摘要
在RV144试验中，疫苗诱导的V1V2 IgG与HIV-1风险降低相关。我们在南非进行的两项1期痘病毒初蛋白加强免疫临床试验中研究了循环抗体的特异性：HVTN 097（B / E型）和HVTN 100（C型）。通过跨亚型肽微阵列和多重结合测定，我们探讨了循环抗体对线性可变环2（V2）和构象性V1V2特异性的反应的幅度和广度。HVTN 097和HVTN 100分别引起针对线性V2表位（RV144中HIV-1风险降低的相关因素）的抗体，分别高达100％和61％。尽管与HVTN 097相比，HVTN 100的包络特定响应幅度更大（p均<0.001），与HVTN 097相比，HVTN 100中V2线性表位和V1V2蛋白的强度和阳性率显着降低。同时，与HVTN 100相比，对其他主要线性表位（包括可变3（V3）和恒定5（C5）表位）的响应更高根据HVTN097。我们的数据显示，在这两个金丝雀痘初免蛋白加强试验中，疫苗诱导的循环抗体特异性存在显着差异。我们的发现表明，初免-加强型疫苗方案中病毒序列的选择以及潜在的佐剂和免疫原剂量会影响V2特异性抗体的产生。我们的数据显示，在这两个金丝雀痘初免蛋白加强试验中，接种疫苗诱导的循环抗体特异性存在显着差异。我们的发现表明，初免-加强型疫苗方案中病毒序列的选择以及潜在的佐剂和免疫原剂量会影响V2特异性抗体的产生。我们的数据显示，在这两个金丝雀痘初免蛋白加强试验中，接种疫苗诱导的循环抗体特异性存在显着差异。我们的发现表明，初免-加强型疫苗方案中病毒序列的选择以及潜在的佐剂和免疫原剂量会影响V2特异性抗体的产生。
许可疫苗的最著名的保护关联涉及抗体反应1。在RV144试验被确定为第一个报告HIV-1感染减少的预防性HIV疫苗功效试验2之后，在确定风险相关性方面取得了进展。在泰国测试的异源初免-加强病毒RV144方案使用了带有亚型AE包膜（env）糖蛋白120（gp120）插入片段的金丝雀痘载体（ALVAC-HIV）的初次疫苗和B / E二价gp120的加强疫苗。HIV-1风险降低的主要相关因素是对HIV包膜3的可变环1和2（V1V2）的IgG结合反应。。二级和探索性相关分析揭示了V2特异性抗体免疫相关性的进一步证据：线性V2 IgG 4，V2 IgG宽度5，V1V2 IgG3 6和V1V2特异性补体结合抗体7与降低感染风险相关。从感染的疫苗接受者和安慰剂接受者获得突破性病毒序列的筛分分析表明，疫苗诱导的V2 8氨基酸（aa）169和181位的免疫压力。
RV144之后进行的非人类灵长类动物研究支持了V2非中和抗体对于保护免受实验性攻击的重要性。疫苗引起的IgG V2与延迟相关SIV 9，10，11，12，13和SHIV采集14，并用SIV感染后病毒血症的控制13。830 A（一种V2特异性单克隆抗体（mAb））的被动转移可改善非人类灵长类动物15的病毒血症控制。
许多研究已经报道抗病毒功能，包括抗体的Fc效应子功能和通过识别V2抗体所介导直接中和7，16，17，18，19，20，21，22。从RV144疫苗接受者中分离出的识别aa169的V2特异性mAbs介导1级中和，结合感染性病毒粒子23并介导杀死主要HIV-1分离株感染的细胞16。Aa169位于由RV144疫苗引发的抗体结合的线性表位序列中，该抗体与降低的HIV-1风险相关4。RV144诱导的V2免疫压力的另一个已知位点aa181，也是亮氨酸-天门冬氨酸-异亮氨酸/缬氨酸（LDI / V）aa179-181序列基序的一部分，据报道该基序介导HIV-1包膜与肠道粘膜的相互作用归巢整合素α4β7以促进细胞与细胞间的价差19，20。它已经假定V2特异性抗体可阻断或与α4β7和HIV-1包膜之间的相互作用，以防止病毒传播干扰19，20。在RV144试验和RV305试验的参与者（其中给予RV144参与者延迟加强免疫）中，一组V2特异性mAb被证明能够阻断AE.92TH023 V2肽与α4β7的结合24。阻断α4β7的抗体既包括针对线性V2热点的抗体，也包括针对构象表位的抗体25。V2特异性抗体可介导的吞噬作用18，26，27，并且可以与C1-C2特异性IgG协同增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）28。此外，涉及V2环季表位被确定为一个目标为广泛中和抗体21，29。
