摘要
实体瘤手术切除后可能发生转移，转移是癌症死亡的主要原因。外科手术中使用的麻醉药在癌症转移中的作用及其潜在机制仍然未知。在这里，我们显示在同种鼠4T1和异种移植的人MDA-MB-231乳腺癌模型中，七氟醚麻醉下小鼠的原发性肿瘤的手术解剖比丙泊酚导致的肺转移明显多于丙泊酚。七氟醚增加血清IL-6的水平，从而激活STAT3和CD11b +髓样细胞向肺的浸润。在4T1模型中，JAK抑制剂AZD1480中断IL-6 / JAK / STAT3途径可逆转七氟醚的促转移作用以及相应的激活的STAT3和浸润的CD11b +细胞的增加。
实体瘤的完全切除提供了治愈的希望，并且通常是一线治疗。但是，重要器官确实会发生复发转移，这是导致死亡的主要原因。尽管有手术治疗的意图，但已表明围手术期对癌症患者存在许多风险1。正在进行的争议是手术期间使用的麻醉剂是否会实质性影响癌症患者的预后2。一些回顾性研究表明，吸入麻醉药，主要是七氟醚，用的患者比癌症手术后静脉麻醉药丙泊酚糟糕的结果有关，但不被别人确认的3，4，5，6，7。回顾性研究和报告不一致的性质排除了关于麻醉药在患者预后中的作用的结论。此外，麻醉剂在癌症转移和潜在机制中的作用在很大程度上尚不清楚，在临床研究中难以解决，部分原因是患者和疾病的异质性。因此，需要进行大量的临床前研究来定义麻醉药在癌症中的作用，并阐明麻醉药在癌症转移中的分子机制。
在这项研究中，我们在同种鼠4T1和异种移植人乳腺MDA-MB-231小鼠模型中比较了七氟醚和异丙酚对肺转移的影响，这两种模型均具有临床相关手术。同种鼠类4T1小鼠模型在某种程度上类似于人类乳腺癌的形成，使我们能够进行模拟患者乳房切除术的手术。鼠乳腺癌4T1细胞是高度致瘤性和可靠地转移到多个远处器官8，9。此外，4T1转移的逐步传播至远处器官与人类乳癌非常相似。微转移出现在疾病的早期阶段，然后激活成为转移随着时间的推移10，11。通过这种方式，有一个时间窗可以靶向转移的早期阶段。MDA-MB-231细胞是一个积极的三阴性乳腺癌细胞系，并能够定殖肺，键，和脑12，13，14。选择非肥胖糖尿病（NOD）严重的联合免疫缺陷（SCID）小鼠用于该模型的成功应用，以评估药物的抗转移效果15。因此，这两个模型被认为是乳腺癌转移的临床相关模型16。
在这项研究中，我们显示，在接受外科手术切除原发性肿瘤的过程中，接受挥发性麻醉剂七氟醚麻醉的小鼠比接受异丙酚的小鼠发生了更多的肺转移。为了描述潜在的机制，我们评估了麻醉剂对癌细胞，细胞因子水平和肺微环境的影响，主要是在4T1模型中显示了小鼠的完全免疫力。我们确定白细胞介素6（IL-6）是七氟醚通过激活IL-6 /信号转导子和转录3（STAT3）通路的激活剂以及CD11b +细胞的浸润而引发肺微环境的关键因素。由于Janus激酶（JAK）在STAT3激活时介导IL-6，因此我们使用JAK2抑制剂AZD1480，靶向IL-6 / JAK / STAT3途径，发现它在4T1模型中明显逆转七氟醚诱导的肺转移和肺中CD11b +细胞的增加。我们的研究不仅揭示了七氟醚促进癌症转移的潜在机制，而且为克服全身麻醉的风险提供了有希望的干预措施。
将稳定表达荧光素酶的鼠4T1细胞植入异氟醚吸入的balb / c小鼠单侧乳腺脂肪垫中。植入过程在10分钟内完成，以最大程度地减少小鼠对异氟烷的暴露。当原发肿瘤的体积达到约500 mm 3时，在吸入七氟醚或腹膜内（ip）注射异丙酚的情况下进行手术解剖，并保持麻醉3小时。手术切除原发肿瘤后两周，离体生物发光成像显示，接受七氟醚治疗的小鼠比接受异丙酚的小鼠明显发生更多的肺转移（图 1a，b，n = 10，p = 0.013，未配对t-测试）。组织学分析证实了肺转移的差异（图 1c）。结节计数与离体IVIS图像非常相关（图 1d，p = 0.019，双向ANOVA + Dunnett事后检验）。
