细胞定位尚未完全了解，需要进一步研究。
总之，我们提供了支持的模型，其中由MLL-融合蛋白介导的MBNL1过表达通过改变MBNL1目标的剪接模式（主要是内含子保留的改变）来促进白血病的发生。我们证明MBNL1是替代剪接事件的重要调节剂，优先在MLL重排的白血病中表达，并参与MLL重排的致癌程序。我们的数据显示了MBNL1在mRNA和蛋白质水平上的作用，并表明MBNL1通过稳定包括DOT1L和SETD1A在内的多个致白血病基因的转录本，在MLL重排白血病的发病机理中起着关键作用; 这反过来又支持MLL融合蛋白下游靶标的转录激活，包括MBNL1的激活，从而形成一个正反馈环（图 8）。我们还表明，MBNL1的一种特异性抑制剂（尽管效力很低）优先影响MLL重排的白血病细胞。鉴于最近的发现支持AML 60中选择性RNA结合蛋白必不可少的概念，我们的工作提供了进一步的证据，证明这是这种预后不良的疾病中有效的新靶标类别。此外，我们的工作可作为开发抗MBNL1疗法的原理证明。正在进行进一步的研究，以进一步阐明在MLL重排的白血病中MBNL1依赖性的潜在机制，并进一步优化候选小分子抑制剂。
MLL融合蛋白直接促进MBNL1基因的过表达，从而导致靶RNA转录物的选择性剪接发生变化（通常内含子保留减少，因此无意义介导的衰变/完整转录本减少），这对MLL重组的白血病程序至关重要。
将人类白血病细胞系保存在Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）或Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中，其中补充了10％的胎牛血清（FBS），1％的青霉素和1％的链霉素。
从辛辛那提儿童医院医学中心生物存储库获得了完全确定的原代患者细胞。患者身份已受到保护。在适当的知情同意下，根据IRB批准的规程（＃2008-0021）使用残留的诊断标本生成PDX模型。将来自患者样品的细胞移植到以白硫丹为条件的NOD / LtSz-SCID白介素2（IL2）RG-/-SGM3（NSGS）（Jackson Laboratories，库存号013062）小鼠中。当小鼠表现出白血病迹象时，小鼠中仅存的人类细胞是白血病细胞（FISH证实了MLL重排）。取自NSGS小鼠（杰克逊实验室，库存号013062）的去鉴定的PDX脾脏样品用于下述体外敲除实验。
MLL-AF9 Tet-off人CD34 +细胞是James Mulloy博士提供的一种礼物，产生方式如下。脐带血（UCB）从CCHMC的转化试验开发和支持实验室（TTDSL）获得。UCDSL单元由TTDSL根据IRB批准的协议收集和分发，并且源自废弃的脐带，因此被完全匿名，从而使它们不受人类研究。使用EasySep CD34 +分离试剂盒（StemCell Technologies）从UCB分离CD34 +细胞。在转导之前，将CD34 +细胞在含有100 ng / mL SCF，TPO，Flt3-L和IL-6和20 ng / mL IL-3的IMDM / 20％FBS中预刺激2天。使用旋涂法将转基因蛋白与4 µg / mL的聚乙烯一起旋涂在Retronectin（Takara Bio）包被的板上。35慢病毒和MSCV-GFP-IRES-tTA 34逆转录病毒。转导后，将细胞维持在IMDM / 20％FBS中，每种细胞因子含10 ng / mL。在数周的培养中选择了纯的dsRED + GFP +细胞群体。为了抑制MLL融合蛋白的表达，将细胞用1 µg / mL强力霉素处理。
通过Genetica细胞系测试（LabCorp）通过STR基因分型来定期验证细胞系。测试细胞，支原体污染呈阴性。ICLAC认为，这项研究中使用的所有细胞系均未被普遍误认为。
如图所示，主要患者AML和ALL样本的RNA-Seq数据来自圣裘德云（原始出版物/数据集，如“结果”部分所述），以及www.vizome.org/aml。
