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褪黑素通过杯状细胞分化和通过Toll样受体4信号产生抗菌肽来控制结肠炎中的微生物群

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发表时间:2020-02-12 15:48作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

褪黑素通过杯状细胞分化和通过Toll样受体4信号产生抗菌肽来控制结肠炎中的微生物群

摘要

长期以来,人们一直认为微生物营养不良与炎症性肠病(IBD)的发病机理有关。尽管支持褪黑激素抗结肠炎作用的证据已经积累,但是尚不清楚褪黑激素如何影响微生物群。在本文中,我们调查了褪黑激素对结肠炎中微生物组的影响,并确定了Toll样受体(TLR)4信号参与该作用。褪黑素可改善野生型(WT)小鼠的右旋糖酐硫酸钠(DSS)引起的结肠炎和恢复的微生物失调,但不适用于TLR4基因敲除(KO)小鼠。服用褪黑激素可观察到杯状细胞的诱导,并伴有Il1bIl17a的抑制褪黑素受体和Reg3β(一种针对革兰氏阴性细菌的抗菌肽(AMP))的诱导。在体外,褪黑激素治疗HT-29肠上皮细胞可促进粘蛋白和伤口愈合,并抑制大肠杆菌的生长在本文中,我们显示褪黑素通过通过TLR4信号抑制革兰氏阴性细菌而显着增加杯状细胞,Reg3β以及FirmicutesBacteriodetes的比率我们的研究表明,通过TLR4感应细菌并通过改变杯状细胞和AMP调节细菌与褪黑激素的抗结肠炎作用有关。褪黑激素可用于IBD的治疗。

介绍

炎性肠疾病(IBD)是胃肠(GI)的慢性复发性病症道1的结果在慢性腹泻,腹痛,体重减轻,和改变的胃肠道蠕动2IBD的发病机理被认为是多维和多因素的,涉及遗传和环境因素。微生物群(微生物群落集合)在胃肠道中起关键作用,并参与营养物的消化,维生素的合成和黏膜免疫耐受的促进。肠微生物群组成的扰动和炎症反应可加重肠屏障功能障碍,是IBD的危险因素,尽管IBD发病机理尚不清楚。虽然IBD有多种药物治疗方法3,一些治疗剂有较高的毒性和感染并发症的危险 4最近,已提出使用粪便微生物群移植,益生菌和益生元控制微生物群作为一种新的治疗选择 5

褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧基5类色胺)是一种松果体激素,可调节其他激素,昼夜节律和氧化应激6最近的实验已经表明,褪黑激素也充当免疫系统调节剂7和改善DSS小鼠结肠炎89许多研究已经表明,褪黑激素影响渗透性,运动性,并且阻挡肠的功能1011褪黑素治疗可以改善胃肠道疾病,例如肠易激综合症12,IBD 13和坏死性小肠结肠炎14,表明它在胃肠道的生理功能中起关键作用。有趣的是,褪黑激素在胃肠道中积累,与松果体的分泌无关。胃肠道中褪黑激素的浓度比松果体15中的褪黑素高400倍胃肠道也是产生褪黑激素的最大酶源16,褪黑激素受体在胃肠道中高度表达,表明褪黑激素会影响免疫反应和微生物群。最近的研究报道,褪黑激素可增加菌毛拟杆菌Akkermania的比例10并抑制致病菌17在肠子里。尽管有这些知识,褪黑素抗结肠炎作用的关键信号途径以及控制肠道菌群的确切机制仍然未知。

我们以前曾报道过褪黑激素可改善小鼠13的睡眠剥夺性结肠炎在这项研究中,我们调查了Toll样受体(TLR)4信号参与褪黑激素的作用。TLR4是一种重要的TLR,可识别病原体相关的分子模式18,尤其是革兰氏阴性细菌,并控制肠道上皮细胞和粘膜屏障。我们还探讨了结肠炎中褪黑激素对微生物菌群失调和抗菌肽(AMP)调节的影响。

