摘要
许多旨在阐明癌症生物学的细胞模型并未概括包括肿瘤异质性在内的病理生物学，肿瘤异质性是构成治疗耐药性的癌症固有特征。在这里，我们介绍了使用基因工程人类多能干细胞（hiPSC）捕获真实癌症病理生物学特性的癌症建模范例。癌症基因组地图集针对胶质母细胞瘤（GBM）揭示的基因组编辑过的hiPSC衍生的神经祖细胞的原位移植物导致了高级别神经胶质瘤的形成。与患者来源的GBM相似，这些模型具有类似于不同GBM分子亚型，肿瘤内异质性和染色体外DNA扩增的肿瘤间异质性。这些原发肿瘤神经球的重新植入产生具有患者样品特征的继发性肿瘤，并呈现出突变依赖性的肿瘤进化模式。这些癌症的化身模型提供了一个全面纵向评估人类肿瘤发展的平台，该平台受分子亚型突变和谱系限制的分化支配。
有效的癌症建模一直是肿瘤学领域中研究病理生物学和确定治疗靶点的概念基石。就成胶质细胞瘤（GBM）（中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤）1而言，GBM样肿瘤的小鼠模型是通过核心抑制剂的不同组合的基因破坏和/或通过引入癌基因（例如Src，K-ras，H-ras，PDGFB和EGFRvIII 2可用于研究这些侵袭性肿瘤的生物学特性或在临床前环境中测试可能的治疗方法3。这些小鼠模型适合于研究遗传学确定的神经胶质瘤的病理学，可用于药物测试，但通常缺乏在人类神经胶质瘤中观察到的肿瘤内异质性4。此外，虽然与人类的组合工程化的人星形胶质细胞TERT和H-的Ras由SV40 T / T-Ag或由HPV E6和E7的表达和TP53途径的抑制或者产生具有高档组织学胶质瘤5，6，如何这些模型概括了神经胶质瘤病理生物学的全貌，尤其是在GBM异质性方面，尚未得到很好的定义。相比之下，源自患者的异种移植物（PDX）已用于研究肿瘤间和肿瘤内异质性7，8和对途径特异性疗法的敏感性 9，但是，它们不允许进行实验标准化或分析分子亚型突变对肿瘤演化的影响。
使用诸如ZFN，TALEN和CRISPR / Cas9等位点特异性核酸酶的人类干细胞技术和基因组编辑技术的进步，拓宽了人类疾病建模领域10。这样的工程也已经有效地应用于神经干细胞，为功能遗传分析提供了机会11。人类干细胞和基因组编辑的这种组合在应用于癌症模型时有望带来巨大的潜力。第一个这样的模型中生成从与四个或五个突变公共工程改造的人肠隐窝干细胞在大肠癌来源的利用结肠类器官12，13。这些类器官模型可准确预测药物反应，并有望将其用于个性化疗法14。后来，TALEN介导的同源重组缺失了 PTEN的脑肿瘤模型导致人类神经干细胞向癌症干细胞样表型 15重新编程。然而，通过基因组编辑产生的这些癌症模型是否具有癌症的真实病理特征，包括肿瘤异质性和克隆进化，仍是未知的。
在这里，我们在等基因背景下建立了一个强大的平台，该平台使用CRISPR / Cas9基因组编辑技术和一系列体内植入，能够纵向评估人类高级神经胶质瘤（HGG）模型，其中包含在前脑和间充质GBM分子中观察到的遗传改变的组合亚型。我们进一步介绍了这些模型在多大程度上概括了该病的病理生物学，并讨论了它们作为未来肿瘤生物学和进化研究的化身平台的实用性。
我们首先介绍驱动突变的两种不同的组合到人体诱导多能干细胞（iPS细胞）由CRISPR / Cas9基因组编辑16，17（图 1A，B）。靶向肿瘤抑制基因的缺失中的一个组合PTEN和NF1，它们通常在GBM的间充质亚型改变在一起18，19。缺失的第二组合目标TP53和外显子8和9 PDGFRA（PDGFRA Δ8-9）。这会在40％的PDGFRA扩增的GBM 20中产生一个组成性活性的截断性PDGFRA突变，导致异柠檬酸脱氢酶的野生型GBM的原神经亚型常见基因型18，19。通过基因分型PCR（图1c）和RT-qPCR（图 1d）证实了单个克隆的遗传修饰 。使用小分子方案21将具有所需突变的已编辑iPSC克隆分化为神经祖细胞（NPC），并通过下调多能性标志物Nanog和Oct4以及相应上调NPC标志物Pax6，Nestin和Sox1来确认分化状态。 （图 1e）。这些编辑的NPC在NPC维护介质21上的基质胶涂层板上扩增，并用于进一步的实验。
