摘要
高致病性禽流感（HPAI）是毁灭性的家禽疾病，对公共健康构成严重威胁。灭活病毒疫苗的接种已作为控制鸡中高致病性禽流感病毒（HPAIV）感染的主要政策之一，已经应用了数年。病毒载体的HA蛋白疫苗是灭活疫苗的理想替代品。但是，每种病毒载体在开发针对HPAIV的基于HA的疫苗时都有其自身的优点和缺点。表达HA蛋白疫苗的重组新城疫病毒（rNDV）菌株LaSota已显示出对HPAIV的有希望的结果。但是，它的复制仅限于呼吸道。因此，我们认为应该评估荷兰副粘病毒血清型3（APMV-3）菌株作为针对HPAIV的安全疫苗载体，可以在更大范围的宿主器官中高效复制。在这项研究中，我们使用反向遗传学生成了表达H5N1 HPAIV的HA蛋白的rAPMV-3，并评估了中和抗体的诱导以及表达HA蛋白的rAPMV3和rNDV对鸡的HPAIV攻击的保护作用。我们的结果表明，用表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV免疫鸡可提供针对HPAIV攻击的完全保护。然而，与表达rNDMV-3的HA蛋白相比，表达rAPMV-3的HA蛋白对鸡的免疫诱导了更高水平的中和抗体。这些结果表明，表达rAPMV-3的HA蛋白可能是在田间条件下大规模接种商品鸡的更好的疫苗。在这项研究中，我们使用反向遗传学生成了表达H5N1 HPAIV的HA蛋白的rAPMV-3，并评估了中和抗体的诱导以及表达HA蛋白的rAPMV3和rNDV对鸡的HPAIV攻击的保护作用。我们的结果表明，用表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV免疫鸡可提供针对HPAIV攻击的完全保护。然而，与表达rNDMV-3的HA蛋白相比，表达rAPMV-3的HA蛋白对鸡的免疫诱导了更高水平的中和抗体。这些结果表明，表达rAPMV-3的HA蛋白可能是在田间条件下大规模接种商品鸡的更好的疫苗。在这项研究中，我们使用反向遗传学生成了表达H5N1 HPAIV的HA蛋白的rAPMV-3，并评估了中和抗体的诱导以及表达HA蛋白的rAPMV3和rNDV对鸡的HPAIV攻击的保护作用。我们的结果表明，用表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV免疫鸡可提供针对HPAIV攻击的完全保护。然而，与表达rNDMV-3的HA蛋白相比，表达rAPMV-3的HA蛋白对鸡的免疫诱导了更高水平的中和抗体。这些结果表明，表达rAPMV-3的HA蛋白可能是在田间条件下大规模接种商品鸡的更好的疫苗。我们使用反向遗传学方法生成了表达H5N1 HPAIV的HA蛋白的rAPMV-3，并评估了中和抗体的诱导以及表达HA蛋白的rAPMV3和rNDV对鸡的抗HPAIV攻击的保护作用。我们的结果表明，用表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV免疫鸡可提供针对HPAIV攻击的完全保护。然而，与表达rNDMV-3的HA蛋白相比，表达rAPMV-3的HA蛋白对鸡的免疫诱导了更高水平的中和抗体。这些结果表明，表达rAPMV-3的HA蛋白可能是在田间条件下大规模接种商品鸡的更好的疫苗。我们使用反向遗传学方法生成了表达H5N1 HPAIV的HA蛋白的rAPMV-3，并评估了中和抗体的诱导以及表达HA蛋白的rAPMV3和rNDV对鸡的抗HPAIV攻击的保护作用。我们的结果表明，用表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV免疫鸡可提供针对HPAIV攻击的完全保护。然而，与表达rNDMV-3的HA蛋白相比，表达rAPMV-3的HA蛋白对鸡的免疫诱导了更高水平的中和抗体。这些结果表明，表达rAPMV-3的HA蛋白可能是在田间条件下大规模接种商品鸡的更好的疫苗。我们的结果表明，用表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV免疫鸡可提供针对HPAIV攻击的完全保护。然而，与表达rNDMV-3的HA蛋白相比，表达rAPMV-3的HA蛋白对鸡的免疫诱导了更高水平的中和抗体。这些结果表明，表达rAPMV-3的HA蛋白可能是在田间条件下大规模接种商品鸡的更好的疫苗。我们的结果表明，用表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV免疫鸡可提供针对HPAIV攻击的完全保护。然而，与表达rNDMV-3的HA蛋白相比，表达rAPMV-3的HA蛋白对鸡的免疫诱导了更高水平的中和抗体。这些结果表明，表达rAPMV-3的HA蛋白可能是在田间条件下大规模接种商品鸡的更好的疫苗。