结果

褪黑激素的腹膜内给药通过TLR4信号改善DSS诱导的结肠炎

共生细菌在肠上皮中的TLR反应在先天免疫,结肠稳态和与腔细菌和肠道炎症相关的耐受性方面起着重要作用19在这些TLR中,TLR4特别识别脂多糖(LPS),主要参与革兰氏阴性菌的控制。已经报道了TLR4和IBD的遗传多态性之间的关联,尽管仍有一些争议19TLR4敲除(KO)小鼠中是高度敏感的革兰氏阴性菌2021因此,探索TLR4信号传导参与褪黑激素的体内抗结肠炎作用通过在饮用水中施用2.5%的葡聚糖硫酸钠(DSS)并以褪黑素(Mel)或媒介物(Veh)腹膜内(ip)处理,在8周大的野生型(WT)和TLR4 KO小鼠中诱发结肠炎。每天监测体重变化。在野生型和TLR4 KO小鼠的媒介物治疗组中,DSS治疗10天显着增加了体重减轻。尽管DSS + Veh和DSS + Mel组之间的体重没有显着差异(图   S1a,b),褪黑激素改善了疾病活动指数(DAI)(图1a,b)并减弱了结肠的缩短(图1b。   。   图1C,d)仅在野生型小鼠而不是在TLR4 KO小鼠。

图1
图1

褪黑激素的腹膜内给药可通过TLR4信号途径改善DSS诱导的结肠炎。从第1天到第8天,对野生型(WT)和TLR4基因敲除(TLR4 KO)小鼠在饮用水中施用2.5%DSS,并用0.25%EtOH / PBS(Veh)或褪黑激素(Mel,10 mg / kg /天)进行腹膜内处理。(ab)疾病活动指数(DAI)。cd)结肠长度。e–j)结肠的组织病理学。ef)高碘酸-席夫(PAS)-染色的代表图像。gh)组织病理学评分。Ĵ)杯状细胞分数。数据代表平均值±SEM(n = 10)。与DSS + Veh相比,使用单向方差分析进行邓尼特后检验来评估统计显着性。* P  <0.05,** P  <0.01,*** P  <0.005,## P  <0.01 vs.TLR4 KO,### P  <0.005 vs.TLR4 KO。骗局,未经处理的对照。

TLR4信号转导的缺陷消除了褪黑素引起的杯状细胞诱导和抗炎反应

DSS治疗组的结肠显示严重炎症,并伴有炎性细胞浸润和微观损伤,包括透壁损伤,隐窝和上皮丧失以及杯状细胞丧失。相比之下,褪黑素治疗组的野生型小鼠与载体治疗组相比在组织病理学特征上有显着改善,而在TLR4 KO小鼠中未观察到这些作用(图   1e–h)。值得注意的是,高碘酸-希夫(PAS)染色表明褪黑激素治疗的对照组结肠中杯状细胞显着增加,而与WT小鼠相比,TLR4 KO小鼠呈杯状细胞减少的趋势(图   1e,f,i ,j)。

结肠炎的特征在于表达两种促炎细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α(Tnfa),白介素1-β(Il1b)和白介素17 A(Il17a),以及抗炎细胞因子,包括白介素10(Il10)。和白介素22(Il22)。研究了这些细胞因子在结肠中的基因表达。实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析表明,褪黑激素可显着抑制WT小鼠Il1bIl17a的诱导,而在TLR4 KO小鼠中则并非如此(图   2a)。值得注意的是,TLR4 KO小鼠表现出Tnfa增加的趋势与WT小鼠相比,II1bII17a降低了Il10(图   2a,b)。两者合计,这些结果表明褪黑激素通过TLR4信号传导调节杯状细胞分化和炎性细胞因子的表达。