通过在balb / c小鼠或NOD-SCID小鼠的乳腺脂肪垫中分别原位植入荧光素酶标记的鼠类4T1乳腺癌细胞或人MDA-MB-231乳腺癌细胞来产生带有原发性肿瘤的小鼠。在两种模型中，七氟醚对原发肿瘤的手术切除均明显高于丙泊酚。在小鼠模型中进行乳房切除术，并在术后两周评估肺转移情况。在4T1模型中，接受七氟醚的小鼠的离体肺部生物发光成像和b光子强度显示的肺转移明显多于接受丙泊酚的小鼠（ 每组n = 10，p = 0.013，未配对t检验）。箱形图的中心线代表中位数，界限代表第一和第三分位数，而晶须代表最低和最高值。生物发光成像的结果通过（c）不同放大率下各组肺切片的组织学（H＆E染色）图片得到证实。量化每组中的大转移结节与微转移结节。d检查转移性结节的数量和大小，发现七氟醚组的宏观转移明显多于丙泊酚组（n = 10，p 对于宏观转移，双向ANOVA + Dunnett事后检验= 0.019）。在MDA-MB-231异种移植模型中观察到4T1同基因模型的结果，如（e）小鼠肺区域的生物发光图像所示，f定量测量了离体肺光子强度（p = 0.04，n = 8七氟醚组和ñ 为异丙酚组，不成对= 6 吨 -test），克肺的组织学和ħ转移结节（定量ñ = 8七氟醚组和ñ 为异丙酚组= 6，p 对于宏观转移，双向ANOVA + Dunnett事后检验= 0.016）。数据显示为平均值±SD比例尺：20×= 2 mm，40×= 600μm，100×= 300μm。源数据作为源数据文件提供。
为了验证在4T1模型中观察到的麻醉药对肺转移的不同作用，我们在相同的实验条件下，采用另一只小鼠模型，该模型具有在稳定的NOD-SCID小鼠中稳定表达萤光素酶的人MDA-MB-231乳腺癌细胞。以下乳房切除术在七氟醚和丙泊酚基之间的肺转移中的差异显著如通过测定体外生物发光成像（图 1E，F，N = 7用于七氟醚组和Ñ = 6异丙酚组，p = 0.04，不成对吨 -测试）。一致地，与用异丙酚麻醉的小鼠相比，H＆E染色显示在用七氟醚麻醉的小鼠的肺部有更多的转移灶（图 1g，h，p = 0.016，双向ANOVA + Dunnett事后检验）。
在一起，我们证明了在两种模型中，七氟醚比丙泊酚与肺转移显着增加的肺转移有关，一种模型是鼠类乳腺癌细胞，一种模型是人乳腺癌细胞。为了描述这两种最常用的麻醉药对转移的不同作用的潜在机制，由于受试小鼠具有完全免疫力，我们在以下实验中使用了4T1同系小鼠模型。
为了研究麻醉剂是否对体内肿瘤细胞生长有直接影响，在将4T1细胞植入balb / c小鼠的一个乳腺脂肪垫期间，使用了七氟醚或异丙酚，并每2天重复暴露于相同的麻醉剂中1小时。通过测量大小（补充图1A），重量（补充图 1B）和体内生物发光成像（补充图 1C）来跟踪原发肿瘤在两周内的生长 。生长曲线（补充图 1A）和最终原发肿瘤重量（补充图 1B））显示七氟醚和丙泊酚组之间没有显着差异，这表明麻醉药不会改变原发性肿瘤的生长过程，或者两种麻醉药对体内4T1细胞的增殖都具有相似的作用。植入后两周，在三小时麻醉下以与植入相同的麻醉剂和反复暴露的方式切除原发肿瘤。之后，每两天继续暴露于相同的麻醉剂一小时，持续两周。手术切除原发肿瘤两周后，体内和离体生物发光成像（补充图1D，E）以及组织学检查（补充图1F，图1F和图1F）显示，接受七氟醚治疗的小鼠比接受异丙酚的小鼠发生的肺转移明显多于接受丙泊酚的小鼠 。 G）。然而，与手术期间的单次暴露相比，七氟醚的多次暴露没有显示出附加的促转移作用（补充图 1H–J）。这表明七氟醚改变手术过程需要一些手术阶段的内在因素。