禽流感病毒（AIV）是正粘病毒科1的 Alphainfluenzavirus属的成员。它们可以在鸡中引起多种临床疾病。根据甲型流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面糖蛋白的抗原差异，将其分为18 H（H1-H18）和11 N（N1-N11）亚型的组合。在鸟类2中发现了H1-H16和N1-N9亚型。AIV分为低致病性禽流感病毒（LPAIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV），低致病性禽流感病毒导致受限的呼吸道和/或肠道疾病，而无特定病原体（SPF）鸡没有死亡在SPF鸡3，4。禽流感是禽毁灭性的疾病和公共卫生，这是由高致病性禽流感病毒H5的或H7亚型造成了严重的威胁，5，6。
灭活病毒疫苗和/或以病毒为载体的基于HA的病毒疫苗在全国范围内接种疫苗是目前在许多国家7实施的针对HPAIV的主要政策之一。尽管当前使用的疫苗大部分是灭活疫苗，但这种类型的疫苗并不是对抗禽类HPAIV感染的最佳选择。因为不仅这些疫苗的有效性不是最理想的，而且这些疫苗的生产和施用过程昂贵，费时且劳动强度大。此外，不能从接种的人血清学上很容易地分化受感染的鸟类是疫苗接种用含有病毒颗粒的灭活疫苗的担忧8，9。相反，病毒矢量HA蛋白的疫苗是灭活的疫苗所希望的替代10，11，12，13，14，15，16。但是，在选择每种病毒作为开发针对HPAIV 17的基于HA的疫苗的载体时，应考虑每种病毒的优缺点。在鸡中广泛研究的几种病毒载体HA蛋白疫苗候选物中，重组新城疫病毒（rNDV）表达高致病性禽流感病毒的HA蛋白已经显示出大有希望的结果，并已授权在现场使用3，10，17，18，19，20，21，22，23。
NDV是属的成员Orthoavulavirus在家庭副粘病毒1。根据NDV毒株在鸡中引起的疾病严重程度，将其分为三种病型：慢病毒（低毒力），中毒（中毒）和速溶菌（高毒力）。决定NDV病态类型的主要病毒因素是融合蛋白切割位点（FPCS）序列。前体F0至F1和F2亚基的裂解为副粘病毒的感染性，组织嗜性和致病性的先决条件24，25。Lentogenic NDV菌株在FPCS内包含一个或一个二元氨基酸，因此F0蛋白只能被存在于呼吸道和肠道细胞外的胰蛋白酶样蛋白酶切割为F1和F2亚基。相比之下，介晶和速生NDV菌株在FPCS处具有多碱性氨基酸，可被普遍存在的弗林蛋白酶样蛋白酶在细胞内裂解，导致全身感染26。尽管对慢病毒和介导NDV菌株均已作为人和兽用疫苗载体进行了评估，但由于其系统复制，发现介导NDV博德特C菌株非常有效27。然而，介基因NDV菌株是选择剂，因此不能用作疫苗载体。因此，我们认为，要评估另一种禽副粘病毒（APMV）血清型作为抗HPAIV的疫苗载体，与仅限于呼吸道的NDV毒株LaSota相比，它可以在更大范围的宿主器官中高效复制28，29。
NDV的所有菌株均属于APMV-1，但正式鉴定出另外20种血清型1。这些血清型的，APMV-3株荷兰，其属于埃希Paraavulavirus，具有multibasic FPCS，它允许复制在大范围的宿主组织的30，31。APMV-3在鸡和火鸡中是高度安全的，不是选择剂。因此，它可用作鸡和火鸡的疫苗载体。此外，APMV-3是抗原性不同的APMV血清型。因此，与rNDV载体相比，它可以更好地规避对NDV的已有免疫力。在这项研究中，我们使用反向遗传学产生了表达H5N1 HPAIV HA蛋白的重组APMV-3（rAPMV3）菌株荷兰。我们评估了rAPMV3菌株荷兰和rNDV菌株LaSota表达中和抗体对鸡的HPAIV和高毒NDV攻击的诱导和中和抗体的保护。我们的结果表明，与表达rNDV的HA蛋白相比，用表达rAPMV-3的HA蛋白免疫鸡可诱导更高水平的抗HPAIV中和抗体。此外，首先用表达rAPMV-3的HA蛋白对肉鸡进行初次接种，然后用表达rNDMV 3的HA蛋白进行加强免疫，甚至可以诱导针对HPAIV的高水平体液抗体反应。表达rAPMV-3的HA蛋白和表达rNDV的HA蛋白都可以保护鸡免受HPAIV攻击后的死亡。尽管两种表达HA蛋白的载体均在免疫鸡中诱导了针对HPAIV攻击的保护性免疫，但表达HA蛋白的rAPMV-3诱导的HI和中和抗体效价高于表达HA蛋白的rNDV。这些结果表明，rAPMV-3可能是该领域中HPAIV疫苗接种的更好载体。
在rAPMV-3的P和M基因之间插入含有密码子优化的H5N1 HPAIV的HA基因的转录盒（图 1）。从全长反基因组cDNA质粒中回收到表达rAPMV-3的HA蛋白，并在SPF雏鸡卵的尿囊液中繁殖。先前还回收了先前构建的含有HA基因质粒的LaSota全长反基因组cDNA 32，并将其与表达rAPMV-3的HA蛋白并行用于体外和体内比较。表达rAPMV-3的HA蛋白和表达rNDV的LaSota菌株表达HA蛋白分别命名为rAPMV-3 / HA和rNDV / HA。