用于该研究的所有动物均为6-12周龄。所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导进行。C57BL / 6小鼠用作供体，用于使用Mbnl1 -/-或Mbnl1 + / +细胞的移植实验。对于正常鼠造血研究中，1×10 6CD45.2 MBNL1 - / -或MBNL1 + / +的骨髓供体细胞移植1×10 6CD45.1竞争性细胞（用于竞争性移植，比例为1：1）或无竞争性细胞（非竞争性移植）至经致命照射的BoyJ受体小鼠体内（RRID：IMSR_JAX：002014）。移植后四或八周，分析受体的骨髓供体嵌合。评估小鼠的白血病迹象，并在痛苦时将其处死并测试其白细胞增多，贫血，血小板减少和脾肿大。对于正常的造血实验，每4周检查一次接受者的外周血，并在实验结束时通过流式细胞术检测骨髓是否存在供体细胞。为了研究Mbnl1基因敲除小鼠的白血病时间，对BoyJ受体小鼠进行了亚致死条件下的条件照射，并静脉注射2×105个转导的供体细胞。对于使用MLL重排的细胞系进行异种移植实验，将免疫受损的NOD / LtSz-SCID白介素2（IL2）RG-/-（NSG）（Jackson Laboratories，库存号005557）的接受小鼠用白消安（Sigma）30 µg / mg腹膜内注射，并在24小时后移植2×10 5个人类细胞。对于使用MLL重排的原代患者细胞进行的异种移植实验，将免疫受损的NOD / LtSz-SCID白介素2（IL2）RG-/-SGM3（NSGS）（Jackson Laboratories，库存号013062）的接受小鼠接受白消安条件并移植2 –7.5×10 5人类细胞24小时后。在异种移植实验中，在移植后四周以及出现白血病迹象时收集骨髓样本。通过流式细胞术分析抽吸物是否存在人CD45 +细胞，以及是否存在shRNA转导的CD45 +和维纳斯阳性细胞
根据生产商的建议，使用CaPO 4方法或FuGENE 6试剂（Promega）通过转染HEK293T细胞产生逆转录病毒和慢病毒上清液。通过碾压坐骨，股骨和胫骨来分离小鼠骨髓细胞。然后通过使用AutoMACS Pro Separator（Miltenyi Biotec）进行磁分离，然后使用Lineage Cell Depletion试剂盒（Miltenyi Biotec）将细胞进行谱系清除。然后用100 ng / ml细胞因子（SCF，G-CSF和血小板生成素）（Peprotech）预刺激谱系阴性细胞过夜，并在逆转录素包被的平板上通过旋涂法逆转录病毒MLL-AF9构建体进行转导。
慢病毒MBNL1 shRNA pLKO.1-Puro质粒（TRCN0000063963，TRCN0000063964，TRCN0000063965，TRCN0000063966和TRCN0000063967）购自Millipore Sigma。将人细胞与单剂量的慢病毒上清液孵育过夜。在0.5–5 µg / ml的嘌呤霉素中筛选转染了赋予嘌呤霉素抗性的结构的细胞72小时。转导后第4-5天，使用MoFlo XDP（Beckman Coulter），FACSAria（BD Biosciences）或Sony SH800S（Sony Biotechnology。）进行筛选，分离出含有荧光标记（GFP，YFP或Venus）构建体的细胞。 MSCV MLL-AF9 GFP是黄刚博士的礼物。
对于鼠外周血流式细胞术分析，通过眼眶后出血收集外周血，并与表面抗体（eBioscience）在染色缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS）中添加0.5％FBS）孵育。用Pharm Lyse裂解缓冲液（BD Biosciences）处理外周血细胞悬浮液，并用PBS洗涤两次。为了进行细胞凋亡分析，将细胞与异花青素偶联的膜联蛋白V（BD Bioscience）在1X膜联蛋白V结合缓冲液（BD Bioscience）中于RT孵育15分钟，然后用7-氨基放线菌素（eBioscience）染色。在FACSCanto I上获取数据，并使用FlowJo版本10（FlowJo）分析结果。补充数据4中列出了用于小鼠和人类细胞的流式细胞术分析的抗体清单 。
将小鼠骨髓细胞铺板于补充有10 ng / ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Peprotech）的含甲基纤维素的培养基（StemCell Technologies，Methocult M3434）中。培养7–8天后，对菌落计数并重新接种3–5轮。在含有甲基纤维素的培养基（StemCell Technologies，H4434）中培养人细胞。接种后14天对菌落评分。Nikon Eclipse T i -U示波器用于菌落图像，并使用Nikon Elements软件执行自动计数。