麻醉剂已经提出经由各种细胞途径，这可能会影响转移级联到靶向肿瘤细胞17，18。为了探索麻醉剂对癌细胞功能的直接影响，我们测试了七氟醚和异丙酚对4T1细胞活力和迁移的影响。在这些体外研究中，我们选择了七氟醚的相关临床剂量（0.2 mM，即1.3 MAC）和近似等效的异丙酚临床剂量（每毫升4 µg）。培养24小时后，通过MTT测定法测量细胞活力。七氟醚在0.2 mM或更低的浓度下不会影响细胞活力，但在1 mM或更高浓度下对4T1细胞表现出显着的抗增殖作用（补充图 2A）。）。异丙酚未能在指定的剂量范围内抑制细胞增殖（补充图 2B）。通过在24和48小时的伤口愈合测定来评估4T1细胞的迁移。七氟醚和异丙酚均以剂量依赖性方式抑制4T1细胞的迁移（补充图 2C，D）。因此，两种麻醉药对4T1细胞的体外作用似乎均未反映其独特的体内作用，这表明麻醉药可能会改变调节转移性肿瘤播种和生长的肿瘤微环境。
接下来，我们评估了术后转移早期与这两种麻醉药相关的细胞因子的潜在变化。细胞因子的变化可能会破坏转移过程中的协调分子网络。由于暴露后数小时通常会在一天之内消除麻醉剂，因此我们使用4T1同系小鼠模型将麻醉剂的短期作用集中于血清和肺中细胞因子/趋化因子的水平。按照与上述相同的手术步骤和麻醉方案，在乳房切除术后三小时或一天收集小鼠血清和肺组织，以进行分泌的细胞因子/趋化因子分析。一组没有手术且没有麻醉的原发肿瘤小鼠作为参考。如图2a所示 和补充图 3，我们发现七氟醚增加了促乳腺肿瘤转移的促炎细胞因子，例如IL-6，白介素12，血管内皮生长因子（VEGF），基质细胞衍生因子1（SDF-1） α），TARC（CCL17），趋化因子配体1（I-309 / CCL1）和前基质金属肽酶9（Pro-MMP9）与参考文献19相比。与七氟醚相反，丙泊酚可降低促炎细胞因子/趋化因子，包括肿瘤坏死因子（TNF-α）。
在4T1同系小鼠模型中，通过细胞因子阵列分析评估了麻醉药诱导的肺组织细胞因子的变化。在七氟醚或丙泊酚的乳房切除术后三小时或一天，对小鼠实施安乐死以收集血清和肺组织，然后对它们进行细胞因子阵列c-100处理。将数据相对于跨膜的参考样本（没有手术的有小鼠肿瘤）进行标准化，以计算血清或肺中细胞因子的相对表达（血清一天：七氟醚与丙泊酚，VEGF-A，p = 0.001； IL-6，p <0.001 ； IL-12，p = 0.007。一天组织：七氟醚与丙泊酚，SDF-1α，p <0.001； TARC，p = 0.023。双向ANOVA + Dunnett事后检验。b在三小时（p = 0.02，双向ANOVA + Dunnett事后检验）和术后一天（p = 0.002，两个）中，七氟醚组的血清IL-6水平均明显高于丙泊酚组ELISA和ELISA方法对血清和肺溶解物中的IL-6和VEGF进行ELISA分析。七氟醚手术后一天的肺中血清VEGF水平明显高于丙泊酚（n = 3，p = 0.03，双向ANOVA + Dunnett事后检验）。c在三小时（p = 0.02，双向ANOVA + Dunnett事后检验）和一日（七小时）中，七氟醚治疗的小鼠的肺中p-STAT3（Tyr 705）水平明显高于丙泊酚。p = 0.01，通过Western blot进行手术后的双向ANOVA + Dunnett事后检验）。没有观察到Ser727的显着变化（n = 3，双向ANOVA + Dunnett事后检验）。通常认为Tyr 705的磷酸化是STAT3的主要激活形式。表示为均值±SD源数据的数据作为源数据文件提供。