建立了痘蛋白公私合作伙伴关系（P5）计划，以开发基于RV144方案30的 C型亚型疫苗。作为该计划的一部分，在南非设计了两项1/2期试验：HIV疫苗试验网络（HVTN）097 31（ClinicalTrials.gov NCT02109354）确定了非洲人群对RV144方案的免疫反应，以及HVTN 100 32（ ClinicalTrials.gov NCT02404311）研究的方案的免疫原性适合于亚型C.的选择标准为C亚型包膜免疫原包括在由V2-特异性mAb结合和亲和力33，34。对照预定的免疫学标准评估了HVTN 100的主要免疫学数据，并指导了将疫苗接种方案纳入功效试验HVTN 702的决定。HVTN100中疫苗引起的应答符合所有四个预定的继续进行/不通过标准HVTN 702试验的结果，包括包膜结合和结合V1V2的IgG反应32。
我们的研究概述了由HVTN 097（也用于RV144试验）和HVTN 100试验中使用的疫苗引起的V2定向应答的异同。因此，我们证明了包膜序列选择在优化对疫苗保护至关重要的表位特异性抗体反应中的重要性。
HVTN 097（第1阶段）31和HVTN 100（第1-2期）32临床试验均评估了南非的金丝雀痘病毒载体初免和二价包膜gp120蛋白增强疫苗方案。两种方法之间的差异包括：（1）HVTN 097中的ALVAC包膜疫苗株分别为92TH023和gp120增强的A244和MN，而HVTN 100包含ALVACprim的ZM96序列和gp120的1086和TV1。促进; （2）HVTN 097的助剂是氢氧化铝，而HVTN 100的助剂是MF59；（3）HVTN 097的蛋白质剂量是HVTN 100的3倍；（4）HVTN 097中ALVAC-HIV的实际剂量是HVTN 100中的2.7倍（参考文献35）和未发布的数据）；（5）删除了gp120 N末端的11个氨基酸（aa）序列，并用单纯疱疹病毒（HSV）gD序列替换了gp120蛋白，将其用作HVTN 097的增强蛋白，而未进行类似的修饰HVTN 100 gp120构建体33。
为了在我们的分析中进行比较，在两项试验中，均对第二次蛋白增强后2周（第一次ALVAC初免后6.5个月）获得的样品进行了所有免疫学评估。
我们曾经报道过HVTN 097和100 HVTN引起的gp120的IgG反应高幅度32，35。测量在6.5个月（第二次二价蛋白加强免疫后2周）收集的血清样品对gp120抗原的结合反应，该抗原与HVTN 097和HVTN 100中的5种C和E HIV-1包膜亚型疫苗株相同，相同： 50血清稀释度（图 1A）。在两个针对菌株匹配包膜的试验中，gp120s的应答率均很高（> 95％），而两次试验之间的应答率没有差异。在那些具有阳性抗体应答的HVTN 100疫苗中，与带有HCTN 097疫苗的HVTN 097疫苗相比，针对疫苗匹配的C型亚型gp120包膜蛋白1086C和TV1.C的幅度明显更高（p's <0.001，双面Wilcoxon秩和检验）。疫苗匹配的AE gp120亚型包膜蛋白A244的阳性反应。
与HVTN 097相比，HVTN 100中的gp120应答较高，而V1V2应答较低。针对与疫苗匹配的gp120抗原（A）和一组C型gp70 V1V2抗原（B）的结合强度（仅基于阳性应答者）进行箱线图分析）以HVTN 100（所有可用的每个协议参与者，N = 185）和HVTN 097（所有可用的每个协议参与者，N = 73）在BAMA中测量。在每个面板的顶部指示包膜抗原。正响应者显示为彩色圆圈，负响应者显示为灰色空心三角形。每个框的顶部列出了阳性率和响应者数量。未调整的响应率（p.rate）和幅度（p.mag）的p值列在每个面板的顶部。此处显示的数据是1:50的血清稀释度，低于先前32报道的HVTN 100的1：200 （因此抗体浓度更高），与先前35报道的HVTN 097相同。
我们先前曾报道，与HVTN 100 32相比，RV144的C V1V2亚型IgG应答的幅度和广度更高。在这里，我们评估了与HVTN 097相比在HVTN 100中的C型V1V2 IgG应答。在第二次加强免疫后2周，对来自HVTN 100和HVTN 097疫苗接种者的血清进行了抗体与一组C型包膜V1V2蛋白结合的评估（图 1B）。）。与HVTN 100相比，HVTN 097中的V1V2 IgG应答率更高，在6种V1V2蛋白中有5种达到统计学显着性（p <0.001，双向Fisher精确检验，图 1B））。C亚型V1V2蛋白对HVTN 097的阳性应答率在65.7％至97.1％之间，而HVTN 100的阳性应答率在46.2％至58.7％之间。此外，与HVTN相比，HVTN 097中的V1V2抗体应答幅度更高100种，其中6种V1V2蛋白中的3种达到统计学显着性（p <0.001，图 1B，双面Wilcoxon秩和检验）。
