摘要
术前鉴别恶性肿块对于准确诊断和迅速转诊至妇科肿瘤学中心进行最佳手术干预至关重要。HGSOC进展与局部和全身性炎症相关。我们假设血清中包含炎症生物标志物可以改善诊断测试。在该培训队列中，我们测试了来自66名因怀疑卵巢癌而接受手术的患者血清中的四种现有临床测试（RMI评分和ROMA，CA125和HE4）和一组28种免疫可溶性生物标记物。随后在独立的验证队列中分析了六个单独或与常规测试结合的有希望的免疫生物标志物（n = 69）。IL-6被确定为变异性的主要驱动力，其后紧接常规诊断测试。与良性肿块或卵巢正常的对照组相比，HGSOC患者的血清IL-6中位数较高（28.3 vs 7.3 vs 1.2 pg / ml，p <0.0001）。IL-6的组合进一步提高了常规测试的总体预测概率。对具有可疑卵巢肿块的女性进行两步分流建模，以IL-6> 3.75 pg / ml作为主要分流，然后进行常规测试（CA125或RMI评分），发现卵巢癌患者的误分类率为4.54-3.03％ ，优于单独使用CA125或RMI（9.09至10.60）。验证队列显示，添加IL-6后，诊断敏感性得到了类似的改善。IL-6与常规检测相结合可能是有用的临床生物标记物，可用于对疑似恶性卵巢肿块的患者进行分类。
上皮性卵巢癌是全球死亡的主要原因之一。高度浆液性卵巢癌（HGSOC）是最具侵略性的亚型，通常出现在晚期1。尽管5年生存率从1986-1990年的36％显着提高到2011-2015年的46％2，但是晚期卵巢癌的出现和缺乏经过科学验证的筛查工具2，对晚期卵巢癌女性的预后仍然很差2，3。作为多学科团队的一部分，最佳的手术细胞减少仍然是卵巢癌管理和生存的重要预后因素4。术前从非恶性盆腔肿块中分辨出卵巢癌对于确保正确诊断并迅速转诊至专科中心以及随后优化主要治疗以提高生存率至关重要。
尚未确定明确的预测生物标志物。当前用于附件包块的标准调查工具是临床检查，肿瘤标志物测定和超声评估。当单独考虑这些工具时，没有一个对预测恶性肿瘤非常敏感或特异。
血清CA125是一种糖蛋白抗原，在1％的健康个体，6％的卵巢良性肿块以及其他恶性肿瘤5和生理状态（包括妊娠，子宫内膜异位和月经6）中发现水平升高。卵巢恶性肿块妇女中78％的女性血清CA125水平升高至35 U / mL以上，但良性肿块妇女中22％的女性7。因此，与良性肿块相比，单独使用血清CA125在区分恶性肿瘤患者中并不是很可靠8。在雅各布斯和巴斯特等人的评论中。人，虽然只有约50％的I期上皮性卵巢癌患者的CA125水平升高，但在90％的晚期女性中最高水平[ 6]。与绝经前女性相比，CA-125在绝经后女性中具有更高的敏感性和特异性。在Grzybowski W 等人的研究中。此外，绝经后卵巢癌女性中CA125的敏感性和特异性分别为88.7％和98.07％，而绝经前队列的敏感性仅为64.0％，特异性94.1％9。
恶性肿瘤风险指数（RMI），由Jacobs 等人开发的算法。在1990年10月，是卵巢恶性肿瘤使用最广泛的风险评估，对于有选择地转诊至专家中心非常有价值。与单独使用CA125相比，RMI（阈值> 200）对卵巢癌11的敏感性提高了87％，特异性提高了97％。RMI得分是通过血清CA125水平，更年期状态得分和超声特征得分的简化回归方程生成的（RMI =超声检查结果x绝经状态x CA125 U / ml）10。RMI根据数字评分将患者分为高风险或低风险，RMI> 200被认为是高风险，可能有75％的恶性肿瘤12因此，需要妇科肿瘤科医生进行紧急评估，以确保获得最佳治疗效果。尽管RMI评分是高度敏感和特定的，但它需要超声成像评分13。在没有超声的设施中，RMI评分不能充分利用术前预测恶性肿瘤；在具有多种成像方式的设施中，缺乏成像方法的标准化，以及对主观操作者评估的依赖性会极大地影响RMI评分的变异性13。
人附睾蛋白4（HE4）是用于检测卵巢癌的一个相对较新的生物标志物的血清14，15。最初发现HE4是WFDC2基因在20 16号染色体上的转录本，在人类附睾中表达。HE4还可以在正常组织中表达，包括呼吸道和生殖道17。1999年，Shummer 等人发现了HE4基因在卵巢癌中的过表达。18。据报道，2003年HE4作为检测卵巢癌的有希望的血清生物标志物19。一项涉及1807名妇女的9项研究的荟萃分析报告说，HE4诊断卵巢癌的综合敏感性和特异性分别为83％和90％，ROC曲线汇总为0.9271 20。当ROC曲线与CA125相比，除CA125绝经后妇女中表现较好，而HE4与年龄呈负相关HE4单独同样进行15，21。在Moore 等人测试的9种分析物中，HE4成为潜在的潜在生物标志物。21，他建议将其与CA125和更年期状态结合在一起，以预测卵巢癌的算法。另一种恶性风险算法（ROMA）将CA125和HE4值以及更年期状态结合到一个预测指标中，该指标随后用于计算卵巢癌的预测概率（从0％到100％）。已显示这可以成功地将患者分为高危和低危人群，其中93.8％的卵巢癌正确分类为高危22。该算法的缺点是使用HE4，这是一项昂贵的测试，在中低收入国家/地区很难获得。
卵巢癌微环境中炎症和免疫抑制途径的成分，包括全身性细胞因子（白介素（IL）-6，TNF-α，IL-10，TGF- β）和趋化因子（CCL2，CCL4，CXCL10），已被证明有助于癌变的发展23，24，25。细胞因子和趋化因子是细胞信号分子，在调节免疫力，炎症和造血作用23方面，对帮助细胞间通讯至关重要。