我们选择验证IL-6和VEGF在癌转移中的关键作用以及与转移性乳腺癌的相关性20的变化。对接受七氟醚或异丙酚的小鼠的血清和肺溶解液进行IL-6和VEGF的ELISA分析。与从细胞因子芯片获得的结果一致，七氟醚组的血清IL-6水平在手术后3小时显着增加，而丙泊酚组则没有（图 2b，p = 0.02，双向ANOVA + Dunnett事后检验） 。手术后一天，七氟醚组的IL-6水平是丙泊酚组的2倍（p = 0.002，双向ANOVA + Dunnett的事后检验）。同时，两组术后肺中IL-6水平均无明显变化（图 2b）。同样，与异丙酚相比，用七氟醚治疗的小鼠的血清VEGF水平也升高，具有术后1天获得的统计学意义（p = 0.03，双向ANOVA + Dunnett事后检验）。在小鼠肺中未观察到VEGF的显着变化（图 2b）。根据ELISA结果，七氟醚比VEGF诱导更明显的IL-6变化。这导致我们进一步分析了IL-6信号通路。
IL-6主要通过JAK 21调节STAT3介导的致癌过程。IL-6升高会激活其下游效应子，因此我们预计七氟醚组的p-STAT3水平高于丙泊酚组。通过Western印迹检查肺组织中STAT3的磷酸化形式p-Tyr705和p-Ser727的表达模式。确实，七氟醚组在术后三个小时的血浆中p-STAT3（p-Tyr705）的水平明显高于丙泊酚组（图 2c，p = 0.02，双向ANOVA + Dunnett的事后检验），并且差异在一天以后手术（p = 0.01，双向ANOVA + Dunnett事后检验）。对于p-Ser727，两组和时间点均未观察到显着变化。IL-6主要通过Tyr705 22的磷酸化激活STAT3 。STAT3的由Ser727的磷酸化调控是有争议的，因为既增强和抑制STAT3活动报告23，24，25。因此，增加的p-Tyr705而不是p-Ser727与我们的假说非常吻合，在外科手术条件下，七氟醚激活小鼠中的IL-6 / JAK / STAT3途径。
为了确认IL-6 / JAK / STAT3通路在介导七氟醚增强的肺转移中的作用，我们在4T1模型中测试了用JAK抑制剂AZD1480中断IL-6 / JAK / STAT3信号级联的作用。手术前，在对照组中以赋形剂或在治疗组中以AZD1480对小鼠进行一次口管给药。按照上述方案进行麻醉和手术。手术后，每天用媒介物或AZD1480治疗小鼠，持续两周（图 3a）。通过该实验，AZD1480显着减少了接受七氟醚的小鼠的肺转移，这通过离体生物发光成像证明（七氟醚与丙泊酚，p = 0.002；七氟醚与七氟醚+ AZD1480，p = 0.003; 单向方差分析+ Tukey事后检验）和结节计数（七氟醚与丙泊酚，p = 0.008；七氟醚与七氟醚+ AZD1480，p = 0.03；双向ANOVA + Dunnett的事后检验）（图 3b-e）。用AZD1480或媒介物治疗的丙泊酚组中未观察到显着差异。为了进一步确认AZD1480干扰IL-6 / JAK / STAT3途径，通过蛋白质印迹分析了下游STAT3的磷酸化水平。在七氟醚手术后两周，AZD1480显着降低了小鼠肺中STAT3（p-Tyr705）的磷酸化水平（图 3f，p = 0.015，双向ANOVA + Dunnett事后检验）。AZD1480也降低了异丙酚组的p-STAT3，但无意义。