为了阐明在HVTN 097和HVTN 100中引发的抗体的特异性和广度，我们使用交叉亚型肽库绘制了第二次加强免疫后2周后血清样品的线性表位结合特异性，该文库包括用于所有6种疫苗株的重叠肽这两项试验加上7种共有菌株（评估2058个肽序列）36。选择了HVTN 100中的53个疫苗接受者和5个安慰剂接受者，以及HVTN 097中的45个疫苗接受者和5个安慰剂接受者进行分析（请参阅选择方法和基于选择方法的加权平均值的计算）。在两项研究中均观察到与线性V2肽的结合，并且在两项研究中均主要与C 1086亚型，AE A244亚型和AE 92TH023亚型肽结合。还观察到与亚型B MN V2肽的结合，但仅在HVTN 097中观察到（图 2A）。峰V2区响应跨越了阵列文库中对应于aa163-180的肽＃53序列（对于AE.A244，C.1086和AE.92TH023）或肽＃54序列（对于B.MN）。标准HXB2编号（图 2A，B）。该肽区域是令人感兴趣的，因为与线性V2热点结合的抗体与RV144 4中HIV-1感染的风险降低相关。与HVTN 100相比，HVTN 097中针对V2热点的抗体强度和阳性率均更高（图 2A，表 1）。阳性率最高的是针对AE.A244 V2热点肽，HVTN 097和HVTN 100分别为100％和61％。相反，两项研究中C.1086的阳性率均低于AE.A244，对于HVTN 100和HVTN 097分别为40％和88％（图 2A）。）。HVTN 100和HVTN 097之间V2热点结合的强度和阳性率的差异均很显着（p <0.0001，HVTN 100 <HVTN 097，Wald试验通过增强的逆概率加权估计方程比较了所有疫苗接受者的平均强度或阳性反应率[请参见统计分析]），适用于AE.A244，AE.92TH023，B.MN和C.1086（表 1）。值得注意的是，AE.A244和AE.92TH023 对于V2热点共享相同的氨基酸序列（图 2C），因此，正如所预期的，这两个菌株对V2热点的响应的幅度和阳性率相同。
与HVTN 097相比，HVTN 097中更高的V2热点线性表位结合。通过线性表位作图测得的第二次蛋白质增强后2周，与HVTN 100和HVTN 097中的线性V2表位的结合。（A）与gp120的V1V2区域中的重叠肽结合（log 2倍的免疫后/预免疫）的幅度。粗实线代表每个研究中所有疫苗接受者的加权均值（请参阅统计分析），而细虚线代表单个疫苗的结合。在每个图的顶部列出的是阳性率，如图例中所示，为每个组用颜色编码，以绑定到V2热点。（B）C.1086和AE.A244涵盖V2热点的重叠肽序列。（C）以HXB2序列和编号为参考，对HVTN 100和HVTN 097中包含的6种疫苗菌株的序列V1V2区进行比对。包含在阵列文库（TV1.ArrayLib）中并用作疫苗株（TV1.GSKvac）的TV1序列不相同，因此都包含在内。
除了针对疫苗株C.1086，AE.A244，AE.92TH023和B.MN的与V2热点结合的抗体外，对于几种共有株（A.Con，AE.Con ，在HVTN 097中，但是对于HVTN 100则没有这种活性（表 1，图 3A）。这些结果表明，与HVTN 100相比，HVTN 097中存在更广泛的V2热点结合反应。
线性线性表位特异性HVTN 100与HVTN 097的不同焦点。在第二次蛋白质增强后2周，以线性线性表位作图为特征，在HVTN 100和HVTN 097中引发的抗体的线性特异性。（A）具有加权平均值（见统计分析）的结合强度（免疫前/免疫后2倍）的热图，比较了线性表位作图中测得的HVTN 100，HVTN 097和安慰剂。表位作图微阵列中使用的肽库包含重叠的肽，覆盖了该图中列出的13个共有序列和病毒包膜序列（另请参见方法和表 S2））。黑色粗线将疫苗组分开。每行代表一个菌株，虚线将C型（顶部）和B / E型（中间）疫苗株以及共有序列（底部）分开。恒定区和可变区标记在顶部，相关的肽号显示在底部。单个样品的最小阳性截止值为1.58（对数2折叠）。有关阳性标准，请参见方法。（B）确定的线性表位的定义。（C）散点图，显示与各表位结合的强度，如每列顶部所示。与每个表位的结合强度是对表位区域内单个肽的最高结合强度，如3B所定义。黑色横线代表所有疫苗接种者的加权平均值（请参阅统计分析）。实心圆表示肯定的响应，空心灰色三角形表示否定的响应。阳性率（已调整重量，请参见统计分析）显示在数据点上方，并相应地进行颜色编码。V2.hs- V2.hotspot。（D）蜘蛛图显示了每个主要表位的结合宽度（涵盖6种疫苗菌株）。在任一研究中，主要表位均定义为任何菌株中阳性率> 75％的表位。在每个图的周围都标记了6种疫苗株，从上到下依次为：C.1086，C.TV1，C.ZM651，AE.A244，AE.92TH023和B.MN。绘制的值是每个研究的加权平均值（请参阅统计分析）。