我们假设血清或血浆中存在的炎症或免疫抑制生物标记物可能会增强或补充HGSOC患者恶性肿瘤的诊断，优于目前的诊断方法包括CA125，RMI，HE4和ROMA。
该研究是免疫和卵巢癌试验（项目13/32）的一部分，并已得到墨尔本皇家妇女医院的人类研究伦理委员会（HREC）的批准。临床研究按照相关的指导方针和规定进行。在签署书面知情同意书后，最初招募了80名接受卵巢切除手术并符合研究纳入标准（表1）的妇女 。遵循严格的排除研究标准（表 1），排除了14名女性。排除的原因是严重的并发心脏，肝和血管疾病（n = 3），服用免疫抑制药物（n = 4）并伴有活动性癌症，例如乳腺癌和结肠直肠癌（n = 3）以及卵巢癌除了高级浆液型（n = 4）。最终招募了66名女性，构成了该研究培训阶段的最终样本。新诊断为HGSOC的33例女性，卵巢良性肿块12例，对照组包括21例因已知基因突变（例如BRCA或Lynch综合征）或有较强卵巢和/或乳腺癌家族史而接受降低风险手术的女性癌症。
所有相关的临床信息，包括年龄，自我报告的更年期状态，既往医疗状况和药物史，以及任何先前的恶性肿瘤史均来自身份不明的患者病历。在进行任何外科手术或化学疗法治疗之前，先从患者获得静脉血样。收集所有患者的基线血液成分，血清CA125水平和骨盆超声报告。手术后，获得了有关多学科团队共识后的最终诊断，手术分期发现以及肿瘤类型，分期和分级的全面组织学评估的相关文献。根据国际妇产科联合会（FIGO）的标准对患者的肿瘤进行分期。表中提供了与本研究直接相关的患者详细信息 2。
验证阶段包括通过OCRF赞助的位于澳大利亚哈德逊学院的卵巢癌组织库计划获得的临床样本。从Epworth人类研究伦理委员会EH2016-165获得伦理批准。临床研究按照相关的指导方针和规定进行。所有参与者均事先提供了知情书面同意。该研究纳入了2014年至2016年期间共50名因怀疑卵巢肿块而接受手术的妇女。为了进行独立的亚分析，我们还从10名经组织学证实为子宫内膜异位的妇女那里获得了血液。在获得该机构研究委员会的知情书面同意和道德批准后，我们还在皇家妇女医院和澳大利亚莫纳什大学招募了19名健康志愿者。
验证阶段队列未根据培训阶段研究中使用的纳入和排除标准预先选择。因此，在25例HGSOC患者中，有7例在卵巢良性肿块中有25例在女性中有5例具有复杂的合并症，例如主要的心血管疾病，复杂或不受控制的医疗状况，主动性自身免疫性疾病以及免疫抑制药物（补充表 1））。所有相关的临床信息，包括年龄，自我报告的更年期状态，既往病情或用药，任何先前的恶性肿瘤病史，由合格的妇科肿瘤科医生对肿瘤类型，分期和等级进行的全面组织学评估，均来自于身份不明的患者病历。在进行任何外科手术或化学疗法治疗之前，从麻醉患者中获取静脉血样。在澳大利亚莫纳什医学中心或澳大利亚墨尔本皇家妇女医院的诊断病理实验室中对所有研究患者的血清CA125进行了测量。
通过以3000 rpm离心10分钟，从收集在血清分离管（主要队列）或EDTA包被的管（验证研究）中的全血中分离血清和血浆。所有血液样本均在不到3小时内分离。去除细胞和蛋白质碎片后，将血清/血浆等分，并保存在-80°C下直至以后使用。在所有怀疑患有卵巢癌的患者中和之前，均常规测定血液参数，即血红蛋白（Hb），血小板计数（PLT），白细胞计数（WCC），绝对中性粒细胞计数（ANC），总淋巴细胞计数（TLC）和血清CA125。手术。
按照制造商的规程（Invitrogen）使用多重磁珠免疫测定试剂盒，以同时测量单个样品中的28种分析物。使用25人Plex面板来确定细胞因子（GM-CSF，IFN-α，IFN-γ，IL-1β，IL-1RA，IL-2，IL-2R，IL-4，IL-5， IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-12（p40 / p70），IL-13，IL-15，IL-17和TNF-α）和趋化因子（RANTES，趋化因子，CCL2 /研究血清中的MCP-1，CCL3 / MIP-1alpha，CCL4 / MIP-1beta，CXCL9 / MIG，CXCL10 / IP-10）。该25-Plex面板与单独购买的单重细胞因子珠sTNFRII和CCL22 / MDC结合在一起。使用单重珠试剂盒分别分析了TGF-β。使用R＆D人预混合磁性Luminex检测试剂盒检测HE4。
为了进行验证研究，使用了由IFN-γ，IL-1RA，IL-6，IL-10，TNF-α，sTNFRII组成的6面板试剂盒，并将TGF-β和HE4作为单重试剂盒进行了分析。
训练和验证阶段均使用相同的分析方案进行分析。分析之前，将血清样品完全融化，通过离心（1000 g，10分钟）进行澄清，然后过滤以防止滤板堵塞。用于TGF-β测定的血清样品需要进行酸处理和中和，以从TGF-β1中去除潜伏期相关肽，然后才能用于测定。将血清样品随机分配到板中以避免测定偏倚，并且一式两份进行分析以确定测定间差异。用25μl抗体包被的小珠包被底部为96孔的微孔板。通过在测定稀释剂中连续稀释人细胞因子标准混合物制成标准曲线。将标准品以每孔100μl一式两份移液，而将患者血清以每孔50μl一式两份进行移液。将50μl测定稀释液添加到标准品和患者样品中，并将50μl孵育缓冲液添加到所有孔中。将平板在室温黑暗中于500-600 rpm的定轨振荡器上于室温孵育2小时。使用磁力分离器将孔洗涤两次。加入生物素化的第二抗体的混合物，并将微板在黑暗中在微量滴定摇床上孵育一个小时。用磁力分离器洗涤两次后，加入抗生蛋白链菌素-藻红蛋白并在黑暗中于室温搅拌下温育30分钟。将板洗涤3次，并向每个孔中添加100μl洗涤溶液，并根据标准方案使用Luminex？200TM分析仪（Luminex Corp）分析样品。对于每种分析物 分析了100个珠子，并确定了中值荧光强度。使用五参数对数曲线拟合标准分析物值进行中值荧光强度分析。每种测定的测定间差异为2％至8％，测定内差异为2％至7％。