一个 iHGG一代的架构。b用于指示sgRNA位置的基因编辑设计。c基因分型PCR和d半定量RT-qPCR评估指定的编辑。数据代表三个重复样本，n =3。数据表示为平均值±SD。Ë为iPS细胞和NPC标记的RT-qPCR的结果。数据代表三个重复样本，n =3。数据表示为平均值±SD。f Kaplan–Meier曲线显示了植入（左）PTEN - /- NPC，PTEN - /- ; NF1 -- /- NPC（右）的小鼠的存活率TP53 - /- NPC和TP53 - /- ; PDGFRA Δ8-9的NPC。通过对数秩检验评估统计显着性。 每个模型的每只手臂n = 4只动物。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们评估了这些经过基因修饰的NPC是否能够在免疫受损的小鼠中形成原位肿瘤（图 1a）。当编辑的NPC移植到四只Nod scid小鼠的大脑中时，PTEN -/- ; NF1 -/- NPC和TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9NPC各自形成脑瘤，中位生存期分别为141天和119.5天。 （图 1f）。对PTEN -/-的病理评估; NF1 -/-肿瘤显示细胞高细胞性区域，偶有有丝分裂（图 2a）），并且在四分之一的肿瘤中，存在双相性密集的神经胶质和松散的间充质/肉瘤形态，是典型的胶质肉瘤（图 2b）。此外，坏死区域（图 2c），血管内皮细胞的增殖（图 2d），蛛网膜下腔扩散（图 2e），神经周围神经卫星炎和肿瘤细胞的椎间盘积聚（图 2f）也很明显。肿瘤始终对GFAP（6/6高倍视野中的3+）（图2g，补充图 2a）和Olig2（4/6高倍视野中的3+，2/6 2/6高视野中的2+ ）呈阳性反应 ）（图 2h，补充图 2b），并具有Ki-67染色指示的高度增殖性（35.44±1.435％；平均值±SEM）（图 2i，补充图 2c）。TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9肿瘤呈结节状生长，原始神经元成分（深紫色）与神经胶质成分混合（图2j），结节呈 神经纤维样纹理（图 2k），为假性苍白性坏死坏死区。 （图 2l）和脑室内生长（图 2m）。这些肿瘤对GFAP（6/6中的3+）（图 2n，补充图 2a）和Olig2（6/6中的3+）（图 2o，补充图。 2b），并且Ki-67染色也高度阳性（27.79±5.731％；平均值±SEM）（图 2p，补充图 2c）。就WHO等级而言，PTEN -/-分别将4个肿瘤中的3个和1个评分为3级；将NF1 -/-肿瘤按4个肿瘤中的4个评分，将TP53- /评分为4级。− ; PDGFRAΔ8-9肿瘤（补充图 3）。相反，PTEN -/-和TP53 -/-单独编辑的NPC在同一时间段内未在大脑中形成肿瘤（图 1f，补充图 4a，b），而未经编辑的iPSC会形成畸胎瘤样肿瘤（补充图 5）。鼻咽癌注射后畸胎瘤的缺乏表明向鼻咽癌的分化效率很高。这些结果说明，使用这种建模范例，在GBM中发现的少量已知驱动程序突变足以对人类HGG肿瘤进行表型重现。
PTEN -/- ; NF1 -/- iHGGs的H＆E染色显示高细胞区域被不规则的，细长的，成角度的肿瘤细胞浸润，偶有有丝分裂（a），比例尺，50μm（左）和10μm（右），双相的致密（胶质）和松散（间质/肉瘤）形态，典型的青光眼肉瘤（b），坏死（中央粉红色区），坏死中心（c）周围细胞呈“假性盘石状” ，比例尺，200μm（b，c），血管内皮细胞的增生（d），比例尺，100μm，穿过脑膜表面破裂，因此蛛网膜下腔扩散（右上）（e），比例尺（200μm）和典型的神经胶质瘤的“二级结构”，包括神经周围神经卫星病变和肿瘤细胞的椎间盘积聚（f），比例尺（50μm）。