使用从上述肽微阵列获得的数据，比较第二次蛋白加强免疫后2周血清样品中在HVTN 100和HVTN 097中引发的抗体的线性gp120表位特异性。在这两项试验中，抗体反应均针对跨gp120的C1，V2，C2，V3和C5区域中的线性表位（图 3A））。尽管在这两项研究中公认的大多数线性表位都相似，但HVTN 097仅针对C1和C2中的几个表位，尽管幅度很小。在HVTN 100中，强烈的V3 IgG反应在所有测试的亚型C疫苗株以及A，B，C，AG和M亚型（即A.con，B.con，C.con，AG）的共有序列中占主导地位。 con和M.con）。另外，对C2线性表位的抗体应答是针对B.MN的应答的主要部分，并且与V3一起对于与C.ZM651，AG.con和M.con的结合是主要的。C2，V3和C5特异性是与C.TV1结合的主要因素，而C5和V3响应则是与C.con结合的主要因素。在HVTN 097中，对于AE.A244和AE.TH23，对线性V2的响应占主导地位，对于C.1086，与V3的响应共同占优势，而对于其他菌株， 3A）。
接下来，我们比较了抗体IgG与HVTN 100和HVTN 097中引发的线性表位结合的幅度和阳性率（图 3B，C）。观察到多个表位存在显着差异，其中V2热点（多种菌株，HVTN 097> HVTN 100），C1-V1（AE。）表现出最深刻的差异（幅度或阳性率p <1×10 -16）。 A244，HVTN 097> HVTN 100），C2.3（多个菌株，HVTN 097> HVTN 100），V3（多个菌株，HVTN 100> HVTN 097），C5.2（多个C型亚型，HVTN 100> HVTN 097）和C5.3（多种菌株，HVTN 100> HVTN 097）（p <0.001， 图1，补充表 S1）。
我们进一步检查了与主要表位结合的IgG的相对大小和广度。在任一试验中，对于任何疫苗株，主要表位均定义为阳性率> 75％。如图3D中的蜘蛛图所示 ，与HVTN 100相比，HVTN 097中针对V2热点的抗体的强度和广度相对较高。但是，与C2.3结合的强度和广度（C.TV1和C.ZM651） ，TN3的V3（尤其是C型亚型），C5.1，C5.2（C.TV1和C.ZM651）和C5.3相对于HVTN 097相对较高。总体而言，这些数据表明，就引起的抗体反应的线性表位特异性而言，这两种痘病毒初免蛋白加强疫苗方案。
RV144泰国疫苗功效试验的有希望的结果激发了人们对优化疫苗免疫原策略以应对世界上受影响最严重地区的HIV流行的兴趣。两个主要考虑因素指导了对南非痘病毒-蛋白质初免-加强策略的进一步探索。首先，尚不知道是否必须对该疫苗进行修饰以编码C型亚型的抗原，C型是在该流行病最明显的撒哈拉以南非洲最普遍的HIV亚型。其次，尚不清楚是否可以通过使用相似的初免-加强方案在不同人群中进行的另一项疫苗试验来证实RV144中鉴定的免疫相关性。HVTN 097和HVTN 100试验均在南非进行，采用了痘病毒载体初免/蛋白质增强的相同策略，但测试了由载体启动子表达并作为gp120蛋白增强剂施用的不同HIV-1包膜抗原。尤其是，针对HVTN 100的增强抗原来自南部非洲C型亚型HIV菌株，并根据其抗原性，可制造性和临床前免疫原性进行选择，目的是增强南非遗传相关菌株的免疫覆盖率33，34。在HVTN 100的第4次接种（第二次二价gp120加强免疫）时间点两周后进行免疫原性评估，结果显示亚型C ALVAC /二价gp120疫苗具有强烈的体液反应 32。与RV144相比，HVTN 100疫苗接种者对gp120抗原的IgG应答具有与疫苗相匹配的序列，在阳性应答者中的应答率和强度更高，而与RV144相比更高。在RV144中。但是，对1086.C（病毒增强HVTN 100的包膜菌株之一）的V1V2区的应答率低于RV144对疫苗序列匹配的AE.A244 V1V2的应答率。这就提出了一个问题，即在HVTN 100中观察到的比RV144更低的V1V2反应是否反映了参与者群体的差异，以及在HVTN 100中不同的C亚型C ALVAC / gp120免疫原方案是否引起了与B / E亚型相同的V2特异性。 RV144。在此分析中，