根据所有患者的绝经状态（M），血清CA125浓度和超声评分（U）计算RMI（恶性指数）。使用的方程式：
其中：M绝经状态-（1 =绝经前，3 =绝经后），U形超声评分-特征包括双侧肿块，实性区域，多处囊肿，腹腔内转移和腹水10。每个功能部件的得分分别为0、1或3。（0 =成像得分为0，1 =成像得分为1，3 =成像得分为2–5）。CA125 –使用的实际浓度单位为IU / ml。
ROMA（恶性肿瘤算法的风险）是根据Moore 等人开发的logistic回归公式使用生物标记HE4和CA125计算得出的。22：
由于这是一项探索性观察研究，因此没有正式的，有文件记录的统计分析计划。研究团队一致认为，将多种参数和非参数方法（用于监督学习）应用于一个数据集以检测信号，并且将第二个数据集用于检查或验证学习。
表 2主要使用非参数Kruskal-Wallis分析来分析三组的连续变量，然后使用GraphPad Prism中的Dunn多重比较检验进行二次分析。结果以平均值±标准偏差（SD）报告。对于涉及三组的分类变量，使用Fisher精确检验的Freeman-Halton扩展进行了初步分析，以使用Graphpad Prism计算3×2或3×3列联表中分类值分布的（两尾）概率。
对于图 1，对包括CA125和HE4在内的30个log 2转化的免疫因子中的每一个进行了单向方差分析（对Interleukin-17进行了统计分析，因为所有值均低于检测极限，因此被排除在分析之外）。对于每种免疫因子，计算出均值，恶性肿瘤与正常/健康对照，良性肿瘤与正常/健康对照以及恶性肿瘤与良性肿瘤的三对对比，以及它们的标准差，并进行配对t结果-检验总结在具有统计显着性的火山图中，-log 10（P值）与倍数变化的关系，即对数2的均值的差-转化的细胞因子浓度。对于每个方差分析，检查诊断残差图，包括正态和半正态概率图，以检查分析所基于的假设（即方差的均质性和残差的正态性）。图 1附带的代码CodeForFiguresandTables.docx
术前血清中可溶性因子的火山图。从33例卵巢癌，15例卵巢良性肿块和21例卵巢正常的患者中抽取术前血液。使用多重磁珠免疫测定法测量了总共28种血清可溶性因子。对28 log 2转化的免疫因子中的每一个进行方差的单向分析。对于每种免疫因子，计算出均值，恶性肿瘤与健康对照，良性肿瘤与健康对照以及恶性肿瘤与良性肿瘤的三个成对对比，以及它们的标准差，并总结了成对t检验的结果在具有统计意义的火山图中，−log 10（P（-值）对倍数变化，即log 2转化的可溶性因子浓度的组平均值之差。具有统计学显着性的火山图（对比值的对比-−log 10（P值），表示为log2尺度上的差异。标记了对比值大于2倍变化或P值<0.05的可溶性因子。
图 2主要使用非参数Kruskal-Wallis分析来分析三组的连续变量，然后使用使用Graphpad Prism进行的Dunn多重比较测试来进行二级分析。结果以平均值±标准偏差（SD）报告。对于涉及三组的类别变量，使用Fisher精确检验的Freeman-Halton扩展进行了初步分析，以使用Graphpad Prism计算3×2或3×3列联表中类别值分布的（两尾）概率。
在训练队列中，晚期浆液性EOC患者以及卵巢良性肿块和卵巢正常的RMI评分，ROMA和促炎细胞因子血清水平。高品位浆液性EOC患者良性的箱须图可扩展至最小值和最高RMI评分，ROMA，CA125，HE4，IL-6和IL-8血清水平卵巢肿块和正常卵巢。指示每个因子的p值。Kruskal-Wallis随后进行Dunn多重比较检验：* p <0.05，** p = 0.001-0.01，*** p = 0.0001-0.001，**** p <0.0001。
进行了图3和图 4以及表 3的 ROC（接收者操作员特征）分析，以确定单独或组合使用的每个标记的预测值。获得了每种分析物的曲线下面积（AUC），并且还使用二项式logistic回归确定了组合分析物的预测概率。良好的风险预测模型的AUC会大于0.7 26，而最具信息价值的生物标记物会将AUC增加0.005或更多27。在适当的情况下，统计显着性定义为p <0.05，并且还报告了95％的置信区间（CI）。图 3和4附带的代码CodeForFiguresandTables.docx
在恶性和非恶性卵巢肿块患者的训练阶段，仅使用CA125，HE4，IL-6，IL-8，RMI评分，ROMA的ROC-AUC值。仅针对训练阶段的所有标记进行ROC分析，并结合具有预测概率的相关表进行ROC分析。ROC接收器工作特性，曲线下的AUC面积，95％CI- 95％置信区间。参考线（灰色连续线）位于AUC 0.5）。
使用CA125，HE4，IL-6，IL-8，RMI得分，仅ROMA进行独立验证阶段的ROC-AUC值，用于卵巢恶性和非恶性卵巢肿块患者ROC分析仅针对所有标记物进行验证阶段和相关表格结合预测的概率。ROC接收器工作特性，曲线下的AUC面积，95％CI- 95％置信区间。参考线（灰色连续线）位于AUC 0.5）。