使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从人嘌呤霉素选择或分选的维纳斯阳性细胞中提取总RNA。使用iScript Advanced cDNA合成试剂盒（Bio-Rad Laboratories）将RNA逆转录为cDNA。使用MyTaq TM在Eppendorf PCR Cycler中进行RT-PCR反应HS Red Mix（Bioline）根据制造商的建议。在琼脂糖凝胶上分离扩增的反应产物（1-3.5％）。BioChemi系统（UVP Bioimaging系统）用于可视化和分析（Image Lab 6.0用于谱带定量）。对于定量RT-PCR，使用iTaq Universal SYBR Green Supermix和iTaq Universal Probes Supermix（Bio-Rad）在StepOnePlus实时PCR机（Applied Biosystems）中分析5-10 ng cDNA。用于RT-PCR的引物在补充数据5中有详细说明 。
使用Magna RIP试剂盒（Millipore）进行RNA免疫沉淀。每个免疫沉淀反应使用2.0×10 7个细胞。使用五微克的小鼠抗IgG（Millipore，CS200621）或抗MBNL1（Millipore，克隆4A8）。RNA免疫沉淀后，通过“ RT-RT和定量RT-PCR”部分所述的过程通过qRT-PCR提取并分析RNA，不同之处在于qRT-PCR使用Taqman探针（Thermo Fisher Scientific，Hs_00986924 （对于SETD1A来说，对于DOT1L来说是Hs_05017433），而不是SYBR Green。
使用的主要抗体是抗MLL1（Bethyl，A300-086A，RRID：AB_242510），抗MBNL1（Millipore Sigma，克隆4A8，RRID：AB_10808499），抗DOT1L（Cell Signalling，D1W4Z，RRID：AB_2799889），抗-SETD1A（细胞信号传导，D3V9S，RRID：AB_2799614），抗肌动蛋白（细胞信号传导技术，13E5，RRID：AB_2223172），抗Lamin B1（细胞信号传导技术，D4Q4Z，RRID：AB_2650517）和抗β微管蛋白（ Cell Signaling Technology，9F3，RRID：AB_823664）。使用RIPA缓冲液（Sigma）分离全细胞裂解液，同时使用NE-PER试剂盒（Thermo Scientific）根据制造商的说明获得核提取物，并通过BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Scientific）确定蛋白质的量。通过SDS-PAGE在4–20％梯度凝胶（Bio-Rad）上分离出10 µg蛋白质。转移到PVDF膜后，印迹用封闭缓冲液TBS（LI-COR）封闭一小时，然后与一抗孵育过夜。洗涤后，将印迹用合适的二抗IRDye 680RD山羊抗小鼠（LI-COR）和IRDye 800CW山羊抗兔（LI-COR）抗体以1：10,000的稀释度处理一小时。使用Odyssey CLx红外成像系统（LI-COR）获得图像。
将0.5×10 5个细胞/ ml接种在96孔板中，并与浓度为250 µM，500 µM或媒介物（DMSO）的抑制剂一起孵育。孵育后的不同时间点，将细胞用膜联蛋白V和7-AAD染色，并通过流式细胞仪进行分析。另外，使用锥虫蓝对存活细胞进行计数。
对于图 1a，从以下来源获得针对MLL重排与WT白血病的预先计算的微阵列基因表达特征：Ross等，Blood 2004 Supplementary Table 10 4，Mullighan等。Leukemia 2007 Suppl Table 5 22，Zangrando等。BMC Med Genomics 2009 Suppl表 2 21和Stam等。血液 2010增刊表 5 6。探针ID与基因符号相符，并通过http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/确定交叉点并可视化。