与以前的结果类似，与RV144 32在HVTN 100中的gp120结合反应相似或更强，我们发现与HVTN 097相比，在HVTN 100中对相应疫苗匹配抗原的gp120结合反应水平明显更高。这些数据表明总体C HVTN 100亚型的免疫原性不亚于B / E HVTN 097亚型的免疫原性。但是，与HVTN 097相比，在HVTN 100中与V1V2支架蛋白抗原（包括C型V1V2抗原）的结合要低。这与先前对HVTN 100与HVTN 097和RV144之间的V1V2反应的比较结果一致，其中更高的结合强度据报道，与HVTN 100相比，HVTN 097和RV144中的V1V2蛋白（32，Zhao，Fiore-Gartland，等。PLoS One 2020，印刷中）。
这些结果表明，在HVTN 100和HVTN 097中均引起了V2特异性IgG反应，并且两种疫苗均靶向相同的V2线性表位。但是，即使对于C型亚型，HVTN 100中的线性V2热点响应的幅度和阳性率也比HVTN 097低。在两个研究中，线性V2结合反应的阳性率在AE.A244和AE.92TH023中最高，在HVTN 100和HVTN 097中阳性率分别为61％和100％。在HVTN 100中引发的V2热点抗体优先于AE.A244 V2序列，而不是亚型C V2线性序列。在HVTN 100中，对TV1 V2线性表位的结合反应最小（阳性率为16％）。对TV1 V1V2 gp70支架的反应率为58.5％。但是，其中包括针对V1的回复，与HVTN 100中的其他菌株相比，TV1菌株对它们的结合反应相对更频繁。疫苗菌株的序列比对显示，C.1086与AE.92TH023在V2热点区域的两个氨基酸不同，并且更接近AE.A244比在阵列文库中测试的任何其他菌株都适合该表位。C.1086和AE.A244的V2热点序列之间的相对较高的序列相似性，在两个试验中都将V2热点结合反应集中在这两个菌株上以及对C.TV1 V2热点的结合反应较差，这表明HVTN 100疫苗方案中的三个包膜免疫原中，C.1086包膜对线性V2反应的贡献最大。与AE.A244 V2热点相比，与AE.A244 V2热点的结合响应强度更高。HVTN 100中的1086 V2热点表明AE.A244 V2区是AE.A244或C.1086 Env引发的V2 IgG的更好配体。同时，与HVTN 100相比，HVTN 097中对C.1086和AE.A244 V2热点的结合反应更高，这表明AE.A244 Env的免疫原性也优于C.1086 Env。对HVTN 100中C.TV1 V2区的抗体应答较低，这表明其他C型候选疫苗可以通过包含具有更多免疫原性V2区的抗原来改善HVTN 100中观察到的C型或交叉亚型V2抗体应答。对于V2特异性，A244 Env也是比C.1086 Env更好的免疫原。对HVTN 100中C.TV1 V2区的抗体应答较低，这表明其他C型候选疫苗可以通过包含具有更多免疫原性V2区的抗原来改善HVTN 100中观察到的C型或交叉亚型V2抗体应答。对于V2特异性，A244 Env也是比C.1086 Env更好的免疫原。对HVTN 100中C.TV1 V2区的抗体应答较低，这表明其他C型候选疫苗可以通过包含具有更多免疫原性V2区的抗原来改善HVTN 100中观察到的C型或交叉亚型V2抗体应答。
除了对V2热点的反应外，另一潜在重要的抗V2反应可能是可能干扰α4β7整联蛋白结合的反应。因此，我们寻找抗体结合覆盖V2中LDI / Vα4β7结合位点的肽的证据。微阵列文库中的＃57肽是围绕LDI / V基序的肽。我们的数据显示，仅在很小一部分受试者中，HVTN 100和HVTN 097中与该肽的结合有限，通过任何一项试验，任何给定菌株的阳性率均低于7.5％。因此，如通过肽微阵列测量的，直接靶向线性LDI / Vα4β7结合位点的抗体不太可能显着促进涉及gp120-α4β7与这两种疫苗方案相互作用的潜在保护机制。不过，24，25，和更近的研究 22表明，一组V2的线性表位结合的抗体（V2P） 26，可以阻止α4β7在aa170-172结合识别涉及潜在α4β7结合次级行列式螺旋构象V2 37，其V2热点重叠。因此，即使在这项研究中直接靶向LDI / V基序的结合反应极少，其他V2抗体（包括靶向线性V2热点的抗体）也可能会干扰V2-α4β7相互作用。