表 4通过SPSS中的受试者工作特征（ROC）曲线评估了诊断的敏感性，特异性，阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。准确度可以定义为正确分类的实例（TP + TN）/（TP + TN + FP + FN）的百分比，其中TP，FN，FP和TN表示正确，错误，否定和正确的数量底片。错误分类是根据错误分类的实例（FP + FN）/（TP + TN + FP + FN）的百分比计算的。
对于图 5A–C递归分配方法用于识别与患者在训练阶段的疾病状态（正常，良性或恶性）相关的细胞因子以及RMI和ROMA指数的组成部分。在第二阶段的研究中，评估了最有希望的细胞因子，其中包括单独的CA125，RMI指数或ROMA算法。评估了三种类型的树（每种类型由相关细胞因子与三种常规指标之一的组合组成）。对于每种类型，在最小节点大小（存储桶大小）为10的约束下，选择具有Gini索引最小值（这是rpart中的默认值）的树。敏感性，特异性，阳性预测值（PPV） ，阴性预测值（NPV），然后分别计算常规测试（RMI和ROMA）和生物标记物（CA125和HE4）的成分的准确度和错误分类率，或将其结合临床使用的临界值与源自树木的IL-6进行比较。数字 附加的5A–C代码CodeForFiguresandTables.docx
使用递归分区方法对分类树和回归树（CART）进行分析，以评估IL-6和常规风险生物标记物CA125的成分以及RMI评分（更年期状态，超声评分CA125）和ROMA（CA125和HE4）等指标的有用性在训练阶段区分恶性（n = 33），良性（n = 12）和正常卵巢肿块（n = 21）的患者。结合CA125（A），RMI（B）或ROMA指数评估树木中的IL-6水平。（C）从左到右，每个节点或子节点内的值代表患者总数（N = 66）中每个组（正常，良性和恶性）的比例。
补充表 1主要使用非参数Kruskal-Wallis分析对三组的连续变量进行分析，然后使用GraphPad Prism中的Dunn多重比较检验进行二次分析。结果以平均值±标准偏差（SD）报告。对于涉及三组的分类变量，使用Fisher精确检验的Freeman-Halton扩展进行了初步分析，以使用Graphpad Prism计算3×2或3×3列联表中分类值分布的（两尾）概率。
对于补充图 1，进行了主成分分析（PCA），以描述使用SPSS的细胞因子浓度的变化。在PCA之前，使用log2转换所有变量以减少偏度。从总数据中提取得到的PCA组件评分以进行分析。使用Scree检验和特征值> 1.0来确定因素的数量。检查数据的内在变化以及在此阶段是否存在任何聚类。提取得到的PCA组件评分进行分析。进行二次分析以检查单个因子得分值。将所有个体评分绘制在简单的散点图上，然后根据肿瘤状态对个体进行分类：恶性，良性和正常/健康对照。补充图 1 附加代码CodeForFiguresandTables.docx
对于补充图。 进行2和3次 ROC（接收机操作员特征）分析，以确定每个标记单独或组合的预测值。获得了每种分析物的曲线下面积（AUC），并且还使用二项式logistic回归确定了组合分析物的预测概率。良好的风险预测模型的AUC会大于0.7 26，而最具信息价值的生物标记物会将AUC增加0.005或更多27。在适当的情况下，统计显着性定义为p <0.05，并且还报告了95％的置信区间（CI）。图 2和3附带的代码CodeForFiguresandTables.docx
还对验证数据集进行了方差分析和ROC曲线分析。通过使用与训练阶段派生的分类树相关的分割规则来进行验证练习，以在验证数据集中对患者进行分类，从而形成其状态的预测。然后，将这些患者状况的预测与3×3列联表中的患者实际状况进行比较，并使用Somers'D统计量来评估预测状况与实际状况之间的一致性。
Graphpad Prism版本8.3.0和SPSS IBM 23.0用于分析PCA，ROC曲线和逻辑回归。GenStat（版本17.1）用于方差分析和均值对比估计。使用R编程语言（版本3.3.2）创建火山图，使用rpart库构建最小节点大小设置为10的分类树。使用拨浪鼓库绘制所得树。SAS软件包（版本9.4）用于计算Somers'D。
所有卵巢癌患者均患有III-IV期高级别浆液性腺癌（n = 33），大多数卵巢良性肿块（n = 12）患者患有浆液性囊腺瘤（75％）。在因遗传突变或遗传性乳腺癌或卵巢癌的家族病史进行风险降低手术的患者中，未发现卵巢病理（n = 21）。卵巢癌患者和卵巢良性患者的中位年龄分别为60岁和55岁，而卵巢癌患者中位年龄为48岁（表 2））。三组患者之间的血红蛋白，血小板和白细胞计数以及绝对中性粒细胞计数水平无显着差异。与卵巢良性肿块（表2）和卵巢正常的患者相比，卵巢癌患者的总淋巴细胞平均值显着降低 。
图 1总结了使用单向方差分析进行多重珠粒免疫分析所测得的所有28种免疫可溶性因子浓度。计算每种免疫可溶性因子的成对t检验和三组（恶性，良性和正常卵巢）平均值的对比，并在火山图分析中进行汇总（图 1）。术前血清中的免疫因子IL-6和IL8是仅有的两种细胞因子变化大于2倍的细胞因子。恶性卵巢与正常卵巢以及良性与正常卵巢的患者血清IL8浓度相差2倍以上（p <0.05）。恶性和良性卵巢肿块患者的血清IL8浓度无统计学差异。在所有三组中，术前IL-6浓度差异均大于2倍：恶性与良性，良性与正常以及恶性与正常卵巢（p <0.05）（图 1）。