a在4T1小鼠模型中，在手术前一天口服载有肿瘤的小鼠媒介物或AZD1480，每天继续给药一次，直到实验结束。b使用离体肺的生物发光图像和c定量的肺光子强度来测量转移负荷。同样，七氟醚比丙泊酚显着促进肺转移（p = 0.002，单向方差分析+ Tukey事后检验）。AZD1480的治疗显着减少了七氟醚促进的肺转移（ 媒介物治疗组n = 6 ，AZD1480治疗组n = 5，p = 0.003，单向方差分析+ Tukey事后检验）。每个框中的线代表中位数。每个框的上下边缘分别代表第一和第三分位数。晶须代表最低和最高价值。d根据（e）肺组织学对转移性结节进行定量证实，与丙泊酚组或AZD1480组相比，七氟醚组的生物转移分析具有明显更多的宏观转移结节（ 接受媒介物治疗的组为n = 6，接受媒介物治疗的组为n = 5 AZD1480;七氟醚vs异丙酚，p = 0.008;七氟醚vs七氟醚+ AZD1480，p = 0.03; 双向方差分析+ Dunnett的事后测试；）。比例尺：20×= 2 mm，40×= 600μm，100×= 300μm。f通过蛋白质印迹分析，AZD1480处理显着降低了七氟醚组肺中磷酸化的STAT3（p-Tyr705）水平（n 媒介物治疗组为n = 6 ，AZD1480治疗组为n = 5，p = 0.015，双向ANOVA + Dunnett的事后测试）。数据显示为平均值±SD。源数据作为源数据文件提供。
肺部的肿瘤微环境由基质细胞的复杂网络组成。在乳腺癌的小鼠模型中，细胞CD11b +骨髓细胞已报告的主要贡献者，建立肺转移前小生26，27。为了证实七氟醚影响肺中CD11b +细胞的观点，我们在4T1和MDA-MB-231模型中进行了小鼠肺的免疫荧光分析。确实，在同种4T1模型中，术后一天，我们观察到在七氟醚下的小鼠肺组织中CD11b +细胞（绿色）增加（与丙泊酚相比）（图 4a，p = 0.007，双向ANOVA + Dunnett的事后检验）。在异种移植MDA-MB-231小鼠模型中也证实了七氟醚诱导的CD11b +细胞浸润（补充图 4）。由于AZD1480逆转了七氟醚促进的转移，因此我们假设AZD1480阻断IL-6 / JAK / STAT3途径也会导致CD11b +细胞浸润的逆转。实际上，AZD1480显着减少了术后一天接受七氟醚的小鼠肺中CD11b +细胞的浸润（图 4a，p = 0.032，双向ANOVA + Dunnett事后检验）。我们还检查了CD31 +细胞（红色）的脉管系统潜在变化，但发现七氟醚和异丙酚在有或没有AZD1480的情况下都没有差异。
一个相比，通过免疫荧光成像异丙酚，七氟醚增加的CD11b +细胞在肺中1天手术后。AZD1480的治疗显着减少了七氟醚在肺中诱导的浸润CD11b +细胞（绿色）（ 每组n = 4只小鼠;七氟醚与丙泊酚比较，p = 0.007;七氟醚媒介物与AZD1480比较，p = 0.032;双向ANOVA + Dunnett的文章hoc测试，比例尺= 20μm）。CD31阳性细胞（红色）未观察到明显变化。一天手术后，将小鼠的肺切片并用抗CD11b，抗CD31和DAPI染色。b手术后一天，AZD1480治疗可显着降低血清和肺组织的IL-6水平（n = 4，p ELISA法分别为0.001和0.02（双向ANOVA + Dunnett事后检验）。c STAT3磷酸化的蛋白质印迹分析表明，AZD1480处理显着降低了p-Tyr705（七氟醚与丙泊酚p = 0.03，七氟醚与AZD1480 p = 0.001，双向ANOVA + Dunnett事后检验）和p-Ser727（七氟醚与AZD1480 p） = 0.001，n = 4，采用七氟醚手术后一天进行双向ANOVA + Dunnett事后检验）。表示为均值±SD源数据的数据作为源数据文件提供。