除了HVTN 100和HVTN 097在载体和蛋白免疫原中疫苗株序列的差异外，佐剂和蛋白质剂量也有所不同：HVTN 097使用无机佐剂（氢氧化铝），而HVTN 100使用有机佐剂。佐剂（MF59，油包水基于角鲨烯乳液与声称剂量节约效应38，39）; HVTN 100中的蛋白质剂量是HVTN 097中的蛋白质剂量的1/3；HVTN 097中的ALVAC剂量是HVTN 100中的ALVAC剂量的2.7倍。但是，与RV144和HVTN 097相比，HVTN 100中更强或更相似的包膜gp120响应表明HVTN 100中较低的V2结合响应可能是由于疫苗株的序列差异，而不是剂量和佐剂差异，往往会影响整体结合抗体反应。先前的研究40比较了ALVAC vCP1521（AE.92TH023）初免，随后是作为二价B / E增强疫苗一部分的不同疫苗序列。与我们的研究一样，它包括相似的佐剂和蛋白质剂量差异（分别是MF59和MF59，前者是后者的3倍）。与我们的研究相反，明矾佐剂研究的Env gp120和V1V2 IgG应答均高于MF59佐剂研究。因此，在我们的研究中，与HVTN 097相比，HVTN 100的gp120应答较高而V1V2应答较低，这可能是由于方案中的病毒序列差异而不是剂量或佐剂差异引起的。支持该结论的是，抗体与其他主要HIV-1包膜表位结合的差异与V2反应的方向相反（即，
正在进行进一步的研究，以测试其他可以补充启动子和增强序列中两个序列的C型亚型，以提高V2响应强度和跨C型亚型的覆盖率（Korber，Haynes，个人交流）。此外，与HVTN 100相比，即使是针对C型亚型，与HVTN 100相比，HVTN 097中更强的V2反应表明，疫苗中可能包含C型亚型的疫苗中的E型亚型抗原，以增强V2抗体应答。纳入具有已证明的V2免疫原性的亚型E Env（例如A244）并为最佳V2抗体反应精心选择C型抗原的异源加强免疫可能值得进一步探索南部非洲的C型流行。另外，痘病毒初株AE之间的V2热点序列相同。41。因此，在优化未来的疫苗接种方案时，应考虑初免和加强免疫原之间的相似性，尤其是针对V2区。最后，HVTN 097 gp120蛋白在gp120的N端包含11-aa缺失，而HVTN 100 gp120蛋白没有类似的修饰。已显示A244中的N末端缺失可增强A244 gp120的免疫原性，包括V1V2 IgG反应 42而其他gp120抗原（包括C.1086）在N端11-aa缺失并没有产生相似的结果。正在进行的HVTN 702功效试验中正在研究的一个假设是，疫苗诱发的V1V2 IgG抗体是否与世界C型亚型中HIV-1感染的风险降低相关。正在进行的1期试验正在测试不同的免疫原和佐剂组合，以期确定可增加C V2亚型亚型应答的广度和/或强度的方案，以供将来的后续试验30。
除了诱发V2特异性抗体的差异外，HVTN 100和HVTN 097的诱发其他线性表位特异性的抗体也有所不同。即使这两个疫苗试验针对的是HIV包膜的相同主要区域（定义为在任何一项研究中测试的任何菌株，其阳性率均> 75％的表位），两次试验之间抗体对特定序列的反应程度和广度也有所不同。HVTN 097引起更高的C1.2线性表位结合强度以及与V2热点的结合强度和广度，而HVTN 100引起更高的结合C5.1和C5.3的强度和广度，而C型亚型菌株的结合的强度更高。至C2.3和C5.2。总体而言，最高平均幅度（对数2HVTN 100中IgG线性表位应答的折叠是针对V3（对于C.1086，是9.2），C5.2（对于C.TV1，是8.1）和C2.3（对于C.TV1，是8.8）。相反，对于HVTN 097，IgG线性表位应答的最高平均幅度为V2（AE.A244为7.9）和V3（AG.con为6.4）。值得注意的是，这与我们在使用HIV-1包膜免疫原的非人类灵长类疫苗研究中的发现相符，在所有测试中，除带有AE.A244 gp120蛋白作为免疫原增强剂的一项研究外，所有V3应答均占主导地位36。此外，在HVTN 100和HVTN 097中，针对线性V3表位的抗体均表现出交叉亚型广度，在两项研究中，针对所有6种疫苗菌株的阳性率均> 65％，而大多数共有菌株的阳性率均> 65％。相反，针对线性V2热点的抗体显示的宽度有限，对于AE.A244，AE.TH023和C.1086的阳性率，对于HVTN 100为40％至61％，对于HVTN 097为88％至100％。对于HVTN 100，测试的共有序列的V2应答率均<10％，对于HVTN 097均<30％。V2线性应答的有限范围凸显了在高HIV-1区域疫苗覆盖不同V2序列的挑战包膜序列多样性，尤其是在V2区域43中。