所有收集的血液因子和临床参数进一步包括在PCA分析中。考虑到恶性肿瘤和正常卵巢患者之间的年龄差异，年龄和绝经状态被进一步纳入PCA的因素。特征值大于1的四个分量被提取，表明它们是样本变异性的主要贡献者。组成部分1占研究组总差异的15.8％。组件1包括常规诊断工具和生物标记，RMI评分，ROMA，HE4和CA125，以及免疫因子IL-6和IL8（补充图 1）。
使用Kruskal-Wallis分析（随后进行Dunn多重比较检验），分别评估了这六个因素对三类患者的区分能力（图 2）。HGSOC患者的RMI得分中位数明显高于卵巢良性肿块和卵巢正常的患者（3204 vs 151 vs 10 IU / mL，p = 0.001）。同样，与良性卵巢癌（19.9±13.4，中位数23.78％）和正常卵巢癌（3.33）相比，HGSOC患者中ROMA的平均值也显着更高，中位数为89.3±12.4％，范围：33.6–99.7％。 ％）。
卵巢癌患者的血清CA125水平平均值较高（1125±2270，中位数372，范围：29–10430 IU / mL），而良性肿块患者（47.8±55.1，中位数：26，范围：5–177） IU / mL）和正常卵巢（15.1±29.9，中位8.0，范围5–145），分别调整p = 0.0002和0.0001。CA125的血清水平无法区分良性卵巢和正常卵巢（邓恩事后检验后的校正p值为0.60）。尽管观察到良性组中CA125水平的中位数是卵巢正常者的中位数，但校正后的p值在0.60时并不显着。这可能主要归因于良性人群的样本量小。
与良性卵巢癌（54.3±23.5，中位数50.6，范围：29.3–99.3 pM）相比，HGSOC患者的平均HE4水平显着更高（583±589，中位数357.4，范围：22.4-2060 pM）质量（38.4±16.3，中位数35.7，范围：18.9-81.3 pM）。经过Kruskal-Wallis分析并与Dunn检验进行多次比较，血清HE4能够区分卵巢癌与良性肿块以及正常卵巢。与CA125相似，HE4的水平无法区分良性卵巢和正常卵巢，调整后的p值为0.84。
与良性卵巢肿块或正常卵巢相比，HGSOC患者中IL-6的中位数更高（28.3 vs 7.4 vs 1.2 pg / ml，p = 0.0001）（图 2））。使用多重磁珠免疫测定试剂盒，测量了包括IL6在内的28种分析物的水平。我们发现，在这项研究中，IL-6的水平低于28.5％（6/21）卵巢正常的患者血清中的检测水平，而卵巢良性肿块和卵巢良性肿瘤患者的血清中IL-6的水平为6.7％（1/15）。没有III-IV期HGSOC患者的水平未检出。与良性肿块（6.8±3.0，范围：0.5）相比，大多数III-IV期HGSOC患者（97％）的IL-6升高，平均浓度为40.4±40.6，范围：5.6–215.88 pg / ml。 –10.73 pg / ml和正常卵巢（1.3±0.7，范围0.5–2.8 pg / ml），这在Kruskal-Wallis和Dunn的事后分析之后具有统计学意义（图 2））。因此，IL-6本身可以区分这三个研究患者组。33名患者中有18名（54.5％）在训练队列中有腹水。与血清（中位数53 pg / ml [范围：11.2至216 pg / ml]）相比，患者腹水中IL-6水平显着升高（中位数18,050 pg / ml [范围：5162至122,883 pg / ml]）。 ）（p = 0.0001）。腹水的存在与血清IL6水平升高无关（p = 0.09）。
与健康对照组相比，卵巢癌患者的平均血清IL8浓度（3124±7336，中位数320.5，范围：48.6–37574 pg / ml）显着更高（262.4±368.6，中位数165.7，范围：23.7–1694 pg / ml） ml，p ＝ 0.02）。血清IL8不能区分良性和恶性卵巢肿块，因为在良性肿块中还观察到IL8浓度升高（1961±2400，中位数1363，范围：21.8–7965 pg / ml），p = 0.07。尽管观察到良性组中IL8水平的中位数是卵巢正常者的1.5倍，但邓恩事后检验后的调整后p值并不显着。这可能主要归因于良性人群的样本量小。分析的其他因素均无法区分这三个研究组。
由于RMI评分和ROMA是目前用于预测恶性肿瘤以方便转诊至专门中心的诊断测试，因此进行了结合敏感性和特异性优势的ROC（接收者操作者特征）分析，以计算曲线下面积（AUC），总结了整体测试性能28（图 3）。使用AUC的值来评估所选因素在区分各组（恶性与良性，恶性与正常以及良性与正常）之间的能力。接近1的值表示更好的区分性测试性能，而AUC = 0.50则表明预测准确度等于仅机会的准确度29。IL8的AUC值为0.743（95％CI 0.618-0.868），具有区分恶性和非恶性患者的可接受的预测能力，但不优于或不及CA125（0.986），HE4（0.997），RMI的AUC值得分（0.987）或ROMA（0.998）（图 3）。相比之下，IL-6在区分恶性和非恶性患者方面显示出极好的预测价值（AUC 0.976，95％CI 0.948-1.000），与常规测试（RMI和ROMA）和生物标志物（CA125和HE4）的AUC值相当（图 3A）。还计算了三个研究组之间所有免疫因素和常规测试的AUC值：HGSOC与良性卵巢肿块，恶性与正常卵巢以及良性卵巢质量与正常卵巢（表 4））。单独的IL-6（AUC 0.927）具有良好的预测AUC值，与传统测试和生物标志物相似，但不能优于传统测试和生物标志物以区分恶性和良性卵巢患者（表 3）。当IL-6可以区分恶性卵巢和正常卵巢时，其预测能力极佳（AUC 1.000）（表 3）。此外，IL-6（AUC 0.905）优于CA125（AUC 0.73），HE4（AUC 0.84）或ROMA（AUC 0.84）在区分卵巢良性肿块和正常卵巢的患者方面具有优势（表 4）。此外，将IL-6与现有的常规诊断工具（如RMI评分和ROMA或常规生物标志物CA125和HE4）结合使用，可提高测试识别卵巢恶性肿瘤患者的能力（表 参照图3。 3，4）。