七氟醚诱导的转移前肺中CD11b +细胞的富集取决于IL-6 / JAK-STAT3信号转导轴，因为AZD1480还显着抑制七氟醚诱导的IL-6的增加（图 4b；血清，七氟醚媒介物vs AZD1480，p = 0.001;肺组织，七氟醚媒介物vs AZD1480，p = 0.02;双向ANOVA + Dunnett事后检验）和术后一天STAT3的激活（图 4c，p-Tyr705，七氟醚vs异丙酚）p = 0.03，七氟醚vs AZD1480 p = 0.001； p-Ser727，七氟醚vs AZD1480 p = 0.00；双向ANOVA + Dunnett事后检验。
尽管该领域正在进行数项大型前瞻性临床试验，但仍缺乏令人信服的关于与癌症患者预后相关的全身麻醉剂选择的临床证据。涉及常见癌症类型的大型临床试验尚未完成多年，并且由于患者和疾病的异质性可能仍未定论。我们的研究在两种临床前动物模型中证明了两种现代全身麻醉剂在乳腺癌转移中的独特作用。我们承认，动物研究不一定总是可以直接翻译给人类。尽管如此，它还是迈向乳腺癌患者基于证据选择麻醉药的一步。
由于缺乏合适的临床前模型和广泛的麻醉作用，麻醉剂在转移过程中的作用机理还知之甚少，并且难以研究。我们将手术纳入两个小鼠模型中，以了解麻醉剂在此过程中的作用。总体而言，我们的数据表明，挥发性的麻醉药七氟醚在围手术期通过在转移前的肺中诱导IL-6的表达并富集CD11b +髓样细胞来促进肺转移。JAK抑制剂AZD1480减轻七氟醚促进的肺转移的可能性表明，一种潜在的治疗方法值得进一步研究。
麻醉药可通过改变癌细胞，肿瘤微环境或同时改变两者来影响转移性肿瘤的进程和生长。两种麻醉剂均能抑制癌细胞的迁移，而不会干扰体外的细胞活力。此外，多次接触麻醉剂不会影响原发性肿瘤的生长，也不会对肺转移产生累加作用。因此，这表明在外科手术中，麻醉很可能会改变调节转移的肿瘤微环境。通过蛋白质阵列筛选和ELISA验证，我们发现七氟醚通过增加促炎细胞因子的表达增强了肺转移。促炎性细胞因子在癌症转移过程的基本调节器28，29。中细胞因子阵列鉴定各种目标，IL-6是一种强效炎性细胞因子支持血管发生，炎症的调节，和癌细胞逃避从在肿瘤微环境免疫监视30，31。IL-6血清水平高与乳腺癌患者的预后不良有关20。此外，已显示全身麻醉剂会影响几种关键的炎症细胞因子，包括IL-6 32。JAK介导的STAT3的酪氨酸磷酸化损害在肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫并促进恶性细胞增殖和存活33，34，35。我们的数据表明，七氟醚的IL-6水平升高会导致IL-6 / JAK / STAT3途径的激活，这可以通过STAT3磷酸化的增加来证明。随后，AZD1480对IL-6 / JAK / STAT3的抑制成功地减弱了七氟醚促进的肺转移。
癌细胞的生长和转移很大程度上取决于远处的有利微环境。肿瘤相关巨噬细胞（TAM），髓源抑制细胞（MDSC），和微血管增殖显著到预转移性利基和转移性肿瘤的后续生长的形成贡献36，37。CD11b在许多白细胞中表达，包括单核细胞和巨噬细胞。CD11b +细胞是肿瘤微环境中转移肺中增加的主要成分。我们显示七氟醚麻醉手术后不久在肺部表现出癌细胞浸润之前CD11b +髓样细胞的积累。我们进一步表明，由AZD1480减少的STAT3磷酸化逆转了术后转移期肺中富集的CD11b +髓样细胞。因此，如两种小鼠模型所示，七氟醚诱导的CD11b +细胞向肺中的积累表明七氟醚对丙泊酚具有明显的作用，可引发转移性肿瘤的肺微环境。