我们分析的一个警告是，精细的线性表位作图不能测量针对构象或四级表位的结合抗体反应。然而，在HVTN 100和HVTN 097之间观察到的线性特异性差异表明疫苗方案具有不同的免疫原性。检验这些非线性表位差异的进一步研究应更加阐明这些C型亚型和B / E型亚型免疫原和疫苗接种方案的免疫原性差异。尽管与HVTN 097相比，HVTN 100中的V2响应较低，但HVTN 100引发了针对HIV-1包膜的有效和跨亚型结合抗体应答，与HVTN 097相比，多个主要表位的应答强度更高。随后评估了抗体的功能，需要在这些研究中引发的图 44来全面了解这些方案在免疫原性方面的差异。另外，在南非测试类似RV144的痘病毒初免/蛋白质增强疫苗的目标之一是观察是否可以通过C型亚型疫苗重复RV144中鉴定的HIV-1风险降低的相关性。我们的研究发现，V3的反应是用于HVTN 100相比HVTN 097更高，表明有机会就V3的IgG跟进作为一个潜在的有相互关系降低HIV-1采集风险 4，45中使用相同的HVTN 702药效试验HVTN 100 30疫苗方案。但是，在HVTN 100中观察到的实质上较低的V1V2反应是该方案疫苗效力的潜在问题。HVTN 702将帮助解决RV144中鉴定出的较低水平的V1V2相关性是否会转化为降低的疫苗效力。
总而言之，我们的研究显示，与HVTN 097和RV144临床试验相比，HVTN 100引起的抗体反应在数量和质量上都存在差异，特别是针对V2热点表位的抗体反应量与降低的风险相关R144疫苗接种者中的HIV-1感染4。我们的数据还证明了疫苗抗原可能对所引发的抗体特异性具有实质性影响，并强调了在针对所需抗体特异性的初免和加强免疫原中选择包膜序列的需求。
所述HVTN 097的产品和疫苗时间表的相同。对于RV144，并列入ALVAC-HIV vCP1521（表达的env与亚型B LAI株的gp41的跨膜序列连接亚型E毒株92TH023的gp120的，以及GAG和蛋白酶（来自B亚型LAI株）（Sanofi Pasteur）在第0和1个月，以及ALVAC-HIV vCP1521加上氢氧化铝佐剂的二价B / E gp120蛋白（E亚型的A244和来自B亚型的MN）（第3和6 2个月的全球传染病解决方案）。MN和A244 gp120的构建体均在gp120 N端缺失了11个氨基酸，并插入了HSV gD肽标签代替了突变46。HVTN 097中ALVAC-HIV vCP1521的实际剂量为5.2×10 7 CCID 50 35；gp120蛋白的剂量为每种蛋白300 µg，与RV144 2相似。
所述HVTN 100个方案包括ALVAC-HIV vCP2438（表达的env与亚型B LAI株的gp41的跨膜序列，以及链接C亚型菌株ZM96C的gp120的GAG和蛋白酶（赛诺菲巴斯德）从亚型B LAI菌株）在几个月0和1，以及ALVAC-HIV vCP2438加上MF59佐剂的二价C亚型g gp120（C.1086和C.TV1 C亚型菌株）33（GSK疫苗）在第3、6和12月32日。HVTN 100中ALVAC-HIV vCP2438的实际剂量为1.9×10 7 CCID 50（未发布的数据）；gp120蛋白的剂量为每种蛋白100 µg。
HVTN 097试验获得了Witwatersrand大学人类研究伦理委员会对Klerksdorp和Soweto场所的批准，并由开普敦大学伦理委员会对开普敦的场所进行了批准35。该试验已在美国国立卫生研究院临床试验注册中心（ClinicalTrials.gov NCT02109354）和南非国家临床试验注册中心（SANCTR编号：DOH-27-0313-4201）注册。HVTN 100试验得到了威特沃特斯兰德大学，开普敦大学，夸祖鲁-纳塔尔大学和医学研究理事会的研究伦理委员会的批准32。从HVTN 097和HVTN 100的所有受试者中获得知情同意。所有实验方法均根据相关指南和规定进行。
如先前所述，通过定制的HIV BAMA进行结合抗体多重测定47。简而言之，将羧化的荧光珠（Luminex Corp.，Austin，TX）共价偶联至Env gp120蛋白和gp70-V1V2支架，并与稀释的血清样品一起孵育。用生物素化的山羊抗人IgG检测抗原特异性IgG，然后用链霉亲和素PE孵育。然后洗涤珠子并在Bio-Plex仪器上采集以测量荧光强度。BAMA在符合GCLP的条件下运行，包括使用符合21CFR Part 11的软件通过Levy-Jennings图表跟踪阳性对照。对所有具有6.5个月和13个月可用样本的HVTN 100和HVTN 097每方案（PP）疫苗接受者进行BAMA血清样本分析（HVTN 100和HVTN 097分别为185和73）。PP是指收到的前四个预定疫苗接种，不包括在6.5个月之前接受HIV-1阳性检测的人员。HVTN 100样品先前已经以1：200的血清稀释度进行了测试，数据由Bekker报告等。32。为了与HVTN 097直接进行直接比较，再次以1:50的血清稀释度测试HVTN 100样品。在1:50和1：200稀释测试之间，对被测抗原的结合反应之间的差异是一致的。