对于图 1c，使用列出的登录号（对于ML-2数据为GSE95511，对于MV4为GSE79899；对于THP-1为GSE79899，对于RS4; 11数据为GSE38403，以及以前列出的登录号）从Gene Expression Omnibus下载了先前分析的bigWig / bedgraph文件。 GSE38338（用于SEM数据），并使用UCSC基因组浏览器（组件hg19）进行可视化。为了保持一致性，使用UCSC Genome Browser Utilities中的liftOver工具将RS4; 11和SEM的数据从其原始映射的hg18转换为hg19。
除非另有特别说明，否则所有数据均采用两尾t检验进行比较。对于生存分析，使用对数秩检验比较生存曲线。RNA测序分析所用的统计数据在以下部分（“ RNA测序和分析”）中进行了描述。Graphpad Prism 8用于执行统计测试和创建图形。选择通过BioRender.com创建的图形。
在用MBNL1 sh64（n = 3 MOLM13，n = 3 MV411），sh65（n = 4 MOLM13，n = 4 MV411）或shNT对照（n = 3）转导后，对从MOLM13或MV411细胞系获得的总RNA进行RNA测序。 在使用TruSeq RNA库制备试剂盒（Illumina）进行文库制备后，类似于Leucegene RNA，使用Illumina HiSeq 2500（GSE123441）进行深度大于4,000万对的双链末端读取，深度为3个MOLM13，n = 4 MV411） -Seq数据集（GSE67040）。用独立的shNT对照（MOLM13）进行的为期12天的较长MBNL1敲除也作为生物学三份进行，并在Illumina NovaSeq平台上以相同的方案进行处理。MLL的AML FASTQ文件（n = 27）和CN AML患者（n = 29）从GEO数据库下载，如先前所述44。使用最新版本的STAR 61将所有FASTQ文件与参考人类基因组（GRCh37 / hg19）进行比对。使用Ensembl-72人类数据库从软件AltAnalyze（2.1.1版）中确定外显子-外显子和内显子内含子的跨度读数，以及通过MultiPath -PSI算法进行剪接事件计算和注释（请参阅：http：// altanalyze .readthedocs.io / en / latest / Algorithms有关算法的详细信息和基准测试）。对于比较性剪接分析，要求每个剪接事件中> 50％的样品具有检测到的PSI值，在患者数据集和转导的细胞系分析之间保持一致。正如统计阈值，我们使用了双尾经验贝叶斯主持人（eBayes）吨 -test与p ≤0.01 shRNA的分析和delta PSI> 0.1。通过MultiPath-PSI软件提供了拼接事件类别的细分，并通过AltAnalyze提供了相关的热图可视化。对于MLL患者样本与CN样本，还进行了eBayes t检验（p ≤0.01）和增量PSI> 0.1用于差异剪接分析。仅报告唯一的结簇ID结果。针对患者数据集和转导的细胞系样本分别计算了相对PSI差异，以进行联合可视化。使用相同的p值阈值和1.5倍变化截止值，通过基因水平RPKM量化，从输入的STAR BAM文件在AltAnalyze中类似地进行了基因表达分析。如先前所述，使用ENCODE RNA结合蛋白敲除和对照造血细胞类型剪接的比较结果来自先前的研究62。使用软件HOMER对交替剪接的外显子和内含子（具有500nt侧翼内含子序列盒的外显子）进行RNA识别元件（RRE）富集分析63来自一个大型的RRE主题模型数据库，形式为位置频率矩阵（PFM），取自CisBP-RNA数据库 64。使用自定义的Python脚本对溢出一致性进行评估。使用ToppGene 65进行途径富集分析。根据AltAnalyze确定，对差异表达的基因进行了GSEAP重排。
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