为了评估将IL-6与常规测试相结合以区分疾病状态（正常，良性或恶性）的有用阈值，使用递归分区方法将分类树和回归树（CART）拟合到训练阶段的数据中。这些分析确定了低于3.75 pg / ml的IL-6血清浓度，可作为初步分类鉴别卵巢正常患者的信息。在选择用于进一步调查的三棵树（图 5A–C）中，在此阈值下将21/21例正常患者正确分配到“正常”组。在CART分析的第二阶段，结合CA125，RMI指数或ROMA指数评估树木中的IL-6。低于3.75 pg / ml的IL-6可以正确地将所有卵巢正常的患者识别为所有树木中的正常患者（图。 5A–C）。在IL-6树中包含CA125或RMI（在同一数据集的CART分析得出的阈值处）导致CA125或RMI单独的错误分类率降低（表 4）。将HE4和ROMA整合到IL-6树中也提高了恶性疾病鉴别的准确性，在HE4和IL-6和/或CA125的组合中，具有最高的准确性和零误分类率（表 4）。因此，该系统可提供比当前方法所观察到的更为稳健的分类，具有更高的准确性，并降低了误分类率，这是由于本研究证明了包含IL-6的结果（表 4）。
为了评估这三个基于IL-6的分类的有效性，测试了来自一个独立队列的血浆样本，包括25名晚期高级别浆液性卵巢癌患者，25名卵巢良性肿块患者和19名健康志愿者。从2014年开始前瞻性收集该队列的预处理样品，并将其保存在生物库中，直至进行检测。补充表1汇总了第二组的人口统计学特征 。在癌症组中，所有卵巢癌患者均患有高度浆液性腺癌（HGSOC）（n = 25），大多数卵巢良性肿块患者（n = 25）患有浆液性膀胱腺瘤（60％）。招募健康志愿者作为研究对照组（n = 19）。卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者的平均年龄相似，而健康对照者则相对年轻（补充表 1）。在验证队列中，共有25名患者中有13名（52.0％）患有腹水。与训练队列相似，在HGSOC患者中，腹水的存在与血清IL6的升高无关（p = 0.19）。
对验证阶段队列中的术前血浆进行选择性分析，以分析相关细胞因子，包括CA125和HE4。对所有人口统计学，血液成分和免疫因子的PCA分析（与培训队列相似）显示，IL-6是与成分1中的RMI得分，ROMA，CA125和HE4聚集在一起的一个因素，占本研究总变异的32.4％组（数据未显示）。然后使用单向方差分析评估这些因素在三个研究组之间的区分能力，随后进行事后的邓恩多重比较检验（补充图 2）。）。正如在训练研究中所观察到的那样，在该验证队列中，IL-6和RMI而非ROMA仍然是所有三个研究组的判别标记。与训练阶段相似，血浆CA125和HE4表现出相似的判别能力，无法区分卵巢良性肿块患者和健康对照组（补充图 2）。
通过ROC分析，IL-6在验证阶段保留了良好的预测价值，并且显然能够区分恶性卵巢患者和非恶性卵巢患者（AUC 0.962，95％CI 0.926-0.998，p = 4.4×10 -11）。IL-6与常规测试（如RMI评分和ROMA）或常规生物标记物（如CA125或HE4）的组合在验证阶段相似地提高了卵巢恶性肿块的预测概率（图 3）。在验证阶段，三个研究组之间单独或与常规测试和生物标志物组合使用的IL-6的ROC曲线进行了比较，显示出与训练阶段相似的模式（补充表 2）。
然后，通过应用从训练阶段数据集的分类树得出的划分规则对处于验证阶段的患者进行分类，以预测其状态。然后将患者的预测状态与患者的实际状态进行比较。在树木中加入IL-6可以正确地将所有19名健康对照患者归类为正常患者，从而在合并常规检测和生物标志物之前基本消除了假阳性。在这三棵树中，基于IL-6和CA125的分类树是最好的（Somers'D = 0.943±0.028），在25例恶性患者中有3例被分类为良性，没有假阳性。相比之下，单独使用CA125时，有2例假阳性。同样，基于IL-6和RMI的树（但Somers的D = 0。929±0.030），而在验证数据集上进行测试时，基于IL-6和ROMA的分类树表现不佳（Somers'D = 0.607±0.071）。在基于IL-6和ROMA的树中，这种拟合优度的降低最明显，这很可能是“过度拟合”而不是多样性的普遍现象的一个例子。从一组数据构建的统计模型始终不会在一组新数据上表现良好。但是，我们相信我们已经证明了基于IL-6和CA125的分类树表现良好。更可能是“过度拟合”而不是多重性这一普遍现象的例子。从一组数据构建的统计模型始终不会在一组新数据上表现良好。但是，我们相信我们已经证明了基于IL-6和CA125的分类树表现良好。更可能是“过度拟合”而不是多重性这一普遍现象的例子。从一组数据构建的统计模型始终不会在一组新数据上表现良好。但是，我们相信我们已经证明了基于IL-6和CA125的分类树表现良好。
