YAP1基因融合已在小儿室管膜瘤中观察到。在这里，我们显示，使用条件诱导的NEX / NeuroD6-Cre在心室区神经祖细胞中异位表达活性核YAP1（nlsYAP5SA）足以驱动小鼠脑肿瘤的形成。海马神经元分化受到抑制。双重条件敲除小鼠中NEX-Cre谱系中YAP1负调控因子LATS1和LATS2激酶的缺失也产生相似的肿瘤，这些肿瘤可通过缺失YAP1及其旁系TAZ得以拯救。YAP1 / TAZ诱导的小鼠肿瘤显示人类室管膜瘤的分子和超微结构特征。小鼠肿瘤的RNA测序和定量蛋白质组学证明与YAP1融合诱导的幕上室室膜瘤相似。最后，我们发现转录辅因子HOPX在小鼠模型和人YAP1融合引起的室管膜瘤中上调，支持它们的相似性。我们的结果表明，神经元前体细胞中不受控制的YAP1 / TAZ活性会导致小鼠出现室管膜瘤样肿瘤。
Yes-associated protein 1（YAP1）是一种具有致癌活性的转录调节因子，参与细胞增殖，干细胞特性维持和肿瘤发生1。YAP1活性是保守的河马的信号传导途径，其在癌症有关的输出2，3，4。该规范的激酶信号系统/途径发送从细胞表面的机械刺激来调节细胞增殖，存活和组织尺寸在跨物种多器官1，5，6，7，8。核心激酶级联由果蝇中的河马激酶组成及其在哺乳动物中的同源哺乳动物不育20样1（MST1）和MST2，以及果蝇中河马的下游效应子疣，与哺乳动物9中的大肿瘤抑制物同源物1（LATS1）和LATS2激酶同源。MST1 / 2磷酸化并激活LATS1 / 2，后者继而磷酸化以抑制YAP1或其紧密同源物TAZ / WWTR1。YAP1磷酸化通过14-3-3结合和细胞质螯合促进其降解，防止其易位至细胞核10。YAP1激活TEAD1-4依赖性基因表达，这是需要其对细胞增殖的影响11，12，13，14。的作用河马信令在哺乳动物肿瘤发生在体内已经证实，例如，通过在肝MST1 / 2或LATS1 / 2的条件的缺失，其中deregulates祖细胞增殖并导致肿瘤发生的小鼠15，16，17。此外，活化的YAP1表达已显示出可驱动胚胎横纹肌肉瘤的形成18，而其在几种癌症类型中的表达使YAP1成为新型治疗的靶点19。但是，其在脑肿瘤，如室间隔膜瘤中的作用尚未完全描述。
室管膜瘤是第三种最常见的小儿脑肿瘤。它在儿童占中枢神经系统（CNS）的所有原发肿瘤的5-10％和青少年20，21，22，23。基于遗传和表观遗传谱，发病和位置（幕上，后颅窝和脊髓）的年龄室管膜瘤最近被分成9个分子亚组24，25。手术后放疗是大多数患者的主要治疗方式24，26，27，28。但是，复发率很高，高达40％的室间隔膜瘤是无法治愈的24，27。幕上室管膜瘤的约70％的特征在于C11ORF95和RELA之间的融合 29，30，而〜4-10％携带YAP1与编码转录因子的其他基因的融合体：YAP1-MAMLD1，或YAP1-FAM118B29，31，32。与YAP1融合的室间隔瘤几乎只发生在儿童中 24。
室管膜瘤可能起源于在胚胎和成人的心室和脊髓中发现的放射状胶质样干细胞的有限种群33。放射状胶质细胞和衍生自它们的中间神经祖细胞通常产生神经元，少突胶质细胞，星形胶质细胞和室管膜细胞34，35，36，37，38。因此，通常调节细胞祖细胞增殖和协调分化的信号传导机制是参与小儿肿瘤发生的强有力的候选者。YAP1存在于胚胎脑室区和后在小鼠中的室管膜39，40那里已经牵涉到室管膜细胞分化40。
我们使用活跃的YAP1表达和LATS1 / 2缺失的条件小鼠模型，并表明抑制表达NEX / NeuroD6的神经元前体细胞中的YAP1活性对于限制脑部增殖和使神经元分化至关重要，而激活YAP1足以产生表现出与人类室管膜瘤相似特征的肿瘤。
在发展中的哺乳动物大脑中，升高的YAP1活性是否具有致瘤性是一个悬而未决的问题。为了靶向在发育中的大脑中通常表达YAP1的细胞类型，我们首先使用免疫组织化学（IHC）与特异性抗YAP1抗体检查了小鼠大脑中YAP1的定位。在出生后第0天（P0），YAP1在心室区（VZ）中高表达（图 1a，补充图 1a），在P20（补充图1a）41局限在室管膜层 。V0处VZ的YAP1阳性细胞的一部分具有有丝分裂活性，并具有放射状胶质起源，分别由Ki67和nestin共表达所显示（图 1b，c）。已知NEX-Cre阳性神经元前体细胞（NPC）从E11.5开始在VZ中生成，NEX / Math2 / NeuroD6谱系产生皮质和海马的锥体神经元，但不会促进星形胶质细胞或少突胶质细胞42，43。我们用Rosa26-tdTomato小鼠报道基因系44杂交了表达NEX-Cre的小鼠。除了锥体神经元，我们在VZ的P0处观察到许多tdTomato表达细胞（补充图 1b–d）。这一发现与以前的报告表明NEX-Cre在划分NPC中是一致的42。TdTomato报告基因阳性细胞也表达YAP1，表明NEX-Cre驱动程序可用于操纵神经前体细胞的亚群（补充图 1b-d）。
一个的控制P0小鼠脑切片冠状视图免疫荧光染色YAP1。箭头指向室管膜层的强阳性染色，比例尺= 1 mm。b – c在P0时，对照组小鼠的室管膜层/心室区放大率更高。b用YAP1和Nestin和c进行的免疫染色。YAP1和Ki67的免疫染色显示共定位（箭头指向具有共定位的细胞，重叠显示为白色）。比例尺= 10 µm。d繁殖方案，以在NEX-Cre的控制下生成表达nlsYAP5SA的小鼠（称为nlsYAP5SA）。仅具有一个NEX-Cre等位基因而不具有YAP1转基因的小鼠用作对照。Ë对照组和nlsYAP5SA小鼠全脑的矢状振动切片显示在P14。在nlsYAP5SA小鼠中，室管膜层被破坏，大脑中形成多个肿瘤，如DAPI染色的核所示，海马未发育。箭头指向海马。比例尺= 1毫米。
基于此证据，我们通过使用Cre诱导型小鼠模型评估了NEX表达NPC中不可控制的YAP1活性的影响，在该模型中，YAP1的高活性形式为nlsYAP5SA，其前是浮选的STOP密码子45。在Cre介导的重组后，这些转基因小鼠表达了磷酸突变型YAP1（S61A，S109A，S127A，S164A，S381A），该蛋白不能被磷酸化并被激酶（例如LATS1 / 2 46）抑制。此外，nlsYAP5SA包含一个核定位信号（nls），可将YAP1活性引导至细胞核。nlsYAP5SA; NEX-Cre小鼠（图 1d）在P14处沿侧脑室和小脑显示出多个室管膜下肿瘤（图 1e））。这些结果表明，NEX-Cre谱系中不受控制的YAP1足以形成肿瘤。
接下来，我们确定了早期发育阶段肿瘤形成的进程。在nlsYAP5SA; 在NEX-Cre小鼠中，核YAP1在整个新皮层和海马中都表达（图 2a）。在这些动物中，海马神经元细胞体层（CA1，CA3和齿状回）表现出神经元丢失和正常分层的破坏，如神经元标记NeuN和CTIP2所观察到的（图 2a，补充图 2a，b）。我们还发现了与室管膜层相邻的多个肿瘤（图 2b）。这些肿瘤的巢蛋白呈阳性，表明组成型细胞具有神经元干细胞规格（图 2c）。）。肿瘤不表达NeuN，表明该肿瘤不包含分化的神经元，但是肿瘤块内的几个细胞表达了Ki67，它是增殖的标志，表明该肿瘤包含活跃分裂的细胞（图 2c）。这些数据表明，表达NEX-Cre的NPC中持续存在的核YAP1通过维持神经干细胞样命运并阻止海马锥体神经元分化而导致肿瘤形成。