含有HPAIV HA基因的重组禽副粘病毒血清型3（rAPMV-3）的构建示意图。预先将APMV-3菌株荷兰的全长反基因组cDNA构建成质粒pBR322。包含H5N1 HPAIV HA基因的ORF序列的转录盒位于APMV-3的P和M基因之间。HA基因转录盒包含以3′至5′顺序排列的以下元件的序列；SacII限制性酶切位点，6位规则的GC核苷酸，Kozak，HA基因ORF，APMV-3P基因的GE，此处作为HA基因的GE，IGS，APMV-3M基因的GS和SacII限制性酶切位点。将HPAIV菌株A /越南/ 1203/2004（H5N1）的多元切割位点基序（PQRERRRKKR'G）修改为LPAIV菌株A / Mexico / 31381/94（H5N2）的一元切割位点基序（PQRETR'G）。
通过Western印迹分析在鸡胚成纤维细胞（DF1）细胞裂解物中检测到rAPMV-3 / HA和rNDV / HA表达的HA蛋白（图 2A）。rAPMV-3 / HA和rNDV / HA均有效表达HA蛋白。但是，rNDV / HA在DF1细胞中检测到的HA蛋白表达水平略高于rAPMV-3 / HA。图2A泳道3中约60 kDa的条带 代表由rAPMV-3 / HA表达的裂解的HA0蛋白的HA1亚基。图2A泳道4中的〜70 kDa谱带和〜60 kDa谱带分别 代表rNDV / HA表达的HA1蛋白和未切割的HA0蛋白。图2A的通道1和2 代表DF1细胞和rNDV作为对照。还通过Western印迹分析检测到HA蛋白掺入rAPMV-3或rNDV颗粒中（图 2B）。将HA蛋白掺入rAPMV-3 / HA（图 2B泳道4）和rNDV / HA（图 2B泳道2）颗粒中。三个〜70，〜60和〜25 kDa带分别代表未切割的HA蛋白（HA0），HA1亚基和HA2亚基。
通过rAPMV-3或rNDV表达HA蛋白，并将HA蛋白掺入rAPMV-3或rNDV颗粒中。用0.1 MOI的rNDV，rNDV / HA或rAPMV-3 / HA感染DF1细胞单层。感染30小时后收集细胞裂解物。使用多克隆鸡抗H5N1血清通过Western blot分析检测HA蛋白的表达。（A）泳道1-4代表；DF1细胞分别为rNDV，rAPMV-3 HA和rNDV / HA。将重组病毒接种在10天的SPF鸡蛋中，接种后3天收集感染的尿囊液，并进行部分纯化。使用所述血清通过蛋白质印迹分析检测HA蛋白掺入rAPMV-3或rNDV颗粒中。（B）1-4线代表；rNDV，rNDV / HA，空泳道和rAPMV-3 / HA。全长凝胶在补充图 S1中给出。
将rAPMV-3 / HA和rNDV / HA传给10天大的SPF胚胎鸡蛋。两种重组病毒均在卵中有效复制。然而，与具有约2 7 -2 8 HAU / 50μl 滴度的rNDV / HA相比，rAPMV-3 / HA在具有约2 8 -2 9 HAU / 50μl 滴度的卵中复制效率更高。与rNDV / HA相比，在含有0.8％甲基纤维素和10％新鲜尿囊液的Dulbecco基本培养基（DMEM）存在下，rAPMV-3 / HA在DF1细胞单层中形成较大的噬斑（图 3C）。重组病毒的多周期生长动力学表明，rNDV / HA和rAPMV-3 / HA在DF1细胞中的生长比其相应的重组亲本病毒的生长稍慢（图。 3A，B）。
rNDV或rAPMV-3在DF1细胞中表达HA蛋白的多周期生长动力学和噬菌斑形态。DF1细胞的单层细胞以0.1 MOI感染rNDV，rNDV / HA，rAPMV-3和rAPMV-3 / HA。吸附一小时后除去含有病毒的上清液。洗涤细胞，并将含有10％尿囊液的DMEM加入细胞中。TCID 50使用DF1细胞以8小时间隔从感染细胞中收集的等体积上清液中的病毒滴度进行了检测。（A，B）在DF1单层中评估了在10％尿囊液存在下的rNDV，rNDV / HA，rAPMV-3和rAPMV-3 / HA的噬菌斑形态（C）。
在这项研究中，通过耳鼻腔途径用rAPMV-3 / HA或rNDV / HA对四日龄SPF雏鸡进行了免疫，并通过鼻腔途径通过H5N1 HPAIV感染了10 5 50％鸡蛋感染剂量（EID 50）/只H5N1 HPAIV鸟免疫后三周。结果表明，所有用rAPMV-3 / HA或rNDV / HA免疫的鸡都受到保护，免受HPAIV攻击的威胁，直至攻击后十天，而所有未免疫的鸡在攻击后第二天死亡（图 4A）。攻击后第4天，从用rAPMV-3 / HA免疫的十分之三的鸡中重新分离出攻击病毒，而从用rNDV / HA免疫的十分之十的鸡中仅一次分离出挑战病毒（图 4B））。与rNDV / HA相比，用rAPMV-3 / HA免疫鸡引起的针对HPAIV和相应骨架载体的中和抗体（图 4C）（P <0.05）和高HI滴度（图 4D）（图 4E）（ P <0.05）。