我们还评估了IL-6在帮助区分卵巢癌患者中的有用性。子宫内膜瘤的特征之一是CA125浓度升高，这可能会误导或降低将子宫内膜瘤与卵巢癌区分开的能力。我们从十名良性子宫内膜瘤患者获得了血清，并测量了CA125浓度和包括IL-6在内的相关细胞因子。CA125的平均浓度为109.3±128.8 IU / L（中位数81，范围：7.5–436 IU / L），比浆液性膀胱腺瘤的平均浓度20.8±24.0 IU / L（中位数17，范围：7）高7倍： 7.0–129 IU / L），p = 0.009。但是，平均IL-6浓度（1.33±0.90，中位数1.2，范围：0.5至3。这十名子宫内膜瘤患者的血浆中的血浆脂蛋白（71 pg / ml）仍与良性浆液性囊腺瘤患者的IL-6的平均浓度相当（1.15±0.52，中位数1.4，范围0.5至2.79 pg / ml），p = 0.16 。与恶性疾病中的IL-6浓度相比，子宫内膜瘤组中的IL-6浓度仍显着降低了6倍（p = 1.0×10-6）。子宫内膜瘤女性的所有浓度水平也低于3.75 pg / ml的阈值点（补充图 3）。
本研究首次表明，IL-6是一种促炎性细胞因子，在晚期高级浆液性卵巢癌患者的血清或血浆中过表达，是能够增强诊断的28种可溶性因子中唯一提供最多信息的细胞因子。传统工具（RMI和ROMA）和生物标记物（CA125和HE4）对卵巢恶性肿瘤，良性卵巢病理和健康卵巢妇女的区分效率。
IL-6在训练和验证队列中对区分恶性卵巢肿块具有总体良好的预测价值，与现有的现有诊断工具CA125，HE4，RMI得分和ROMA相当。具体而言，在这项研究中，IL-6是区分晚期恶性卵巢和正常卵巢的极佳预测指标（AUC 1.000，p = 7.8×10 -10）。
在本研究中，晚期卵巢癌患者的IL-6中位数比正常卵巢的患者高24倍。在所有晚期卵巢癌患者中，IL-6水平均保持较高的检出率，而在训练阶段中，只有23.8％的卵巢功能正常的患者未检出该水平。虽然IL-6可以在卵泡发育过程中由人类卵巢上皮细胞产生，但该水平可能未达到检测阈值30。相反，循环IL-6的过度水平在晚期卵巢癌症中观察到，这可以由肿瘤细胞或腹膜间皮细胞，这两者都是主要贡献者IL-6产生肿瘤微环境中被贡献31，32。IL-6在恶性腹水，血清和治疗晚期卵巢癌血浆已经显示出与晚期疾病和差的存活正相关33，34，35，36。目前的研究表明，血清IL-6单独或与其他标志物联合使用对区分恶性和非恶性卵巢肿块具有诊断和预测价值。
过去的研究的患者血清卵巢癌中报告更高水平的IL-6的37，38和在复杂的多标志物组已经结合其用于检测卵巢癌的27，39。然而，就我们所知，这是唯一一项对晚期HGSOC患者单独分析血液IL-6的诊断价值并结合常规检测（RMI和ROMA）和生物标志物（CA125和HE4）的研究。
IL-6在区分良性卵巢和正常卵巢组方面也比CA125，HE4和ROMA具有更好的预测价值。虽然CA125（在> 35 U / ml的阈值）未达到令人满意的灵敏度（81％）和用于卵巢癌检测的特异性（75％）6，40，CA125已报道具有浆液性亚型和先进最高灵敏度阶段41，这在这项研究中也很明显。在该研究人群中，对于训练队列，血清CA125水平区分恶性和非恶性肿块的敏感性和特异性分别为96.0％和79.5％，而验证组的敏感性为97.0，特异性为81.8％。与绝经前相比，观察到的血清CA125水平更高的敏感性和特异性可能归因于卵巢癌的晚期和绝经后妇女所占的百分比更高。培训队列包括二十四名（36.4％）绝经前妇女和42名（63.6％）绝经后妇女，而验证组有24名（34.8％）绝经前妇女和45名（65.2％）绝经后妇女。
在本研究中，IL-6而非CA125可以在训练和验证阶段队列中区分所有三个研究组。与正常卵巢相比，在良性卵巢中训练阶段的平均IL-6水平要高4.5倍。与单独使用CA125相比，将CA125与IL-6结合使用可降低假阳性率并获得更高的预测值。对于RMI，HE4或ROMA与IL-6组合，也观察到类似的改善模式。
但是，单独的IL-6在区分良性和恶性卵巢肿块方面并不优于其他常规生物标志物和测试的预测价值。单独使用时血清CA125或RMI具有较高的假阳性率41。IL-6和CA125的组合在将卵巢子宫内膜瘤与恶性疾病的CA125错误升高相鉴别时可能特别有用。可比血清IL-6水平先前报道在妇女和不子宫内膜异位症42，43，而其他研究者已报道IL-6的水平升高在子宫内膜异位症的患者正常卵巢相比44，45。正如我们的试验数据所示，尽管子宫内膜瘤可能具有升高的IL-6水平，但与Darai 等人保持一致，子宫内膜瘤女性的血清IL-6水平低于卵巢癌女性。37。因此，与单独使用CA125相比，在CA125中添加IL-6可能在临床上有助于区分子宫内膜瘤。但是，这值得在更大的队列中进行评估。