在P0动物的冠状纤毛切片中YAP1 的免疫荧光染色。nlsYAP5SA小鼠皮质中的神经元显示出YAP1的强核染色。在nlsYAP5SA中海马的形成发生了变化（箭头）。比例尺= 1毫米。b箭头指向在P0 nlsYAP5SA动物的冠状纤毛切片中可见的肿瘤。比例尺= 1毫米。c在nlsYAP5SA小鼠的肿瘤冠状切片中进行了免疫荧光染色。肿瘤用黄色虚线表示。Nestin，Ki67和MUC1在肿瘤中表现出高度强烈的染色，而NeuN则不存在。比例尺= 100 µm。
尽管有几条证据支持YAP1的致癌作用，但尚不清楚关于调节YAP1活性的激酶在癌症中的影响。在哺乳动物中，典型的上游磷酸化和YAP1 / TAZ活性的抑制主要是通过两个同源激酶LATS1和LATS2完成的。LATS2的组成性敲除会导致胚胎致死性47，而LATS1的组成性敲除会导致软组织肉瘤和卵巢肿瘤的发生48，这表明LATS2在发育过程中的重要作用以及同系物之间的补偿作用。小鼠肝脏中条件性敲除LATS1和LATS2（LATS1 / 2）可增加增殖并抑制肝细胞的成熟，从而引起产前致死性17。LATS1 / 2是否在哺乳动物的神经元分化中起作用尚不清楚。我们测试了LATS1 / 2的YAP1磷酸化不足是否足以通过有条件地敲除NEX-Cre谱系中的Lats1和Lats2来导致肿瘤形成（图 3a）。我们发现双LATS1 / 2条件敲除（cKO），而不是单个LATS1 cKO或LATS2 cKO，与对照组同窝仔相比，P19-P21体重显着降低，在P15出现差异（补充图 3a，b）。在对P0–P21年龄组的LATS1 / 2 cKO小鼠进行检查后，我们发现P5–P7的小鼠中有67％出现了肿瘤，而P8–P21的小鼠中有100％出现了肿瘤，而在P5之前未发现肿瘤（补充图 3c）。）。在所有LATS1 / 2 cKOs中均发现了多发性克隆性前脑肿瘤，始终起源于室管膜层，但在P20的对照组或单个LATS1 cKOs或LATS2 cKO中均未发现（18/18双敲除，0/3 LATS1 cKO，0/3 LATS2 cKO，0/6控件），表示LATS1和LATS2之间的冗余。动物显示出多灶，离散的肿瘤，表明它们是同步起源的（图 3b））。LATS1 / 2 cKO大脑是在我们的项目许可允许的预定时间点（主要是在P20）收集的，并且未通过存活率进行评估（请参见方法）。根据严重程度指示，我们认为大多数LATS1 / 2 cKO小鼠和所有nlsYAP5SA小鼠在2个月大之前就已死亡。YAP1在包括年轻动物中观察到的最小病变在内的所有肿瘤中表达。该发现表明LATS1 / 2功能的丧失增加了YAP1活性（图 3c）。在LATS1 / 2缺失诱导的肿瘤中，YAP1在所有细胞的细胞质中高度表达，并以镶嵌的方式富集在肿瘤中一部分细胞的细胞核中（图 3d）。，e）。尽管一些细胞在细胞核中表达高水平的YAP1，但有些细胞在细胞核中具有较低的YAP1水平（图 3d，e）。这些结果表明，在LATS1 / 2 cKO肿瘤中，YAP1的核定位可以受其他因素（如放线菌素和Src激酶）调节，如先前所示49。此外，在该发育的早期阶段，YAP1阳性肿瘤显示巢蛋白表达增加，表达细胞核YAP1的细胞以及细胞质中YAP1增加的细胞中都存在巢蛋白（图 3e）。除了脑室周围肿瘤，我们还观察到小脑中有肿瘤形成（补充图 3d），概括了nlsYAP5SA的特征。NEX-Cre小鼠（图 1e）。这些数据表明，表达NEX-Cre的神经前体细胞中的LATS1 / 2缺失会导致表达YAP1的肿瘤，与在nlsYAP5SA中发现的肿瘤高度相似。NEX-Cre小鼠。与nlsYAP5SA相比，我们在LATS1 / 2 cKO小鼠中发现了更小的克隆肿瘤形成；NEX-的Cre小鼠中可能由于YAP1 / TAZ活性的其它调节剂，如Src和NDR激酶50，51。因此，NPC中的LATS1 / 2活性对于控制发育期间的YAP1活性是必需的。
产生LATS1 / 2条件敲除（LATS1 / 2 cKO）小鼠和对照同窝仔的育种方案。b在LATS1 / 2 cKO小鼠的P20处发现与室管膜层有关的肿瘤（箭头）。在每个大脑中都可以发现多个克隆性肿瘤（中图和右图来自同一大脑的不同冠状平面）。比例尺= 1毫米。c在P6处，LATS1 / 2 cKO脑的冠状切片在由室管膜层（箭头）引起的肿瘤中显示出强的YAP1免疫荧光染色。比例尺=毫米。d – e LATS1 / 2 cKO脑中免疫荧光染色的共聚焦图像。比例尺= 10 µm。dYAP1染色在肿瘤中增加，而YAP1在某些细胞中是核的（箭头）。YAP1表达不与GFAP +细胞重叠。È YAP1和巢蛋白共表达在肿瘤细胞（箭头）。
尽管人们普遍认为YAP1是河马途径的主要功能输出，并且其失调会导致肿瘤发生，但仍有待检验YAP1在Lats1 / 2依赖性脑肿瘤的产生中是否具有重要作用。YAP1与其紧密同源的TAZ具有很大的冗余功能。因此，我们使用YAP1 f / f; TAZ f / +小鼠50评估LATS1 / 2双敲除小鼠的肿瘤发生是否需要YAP1 / TAZ。为此，我们越过了NEX-Cre；Lats1 f / f; 具有YAP1 f / f的Lats2 f / f小鼠；TAZ f / +小鼠（图 4a）。我们发现，删除了一个或两个YAP1副本的所有LATS1 / 2 cKO动物仍在P20处显示肿瘤（n =每个= 3），表示YAP1不是LATS1 / 2调节的唯一下游因素。然而，我们观察到，耗尽YAP1的两个拷贝的LATS1 / 2 CKO动物表现出显著减少（p <0.001，Dunn多重比较检验）的平均肿瘤大小与LATS1 / 2 CKO动物（图相比 图4b），这表明电平YAP表达的改变影响肿瘤大小。此外，使用随机效应模型解释了从每只动物身上记录的多个肿瘤，我们观察到明显的累加剂量效应证据，特别是每个YAP1 WT等位基因丢失对应于估计的肿瘤体积减少约0.03 mm 3（p = 0.0068）。在LATS1 / 2中；YAP1 f / f对于小鼠，YAP1免疫染色的肿瘤阴性，支持其特异性（补充图 4a）。LATS1 / 2 cKO YAP1 f / + TAZ f / +小鼠患有肿瘤（n = 3）。但是，在LATS1 / 2 cKO YAP1 f / f TAZ f / +小鼠中，P20处的肿瘤形成受到抑制（n = 3）（图 4c）。这些结果强烈支持YAP1和TAZ的激活介导了LATS 1/2 cKO小鼠的肿瘤形成（图 4c）。我们得出结论，对于NEX表达NPC引起的LATS1 / 2依赖性肿瘤发生，YAP1和TAZ是必需的。
一个育种方案产生了救援模式。将可用的动物（Lats1 f / f Lats2 f / f，YAP f / fTAZ f / +和NEX Cre / Cre）杂交以产生具有所示基因型的小鼠。b在 每种基因型的n = 3小鼠的LATS1 / 2 cKO（n = 16肿瘤），YAP突变f / +（n = 15肿瘤）和YAP f / f突变（n = 11肿瘤）中发现的肿瘤大小。。阴影表示来自同一只动物的肿瘤。LATS1 / 2 cKO肿瘤体积与突变型YAP f / f中测量的相比动物的padj = 0.0006（两侧Dunn多重比较测试）显示出显着差异。误差棒＝ SEM。c D20的P20大脑的冠状玻璃体切片。在救援小鼠中未发现肿瘤形成。在LATS1 / 2 cKO，YAP突变型f / f和YAP突变型f / +动物中可以发现肿瘤（箭头）。比例尺= 1毫米。