图2
图2

褪黑激素通过TLR4信号通路调节结肠中的炎性细胞因子和褪黑激素受体。a–c)结肠组织中的基因表达。通过定量RT-PCR评估促炎细胞因子(TnfaIl1bIl17a)(a),抗炎细胞因子(Il10Il22)(b)和褪黑激素受体(Mtnr1aMtnr1b)(c)的mRNA表达。d–f)WT(d)和TLR4 KO(e)小鼠结肠组织中褪黑激素受体的蛋白水平de)褪黑激素受体1A(MTNR1A)的免疫组织化学的代表性图像。f)光密度分析。数据代表平均值±SEM(n = 7)。使用学生t检验评估统计学显着性。* P  <0.05,** P  <0.01,*** P  <0.005,P  <0.05 vs.TLR4 KO,### P  <0.005 vs.TLR4 KO。骗局,未经处理的对照;梅尔,褪黑激素治疗;TLR4 KO,TLR4敲除小鼠;Veh,经过车辆处理;WT,野生型小鼠。

褪黑素改变微生物群组成并纠正肠道营养不良

有两种不同的受体对褪黑激素,1型A(MT1)和1b型(MT2),其由编码MTNR1AMTNR1B,分别22和表示在肠道232425评估褪黑激素受体(Mtnr1aMtnr1b)的表达以研究褪黑激素和TLR4信号传导的变化。与同时用DSS处理的媒介物处理组相比,qRT-PCR显示在褪黑素施用的小鼠结肠Mtnr1a的表达明显增加,并且Mtnr1b的趋势增加(图   2c)。但是,Mtnr1a的表达水平与WT小鼠相比,在TLR4 KO小鼠中显示出降低的趋势。结肠切片中MT1的免疫组织化学染色也支持了这些结果(图   2d–f)。TLR4是宿主与病原体之间体内平衡的重要信号途径。结果表明褪黑激素信号传导与TLR4信号传导相关并影响微生物群,并且存在依赖于TLR4信号传导的关键调节剂。

首先,为了观察由褪黑激素引起的微生物群的变化,使用WT和TLR4 KO小鼠的粪便进行了基因组分析。16 S rRNA基因高通量焦磷酸测序揭示了使用主坐标分析(PCoA)评估的总体微生物组组成(β多样性),这显示了媒介物和褪黑素治疗组的微生物群之间以及WT和TLR4 KO小鼠的微生物群之间的明显差异(图   3a)。在alpha多样性分析中,褪黑素给药组与DSS + Veh组相比,显示出使用Chao指数(图3b评估的粪便微生物群丰富度显着增加(图   3b),ACE和Shannon多样性指数的增加趋势以及Simpson指数的减少趋势。 (图   S2a),表明褪黑激素增加了微生物组的丰富度和多样性。值得注意的是,褪黑激素治疗组表现出对Proteobacteria的显着抑制,Proteobacteria是代表沙门氏菌大肠杆菌的革兰氏阴性(图   3c),并且Ruminococcaceae家族菌株增多(图   S2d),代表产生丁酸的革兰氏阳性。细菌在丰度在IBD粪便微生物减少2627虽然差异不显着,但褪黑素治疗组的拟杆菌属趋势有所下降,而坚定菌则呈上升趋势相对丰度相比于载体处理组(图   3C)如先前的研究1728甲显著降低厚壁菌门拟杆菌在DSS处理的组比在TLR4 KO小鼠也显示,而显著降低的丰度变形菌在WT小鼠(图的DSS处理的组显示出   3c中,dS2b中-F )。

图3
图3

褪黑素通过TLR4信号途径抑制肠道微生物组的营养不良。粪便微生物组组成使用16 S rRNA测序生成,并分析了β和α多样性和分类群。a)主坐标分析(PCoA)。b)Chao1指数。c)门的微生物群分布。d硬菌拟杆菌的比率。数据代表平均值±SEM(n = 5)。使用学生t检验(bd)和单向方差分析(ANOVA),然后进行Dunnett后检验(c评估统计学显着性* P  <0.05,** P <0.01。骗局,未经处理的对照;梅尔,褪黑激素治疗;OUT,业务分类单位;TLR4 KO,TLR4敲除小鼠;Veh,经过车辆处理;WT,野生型小鼠。