GFAP（g），Olig2（h），PTEN -/-的 Ki-67（i）染色； NF1 - I - GGGGs，比例尺，100μm（g – i）。TP53 -/-的 H＆E染色； PDGFRA Δ8–9 iHGGs显示原始神经元成分（深紫色）与胶质成分（粉红色）混合结节状生长（粉红色）（j），比例尺，200μm，玫瑰花结，具有类似神经纤维的质地原始神经元组分（ķ），比例尺（50μm），假性假性坏死的锯齿状区域（l），比例尺（200μm）和穿过室管膜的肿瘤破裂，表明脑室内生长（m），比例尺（500μm）。TP53 -/-的 GFAP（n），Olig2（o），Ki-67（p）染色； PDGFRA Δ8–9 iHGG，比例尺，100μm（n – p）。
在癌症研究中使用PDX模型的好处之一是，它们可以在体外培养，然后重新植入动物体内，从而可以进行体内和体外分析22。我们评估了我们诱导的HGG（iHGG）模型是否可以类似的方式使用。使用人MHC抗体对从小鼠脑中分离出的肿瘤进行分类，以分离出人类细胞，然后在与用于GBM PDX球23相同的神经球条件下繁殖分离的细胞，这证实了iHGG球的形成能力（图 3a）。这些iHGG球具有与相应的输入NPC相同的基因型（补充图 6）。极限稀释法24结果表明，与移植前的NPC相比，iHGG球具有更大的自我更新能力，这是癌症干细胞的特征（图 3b），再次突出了与原始输入细胞相比，iHGG细胞的癌表型获得了。
一个 iHGG球体通过保持iHGG肿瘤细胞中的神经球的培养条件，比例尺，2毫米获得。b输入NPC和肿瘤来源的iHGG球形细胞的极限稀释分析。c从原代iHGG球，比例尺，5 mm，250μm，5 mm，250μm（从左到右）重新植入产生的继发性肿瘤的H＆E染色。d在用媒介物或替莫唑胺治疗后，原位移植了原代iHGG球细胞的小鼠的体内存活试验。数据代表六个重复， 每个模型的每个治疗组n = 6只动物。通过对数秩检验分析数据。Ë通过半定量RT-qPCR分析iHGG细胞中的MGMT表达水平。数据代表三个重复样本，n =3。数据表示为平均值±SD，通过不成对的t检验进行分析。源数据作为源数据文件提供。
然后，我们评估了这些iHGG衍生的球状细胞是否通过二次原位移植维持了致瘤能力（图 3c）。当将其注射到Nod scid小鼠的大脑中时，PTEN -/- ; NF1 -/-和TP53 -/- ; PDGFRA Δ8–9 iHGG衍生的球形细胞形成肿瘤，其中位潜伏期分别缩短了76.5天和34.5天。 （p = 0.0005，对数秩检验）（补充图 7）。我们还测试了如果这些模型可用于体内药物治疗实验与那些由替莫唑胺（TMZ）处理原位植入的动物施加到PDX线，用于标准护理治疗GBM患者的DNA烷基化化学治疗剂25。与PTEN -/- ; NF1 -/- iHGGs 相比，TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9iHGGs对TMZ更敏感（图 3d）。发现PTEN -/- ; NF1 -/- iHGGs表达更高水平的O 6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）（图 3e），与TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9iHGGs相比，它与GBM患者对TMZ的耐药性有关26。这个差动灵敏度的另一种解释，通过在的上下文中MGMT无关的机制TP53改变27，28不能被消除。
我们进一步调查了这些iHGGs是否显示出肿瘤间和肿瘤内异质性，这是GBM和癌症的另一个普遍特征29。迄今为止，尚未在以前的模型中很好地研究癌症的这一重要特征。为了研究我们的iHGG模型的稳健性，我们使用原代iHGG球，原位注射原代球体获得的次生iHGG肿瘤细胞以及通过体外衍生的次生球体进行了三次重复的单细胞RNA测序（scRNA-seq）两种基因型的继发性肿瘤细胞的共培养，总共有14个样品（图 4a）。