接下来，我们研究了LATS1 / 2 cKO肿瘤的病理特征。石蜡包埋的P20 LATS1 / 2 cKO小鼠脑的连续切片显示脑室周围多灶性肿瘤与室管膜层连续（图 5a）。从组织学上看，肿瘤表现为中度细胞病变，并有压迫性边缘。它们由均匀的纺锤形或圆形细胞组成，具有原纤维或稀少的细胞质和略带彩色的核（图 5b，c）。我们没有观察到格式良好的血管周围假玫瑰花。一些细胞含有胞浆内的液泡（图 5d）。线粒体不存在。这些病变周围的组织表现出反应性星形细胞增多和小胶质细胞反应。肿瘤细胞显示核和较小程度的细胞质YAP1表达（图 5e），它们弱表达MUC1（EMA）（图 5f），并且它们对GFAP（图5g）和细胞角蛋白18 呈局部阳性 （图 5h）。radial胶质细胞中存在的波形蛋白，巢蛋白也在肿瘤中表达，而神经元标记物NeuN始终不存在（补充图 5a）。Ki67在肿瘤中表达，表明细胞分裂（补充图 5a）。值得注意的是，小鼠正常的室管膜增生还表达了细胞角蛋白18，如先前所示52（补充图 5b）。光镜的特征和肿瘤的免疫表分别与室管膜瘤一致和相似的人对应53，54，55。
a – d肿瘤（箭头）似乎起源于海马水平的侧脑室前颞角的室间隔层（* CA3）。一个 H＆E，×4，比例尺= 500微米; 病变有压迫性边缘。b H＆E，×10，比例尺= 200 µm，由纺锤状细胞的束状细胞组成，具有局部核簇。c。H＆E，×40，比例尺= 50 µm。一些肿瘤细胞含有胞浆内核旁液泡（箭头）。d。H＆E，×60，比例尺= 20 µm。肿瘤细胞显示。È细胞核和细胞质表达YAP1（免疫过氧化物酶，×20），˚F弱细胞质表达MUC1（免疫过氧化物酶，×20），并克它们对GFAP（免疫过氧化物酶，×20）和h细胞角蛋白18 / CK18（免疫过氧化物酶，×10）呈局部阳性。病变周围的反应性星形胶质细胞也为GFAP阳性（g-免疫过氧化物酶，×20）。比例尺= 50 µm。我 TEM图像（×9900）表示的多个室管膜特征（黄色箭头=微绒毛，红色箭头=紧密连接）在肿瘤内。比例尺= 1 µm。Ĵ，ķ。i中的黄色和红色插图分别放大。比例尺= 200 nm。Ĵ。高倍放大微绒毛和k。显示了在肿瘤中发现的紧密连接。
为了进一步测试LATS1 / 2 cKO肿瘤的室管膜起源，我们使用透射电子显微镜（TEM）进行了超微结构检查。在通过Micro-CT与大脑的核4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）荧光图像进行比较确定了肿瘤块的区域后（补充图 5c），我们使用序列研究了肿瘤的多个区域断面扫描电子显微镜（补充图 5d）和TEM（图 5i-k，补充图 5e-f）。大量微绒毛和紧密连接（图 5i-k，补充图 5f）在肿瘤的不同区域被观察到。微绒毛和紧密连接的存在证实，YAP1失调和激活导致形成类似于人类中相应肿瘤的室间隔瘤。
我们进行nlsYAP5SA小鼠的右半球的总RNA测序（NEX 的Cre / + ; YAP1 nlsYAP5SA / +）和未受影响的同窝小鼠（NEX + / + ; YAP1 nlsYAP5SA / +）（ñ = 5每个基因型）（图 6a中） 。实验包括另外三个非同窝仔C57BL / 6对照，它们与对照动物成簇，但未包括在以后的分析中（补充图 6a））。首先，我们基于nlsYAP5SA和对照中的差异表达对所有30,280个已鉴定基因进行了排名。然后，我们应用了基因富集分析（GSEA），选择了《京都基因与基因组百科全书》（KEGG）数据库，以鉴定在排名表的两个极端中都过分代表的基因集。在nlsYAP5SA中排名前10位的上调基因集中，我们发现了癌症的途径，细胞因子受体的相互作用和粘着斑，与活性YAP1诱导癌症的能力以及随之产生的免疫应答相一致（图 6b，c）。另一方面，氧化磷酸化基因集减少最多，这可能表明能量代谢肿瘤发生了变化（补充图 6b））。在一项补充分析中，我们使用在线工具DAVID和KEGG定义的基因集，分析了两种基因型之间2035个显着差异表达的基因。使用DESeq2 R软件包通过Wald显着性检验（显着性阈值为0.05）生成显着差异表达的基因列表。不出所料，除包括免疫和感染相关基因的术语外，最丰富的基因集之一是河马信号通路（补充图 6c）。具体地，在nlsYAP5SA小鼠中，许多已知的YAP1下游效应子56在mRNA水平上显着上调，包括AMOTL2，CTGF，CYR61，ANKRD1和AXL（补充数据 1）。
a – e nlsYAP5SA与对照的基因表达分析。每五个基因型的动物（对照= NEX + / +YAP1 nlsYAP5SA / + ; nlsYAP5SA = NEX 的Cre / + YAP1 nlsYAP5SA / +）分析利用Illumina公司HiSeq 4000 一个控制之间的热地图所有显著差异表达的基因的（2035个基因）和nlsYAP5SA动物。行代表基因，列代表个体动物。图例表示每个基因的中位数中心倍数变化。b来自RNA测序（RNASeq）的完整基因列表（检测到30,280个基因）的完整基因列表的基因富集分析（GSEA），其基因集来自KEGG途径数据库。显示了具有最高归一化富集得分（NES）的前10条带注释的途径，其中数据集中的基因数量与指示的途径（大小）相关。c KEGG的GSEA在分析中具有最高的NES注释。d使用YAP1和RELA关联的基因列表（请参见方法）来指定nlsYAP5SA筛选中表达数据中检测到的基因的特异性（参考列表中354个基因中有350个基因存在于我们的数据集中）。对照相对于nlsYAP5SA的Log2倍数变化从最高到最低排名。蓝绿色和红色分别表示YAP特异性和RELA特异性基因。e具有指定特异性的排名最高的10个基因均与YAP1相关。f Venn图显示了转录组（RNAseq，蓝色）和蛋白质组中通过液相色谱质谱（LC-MS）（红色）定量的已鉴定基因的数量。左：所有基因，右：nlsYAP5SA中的基因明显上调。G蛋白质组和转录组中均存在的6439个基因的密度散点图通过对照和nlsYAP5SA之间的表达差异绘制（Welch差异用于蛋白质组学，stat值用于转录组学）。数据集显示相关系数为0.5。每个点代表一个基因。h对照和nlsYAP5SA队列之间蛋白质水平差异的火山图。每个点代表一种蛋白质。的X轴表示LOG2转化倍数变化和ÿ通过-log10转化轴示出显着性p通过获得的值双面韦尔奇吨测试。如果基因的FDR <0.05并且s0> 0.1（黑色线表示），则该基因被称为显着差异表达。显示与星形胶质细胞（洋红色）和小胶质细胞（绿色）相关的蛋白质。通过整合先前发布的数据（参见方法）来生成细胞类型关联。i h所示的区域，放大以显示并命名nlsYAP5SA脑中明显上调的蛋白质。