褪黑素通过Reg3β的诱导来控制革兰氏阴性细菌

接下来,检查了与近端结肠中AMPs相关的基因表达,包括cathelin相关的抗菌肽(Cramp),胰岛衍生蛋白3 beta(Reg3b),防御素α3Defa3)和防御素α4Defa4),探索结肠中微生物群调节的机制。在这些AMPs中,无法检测到Reg3b表达的其他组相比,在褪黑激素施用组中Reg3b表达显着增加其他肠道抗菌分子的表达未受影响(图   4a,b)。同时,褪黑激素治疗组通过免疫染色和蛋白质印迹评估的蛋白质水平也增加了(图   4c-g)。但是,TLR4 KO小鼠的可诱导AMP(例如Reg3β和防御素)水平降低。这表明褪黑激素通过TLR4信号传导诱导AMP的表达,特别是Reg3β的表达。

图4
图4

褪黑激素通过TLR4信号途径促进抗菌肽的产生。ab)抗菌肽在结肠组织中的基因表达。通过定量RT-PCR评估WT(a)和TLR4 KO(b)小鼠中CrampReg3bDefa3Defa4的 mRNA水平ce)WT和TLR4 KO小鼠结肠组织中Reg3β的蛋白水平。cd)WT(c)和TLR4 KO(d结肠Reg3β免疫荧光染色的代表性图像。) 老鼠。红色箭头表示代表性的杯状细胞。e)免疫荧光染色的光密度分析。数据代表平均值±SEM(n = 7)。f)WT和TLR4 KO小鼠结肠裂解物中Reg3β的Western blot代表性图像。e)蛋白质印迹的光密度分析。使用学生t检验评估统计学显着性。* P  <0.05,** P  <0.01,*** P  <0.005,## P  <0.01 vs.TLR4 KO。Con或C,未经处理的对照;DSS或D,经DSS处理;Mel或M,褪黑激素处理;TLR4 KO,TLR4敲除小鼠;Veh或V,经过车辆处理;WT,野生型小鼠。

Reg3β可以在杯状细胞中被诱导29,褪黑激素可以促进杯状细胞并调节细胞因子。此外,由于褪黑激素可以调节巨噬细胞30的功能,HT-29细胞用褪黑激素处理,无论是否含有通过PMA刺激而分化为巨噬细胞的THP-1细胞,并进行Alcian蓝染色以评估褪黑激素是否诱导了杯状细胞分化。体外与媒介物处理组相比,褪黑素处理增加了阿尔辛蓝染色。但是,仅HT-29(图5a)与分化的THP-1细胞共培养(图S4a之间没有区别   )。用TLR4抑制剂处理细胞时未检测到增加的Alcian蓝染色。一致地,褪黑激素和LPS处理后MUC2MTNR1AMTNR1B的 mRNA表达显着增加,这一发现在用TLR4抑制剂处理后消失了(图   5b,c)。这些结果表明褪黑激素直接调节杯状细胞的分化,这需要褪黑激素受体和TLR4信号通路。此外,褪黑激素增加促炎细胞因子(TNFA)和抗炎细胞因子(IL10)以及褪黑激素受体(MTNR1AMTNR1B)的mRNA表达)在分化的THP-1细胞中(图   5e,f)。