SPF鸡中和抗体的表达以及表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV的HA蛋白对H5N1 HPAIV的保护作用（实验1）。通过眼鼻途径用10 6.5 TCID 50 /只rNDV / HA或rAPMV-3 / HA的鸟免疫日龄SPF小鸡。免疫三周后，用10 5 EID 50的H5N1 HPAIV 感染鸡。攻击后10天观察感染的鸟，每天记录每组的死亡率。（A）在攻击后第4天，从存活的鸟中采集口咽拭子，并将每个拭子样品接种在一个10天大的有胚卵中，以重新分离挑战病毒。通过HA分析检测感染的卵。（B）免疫后三周，从所有鸡中收集血清，并通过微病毒中和法（C）和HI法（D）检测针对H5N2 LPAIV的诱导抗体水平，以及针对NDV和APMV的抗体HI效价HI测定也检测到-3。（E）血清滴度表示为倒数Log2稀释度。各组之间的统计学显着性是：P <0.05（*），p <0.01（**）和p <0.0001（***）。
在这项研究中，用rAPMV-3 / HA或rNDV / HA对日龄SPF鸡进行免疫，并在免疫后三周用更高剂量的10 6 EID 50 /只H5N1 HPAIV鸡进行感染。结果表明，用rAPMV-3 / HA免疫的所有鸡都可以从HPAIV攻击中幸存。保护了用rNDV / HA免疫的十只鸡中的九只免于HPAIV的死亡直至攻击后十天，而一只鸡在攻击后第四天死亡。而所有未接种疫苗的鸡在攻击后第二天死亡。（图 5A）。攻击后第4天，从用rAPMV-3 / HA免疫的十只鸡中的五只和用rNDV / HA免疫的十只鸡中的四只重新挑战病毒（图 5B））。与rNDV / HA相比，用rAPMV-3 / HA免疫鸡可诱导更高的中和抗体（图 5C）和更高的针对HPAIV的HI滴度（图 5D）（P <0.05）和相应的骨架载体（图 5E）。
SPF鸡中和抗体的表达以及表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV的HA蛋白对H5N1 HPAIV的保护作用（实验2）。通过眼鼻途径用10 6 PFU /只rNDV / HA或rAPMV-3 / HA的鸟免疫日龄SPF小鸡。免疫三周后，鸡用10 6 EID 50的H5N1 HPAIV 感染。攻击后10天观察感染的鸟，每天记录每组的死亡率。（A）在攻击后第4天，从存活的鸟中采集口咽拭子，并将每个拭子样品接种在5个10天大的有胚卵中，以重新分离挑战病毒。通过HA分析检测感染的卵。（B免疫后三周，从所有鸡中收集血清，并通过微病毒中和试验（C）和HI试验检测针对H5N2 LPAIV的诱导抗体水平。（D）还通过HI测定法检测了针对NDV和APMV-3的体液抗体应答。（E）血清滴度表示为倒数Log2稀释度。各组之间的统计学显着性是：p <0.01（**）和p <0.0001（***）。
用单表或初免-加强方案（年龄第一天的初次免疫和年龄三周的初次免疫）的表1所列的rAPMV-3 / HA和/或rNDV / HA对肉鸡进行免疫， 并感染10只在第5周龄时，H5N1 HPAIV的鸟类为6 EID 50 /只。结果表明，无论采用哪种免疫方案，用rAPMV-3 / HA和/或rNDV / HA免疫的所有鸡都可以从HPAIV攻击中幸存下来。而所有未接种疫苗的肉鸡均在攻击后的第一天死亡（图 6A）。在攻击后第四天从没有免疫的鸡中重新分离出攻击病毒。
表达rAPMV-3或rNDV的HA对肉鸡H5N1 HPAIV的保护作用。基于表1中提到的每组的接种方案，通过眼鼻途径用10 6 PFU /只rNDV / HA和/或rAPMV-3 / HA的鸟 免疫五只肉鸡。在第5周龄时，通过眼鼻途径用10 6 EID 50的H5N1 HPAIV 感染鸡。攻击后10天观察感染的鸟，每天记录每组的死亡率。（A）在初次免疫后三周和加强免疫后两周，从所有鸡中收集血清，并通过HI测定法检测针对H5N2 LPAIV的诱导的抗体。（B）血清滴度表示为倒数Log2稀释度。各组之间的统计学显着性是：P <0.05（*）。
用rAPMV-3 / HA或rNDV / HA诱导的日龄肉鸡单次免疫诱导产生针对HPAIV的体液抗体（图 6B）和相应的骨架载体（图 7A，B），随着时间的流逝，抗体滴度在5周后增加免疫（免疫后5周的HI效价高于免疫后3周的HI效价）（图 6B，7A，B）。与用rNDV / HA初免免疫后再用rAPMV-3 / HA加强免疫相比，用rAPMV-3 / HA初免免疫后经rNDV / HA加强免疫可诱导更高的针对HPAIV的HI滴度。 6B）（P <0.05）。在未感染的对照肉鸡中，在第2天，第1、2、3、4和5日龄时检测到了针对NDV菌株LaSota的母源抗体（MDA）HI效价，随着年龄的增长，效价下降（图 7D） 。在年龄的第二天和第一周也检测到针对rAPMV-3的MDAs HI滴度（图 7C）。
肉鸡中表达HA的rAPMV-3或rNDV对APMV-3和NDV的抗体反应。根据表1中提到的每组的接种方案，通过眼鼻途径用10 6 TCID 50 /只鸟的rNDV / HA或rAPMV-3 / HA 对肉鸡进行免疫。在初次免疫后三周和加强免疫后两周，从所有鸡中收集血清，并通过HI测定法检测针对rAPMV-3菌株荷兰（A）和rNDV菌株LaSota（B）的诱导的抗体。针对rAPMV-3株荷兰（C）和rNDV株LaSota（D的母源抗体（MDA）的水平。还通过HI测定法检测了未感染的肉鸡中的）。血清滴度表示为倒数Log2稀释。