接下来，我们检查了nlsYAP5SA小鼠模型中的基因表达特征如何与人类室管膜瘤亚型的已发表基因表达数据进行比较。为此，我们使用先前建立YAP1-MAMLD1融合和RELA融合阳性的人室管膜瘤亚型，以及YAP1-MAMLD1和之间的差异表达基因的列表C11orf95-RELA驱动鼠标室管膜瘤模型31，57。在这354个已发表的独特基因（151个YAP1相关基因和203个RELA相关基因）中，有350个存在于我们的转录组学数据中，我们根据nlsYAP5SA与对照小鼠的倍数变化进行了排名（图 6d）。）。我们发现，尽管在nlsYAP5SA模型中增加和减少的基因中RELA融合相关基因均被代表（图 6d，红色），但是在nlsYAP5SA模型中上调的基因中，针对YAP1-MAMLD1融合阳性室管膜瘤的特异性基因显然被过度代表。 （图 6d ;蓝绿色，补充数据 2）。当我们将分析局限于对照小鼠和nlsYAP5SA小鼠之间显着变化的mRNA（在我们的差异显着表达的基因列表中发现89/354个基因，与基因名称匹配）时，我们发现这种模式更为醒目。在我们的小鼠模型中，总共46个（98％）YAP1-MAMLD1融合相关的mRNA中有45个显着增加，而只有一个mRNA减少，相比之下，43个（46％）RELA融合特异性基因中有20个增加了在nlsYAP5SA小鼠中，α和β的表达降低（补充图 6d，补充数据 2）。这些数据表明，在nlsYAP5SA中增加的YAP相关基因的比例远高于RELA相关基因（p <0.0001，卡方检验），表明在nlsYAP5SA模型中存在YAP-MAMLD1融合相关的基因表达标记。在nlsYAP5SA中表达变化最高的18个基因包括已知的YAP1下游靶基因，例如Ankrd1，Cyr61和Ctgf（图 6e）56。有趣的是，在角膜上皮层和我们的LATS1 / 2 cKO肿瘤中表达的标志物细胞角蛋白18是nlsYAP5SA小鼠中增加的前10个基因之一（图 6e））。这些数据支持NPC中nlsYAP5SA的表达会导致基因表达谱，类似于具有YAP1-MAMLD1融合蛋白的人类室管膜瘤。我们试图在多种类型的小儿脑肿瘤基因表达58与我们的nlsYAP5SA小鼠测序结果之间进行主成分分析。我们没有观察到单个患者肿瘤类型的强聚集性（补充图 6e），因此也无法比较nlsYAP5SA肿瘤，从而导致该分析没有定论。将微阵列数据集与我们的下一代测序数据集（请参见方法）进行比较时，存在大量技术警告。
为了研究我们在mRNA表达中观察到的变化是否转化为蛋白质水平的变化，我们采用了质谱法。 转录组筛选中使用的nlsYAP5SA和对照动物（每只n = 5）的左半球用TMT（串联质量标签）10-plex试剂标记，以进行相对蛋白质组定量。我们共鉴定了6643种蛋白质，其中21.3％的已鉴定mRNA在蛋白质水平上被发现，并且发现85个基因和蛋白质的重叠在nlsYAP5SA的两个数据集中均显着增加（与基因名匹配时与对照组相比）（图。 1207米）。蛋白质组学数据的主成分分析表明，两个不同的簇清楚地区分了不同的基因型（补充图。 6f）。我们观察到转录本（Stat值）和蛋白质（Welch差异）水平之间的相关性，皮尔逊相关系数为0.5（图 6g，补充数据 3）。接下来，我们如先前所述59在二维中计算了类别丰富度。在转录本和蛋白质水平上都注释了基因本体（生物过程，分子功能和细胞室）和KEGG。这些数据揭示了转录组和蛋白质组数据在分类水平上的良好相关性（补充图 6g，Pearson's r = 0.844，相关的2D富集得分）。GFAP，波形蛋白和ANXA1是在nlsYAP5SA脑中mRNA和蛋白质水平增加的基因的具体例子（图6g），这些以前与室间隔 膜瘤60有关。
为了研究增加的蛋白质是否可以与特定的细胞类型相关，我们通过将蛋白质组学数据与在分离的CNS细胞上进行的完整蛋白质组学的现有数据集叠加来单独分析蛋白质组学数据61。我们显示在荷瘤小鼠中，小胶质细胞和星形胶质细胞相关蛋白增加（图 6h，i，补充图 6h，i；补充数据 4），表明小胶质细胞对肿瘤的反应。另外，与GSEA一致，补体级联蛋白如C1qa，C1qb，C1qc和C4b高度上调，指向免疫应答成分（图 6b，补充图 6c）。）。有趣的是，已知的YAP1靶CTGF在mRNA水平上调，但在蛋白水平上不变（图 6g），这已通过Western印迹进一步证实（图 7a），表明了额外的转录后控制。总体而言，我们观察到我们的蛋白质组学和转录组学分析具有良好的相关性，它们强有力地支持了nlsYAP5S脑肿瘤类似于YAP1融合阳性室管膜瘤并激活了已知的YAP目标基因。
一个 Western印迹和蛋白质水平比较控制和nlsYAP5SA动物的定量（对照= NEX + / + YAP1 nlsYAP5SA / + ; nlsYAP5SA = NEX 的Cre / + YAP1 nlsYAP5SA / +）（ñ = 3只小鼠，每个）。 在nlsYAP5SA（两尾未配对t检验）中观察到YAP1 （p = 0.0042），波形蛋白（p = 0.0017），GFAP（p <0.0001）和HOPX（p = 0.0002）显着增加。TAZ和CTGF的蛋白质水平未见明显差异。误差棒＝ SEM。b在P20处LATS1 / 2 cKO肿瘤中选定的YAP1下游基因的免疫荧光染色。在肿瘤中观察到ANKRD1，AMOTL2和AXL的强烈染色。ANKRD1在所有肿瘤细胞中均匀表达，AMOTL2和AXL在其边界附近的肿瘤中表现出更高的水平。比例尺= 100μm。c在P20的LATS1 / 2 cKO肿瘤中HOPX和YAP1的免疫荧光，在肿瘤边缘显示较高的染色，HOPX与YAP1在该区域共定位（白色表示共定位，比例尺= 100μm）。d HOPX表达细胞的子集具有清晰的核YAP1染色，示例细胞显示于不同的LATS1 / 2 cKO肿瘤（比例尺= 10μm）。Ë两个YAP1-MAMLD1融合性室管膜瘤，其特征是均匀的细胞在原纤维背景中形成假红斑（H＆E，比例尺= 100μm（患者1），200μm（患者2））；肿瘤细胞显示YAP1核表达（免疫过氧化物酶，比例尺= 50μm）；HOPX有细胞质和核表达（免疫过氧化物酶，比例尺= 100μm），而p65在肿瘤细胞中为阴性（免疫过氧化物酶，比例尺= 100μm）。
首先，我们证实波形蛋白，GFAP和HOPX在nlsYAP5SA脑中高度增加，在该脑中可以观察到带有FLAG标签的YAP1过表达（图 7a）。接下来，我们想知道在llsYAP5SA小鼠中上调的基因和蛋白质在LATS1 / 2基因敲除小鼠肿瘤中是否也被上调。使用免疫荧光，我们发现在LATS1 / 2 cKO肿瘤中，在mRNA分析，ANKRD1，AMOTL2和AXL中鉴定到的YAP1下游效应子增加了（图 7b）。ANKRD1在肿瘤中心丰富，而外周的AMOTL2和AXL较高，在该处还观察到C3阳性小胶质细胞（补充图 7a）。这些结果表明，在我们的两个小鼠模型中，典型的YAP1信号传导效应因子都与室间隔瘤样肿瘤的肿瘤发生有关。
除YAP1外，仅Homeodomain蛋白（HOPX）是在mRNA测序和蛋白质组学分析中显着增加的唯一转录辅因子（图 6g–i）。HOPX是在许多组织，包括神经干细胞星形细胞与命运表达的转录调控因子62，63。HOPX存在于细胞核和细胞质中，尤其是在野生型小鼠小脑和齿状回中含量很高（补充图 7b）。在nlsYAP5SA小鼠（补充图7c）和LATS1 / 2 cKO肿瘤（图 7c）中，HOPX蛋白增加 。HOPX与LATS1 / 2 cKO肿瘤中表达核YAP1的细胞共定位（图 7d）。这些结果表明在具有YAP / TAZ活性的肿瘤细胞中强烈诱导了HOPX表达。