图5
图5

褪黑素通过杯状细胞分化和通过TLR4信号途径产生抗菌肽来控制革兰氏阴性细菌。ad)HT-29细胞用赋形剂(Veh)或褪黑激素(Mel)加或不加TLR4抑制剂(T4I)处理48小时。a)阿尔辛蓝染色的代表性图像(左)和光密度分析(右)。bd)褪黑素受体,粘蛋白和抗菌肽在肠上皮细胞(IEC)中的基因表达。粘蛋白2(MUC2)(b),褪黑素受体(MTNR1AMTNR1B)(c)和抗菌肽(REG3B)的mRNA水平。CAMPDEFA3)(d)通过定量RT-PCR进行评估。数据代表3个独立实验的平均值±SEM。e–g)将分化的THP-1细胞用赋形剂或褪黑素加或不加TLR4抑制剂处理4 h。通过定量RT-PCR评估细胞因子(TNFAIL10)(e),褪黑激素受体(MTNR1AMTNR1B)(f)和抗菌肽(REG3B)(g)的mRNA水平。hi)褪黑激素处理的细胞的抗菌活性。大肠杆菌 用来自HT-29细胞的培养基处理在LB肉汤中生长的(OD 600 = 0.5),孵育48小时,以1/10 5稀释,并接种在琼脂平板上。h)琼脂平板上菌落的代表性图像。将存在HT-29培养基的稀释细菌培养物点接种到EMB琼脂平板上,并在Gel文档系统中捕获。i大肠杆菌培养物的光密度(OD 600数据代表4次独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析,然后进行Dunnett后测,评估统计学显着性。* P  <0.05,** P  <0.01,*** P  <0.005,P 与DMSO相比,<0.05,与DMSO相比,## P  <0.01,与DMSO相比,### P  <0.005。DMSO,二甲亚砜处理;L P S,脂多糖处理,Mel,褪黑激素处理;T4I,经CLI-095处理;Veh,经过车辆处理。

仅褪黑素处理或褪黑素与LPS共同处理后,HT-29细胞REG3GCAMPDEFA3(人Reg3bCrampDefa3的直系同源物)的表达上调(图5d),尽管诱导了CrampLPS的表达。   在体内褪黑素不能诱导Defa3一致地,我们观察到分化的THP-1细胞REG3G的表达上调(图   5g)。为了证实褪黑素处理的细胞在结肠炎的发病机理中抑制革兰氏阴性细菌的生长,将HT-29细胞或与分化的THP-1细胞共培养的HT-29细胞的培养基用大肠杆菌(代表革兰氏菌)处理阴性细菌。大肠杆菌培养的集落和光密度显示褪黑素处理的HT-29细胞和与THP-1细胞共培养均抑制了大肠杆菌的生长,而不受THP-1细胞共培养的影响(图   5h,iS4b)。这些结果表明褪黑激素通过Reg3β诱导抑制拟杆菌

褪黑素通过TLR4信号传导促进肠上皮细胞的伤口愈合

先前的研究报道,TLR4信号传导可促进伤口愈合并在肠道中诱导AMPs 31而且,褪黑激素受体通过TLR4信号转导褪黑激素受体的表达。为了评估褪黑激素是否通过伤口修复影响肠道屏障调节,使用刮擦的HT-29细胞(有或没有分化的THP-1细胞)进行了伤口愈合试验。与对照相比,褪黑激素促进伤口闭合,LPS刺激进一步增加了伤口闭合。然而,仅HT-29细胞(图6a,b)和与THP-1细胞共培养的HT-29细胞(图   S4c,d之间没有显着差异   ,这表明褪黑激素直接影响IECs的伤口愈合。

图6
图6

褪黑激素通过TLR4信号途径改善肠上皮细胞的伤口愈合。a)伤口愈合试验的代表性图像。b)伤口闭合率。通过使用Image J软件测量伤口面积来评估伤口闭合率。数据代表3个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析,然后进行Dunnett后测,评估统计学显着性。 与DMSO相比 ,* P <0.05,** P  <0.01,## P <0.01 DMSO,二甲亚砜处理;LPS,脂多糖处理,Mel,褪黑激素处理;T4I,经TLR4抑制剂处理;Veh,经过车辆处理。

讨论区

褪黑激素具有多种功能,包括抗氧化剂,记忆形成和降低血压的特性32另外,许多先前的研究显示褪黑激素禁止显示DSS诱导的结肠炎的口服和直肠给药333435褪黑激素是在肠道中丰富的15,松果体对肠道的褪黑激素浓度没有影响36尽管IBD涉及肠道菌群和宿主免疫系统之间的体内平衡扰动,但这一观点已被广泛接受37,褪黑素对IBD中生物合成异常的影响尚不清楚。目前尚不清楚褪黑激素如何影响生物功能,虽然最近的研究表明,褪黑激素会改变胃肠道的微生物1017在本文中,我们表明在WT小鼠中腹膜内注射褪黑激素可缓解DSS诱导的结肠炎。如同上DSS-或褪黑激素的先前报道的效果TNBS诱导的结肠炎3839,褪黑激素禁止显示强效的促炎介质在结肠炎诸如IL1BIL17A,以及在肠道微生物群控制。