总而言之，在本报告中，我们显示了在两种自发转移模型的小鼠术后，挥发性麻醉药七氟醚比静脉麻醉药异丙酚导致更多的肺转移。我们进一步显示了麻醉药对促炎细胞因子（包括IL-6）的产生和归巢前转移性肺微环境的独特影响。IL-6 / JAK / STAT3抑制剂AZD1480对七氟醚促进的肺转移的缓解表明，潜在的治疗靶点值得进一步研究。我们的结果可用于癌症患者麻醉的循证医学。
实验步骤中使用的所有动物均经石溪大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（917821），购自杰克逊实验室（马萨诸塞州波士顿），并根据联邦指南进行维护。在无病原体的条件下（21–25°C，12/12光照/黑暗周期），将所有动物圈养在无菌塑料笼中。随意提供食物和水。尽一切努力使用过量的CO 2并随后进行颈椎脱位来减轻安乐死期间动物的痛苦。
将雌性balb / c小鼠在乳腺脂肪垫中原位植入4T1细胞（每只小鼠2×10 5个细胞）。工程改造了4T1细胞以稳定表达萤火虫荧光素酶（由药理学系Cia-Hsin Chan博士提供，商品慢病毒载体pTRIPZ编码萤火虫荧光素酶）。在10分钟内用2％异氟烷进行植入。通过生物发光IVIS（IVIS Lumina III，PerkinElmer，Waltham，MA）进行无创监测4T1肿瘤的发生，每周用卡尺测量肿瘤体积并使用公式V =（宽度2 ×长度）× 2 - 1。当原发肿瘤的体积达到约500 mm 3时，将具有大小匹配肿瘤的小鼠随机分为三组。两组在三小时麻醉下用七氟醚或丙泊酚进行手术切除原发肿瘤。第三组未接受手术或麻醉作为参考。在手术过程中，通过SomnoSuite系统维持七氟醚的输送，并用带有脉搏血氧仪的PhysioSuite监测所有组的血氧饱和度和心率，并将其放在加热垫上以通过SomnoSuite进行温度控制。最初通过腹腔注射200 mg / kg给予异丙酚以达到手术条件而无明显的呼吸抑制。额外注射丙泊酚（每公斤50 mg），以维持手术麻醉水平三个小时。手术两周后，
对于多次暴露实验，在接受异丙酚或七氟醚麻醉的麻醉下，将4T1细胞原位植入balb / c小鼠的乳腺脂肪垫中约30分钟，然后根据所用麻醉剂对小鼠分组。之后，每两天每组小鼠用相应的麻醉剂治疗一小时。当原发肿瘤达到500mm 3时，如上所述进行手术。手术后，每两天继续接触麻醉药直至实验结束。通过上述方法测量肺转移负担。
在NOD-SCID模型中，原位肿瘤是通过原位植入MDA-MB-231细胞（5×10 5个细胞）而产生的，这些细胞被设计用于萤火虫荧光素酶的稳定表达（由药理学系Cia-Hsin Chan博士提供）科学，将编码萤火虫荧光素酶的商业慢病毒载体pTRIPZ导入NOD-SCID小鼠的乳腺。在10分钟内用2％异氟烷进行手术植入。当原发肿瘤的体积达到500 mm 3左右时如上所述，将小鼠随机分配在七氟醚或异丙酚下接受原发性肿瘤切除三个小时。手术后，通过无创生物发光成像对肺转移进行跟踪和量化。两周后，对小鼠实施安乐死，并收集肺以进行离体生物发光成像，宏观和组织学分析。
对于AZD1480的实验，如上所述，植入4T1肿瘤的方法相同。将小鼠随机分为对照组和治疗组，分别口服赋形剂或AZD1480（50 mg / kg）。如上所述，在切除原发肿瘤期间，将小鼠随机分配为接受七氟醚或异丙酚三小时。手术后，每天一次经口管饲法治疗小鼠，持续两周。在治疗结束时，对小鼠实施安乐死以收集肺以进行离体生物发光成像，宏观和组织学分析。