接下来，我们使用蛋白质组学数据来预测潜在的YAP1融合室管膜瘤特异性标志物，理由是蛋白质水平升高可能会导致免疫染色检测更加容易。我们专注于ANKRD1和HOPX，因为上调的星形胶质和小胶质蛋白不太可能是亚型特异性的。我们使用已确诊的YAP1-MAMLD1和C11orf95-Rela融合蛋白的人室膜瘤切片（ 每组n例3例）。核YAP1表达存在于YAP1-MAMLD1（图 7E），如先前所观察到的64，核p65的表达在仅观察到C11orf95-RELA稠合室管膜瘤与目前的文献保持64，65（补充图 7D）。Ankrd1抗体未产生特异性染色IHC。有趣的是，我们发现HOPX在3种YAP1-MAMLD1诱导的人室间隔膜瘤中表达，而在3种C11orf95-RELA诱导的室间隔膜瘤中却不存在（图 7e，补充图 7d）。HOPX已经报道为不存在或恶性肿瘤抑制63，66和已被确定为在YAP1稠合室管膜瘤一个显著增强剂67。可能推测HOPX的表达可能会影响YAP1融合性室管膜瘤的更有利结局32。这些最初的结果将在以后的研究中由更大的队列进行随访。
我们的研究表明，通过LATS1 / 2激酶控制VZ处神经元前体细胞中YAP1 / TAZ活性对于限制其增殖至关重要。在nlsYAP5SA表达后，海马神经元分化受到严重影响。这些结果与以下发现相吻合：NF2是海马信号的正向调节剂，它还通过限制祖细胞数量并促进海马神经元分化来改变海马的形成。通过YAP1介导的影响68，69。我们的LATS1 / 2 cKO小鼠模型数据表明，LATS激酶在抑制祖细胞中的YAP1活性中发挥了作用，因此对限制祖细胞增殖的经典LATS-YAP1信号通路建立了要求。
室管膜瘤的小鼠模型对于理解该肿瘤及其亚型的发病机理以及制定治疗性干预措施非常重要。除了患者来源的异种移植物70，71，室管膜瘤的小鼠模型中，在原点的细胞模拟遗传原因是非常宝贵的用于研究肿瘤的发展57，72，73。例如，从Ink4a / Arf缺失的小鼠中分离出的大脑胚胎神经干细胞，先前在人类室间隔膜瘤33中观察到的遗传畸变，由表达Ephb2的病毒72转化。该小鼠模型，mEP Ephb2re，用于高通量筛选，确定5-氟尿嘧啶是一种有效的治疗方法74，这一假说正在临床上进行测试75。最近，通过用c11ORF95-RELA融合蛋白73转导表达Nestin的小鼠干细胞产生了小鼠模型RELA FUS1。在这两种小鼠模型中，在移植，具有深刻相似之处室管膜瘤肿瘤形成72，73。类似于其他室管膜瘤小鼠模型57，72，在LATS1 / 2 cKOs我们没有观察到莲座或合式伪玫瑰花结，这是在人类室管膜瘤通常观察到的，并且也存在于MEP EPHB2模型71。我们推测这些结构的形成可能取决于肿瘤的大小和种类。
在我们的nlsYAP5SA和LATS1 / 2 cKO小鼠模型中，由增加的YAP / TAZ活性产生的肿瘤位于脑室周围区域，与人中具有YAP1-MAMLD1融合的室间隔瘤相似，始终显示出脑室周围位置，有或没有心室内组件32，在具有RELA稠合室管膜瘤，其倾向于在皮层为中心的位置更经常地出现对比度64。最近的出版物显示，巢蛋白阳性神经干细胞中的YAP1-MAMLD1融合在小鼠中诱发了室管膜瘤样肿瘤57。在该模型中，MAMLD1是YAP1核定位所必需的，并赋予YAP1依赖性基因调控特定的特性57。我们的nlsYAP5SA和LATS1 / 2 cKO小鼠模型表明，仅使用YAP / TAZ活性就足以形成室管膜样瘤样肿瘤。该结果支持融合蛋白如MAMLD1的主要功能可能是YAP / TAZ的核定位和/或激活。重要的是，通过使用转录组学分析，我们发现nlsYAP5SA大脑具有与YAP1-MAMLD1融合室管膜瘤和YAP1-MAMLD1融合诱导的小鼠模型相似的基因表达模式57。当使用具有多个儿科脑肿瘤微阵列分析的数据集时，我们无法证明我们的nlsYAP5SA基因表达数据与室管膜瘤的聚类58。为了建立nlsYAP5SA小鼠模型与小儿肿瘤的一般关系并将其增强为临床前模型，有必要将我们的mRNA测序数据集与下一代儿童脑肿瘤测序数据集（包括YAP1融合室管膜瘤）进行比较。使用通过从具有LATS1 / 2缺失的相同细胞中删除YAP1和TAZ进行的基因拯救，我们证明了这些旁系同源物中的任何一个均可导致肿瘤形成。我们的结果表明，增加的YAP / TAZ活性足以使小鼠出现室管膜瘤样肿瘤。
在这项研究中将转录组学与蛋白质组学结合起来是有利的，因为某些mRNA的变化可能无法反映在蛋白质水平上。蛋白质组学筛选能够检测到约21％的RNA测序筛选中检测到的基因，蛋白质组学命中率最高，表明蛋白质丰度高，因此有可能用作诊断和预后的组织学标记。通过这种推理，我们在IHC中测试了HOPX，并在具有YAP1-MAMLD1融合的肿瘤中显示了高水平的表达。需要进一步研究大量的室管膜瘤亚型，以评估该标志物的亚型特异性。然而，这些数据支持使用nlsYAP5SA和LATS1 / 2 cKO小鼠作为室管膜瘤模型。
我们的蛋白质组学筛查显示，与小胶质细胞相关的蛋白质（例如ANXA1和补体因子）显着增加。来自整个组织的基因组学特征将不可避免地包含所有细胞类型的特征。需要高通量组织染色来阐明肿瘤中的细胞亚型。在我们的LATS1 / 2 cKO小鼠模型中，尽管一些肿瘤标志物高度存在于肿瘤块的中心，例如ANKRD1，Vimentin，CK18，nestin和Ki67，但有些则定位在肿瘤边缘，例如， HOPX，AMOTL2，AXL和小胶质标记C3。对于后一类，将需要进一步的研究来区分Cre重组细胞中YAP1表达的细胞自主作用与YAP1诱导的肿瘤对周围野生型细胞的作用之间的区别。
我们的结果表明，就组织学，免疫学特征和超微结构特征而言，nlsYAP5SA和LATS1 / 2 cKO小鼠模型总体上与室管膜瘤相似。具体来说，nlsYAP5SA小鼠肿瘤的基因表达与YAP1融合室管膜瘤高度相似。我们的研究表明，nlsYAP5SA和LATS1 / 2 cKO小鼠是用于生物学和临床前研究的YAP1融合性室管膜瘤的有价值模型。肿瘤小，早期致死率和缺乏假红斑可能有局限性。可以将互补模型（例如异种移植物）与基因定义的小鼠室管膜瘤模型结合使用，以更全面地了解室管膜瘤。
本研究使用了六名患者的组织。患者（一名成人RELA肿瘤）或法定代表（五个孩子，三个YAP和两个RELA室间隔瘤）给予书面同意。诊断时所有肿瘤未经任何先前的治疗，如化学疗法或放射疗法。
为了对YAP1，HOPX和RELA表达进行IHC组织分析，将患者的组织脱蜡并进行热介导的抗原提取（pH6柠檬酸缓冲液，微波23分钟）。将载玻片与YAP1（1：400，Cell Signaling＃14074），HOPX（1：250，Proteintech＃11419-1-AP），NF-kB p65（1：800，Cell Signaling＃8242）在信号染色稀释液中孵育在4°C下过夜，在二抗中孵育45分钟。将二氨基联苯胺用作发色剂，并将切片用苏木精复染。使用Leica DM2500 LED采集图像。
动物的维护和处理是根据英国1986年《动物（科学程序）法》的规定进行的，并得到了机构伦理审查的批准。将小鼠分组饲养并维持在12小时的明/暗周期中，随意提供食物和水。实验小鼠均未免疫受损。使用雄性和雌性小鼠，并根据基因型将其随机分配至实验组。密切监测LATS1 / 2 cKO和nlsYAP5SA小鼠并定期称重。大部分LATS1 / 2 cKO小鼠在<3周龄时收集。根据我们的项目许可，一部分LATS1 / 2 cKO动物的年龄不超过2个月大，
Nex-Cre（Neurod6 tm1（cre）Kan，MGI：2668659）是Klaus Nave博士的慷慨礼物。Lats1 f / f Lats2 f / f Lats1（tm1.1Jfm）MGI：5568586和Lats2（tm1.1Jfm）MGI：5568589小鼠由R. Johnston博士（美国德克萨斯大学安德森分校癌症中心）友善提供。Ai14（Gt（ROSA）26Sor tm14（CAG-tdtomato）Hze）购自Jackson实验室（股票编号：007908）。YAP1 F / F（YAP1 TM1C（KOMP）Mbp的，MGI：5603606），TAZ F / F（WWTR1 TM1C（EUCOMM）Wtsi，MGI：5603602）小鼠来自巴里汤普森的实验室和nlsYAP5SA小鼠先前所描述的45。