与我们的观察相一致,很多研究报告说,褪黑激素增加,杯状细胞在脊椎动物的肠道10173940杯状细胞是结肠炎19中产生黏蛋白和AMP的重要分泌性IEC 这些产品可用作对抗病原体防御的第一线通过保持粘液屏障和共生细菌的稳态和由分离肠道细菌和上皮41考虑到IEC与肠道细菌相互作用,IEC产生的AMP可能会影响微生物群的组成和丰度,并在防止细菌入侵方面发挥作用42,除了其他类型的细胞,如T细胞和先天性淋巴样细胞43尽管给药途径与之前的研究不同,但我们仍发现褪黑激素可以逆转结肠炎中的微生物菌群失调,并增加菌毛拟杆菌的比例。虽然褪黑激素已被报道提高的丰度厚壁菌乳酸菌Akkermania,并降低拟杆菌Prevotellaceae 1017,我们没有观察到这些细菌的任何明显变化。这可能是由于不同采样方法导致的胃肠道内不同细菌位。鉴于粘蛋白影响的微生物群的组成29和一些细菌使用的聚糖作为营养4445由于杯状细胞粘蛋白分化调节,微生物群调制由褪黑激素可以是。

更重要的是,对革兰阴性菌如宿主防御沙门氏菌可以通过抗菌肽如Reg3β和防御素的α来控制464748这可能是褪黑激素控制微生物的另一重要机制。革兰氏阴性细菌(通常与IBD相关的病原体)的细胞壁中的LPS通过TLR4 49诱导炎症反应TLR4是细菌LPS的受体,并调节LPS诱导的炎症反应。革兰氏阴性细菌大量增加在TLR4 KO小鼠和杯状细胞和AMP表达,包括Reg3γ和Reg3β的TLR4诱导分化4250我们发现革兰氏阴性细菌如在TLR4 KI小鼠的粪便中细菌杆菌含量升高(图3c),而在TLR4 KI小鼠的粪便中   诸如Ruminococcaceae的硬毛菌减少(图   S2d)。正如在以前的研究中2948,我们确定了Reg3β可以在近端结肠组织中引起的。先前的研究报道,褪黑素抑制了产肠毒素的大肠杆菌感染模型的感染17我们的研究首次表明褪黑激素可增加AMP,尤其是Reg3β。与Reg3β的革兰氏阴性菌抗菌特异性一致47515246,我们观察到褪黑素处理IECs后,小鼠结肠,IECs和巨噬细胞中Reg3β的表达急剧增加,并抑制了大肠杆菌的生长我们的结果表明,褪黑激素诱导AMPs是革兰氏阴性细菌抑制的直接原因。事实上,Reg3β缺陷小鼠显示出在抑制革兰氏阴性细菌,如沙门氏菌异常 4753抗菌肽总是表达,但Reg3β已知由TLR活化微生物生长或炎症期间被表达 4654在正常生理条件下,结肠不表达Reg3β和α-防御素,但这些AMPs在结肠炎中被诱导 55,表明TLR4信号传导在褪黑激素调节Reg3β中也起作用。虽然褪黑激素已被报道抑制TLR4 / NF-κB信号5657,TLR4信号出现链接病原体检测和AMP的产生被认为是褪黑激素的功能发挥保护作用。用TLR4 KO小鼠和TLR4抑制剂进行的实验揭示了褪黑激素对杯状细胞分化和褪黑激素受体诱导的抗结肠炎作用。先前我们证明了杯状细胞分化58需要TLR4信号传导