如先前稍作修改所述进行针对HIV包膜的纯化的IgG的线性表位作图4，47。由JPT Peptide Technologies GmbH（德国）通过将由Los Alamos国家实验室的B. Korber博士设计的库印刷到环氧玻璃载玻片（德国PolyAn GmbH）上来提供微阵列载玻片。该文库包含覆盖7个共有gp160序列和6个gp120病毒株的全长包膜序列的重叠肽（15聚体与12重叠）。补充表S2中的微阵列文库中的肽的完整列表 。每个载玻片上都印有三个相同的亚阵列，每个亚阵列都包含整个肽库。封闭所有阵列载玻片并洗涤，与1:50稀释的血浆一起孵育，然后与缀合了AF647的山羊抗人IgG缀合（Jackson ImmunoResearch，PA）一起孵育。使用XDR模式，使用InnoScan 710 AL扫描仪（Innopsys，Carbonne，法国）以635 nm的波长扫描阵列载玻片。使用Mapix 8.0软件分析图像以获得所有肽的荧光强度值。然后使用R包pepStat处理数组数据。结合强度定义为：信号=每个免疫后样本与其基线（匹配的基线样本或所有基线样本的中位数，以较高者为准）之间强度值的log2转换倍数差异。个百分所有免疫前样品对于肽的强度; （2）肽信号> 1.58，代表样品与其基线之间荧光强度的3倍差异。为了确定阳性，pepStat过程包括“平滑”功能以减少假阳性。由于RV144的线性表位作图是在10年前进行的，并且测定和分析方法已更新，因此不能将阳性率直接与RV144进行比较。为了确保两次试验之间比较的鲁棒性，同时进行了HVTN 100和HVTN 097的测试以进行免疫原性比较。
对于通过肽微阵列进行的详细表位作图，我们集中于对V1V2区可检测到抗体反应的疫苗接种者。基于具有足够水平的抗体结合能力同时保持性别平衡的血浆样品被向下选择。此处介绍了基于预先指定的绑定标准的每种协议的详细信息。对于HVTN 100，根据BAMA中测得的针对V1V2抗原的结合血浆IgG，选择53种PP疫苗和5个安慰剂的亚组进行线性表位作图，如下所示：1）选择n = 32种具有最高IgG结合抗体滴度的PP疫苗（log10净MFI> 2.75）到三个V1V2抗原（B亚型gp70_B.CaseA_V1_V2，C C.1086C_V1_V2_Tags亚型和C C gp70-TV1.21 V1V2亚型）。2）选择另外n = 6个对C的最高PP疫苗接种者应答者。1086C_V1_V2_不是gp70_B.CaseA_V1_V2和/或C型gp70-TV1.21 V1V2的高响应者的标签（即log10 net MFI <= 2.75）。3）从剩余的PP疫苗中随机选择n = 15的样本，按性别分层以平衡在n = 38个高应答者（39％的女性：61％的男性）中观察到的性别比例。4）随机选择n = 5个按性别分层的PP安慰剂。
按性别分层以平衡整个选择和治疗组（T1 / T2）在步骤1和步骤2之间的性别平衡。3）随机选择n = 5个按性别分层的PP安慰剂。在通过肽微阵列启动表位作图之前，要满足这些预先指定的选择标准。
分别使用双面Wilcoxon秩和检验（阳性反应者的量级）和双面Fisher精确检验（阳性反应率），对BAMA中V1V2蛋白结合的抗体反应的强度和阳性率进行比较，分别使用SAS（9.4版； SAS Institute，美国北卡罗来纳州卡里）和R统计软件（3.3.2版； R统计计算基金会，奥地利维也纳）。小于0.001的P值被认为是重要的；没有针对多个测试进行调整。
对于线性表位作图数据，根据参与者变量，以抽样概率随机选择分析中包含的受试者子集（请参见“方法”下的“选择用于线性表位作图的受试者”）。为了说明此子集分析，增加了逆概率加权48使用R统计软件（版本3.5.1； R Foundation for Statistics Computing，根据相应的选择标准进行了估计和假设测试，以评估响应率，平均震级以及估计用于数据可视化的任何其他总体水平参数。维也纳，奥地利）。此方法可得出均值，均值差，均值差的95％置信区间以及均值是否偏离零的2边基于Wald的p值的估计。针对性别对潜在的混淆进行了调整。
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