对于脑组织切片染色，将P0小鼠断头，将脑在PBS中的4％冰冷的多聚甲醛（PFA）中固定4天，持续2天。在终末麻醉下，对较年长的动物进行心内灌注4％冰冷的PFA。解剖大脑，并在4°C下在4％PFA中固定过夜。为了进行免疫荧光，用50μm的振动刀制备冠状或矢状切片。将切片用PBS中的10％血清和0.2％Triton-X封闭，并在封闭溶液中与一抗在4°C下孵育过夜。使用的抗体包括AMOTL2（1：100，GeneTex＃CTX120712），ANKRD1（1：100，Proteintech＃11427-1-AP），AXL（1：100，R＆D Systems＃AF854），C3（1：100，Abcam＃ab11862 ），Cre（1：500，Covance＃PRB-106P），Ctip2（1：500，Abcam＃ab18465），GFAP（鼠标1：500，Sigma＃G6171和鸡肉1：1000，Abcam＃ab134436），HOPX（1 ：100，Proteintech＃11419-1-AP），Ki67（1：100/1：300，BD＃550609），MUC1（1：500，Abcam＃ab45167），Nestin（1：100，Millipore＃MAB353），NeuN（1： 100，密理博（Millipore）＃MAB377）和YAP1（兔子1：100，CST＃14074和小鼠1：100，圣克鲁斯生物技术＃sc-101199）。将切片与适当的Alexa fluor 488-，546-或647-缀合的二抗（1：500; ThermoFisher）在室温下孵育2小时。使用DAPI将细胞核染色。将切片用Fluoromount固定在载玻片上。如图所示，图像是使用Olympus IX83或Leica MPSP5 Upright Confocal采集的。将切片与适当的Alexa fluor 488-，546-或647-缀合的二抗（1：500; ThermoFisher）在室温下孵育2小时。使用DAPI将细胞核染色。将切片用Fluoromount固定在载玻片上。如图所示，图像是使用Olympus IX83或Leica MPSP5 Upright Confocal采集的。将切片与适当的Alexa fluor 488-，546-或647-缀合的二抗（1：500; ThermoFisher）在室温下孵育2小时。使用DAPI将细胞核染色。将切片用Fluoromount固定在载玻片上。如图所示，图像是使用Olympus IX83或Leica MPSP5 Upright Confocal采集的。
完成4％PFA固定后，将经过组织学分析的大脑脱水并包埋在石蜡中。将组织切成薄片（4 µm），并为H＆E或IHC准备切片。除非另有说明，否则已应用热诱导的抗原回收（柠檬酸盐缓冲液pH = 6，微波23分钟），并将原液在室温下孵育1小时。以下抗体用于IHC；CK18（1：3000，ThermoFisher＃PA5-14263; Tris-EDTA pH9），GFAP（1：750，DAKO＃z0334），HOPX（1：250，Proteintech＃11419-1-AP），Ki67（1：350， Abcam＃ab16667），MUC1（1：500，Abcam＃ab15481），Nestin（1：600，BD Biosciences＃611659），Rela / NF-kB p65（1：800，Cell Signaling＃8242），（NeuN（1： 600，Chemicon＃MAB377），波形蛋白（1：600，Abcam＃ab92547），YAP1（1：400，CST＃14074;在信号染色（来自CST）中于4°C过夜）。
对于连续块扫描电子显微镜（SBF SEM）和TEM，将小鼠大脑灌注在2％PFA，2.5％GA在0.1 M PB pH 7.4中固定，并在2％PFA在0.1 M中固定至少4–5小时。 PB pH 7.4在4°C下。然后使用Leica VT1000 S振动刀片切片机（Leica）对大脑进行切片。总共收集了50和100 µm切片，并保存在0.1 M PB中。然后将50 µm切片用DAPI染色，并像以前一样成像，以鉴定肿瘤的位置。然后将连续的100 µm切片转移至聚丙烯24孔板（美国布法罗的Caplugs Evergreen），并使用Pelco BioWave Pro +微波（美国雷丁的Ted Pella Inc）进行处理，并遵循美国国家显微镜中心的规程和影像研究协议（可用的最新版本：https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol）。除PB和水洗步骤外，每个步骤均在Biowave中执行，该步骤包括在工作台上进行两次洗涤，然后在Biowave中在不施加真空的情况下于250 W进行两次洗涤40 s。所有化学温育均在Biowave中于真空下以2分钟的步长交替进行，持续时间为14分钟，有/无100 W功率。除非另有说明，否则SteadyTemp板的温度设置为21°C。简而言之，将样品再次固定在0.1 M PB中的2.5％戊二醛（TAAB）/ 4％甲醛中。然后将细胞用2％四氧化（TAAB）/1.5%铁氰化钾（Sigma）染色，在SteadyTemp板设置为40°C的1％硫代碳酰肼（Sigma）中孵育，并进一步用ddH 2中的 2％四氧化染色O.然后将细胞在SteadyTemp板设置为40°C的1％乙酸铀酰水溶液中（Agar Scientific，Stansted，UK）孵育，然后在dH2O中将SteadyTemp设置为40°C洗涤。然后将样品用Walton天冬氨酸铅染色，并将SteadyTemp设置为50°C，并在分级的乙醇系列中脱水（20％，50％，70％，90％和100％，每次两次），然后在300℃下进行三步干丙酮洗涤250 W，持续40 s（无真空）。在25％，50％和75％的丙酮树脂溶液中交换成Durcupan ACM树脂（Sigma），然后进行4个纯Durcupan步骤，在250 W下进行3分钟，并进行真空循环（每30秒间隔开/关），然后在60°C下嵌入48小时。然后使用Devcon S-210环氧胶将试块安装在圆柱形样品架上，以进行微计算机断层扫描（micro-CT）。安装时将脑部的纵轴垂直定向。断层扫描成像是在Xradia Versa 510（卡尔·蔡司有限公司，英国剑桥）中进行的。以xkV / xW捕获低分辨率扫描，x个投影，像素大小为x。使用3DXMViewer软件（Zeiss）识别了感兴趣的区域，并定位了坐标以在Xradia Versa 510中定位。以xkV / xW的分辨率捕获了高分辨率扫描，其中x投影且像素大小为x。将数据导出为tiff，以在ClearVolume（FIJI框架76的插件）中以3D可视化。然后将样品修剪成小的梯形，从树脂块上切下，并使用导电环氧树脂（Circuitworks CW2400）连接到SBF SEM样品架。在开始进行SBF SEM成像之前，将样品涂上2 nm的铂层，以进一步提高电导率。
