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单克隆抗体制备-动物免疫

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发表时间:2019-07-01 16:49作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

单克隆抗体制备动物免疫

(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加,同时可以减轻筛选的工作量。因此,免疫抗原是越纯越好,应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说,抗原的来源有限,或性质不稳定,提纯时易变性,或其免疫原性很强,或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等,免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯,但抗原中混杂物很多,特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同,也可是不同的纯度,这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。

(2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为,所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠,所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交,则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失。就小鼠而言,初次免疫时以8-12周龄为宜,雌性鼠较便于操作。

(3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射,也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射,目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好,许多实验室的结果表明,初次免疫和再次免疫应答反应中,取脾细胞与骨髓瘤细胞

融合,特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天,在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体,再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系,且多在血清抗体高峰之前。因此,为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞,这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫,可提高小鼠对抗原的免疫反应性,且节省时间,一般免疫3天后即可融合。

体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原,对于免疫原性很弱或对机体有害(如引起免疫抑制)的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此,针对这些情况,可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞(或淋巴结细胞,或外周血淋巴细胞)取出体外,在一定条件下与抗原共同培养,然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏,制成单细胞悬液,用无血清培养液洗涤2-3次,然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中,再加入适量抗原(可溶性抗原0.5-5ug/ml,细胞抗原105-106个细胞/ml)和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液;在376%CO2浓度下培养3-5天,再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。



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