尽管有褪黑素抑制相关TLR4信号转导的矛盾研究,但Reg3β的表达也依赖于TLR4信号转导[ 56]TLR4介导愈合和受伤肠上皮的增殖3140,并且随后调节肠屏障功能和粘膜愈合59一致地,我们发现褪黑激素可增强IECs的伤口愈合,这些作用需要TLR4信号传导,并通过巨噬细胞介导。我们还观察到用LPS褪黑素处理后,粘蛋白,抗菌肽和褪黑素受体的协同表达,这很可能是由于LPS增强了TLR4的表达。我们的研究结果也与先前的研究认为TLR4 KO小鼠对结肠炎比野生型小鼠更容易受到一致的6061然而,除TLR4之外,褪黑激素功能可能还有其他途径,需要进一步的机械研究来解释褪黑激素与TLR4信号传导之间相互作用的这些矛盾结果。

尽管还需要进行进一步的研究(例如常规敲除系统)来确认褪黑素诱导AMP的确切机制并排除许多混杂因素,但这是首次解释褪黑素如何调节结肠炎中微生物群并显示两者之间的联系的研究。褪黑激素和微生物群。此外,我们表明,通过杯状细胞的TLR4,粘蛋白和Reg3β产生的细菌感应与褪黑激素的抗结肠炎作用有关,这表明褪黑激素可能在IBD的菌群控制和治疗中有用。

方法

小鼠结肠炎模型

TLR4缺陷型BALB / c小鼠由韩国生物科学与生物技术研究所(韩国大田)提供,并按照前述方法饲养58为了诱发急性结肠炎,在饮用水中向8-9周大的雄性BALB / c小鼠和TLR4敲除小鼠喂食了2.5%(w / v)DSS(MW 36,000–50,000,MP Biomedicals,Solon,OH,美国)持续6天。DSS管理的第一天指定为第0天;在第6天用DSS饮用水代替普通饮用水。将小鼠随机分为四组:对照组,褪黑激素,DSS +载体和DSS +褪黑素。对照组和褪黑激素组小鼠仅饮水。褪黑素和DSS +褪黑激素组从第1天到第8天通过腹膜内注射褪黑激素(10 mg / kg /天),而对照组和DSS +媒介物组则根据我们以前使用DSS诱导的结肠炎的研究,以0.25%EtOH / PBS ip接受治疗以检测快速反应81362在第9天处死所有小鼠,并测量结肠长度。收集结肠和盲肠内容物进行分析。每天监测所有小鼠的体重减轻,粪便稠度和直肠出血。处死前评估疾病活动指数(DAI)分数。DAI评分是根据以下参数计算得出的:体重减轻(0,无; 1、1–5%; 2、5-10%; 3、10-20%; 4,> 20%),直肠出血(0 ,不存在; 1和2,轻度出血; 3,出血)和大便稠度(0,阴性; 1和2,松弛; 3,腹泻)。DAI分数表示为这三个参数的平均值。将所有动物在标准条件下于21–22°C下进行12小时的明暗循环。沿整个结肠进行纵向切口,并通过用PBS洗涤消除所有粪便。将近端结肠的部分切成3块,用于PAS染色和RNA分离。所有使用动物的实验均经过韩国首尔延世大学遣散医院的机构动物护理和使用委员会(IACUC)的审查和批准(IACUC批准号:2015-0407),并按照IACUC的指导进行。

高碘酸-席夫和阿尔辛蓝染色,免疫染色和组织学

根据标准程序分别评估每只动物或细胞远端结肠的4 µm厚石蜡切片或PAS染色或Alcian蓝染色,以评估组织病理学和杯状细胞。使用抗小鼠MTNR1A进行免疫组织化学(1:500; Abcam公司,剑桥,MA,USA),如先前所描述5863与抗小鼠Reg3β(1:200,R&D Systems,美国明尼苏达州明尼阿波利斯)孵育后,将切片与Alexa Fluor-488偶联的二抗(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)孵育以进行免疫荧光染色。所有图像通过共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 700,Prenzlauer,柏林,德国)获得,并且染色强度使用Image J软件(NIH,Bethesda,MD,美国)测定。杯状细胞染色的评分为0到5(5,最低,<10%; 4,最低,<20%; 3,轻度,21–30%; 2,中度,31–40%; 1,中度,41– 50%; 0,已标记,> 50%)。