用rAPMV-3 / HA或rNDV / HA免疫四天大的SPF小鸡，并在免疫后三周用100 50％致死性NDV 鸡致死剂量（CLD 50）/只鸟感染。结果表明，所有用rAPMV-3 / HA或rNDV / HA免疫的鸡在攻击后10天之前均不受死亡和强毒NDV攻击的临床征象，而所有未免疫的鸡在攻击后第5天和第6天死亡（图 8A）。rAPMV-3 / HA诱导的针对APMV-3的HI滴度高于rNDV / HA诱导的针对NDV的HI滴度（图 8B）（P <0.05）。在分别由rNDV / HA和rAPMV-3 / HA诱导的针对rAPMV-3和rNDV的抗体之间观察到交叉反应（图 8B）。
免疫SPF鸡的抗NDV株GB Texas的抗体反应和表达HA的rAPMV-3或rNDV的HA表达。通过眼鼻途径用10 6.5 TCID 50 / ml rAPMV-3 / HA或rNDV / HA 免疫四日龄SPF鸡。免疫三周后，鸡用100 CLD 50的NDV毒株GB Texas 感染。攻击后10天观察感染的鸟，每天记录NDV的死亡率临床体征。（A）免疫后三周，从所有鸡中收集血清，并通过HI测定法检测针对APMV-3和NDV的诱导的抗体水平。（B）血清滴度表示为倒数Log2稀释度。各组之间的统计学显着性是：P <0.05（*）和p <0.0001（***）。
rNDV毒株LaSota已经发现作为对HPAIV一个非常成功的疫苗载体中的鸡10，17，18，19，20，21，22，23。尽管rNDV载体可诱导良好的局部和全身免疫反应，但其复制仅限于呼吸道。因此，我们认为可以通过使用另一种无毒的禽副粘病毒载体来增强对HA抗原的免疫反应，该载体不仅可以在呼吸道中复制，而且可以在全身复制。我们选择将APMV-3评估为疫苗载体，因为它不会在鸡中引起明显的疾病，在鸡中复制良好并且不是选择剂。APMV-3具有在一个FPCS multibasic氨基酸基序，这使得它能够复制不仅在呼吸道，还全身性导致诱导强烈的免疫应答28，29，30，31。最近的一项研究表明，表达埃博拉病毒糖蛋白的rAPMV-3载体在豚鼠中诱导了高水平的针对埃博拉病毒的粘膜和体液中和抗体33。APMV-3 FPCS（ARPRGR↓L）和有毒的NDV菌株FPCS（RRQKR↓F）均含有多碱性氨基酸，被弗林蛋白酶样蛋白酶识别28。但是有毒的NDV菌株的FPCS在F1亚基的第一个位置包含一个F残基，而无毒的NDV菌株的FPCS在该位置包含一个L残基。它已经表明，F的存在残基与L残作为F1亚基的第一残余物与毒力相关联的34。APMV-3 FPCS在此位置包含L残基。我们认为，尽管APMV-3 FPCS包含弗林蛋白酶识别位点（RX-（R / K）-R↓），但它在F1亚基的第一个位置缺少F残基和其他病毒因素，可能是它在大肠杆菌中无毒的原因鸡。因此，APMV-3可以全身复制，但不会在鸡中引起明显的疾病。因此，rAPMV-3是产生针对HPAIV的基于HA的重组疫苗的有吸引力的载体。在这项研究中，通过采用反向遗传学技术，我们产生了表达H5N1 HPAIV的HA蛋白的rAPMV3菌株荷兰。然后，我们比较了SPF和商业鸡中表达rAPMV3的HA蛋白与表达rNDV的HA蛋白在中和抗体诱导和针对HPAIV的保护中的功效。
rAPMV-3和rNDV都在DF1细胞中高水平表达HA蛋白，并且发现HA蛋白被掺入了rAPMV-3和rNDV颗粒中。但是，rNDV的HA蛋白在DF1细胞中的表达水平略高于rAPMV-3。rNDV载体的HA表达水平较高，可能是由于在存在外源蛋白酶的情况下rNDV载体在体外的复制水平较高。与它们在DF1细胞中的相应亲本病毒相比，表达HAp的rAPMV-3或rNDV的生长较慢，这可能是由于将外源基因插入病毒基因组引起的35。相比rNDV矢量，rAPMV-3载体开发DF1细胞尺寸大斑和生长在含胚鸡卵中约1个对数滴度更高，因为这两种病毒FPCS之间的差异的结果28，29。
我们的结果表明，与表达rNDV的HA蛋白相比，表达rAPMV-3的HA蛋白在SPF鸡中诱导了更高水平的针对HPAIV和相应骨架载体的中和抗体。这些结果与先前的研究结果一致，后者表明rAPMV-3在鸡中比rNDV全身复制，从而导致较强的体液抗体反应诱导36。我们还发现，用表达rAPMV-3的HA蛋白对肉鸡进行初次免疫，然后用表达rNDV-3的HA蛋白对肉鸡进行初次免疫，再用表达rNDMV-3的HA蛋白的rHAV免疫对肉鸡进行免疫，结果会更高抗HPAIV的体液抗体水平。这些结果表明，日龄雏鸡含有母本衍生的NDV抗体，该抗体可以抑制表达rNDV的HA的复制，但不能影响rAPMV-3 / HA的复制。在3周龄时，母源性NDV抗体会减弱，这不再影响表达HA的rNDV的复制。因此，当使用rAPMV-3 / HA进行初次免疫，然后在3周龄时用表达rNDV的HA加强免疫时，可获得对HA的更强免疫应答。37，38，39。此外，这些结果表明，rAPMV-3 / HA在更大范围的雏鸡器官中具有高效复制。因此，在5周龄时，用rAPMV- / HA初次免疫然后用rNDV / HA加强免疫的鸡中检测到的抗体水平要高于用rNDV / HA初次免疫然后用rAPMV-3 / HA加强免疫的鸡。因为在用rAPMV-3初次免疫的鸡中，rAPMV-3 / HA诱导的抗体要比在用rAPMV-3 / HA加强免疫的鸡中诱导的抗体（2周）更长（5周）。