使用连接到Sigma VP SEM（Carl Zeiss Ltd）的3View2XP（Gatan Inc.，Pleasanton，CA）收集SBF SEM数据。在整个感兴趣区域的整个范围内都采集了反向散射电子图像。对于每个50 nm的切片，一个低分辨率的概览图像（03的水平框架宽度为02/384 µm为800 µm； 03的02/48 nm的像素尺寸为78 nm；使用2 µs的停留时间）和多个高分辨率获得了不同关注区域的图像（03的水平帧宽度为170 / m（03的水平； 03的水平像素宽度为02 / 11.4 nm的像素，使用2 µs的停留时间））。SEM在5 Pa的可变压力模式下运行。使用30 µm的孔径，03的加速电压为2.5 kV，02的加速电压为2 kV。为了获得整个肿瘤足够的3D信息，需要130（用于02）和400（用于03）切片。由于数据是在可变压力模式下收集的，因此只需要对图像对齐进行细微调整即可。所有图像都在Digital Micrograph（Gatan Inc.）中转换为tiff，并且使用FIJI框架的插件TrakEM2自动对齐了tiff堆栈。77。
SBF SEM后，使用UC7超薄切片机（Leica Microsystems，维也纳，奥地利）对样品进行连续切片，并在Formvar涂层的2 mm槽铜网格（Gilder Grids Ltd.，Grantham，UK）上拾取70 nm切片。使用120 kV Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜（FEI Company，埃因霍温，荷兰）查看了第一部分，并使用Orius CCD相机（Gatan Inc.）捕获了图像。
为了进行RNA测序和质谱控制，在P11年龄（每个基因型五只动物）收集了来自两个交配处的nlsYAP5SA同窝仔。此外，收集了三只年龄匹配的C57BL / 6动物。幼犬因颈椎脱臼而被杀死，被斩首并从颅骨中解剖出大脑。嗅球和小脑被分开，并且半球被分开。尽管将右半球放入RNAlater（Qiagen，＃76104），但将左半球速冻在液氮中。
为了进行蛋白质印迹，在P11年龄收集了对照和nlsYAP5SA（每个基因型三只动物）。幼犬因颈椎脱臼而被杀死，被斩首并从颅骨中解剖出大脑。像以前一样，嗅球和小脑被分开，半球被分开，将右半球在液氮中快速冷冻。
使用RNeasy Mini Kit（Qiagen＃74104）根据制造商的规程提取稳定在RNAlater中的组织的RNA。通过GloMax（Promega）对样品进行定量，并使用Agilent TapeStation上的RNA ScreenTape评估RNA质量。所有RNA样品的RIN得分均高于7。使用KAPA mRNA HyperPrep试剂盒（Roche）制备文库，将样品标准化为500 ng RNA输入，并根据试剂盒制造商的说明将其制备到Illumina兼容的文库中。将文库标准化并合并用于测序。测序是在Illumina HiSeq 4000上进行的，该池在2.5个泳道上镜像，每个样本平均产生2700万次读取（±百万次读取）。样品质量控制，
使用CutAdapt 1.5 78对原始的fastq文件进行适配器修剪，并使用R软件包RSEM 1.3.0 79封装的STAR 2.5.2a 78将这些修剪后的读数映射到GRCm38版本86及其相关的整体转录定义，该R包裹RSEM 1.3.0 79用于计算估计的读数计数每个基因。必要时，使用samtools 1.8合并bam文件。80。使用R软件包DESeq2 1.12.3将估计的计数标准化并在基因型组之间调用差异表达的基因。81。调整后的p值≤0.05的基因被认为是差异表达的。热图是使用R软件包pheatmap 1.0.8 https://CRAN.R-project.org/package=pheatmapall生成的使用R 3.3.1（R核心团队“ R：用于统计计算的语言和环境” https://www.R-project.org/）进行了分析。使用包含186个基因集的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt基因矩阵设置为经典富集统计的GSEA 4.0.1 82，完成了完整的预先排名基因列表的GSEA。设置为1000的排列数，经典富集统计，最小和最大分别设置为15和500，用于集合包含。
显著差异表达基因列表上传到DAVID 6.8 83，84有44.8％（887）的KEGG途径找到注解。
为了研究nlsYAP5SA小鼠模型与人类室管膜瘤亚型的相似性，我们利用先前报道的关于人ST-EPN-YAP1和ST-EPN-RELA亚型之间差异表达基因的微阵列数据，这些基因也存在并在YAP1-MAMLD1诱导中差异表达和C11orf95-RELA引起的室管膜瘤小鼠模型31，57。参考文献补充数据6中列出的这些亚型相关的差异表达基因的汇总合成 。将57与我们完整的基因列表以及差异显着表达的基因列表进行了比较。绘制了我们数据集的Log2倍数变化，并使用R 3.5.1从其他数据集中获得了规格说明。
为了将nlsYAP5SA基因表达谱与先前发表的人类小儿脑肿瘤数据集进行比较，该数据集包含：室管膜瘤，胶质母细胞瘤，髓母细胞瘤和毛细胞星形细胞瘤58。在比较分析之前进行的调整：人类Affymetrix微阵列报告了21,050个探针，其中10,347个（49.2％）具有使用最新版本的Bioconductor注释（hgu113aENSEMBL2PROBE）的相应Ensemble标识符。其中，5771（27.4％）被分配了带有带有明确定义的Ensemble标识符的带注释的小鼠同源物的基因符号。这些5750几乎全部包含在我们用于RNA序列分析的注释中。所有这些中有68个具有重复项，而从Affymetrix微阵列的原始21,050个基因探针中总共留下了5682个RNA测序探针。总共将5682个基因表达数据（占初始Affymetrix探针的27％）与我们从Illumina获得的测序结果进行了比较。归一化是按基因进行的：每个数据集分别通过中位居中和每个基因的标准差按比例归一化。然后合并这些缩放的数据集，并将每个基因相同的中位居中和标准偏差缩放应用于此合并的数据集。热图是使用R 3.3.1中的R软件包热图生成的（详细信息请参见上文）。上面描述的数据集和归一化协议的大量减少构成了该实验的重要警告。