细胞培养与处理

将HT-29(韩国细胞系银行,韩国首尔)和THP-1(ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)细胞系保存在10%胎牛血清补充RPMI培养基中,温度为37°C。含或不含褪黑素(200 µM,美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich),脂多糖(LPS,200 ng / mL,美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich)的5%CO 2的加湿气氛和TLR4抑制剂CLI-095(1μg/ mL,InvivoGen,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)显示时间。用最终的100 nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA,Sigma-Aldrich)处理THP-1细胞,使其分化为巨噬细胞样细胞。

Yoon友善地提供了先前从小鼠64分离出的本地大肠杆菌菌株将用HT-29细胞培养基孵育的细菌培养物铺在营养琼脂或EMB琼脂上,或在营养培养液中于静态培养条件下于37°C下培养48小时。大肠杆菌菌落图像通过Gel文件系统(MINIBIS PRO,耶路撒冷,以色列)捕获,并使用ELISA阅读器VERSA Max(分子仪器,美国加利福尼亚州桑尼维尔)测量大肠杆菌培养物的光密度(OD 600)。)并使用SoftMax Pro版本6.3(Molecular Devices)进行分析。

实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

根据制造商的说明,分别使用Ribospin试剂盒(Geneall,韩国首尔)和TRIzol试剂(Life Technologies,Carlsbad,CA,美国)从结肠组织和细胞中制备总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(加利福尼亚州福斯特城的Applied Biosystems)对RNA进行逆转录。使用StepOne Plus实时PCR系统(Applied Biosystems)和SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)对mRNA表达水平进行定量。热循环为:45个循环,其中95°C持续30 s,60-63°C持续30 s,72°C持续40 s。所有PCR均一式两份进行。将结果归一化至β-肌动蛋白基因的表达,并且将每个靶mRNA的相对表达计算为2- ΔCt将结果标准化为β-肌动蛋白的表达,并通过方程式2- ΔΔCt进行计算引物序列由Macrogen(韩国首尔)合成。PCR引物列于表   S1中

微生物组的基因组分析

根据制造商的说明,使用用于土壤试剂盒的FastDNA™SPIN(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,美国)从粪便中获得细菌基因组DNA。ChunLab Inc.(韩国首尔)使用位于16S rRNA基因V3-V4区侧翼的条形码引物对微生物组进行检测。(操作分类单元(的OTU)根据16个使用EzTaxon-E数据库,这rRNA序列数据鉴定://eztaxon-e.ezbiocloud HTTP。净)。肠道微生物组组成的主坐标分析(PCoA)由Jensen-Shannon进行评估。对OTU丰富度(基于丰度的覆盖估计量(ACE)和Chao1指数)和多样性(Shannon指数和Simpson指数)进行了alpha多样性分析。使用CLcommunity软件(Chunlab Inc.)分析细菌群落的丰度和组成。

蛋白质印迹分析

通过用冷PBS洗涤两次,刮擦并重悬,在冰上裂解收集结肠组织。使用牛血清白蛋白的BCA测定法测定结肠裂解液的蛋白质浓度。通过混合SDS样品缓冲液制备的蛋白质样品在NuPAGE 4–12%梯度Bis-Tris上运行,并电转移到聚偏二氟乙烯膜(Thermo Fisher Scientific)上。64用5%(w / v)封闭印迹在含有0.1%Tween 20的Tris缓冲盐水溶液中(美国皮尔斯(Pierce,Appleton,WI,USA))脱脂牛奶,并在4°C下与抗Reg3β(1:1000,R&D Systems)和β-肌动蛋白(Sigma)的抗体一起孵育过夜。

统计分析

使用GraphPad软件(美国加利福尼亚州拉霍亚)进行统计分析。使用学生t检验或单向方差分析(ANOVA)评估条件之间差异的显着性P值<0.05被认为是显着的。




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