用表达rAPMV-3的HA蛋白或表达rNDV的HA蛋白免疫鸡为HPAIV攻击后的死亡提供了完全保护。这些结果表明，通过rAPMV-3或rNDV表达HA蛋白提供的免疫力足以提供对鸡高致病性禽流感病毒攻击的保护作用，在符合以前的报告3，17，18，19，20，21，22，23。用表达rAPMV-3的HA或表达rNDMV的HA免疫SPF鸡，可显着降低HPAIV攻击后口咽病毒载量。尽管通过表达rAPMV-3的HA蛋白和通过表达rNDV的HA蛋白诱导的针对HPAIV的中和抗体水平较高，但在两个实验挑战中，rAPMV-3和rNDV载体均未在SPF鸡中提供针对HPAIV的灭菌保护。在肉鸡的情况下，用表达HAMP的rAPMV-3或rNDV的鸡进行单次免疫或初免-加强免疫会引起杀菌免疫。肉鸡HPAIV攻击后缺乏病毒脱落可能是由于攻击剂量低，攻击时鸡龄高和/或每个拭子样本中分离分离攻击病毒的鸡蛋数量少所致。7。然而，在一个非常优化的挑战实验中，可以从用高效疫苗免疫的鸡中分离出非常低水平的挑战病毒，这种疫苗可以被视为具有杀菌保护作用。
表达HA蛋白的rAPMV-3和rNDV载体都没有完全停止攻击病毒的脱落。我们不认为这是这些载体疫苗的主要缺陷，因为H5N1 HPAIV是一种快速复制和高度传染性的病毒。因此，完全停止复制10 6 EID 50直接递送到鸡鼻道中的H5N1 HPAIV需要很高水平的局部和全身免疫。在野外条件下，接种疫苗的鸡不会遇到如此高剂量的感染性HPAIV。因此，我们认为两种载体引发的中和抗体滴度水平足以为该领域的HPAIV提供完全保护。出人意料的是，在接种了表达rAPMV-3的HA的鸡中发现的挑战病毒脱落量比表达rNDMV的HA高。这可能是由于某些未知原因而发生的。
在禽类的田间条件下，我们认为rAPMV-3 / HA比rNDV / HA更好的疫苗有几个原因。尽管用rAPMV-3 / HA和rNDV / HA免疫鸡可提供针对HPAIV的类似保护作用，但rAPMV-3 / HA在鸡中的复制比rNDV / HA更有效，导致诱导出更高水平的中和抗体。在野外大规模疫苗接种条件下，鸡是通过喷雾方法接种疫苗，而不是直接通过鼻内和眼内途径进行接种，鸡只接受较低滴度的疫苗。因此，由于在鸡中更有效的复制而导致的低剂量rAPMV-3 / HA可以诱导更高水平的中和抗体，并可能提供更好的保护。但是，在野外条件下，准确评估了rAPMV-3 / HA和rNDV / HA的相对保护效果，将需要进行大规模研究。与rNDV / HA相比，rAPMV-3 / HA的另一个优势是它可以复制到有胚鸡卵中更高的滴度，这是大规模生产疫苗的优点。此外，NDV母源抗体不会抑制rAPMV-3 / HA。因此，可以成为日龄肉鸡的有效疫苗。
我们的NDV攻击结果表明，用表达HA蛋白的rAPMV-3或rNDV免疫SPF鸡可提供针对高毒NDV毒株GB Texas攻击的完全保护，使其免于死亡。有趣的是，APMV-3和NDV的F和HN蛋白之间分别只有31％和34％的氨基酸同一性，但是它们提供了交叉保护28。这种保护很可能是由APMV-3的表面糖蛋白中的一些交叉反应中和表位提供的，先前已有报道[ 40]。
总而言之，这项研究的结果表明，用表达rAPMV-3的HA蛋白或表达rNDV的HA蛋白对鸡进行免疫，可以完全抵抗HPAIV攻击。但是结果表明，用表达rAPMV-3的HA蛋白免疫鸡所诱导的中和抗体水平要高于表达rNDMV-3的HA蛋白。综上所述，这些结果表明，表达rAPMV-3的HA蛋白可能是在田间条件下大规模接种商品鸡的较好疫苗。
从美国典型培养物保藏中心（ATCC，Manassas，VA）获得人表皮样癌（HEp-2）细胞和DF1细胞，以通过反向遗传学回收重组病毒并用于体外分别表征回收的病毒。还从ATCC获得Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞，以针对LPAIV株A / Mallard / Pennsylvania / 10218/1984（H5N2）进行病毒中和测试。HEp-2和DF1细胞在含有10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco基本必需培养基（DMEM）中生长；MDCK细胞在含5％FBS的DMEM中生长。重组病毒在10天大的SPF胚胎鸡蛋的尿囊液中繁殖（查尔斯河，马萨诸塞州）。将HPAIV菌株A / Vietnam / 1203/2004（H5N1）繁殖于10天大的SPF胚胎胚胎鸡蛋中，将其等分并保存在−70°C的Biosafety Level-3 plus设施中。储存的病毒原液用作攻击病毒，其终点滴度通过EID 50确定。H5N2 LPAIV在10天大的SPF胚胎鸡蛋中繁殖，等分后在-70°C的生物安全等级2设施中存储。所储存的病毒原液用于微中和试验，其终点滴度由MDCK中50％的组织培养物感染度（TCID 50）确定。