液相色谱-串联质谱（LC-MS / MS）用于分析P11 nlsYAP5SA与对照动物相比蛋白表达的差异（n = 5个）。取每只动物的左半球并在含有8M尿素，50mM HEPES pH8.2、10mM 2-磷酸甘油，50mM氟化钠，5mM焦磷酸钠，1mM EDTA，1mM钒酸钠的裂解缓冲液中裂解。 ，1 mM二硫苏糖醇（DTT），1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche），1x磷脂酶抑制剂鸡尾酒，1 µM冈田酸，在冰上孵育30分钟。根据制造说明书，用BCA蛋白质测定法测定蛋白质浓度。用DTT还原每个样品100 µg，用IAA烷基化，用DTT淬灭，并用rLysC（赖氨酸内肽酶，质谱级（Lys-C），21-05063，批号CAR2347）和胰蛋白酶（皮尔斯胰蛋白酶，MS级）消化，90058，批号TK276718）。用三氟乙酸（TFA）酸化后，将样品在C18 MacroSpin柱（Nest Group）上脱盐，然后在液氮中冷冻干燥，然后以vac真空干燥。随后，根据制造商协议，将样品用TMT 10重样品（ThermoFisher，90110，Lot＃TJ268160）标记。确认TMT标记效率（> 99％），并在淬灭标记反应之前进行混合检查。合并样品，部分干燥，然后在C18 SepPak上清洗并等分。随后，使用Pierce高pH反相肽分离试剂盒（ThermoFisher＃84868）将十分之一的样品溶解并分馏为八个馏分。在LC-MS / MS分析之前，将所有样品干燥并在0.1％TFA中溶解。在50厘米处分离肽，75 µm ID Pepmap色谱柱经过180分钟梯度洗脱，并直接洗脱到具有HCD MS2片段的质谱仪（Orbitrap Fusion Lumos ETD）中，并在第二次进样中（每次7 µl）在MS3中进行分析。Xcalibur软件用于控制数据采集。该仪器以数据依赖的采集模式运行，通过HCD片段化为MS / MS选择了最丰富的肽。MaxQuant v1.6.6用于处理通过报告离子定量方法获取的原始数据。根据TMT批号调整了报告离子的同位素分布。蛋白质数据库搜索由Andromeda搜索引擎使用小家鼠序列的Uniprot KB数据库（日期为2016年1月8日）完成。蛋白质组表已上载到Perseus 1.4.0.2中，以进行后续统计分析和数据可视化。双面韦尔奇 在180分钟的梯度下用Pepmap色谱柱洗脱，并直接洗脱到具有HCD MS2片段的质谱仪（Orbitrap Fusion Lumos ETD）中，并在第二次进样（每次7 µl）中用MS3分析。Xcalibur软件用于控制数据采集。该仪器以数据依赖的采集模式运行，通过HCD片段化为MS / MS选择了最丰富的肽。MaxQuant v1.6.6用于处理通过报告离子定量方法获取的原始数据。根据TMT批号调整了报告离子的同位素分布。蛋白质数据库搜索是由Andromeda搜索引擎使用小家鼠序列的Uniprot KB数据库（日期为2016年1月8日）完成的。蛋白质组表已上载到Perseus 1.4.0.2中，以进行后续统计分析和数据可视化。双面韦尔奇 在180分钟的梯度下用Pepmap色谱柱洗脱，并直接洗脱到具有HCD MS2片段的质谱仪（Orbitrap Fusion Lumos ETD）中，并在第二次进样（每次7 µl）中用MS3分析。Xcalibur软件用于控制数据采集。该仪器以数据依赖的采集模式运行，通过HCD片段化为MS / MS选择了最丰富的肽。MaxQuant v1.6.6用于处理通过报告离子定量方法获取的原始数据。根据TMT批号调整了报告离子的同位素分布。蛋白质数据库搜索由Andromeda搜索引擎使用小家鼠序列的Uniprot KB数据库（日期为2016年1月8日）完成。蛋白质组表已上载到Perseus 1.4.0.2中，以进行后续统计分析和数据可视化。双面韦尔奇阈值设置为FDR = 0.05且s0 = 0.1的t检验用于显示显着性。
为了研究蛋白质与特定细胞类型的关联，将数据与来自61的现有数据集合并。从该出版物中，补充数据 15用于鉴定蛋白质与分离的细胞类型的关系，补充数据 8用于包含培养细胞类型的数据。数据集被部分合并（通过匹配基因名称，将其他数据集的每种细胞类型的log2倍表达列整合到我们的细胞中），并且与特定分离的CNS细胞类型的关联由表达值定义为至少三分之一四种分离的细胞类型（星形细胞，小胶质细胞，神经元和少突胶质细胞），其值至少是其他任何一种细胞类型的两倍。
将总RNA和蛋白质列表按基因名称合并，并分别使用stat和Welch差异值作图。注释是在Perseus 1.4.0.2中使用注释集KEGG，基因本体细胞室，分子功能和生物过程完成的。蛋白质组和转录组的2D注释使用Benjamini-Hochberg FDR进行了截断，阈值为0.02。
通过在含0.2 M DTT的样品缓冲液中超声处理，将速冻的小鼠大脑匀浆。裂解液以13,000 g离心 持续15分钟，并且上清液在95℃下变性10分钟。等量的脑溶解产物在NuPAGE 4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）上电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上。用TBST在5％脱脂牛奶中封闭60分钟后，将膜与一抗在4°C下孵育过夜。使用了以下抗体：CTGF（1：1000，Abcam，＃ab6992）; CYR61（1：1000，Abcam，＃ab24448）; GAPDH（1：5000，Abcam，＃ab8245）; GFAP（1：1000，Sigma-Aldrich，＃G6171）; HOPX（1：1000，ProteinTech，＃11419-1-AP）; TAZ（1：1000，Abcam，＃ab84927）; 波形蛋白（1：5000，Abcam，＃ab92547）和YAP1（1：2000，Cell Signalling，＃14074）。随后，将膜与辣根过氧化物酶偶联（HRP）二抗孵育60分钟-HRP偶联小鼠（1:10，000; 杰克逊＃715-035-151）和结合HRP的兔子（1：10,000;杰克逊＃711-035-152）。最后，用ECL系统（Pierce）对膜进行显影，并通过化学发光检测系统（Amersham WB System）进行可视化。使用ImageJ软件（1.52r版）进行蛋白质印迹分析。
对LATS1 / 2 cKO，突变f / +，突变f / f和拯救的三只动物进行详细的肿瘤大小分析。使用深度为50 µm的玻璃纤维刀将大脑切成冠状。第二部分用肿瘤标记物（波形蛋白，YAP1或GFAP）染色，以帮助肿瘤鉴定和DAPI。使用Olympus IX83对所有切片进行评估并成像。使用FIJI在所有切片中测量每个鉴定出的肿瘤的面积，并通过切片厚度并考虑间隙切片来计算体积。进行了Kruskal–Wallis检验，以评估肿瘤大小是否在任何其他组之间显着不同（p = 0.0009）。事后进行了邓恩的多重比较测试，以识别哪些组是彼此重要的。
此外，通过将基因型编码为有序因子（突变f / f <突变f / + <LATS1 / 2 cKO）并拟合以动物为随机效应的线性混合效应模型来确定基因型变化对估计量的影响使用来自MASS软件包的功能glmmPQL并调用“ glmmPQL（vol〜geno，random =〜1 | animal，“ gaussian”）” lm（vol〜geno / animal）的诊断图表明，残差的正态性和异方差是合理的假设，但混合效应函数用于假设检验，以解释基因型内动物的“正确”筑巢。基因型的二次项 无关紧要（p = 0.8764）。
使用GraphPad Prism 7软件（R 3.3.1或R 3.5.1）使用文中所述的统计测试进行统计分析。统计显着性可视化为：ns =不显着（p > 0.05），* = p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001，**** = p <0.0001。
使用三只小鼠进行了所有免疫染色实验，并选择了代表性图像作为数字。对于TEM，由于资源有限，已经在两只动物身上进行了实验；LATS1 / 2 cKO小鼠中观察到的所有特征（微绒毛，紧密连接）均在两只小鼠的整个肿瘤中发现。
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