在我们的研究中，无论是在原发性（AUC 0.997）还是验证性（AUC 0.889）队列中，单独的HE4都能对卵巢癌患者实现良好的总体预测价值。但是，我们发现，HE4用作区分良性卵巢质量和正常卵巢的指标，与CA125相比具有较低的预测价值，主要队列的AUC为0.706，验证队列的AUC为0.497。单独作为生物标志物的用途HE4的至因此良性和正常卵巢区分如图以前的研究可能不可靠15，46。其中结合CA125和HE4的引入ROMA已经有希望作为恶性卵巢肿块的更具体的鉴别器22，47。在澳大利亚队列中对术前卵巢肿块的前瞻性评估中，发现ROMA在检测卵巢恶性肿瘤方面不逊于RMI 47。同样，在我们的研究中，ROMA在主要研究组（AUC 0.998）和验证研究组（AUC 0.996）中均具有良好的总体预测价值，因此比单独的HE4或RMI评分是更好的预测工具。另外，在本研究中，在所有三个研究人群之间向ROMA添加IL-6可以提高ROMA预测AUC为1.000的可能性。在CA125和HE4中添加IL-6可获得极高的灵敏度和特异性，且准确性最高，因此可能在术前评估成像方式较不发达国家的可疑卵巢肿块的术前评估中具有潜在用途。
有限的研究可用于定义IL-6的临界值作为诊断工具48。在这项研究中，我们发现IL-6在> 3.75 pg / ml的阈值时具有良好的区分性，灵敏度为100％，特异性为76.8％，阳性预测值为69.7％，阴性预测值为100％。这是对Tempfer 等人针对IL-6报告的中度敏感性/特异性特征（敏感性为61％，特异性为79％，阳性预测值为70％和阴性预测值为61％）的一种改进。49可以通过选择所使用的研究队列和与当前研究相比使用的IL-6阈值水平不同来解释差异。虽然我们招募了均一的FIGO晚期（III-IV）HGSOC组，并将其与良性膀胱腺瘤和卵巢正常的患者进行了比较，但先前的研究包括所有FIGO阶段和各种卵巢癌亚型，对照组是健康的献血者。与我们的研究（3.75 pg / ml）相比，IL-6的阈值水平也较低（0.78 pg / ml）。在训练和验证队列中，我们都试图为年龄在40至84岁之间的对照组包括一个类似的年龄组，但是与癌症患者相比，对照组的年龄要小得多。据报道，老年妇女的IL6水平升高，该数据可能具有关于IL6阈值水平的潜在偏差。可能需要进行年龄匹配的对照研究以验证IL6的阈值水平。
由于细胞因子是免疫系统的一部分，可对外部和内部刺激快速响应，因此细胞因子的测量非常敏感，并具有临床适用性，可重复性和质量保证标准，可最大程度地减少结果差异24。这项研究的优势在于，我们招募了一个均质的卵巢癌人群，其中所有妇女均患有晚期（III-IV期）高级别浆液性卵巢/输卵管癌，良性人群主要是浆液性膀胱腺瘤患者，在对照组中，卵巢切除是降低风险手术的一部分。训练阶段有一个预先选择的人群，排除了可能干扰循环细胞因子水平的临床状况。IL-6的浓度在很大程度上受运动，体重，压力，重要的医疗状况和免疫抑制药物的影响24。样品的收集和存储也可能影响细胞因子的测量，这可能会影响测试的有效性。在手术干预之前收集血清样品。避免使用肝素锂和柠檬酸钠，因为它可以降低促炎细胞因子（包括IL-6和TNF 50）的测定水平。相反，在训练阶段研究中未根据纳入和排除标准筛选入选为验证阶段的患者。因此，这些患者具有复杂的合并症，例如主要的心血管疾病，复杂或不受控制的医疗条件，活动性自身免疫病以及服用免疫抑制药物。该队列研究可以更紧密地反映临床筛查过程中遇到的真实人群，不仅可以验证IL-6作为潜在生物标记的有效性，而且还可以证明IL-6作为诊断生物标记的真实潜力。
该研究与Nowak 等人的发现一致，即晚期卵巢癌患者血清中促炎性细胞因子IL6水平较高。因此，我们的研究结果支持炎症在卵巢癌发生和发展中的关键作用。由于IL-6在促进癌细胞增殖中起着重要作用24，因此不仅与原发性上皮性卵巢癌有关，而且与包括乳腺癌，肺癌和结肠直肠癌在内的各种其他实体瘤相关的IL-6浓度也升高，这可以使诊断特别具有挑战性的24，51，52。对于卵巢质量可疑且IL-6浓度升高的女性，在鉴别诊断中应考虑转移性乳腺癌，肺癌或肠癌的可能性。
的潜在用途外周血IL-6浓度的作为筛选工具与IL-6水平在有前途的卵巢癌的早期阶段（FIGO阶段I和II）发现显著升高相比良性卵巢肿块或健康对照39，53。IL6的使用可能会改善术前对可疑卵巢肿瘤的辨别力，但是仅本项研究的结果不足以支持其广泛用于卵巢筛查。鉴于可用的真正的早期，高级别浆液性卵巢癌数量很少，因此有必要使用晚期疾病病例进行推断。需要确定上皮性卵巢癌的早期阶段，并在较大的分层阶段队列中与良性肿块和正常卵巢进行比较，以确定IL6在广义卵巢癌筛查中的作用，包括多个和较早的疾病阶段。
与任何探索性的观察性研究一样，存在将预测模型“过度拟合”到观察到的数据的风险，但是，在研究第二个数据集的过程中检查模型的有用性可以减轻这种风险。 ，我们在验证研究中发现，IL-6仍然能够准确识别和分类所有19名正常患者。将IL-6添加到CA125或RMI中进一步证实可改善其诊断效用。尽管可以将培训队列中产生的分析进一步优化以专门考虑合并症，但排除这些混杂因素会使ROC-AUC值分别从0.962增加到0.985和0.993（图3和图 4）），以确认验证阶段的IL-6区分恶性和非恶性卵巢肿块的能力。因此，在临床筛查中使用IL-6时应考虑这些发现，因为它们可能会影响IL-6的水平。
单独使用IL-6可能是一种临床可靠的生物标记物，可以区分晚期晚期浆液性卵巢癌患者和卵巢正常患者。结合RMI评分，ROMA，HE4或CA125，IL-6可能会增强现有常规工具或生物标记物在区分恶性和良性卵巢肿块患者以及良性卵巢肿块和卵巢正常患者中的预测能力。影像学上偶然发现的囊肿患者可以免除手术干预。这些结果表明，IL-6可能是可疑卵巢肿块术前评估的有用诊断工具。这些结果支持进一步的研究，包括那些疾病的早期阶段，以探索和扩展在常规诊断测试中添加IL-6的潜在效用。
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