将含有APMV-3株荷兰的全长反基因组cDNA的质粒先前构造41，42和后来的病毒蛋白2（VP2）传染性法氏囊病病毒（IBDV）的基因APMV-3的P和M基因之间使用侧翼该质粒。在这里，我们使用SacII将HPAIV株A /越南/ 1203/2004（H5N1）的HA基因替换为VP2基因限制酶位点。HA基因经过密码子优化，可在人（哺乳动物）细胞中更高的表达水平。从含有HPAIV株A /越南/ 1203/2004（H5N1）的经密码子优化的HA基因的NDV全长反基因cDNA的质粒中扩增出含有H5N1 HPAIV的HA基因的ORF序列的转录盒。将HPAIV菌株A /越南/ 1203/2004（H5N1）的多元切割位点基序（PQRERRRKKR'G）修改为LPAIV菌株A / Mexico / 31381/94（H5N2）的一元切割位点基序（PQRETR'G）。HA基因转录盒包含以3′至5′顺序排列的以下遗传元件的核苷酸序列；SacII限制性内切酶位点，六个规则的GC核苷酸，Kozak，HA基因开放阅读框（ORF），APMV-3的P基因的基因末端（GE）（在此处用作HA基因的GE），APMV-的31个核苷酸3个基因间序列（IGS），APMV-3 M基因的基因起始（GS）和SacII限制酶位点。将HA基因转录盒的扩增片段克隆到pGEM®–T Easy载体（Promega Corporation）中，然后用SacII消化。限制性酶，并重新克隆到APMV-3的P和M基因之间，而不是先前插入P和M基因之间的VP2基因。通过共转染含有HA基因的APMV-3的全长抗基因组cDNA质粒和含有核衣壳蛋白（N），磷蛋白（P）或大聚合酶蛋白（L）的支持质粒来回收表达APMV-3的重组HA蛋白。 ）的APMV-3株荷兰到HEp-2细胞使用反向遗传技术，如先前所述43。表达rAPMV-3的HA蛋白和表达rNDV毒株LaSota的HA蛋白分别命名为rAPMV-3 / HA和rLaSota / HA。
在10％尿囊液存在下，用rNDV，rNDV / HA和rAPMV-3 / HA感染DF1细胞的单层细胞。感染30小时后收集DF1细胞裂解物。使用多克隆鸡抗H5N1血清检测HA蛋白的表达。为了检测HA蛋白掺入rAPMV-3或rNDV颗粒中，将重组病毒接种到10天大的SPF胚胎鸡蛋中。接种三天后，收集尿囊液并以1500 rpm离心10分钟以去除细胞碎片。将含有重组颗粒的尿囊液通过2％的蔗糖缓冲液在4°C下以28000 rpm（转子SW28）超速离心2:30小时。将包含部分纯化的病毒颗粒的沉淀沉淀物溶于50μl磷酸盐缓冲液（PBS）中。
重组病毒在10天大的SPF胚胎鸡蛋中传代。收获具有高HA滴度的病毒，并分装在-70°C下保存。在10％尿囊液存在下，通过噬斑测定来确定每种储存病毒的滴度。然后在0.1 MOI的rNDV，rNDV / HA，rAPMV-3和rAPMV-3 / HA感染6孔组织培养板中的DF1细胞单层。吸附一小时后，除去上层培养基，并在用DMEM洗涤单层细胞后，用含有10％尿囊液的新鲜DMEM代替。从每个孔中收集200μl的体积，并每隔8小时用含有10％尿囊液的新鲜培养基替换。将收集的上清液保存在-70°C，通过TCID 50检测每个样品中的病毒滴度使用DF1电池。使用Reed和Muench和Spearman-Karber方法44得出的公式计算每个样品的效价。
从查尔斯·里弗斯（Charles Rivers）购买的30只四天大的白色来亨鸡SPF小鸡分为三组，每组十只。第一组和第二组的小鸡分别用10 6.5 TCID 50 /只鸟，体积为160μl的rNDV表达HA蛋白和rAPMV-3表达HA蛋白免疫。通过眼鼻途径向第三组家禽接种160μlPBS。免疫三周后，将鸡转移到生物安全3级以上设施中，并用10 5 EID 50感染通过眼鼻途径检测HPAIV菌株A /越南/ 1203/2004（H5N1）。每天观察感染的鸡的死亡和H5N1 HPAIV的临床体征。攻击后第4天，从鸡中取出口咽拭子，并置于含10 X抗生素和两性霉素B的三毫升冷DMEM中。将每个拭子样品以1500 rpm离心10分钟，然后将200μl每个拭子样品的上清液接种到一个10天大的SPF胚胎鸡蛋中。接种后三天，通过HA测定测试尿囊液中是否存在挑战病毒。