在磷酸盐缓冲液中冲洗小鼠肺部以去除血液，然后在4％C中于4％多聚甲醛中固定过夜。将组织包埋在石蜡中，并按以下方式在肺部进行切片取样。取两个连续的5μm切片，然后丢弃多个连续的5μm切片（根据肿瘤结节的大小，通常为20–40），然后再收集两个连续的5μm切片。整个肺部重复此过程。然后使用H＆E对连续切片进行染色。在相衬显微镜下，在每个H＆E石蜡切片上对转移结节进行计数，并将显微计数的总和作为肺转移结节的最终数目。
按照上述相同的手术步骤和麻醉方案，探讨了麻醉剂对肿瘤微环境中分子网络的短期影响。乳房切除术后三小时零一天，收集小鼠血清和肺组织裂解物，并根据制造商的说明通过RayBiotech小鼠细胞因子阵列c-1000探测分泌的细胞因子谱。
收集小鼠血液用于血清，并用含有蛋白酶抑制剂（cOmplete TM）的裂解缓冲液（T-PER组织蛋白提取试剂，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，78510）消化肺。蛋白酶抑制剂混合物和PhosSTOP磷酸酶抑制剂，Roche，Pleasanton，CA，04693159001和4906845001。通过BCA测定法（Pierce BCA蛋白质测定法，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，23225）测定组织裂解物的蛋白质浓度。根据制造商的说明（小鼠IL-6 DuoSet，小鼠VEGF DuoSet，R＆D Systems，Minneapoli，MN，DY406-05，DY493-05）对血清和组织裂解物进行IL-6和VEGF ELISA分析。分别根据血清体积和肺组织溶解产物的蛋白浓度计算血清和肺中IL-6的浓度。
对如上所述从小鼠获得的肺溶解产物进行蛋白质印迹分析。通过SDS-PAGE在10％的凝胶上溶解肺部溶解产物（30μg），并转移到甲醇活化的PVDF膜上。为了检测p-STAT3，STAT3和GAPDH，使用兔单克隆抗Phospho-Stat3（Tyr705，1：1000，Cell Signaling，9145），兔单克隆抗Phospho-Stat3（Ser727，1：1000，Cell Signaling，9134） ），分别使用兔单克隆抗Stat3（1：1000，Cell Signaling，30835）和兔单克隆抗GAPDH（1：1000，Santa Cruz，sc-32233），然后使用山羊抗兔IgG-HRP抗体（1：5000，圣克鲁斯，sc-2004）。通过增强的化学发光可视化抗体结合。
收集原发肺组织，用4％多聚甲醛固定，处理和石蜡化。从每个肺的三个切片对浸润的巨噬细胞（CD11b，Abcam，Cambridge，MA，ab133357、1：200）和内皮细胞（CD31，BD Pharmingen，圣地亚哥，CA，55074、1：100）染色。简而言之，将切片去石蜡，煮沸回收，用含有正常山羊血清的封闭缓冲液封闭，并与一抗在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤后，将切片与荧光标记的二抗（Invitrogen，Carlbad，CA）孵育，并使用与AxioCam HRm相机耦合的蔡司Axioplan 2荧光显微镜进行可视化。从每个切片中以×40放大倍率获取五个随机选择的区域，并用AxioVision Rel（版本4.6）进行处理。显示的所有图像代表四个独立实验。通过对内部具有核染色的CD11b阳性产物进行计数，对CD11b阳性细胞进行定量分析，通过对CD31阳性产物进行计数，对内皮细胞进行定量分析。
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