从查尔斯·里弗斯（Charles Rivers）购买的30天，两日龄的白色来亨鸡SPF小鸡分为三组，每组十只。用10 6 PFU /只鸟（体积为200μl）分别免疫表达rNDV的HA蛋白和表达rAPMV-3的HA蛋白免疫第一组和第二组小鸡。第三组家禽通过眼鼻途径接种200μlPBS。免疫三周后，将29只禽（PBS组中的一只禽在免疫时间内死亡）转移到生物安全3级设施中，并感染了10 6 EID 50通过眼鼻途径检测HPAIV菌株A /越南/ 1203/2004（H5N1）。每天观察感染的鸡的死亡和H5N1 HPAIV的临床体征。攻击后第4天，从鸡中取出口咽拭子，并放入含10X抗生素和两性霉素B的三毫升冷DMEM中。将每个拭子样品以1500 rpm离心10分钟，并取出5个10天大的SPF胚胎鸡蛋。将每个拭子样品的上清液接种，每个鸡蛋200μl。接种后三天，通过HA测定测试尿囊液中是否存在挑战病毒。
30只两天大的肉鸡共分为六组，每组五只。在单一或初免-加强免疫方案中（第一天开始免疫，第三龄时加强免疫），用10 6 TCID 50 /只鸟（体积为200μl）的rNDV表达HA蛋白或rAPMV-3表达HA 免疫小鸡。表1所列各组的免疫方案通过眼鼻途径的蛋白 。在第5周龄（初次免疫后5周和加强免疫后2周）时，将禽类转移到生物安全3级以上的设施中，并感染10 6 EID 50通过眼鼻途径检测HPAIV菌株A /越南/ 1203/2004（H5N1）。每天观察感染的鸡的死亡和H5N1 HPAIV的临床体征。攻击后第4天，从鸡中取出口咽拭子，并放入含10X抗生素和两性霉素B的三毫升冷DMEM中。将每个拭子样品以1500 rpm离心10分钟，并接种200μl每个拭子样品的上清液在一个10天大的SPF胚胎鸡蛋中。接种后三天，通过HA测定测试尿囊液中是否存在挑战病毒。
从查尔斯·里弗斯（Charles Rivers）购买的15只四天大的白色来亨鸡SPF小鸡共分为三组，每组五只。用10 6.5 TCID 50 /只，体积为160μl的rNDV表达HA蛋白和rAPMV-3表达HA蛋白免疫第一组和第二组小鸡。第三组家禽通过眼鼻途径接种200μlPBS。免疫三周后，将禽类转移至生物安全3级设施，并通过眼鼻途径用100 CLD 50的强毒NDV株GB Texas感染。每天观察感染的鸡的死亡和NDV的临床体征。
使用与抗原相关的H5N2 LPAIV 3通过血凝抑制（HI）分析评估了从免疫鸡中收集的针对H5N1病毒HA蛋白的诱导抗体。使用LPAIV菌株A / Mallard / Pennsylvania / 10218/1984（H5N2）代替H5N1 HPAIV，因为该实验可以在生物安全性2级设施中进行。A / Mallard / Pennsylvania / 10218/1984（H5N2）病毒在抗原上类似于A / Vietnam / 1203/2004（H5N1）病毒（HA蛋白氨基酸之间有90％的同一性）。使用标准方案，通过微病毒中和测定评估针对血清中针对LPAIV H5N2诱导的中和抗体。简而言之，将血清在56℃下孵育30分钟。制备每种血清的系列两倍稀释液。将每种稀释液25μl和含有10 2 TCID 50病毒的25μlH5N2 LPAIV储备液混合，并在37°C下孵育90分钟。H5N2 LPAIV的效价由TCID 50确定在含有1μg/ ml N-甲苯磺酰基-1-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）处理过的胰蛋白酶的DMEM存在下，对MDCK细胞进行检测。除去96孔板中MDCK细胞单层的上清液，并用DMEM洗涤细胞。首先将50μlDMEM添加到每个孔中。然后将50μl血清和病毒的混合物添加到每个孔中，每个稀释的血清添加三个孔，并在37°C下孵育。吸附一小时后，除去孔的上清液，并用DMEM洗涤细胞。将包含1μg/ ml TPCK处理的胰蛋白酶的100μlDMEM加入每个孔中，并在37°C下孵育。孵育三天后，使用1％鸡RBC通过HA分析评估每个孔的50μl上清液中LPAIV株H5N2病毒的存在。44。还使用OIE方案通过HI分析评估了在免疫鸡血清中针对NDV菌株LaSota和rAPMV-3菌株荷兰诱导的抗体（在HPAIV保护性实验1 HI分析中使用了8 HAU抗原，在HAIIV保护性实验中使用了4 HAU抗原）其他HI分析） 45。
所有涉及rAPMV-3和无毒力NDV毒株LaSota的动物实验均在美国农业部批准的生物安全2级和生物安全2级加上设施中进行，所有涉及HPAIV和强毒NDV的动物实验均在美国农业部批准的3级生物安全加上设施中进行。遵循马里兰大学动物护理和使用机构委员会（IACUC）的指南和批准。所有实验均由IACUC批准并按照指南进行。
通过单因素方差分析分析各组之间的数据。t检验用于比较两组。为了避免偏差，将HPAIV和NDV激发实验设计为盲研究。
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