一个 iGBMs的scRNA-seq的分析架构。b所有测序样品的均一流形近似和投影（UMAP）分析。c所有测序样品的主成分分析（颜色代码与b中的相同）。d GBM分子亚型分析的热图，该热图基于每个样品中单个细胞的平均基因表达，从而获得基于参考文献的手动整理的基因清单。18。
通过均匀歧管逼近和投影（UMAP）对所有样品进行视觉分析，发现相同基因型的初级和次级球体之间以及球体与肿瘤之间存在清晰的结构分层（图 4b）。但是，最大的差异出现在两个不同基因型的iHGG模型之间。iHGG模型之间的这种肿瘤间异质性在具有不同基因编辑的植入前NPC中并不明显（补充图 8）。实际上，转录组差异的最强驱动力是基因型，如它们之间的明显分裂所示，无论其最强主要成分（PC）pc1的来源（球体或肿瘤，是原发性还是继发性）如何（图 4c））。这些发现继续支持这样的观点，即少数驱动子突变足以形成这种在转化过程中产生的病原性肿瘤间异质性。
鉴于我们的模型设计的概括不同的临床GBM分子亚型，特别是前神经和间质，我们试图确定，如果我们的样本表现转录GBM签名，以前建立的8，18。TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9iHGG显示上皮亚型特征基因的上调，而PTEN -/- ; NF1 -/- iHGG对球体和肿瘤均显示间质亚型特征（图 4d和补充图） 。 9）。涉及每个亚型下所有表达基因的亚型评分显示出相似的趋势，TP53的 proneural评分更高-/- ; PDGFRA Δ8–9 iHGG和 PTEN -/- ; NF1 -/- iHGG的更高的间充质分数（补充图 10）。有趣的是， TP53 -/- ; PDGFRA Δ8–9 iHGG样本也显示出增加的经典亚型评分。重要的是，当以单细胞分辨率检查时，每个样本均显示肿瘤内异质性，表现出不同亚型特征的不同细胞群（补充图 10），这是GBM患者样本的特征 29。此外，所有样本均由循环和非循环细胞组成（补充图 11a，b），这也是患者样品的特征，并且与其他体外GBM模型并置，其中几乎100％的细胞正在循环29。最后，在与患者样品以前文献一致，具有较高的原神经分数细胞也高度得分干性如对于我们的情况下TP53 - / - ; PDGFRA Δ8-9 iHGG样品（补充图 11C-E ）29。总而言之，我们的结果突出了我们的iHGG模型在球体和肿瘤方面的鲁棒性，概括了患者GBM样本的特征，如细胞间和肿瘤内异质性，亚型特征以及循环和干性得分。
从UMAP图中还可以明显看出，初级球的转录组特征在它们通过小鼠，被切除并在体外培养时不断发展。实际上，通过分别分析每种基因型模型从初级到次级的转变，我们可以洞悉肿瘤的生物学以及体内传代的作用。我们进行的无监督聚类鲁汶PTEN - / - ; NF1 - / - iHGG初级和次级球（图 5A），并且在并行，TP53 - / - ; PDGFRA Δ8-9。iHGG初级和次级球（图 5b中），分别找到8和15个不同的群集。在这两种情况下，初级球体几乎都由在任何次级球体中都找不到的独特簇表示。值得注意的是，在其余簇中，所有三个PTEN -/- ; NF1 -/- iHGG次级球的比例都非常相似。与之形成鲜明对比的是，每个TP53 -/- ; PDGFRA Δ8–9 iHGG次级球均显示出独特的簇组成。
PTEN -/- ; NF1 --/-（a）和TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9（b）的初级和次级球体。UMAP图按样本（左上）或Louvain聚类（右上）进行颜色编码。在每个Louvain群集中找到的样品分布，按样品标识进行颜色编码（左下），每个样品的Louvain群集分布，按群集标识进行颜色编码（右下）。从PTEN -/- ; NF1 -/-（c）和TP53 -/- ; PDGFRA Δ8–9（d）。色标代表统计意义。灰色表示缺乏意义。
此外，当对每个簇的差异表达基因进行基因本体分析（GO）时，每个iHGG模型的模式就会不同。PTEN -/- ; NF1 - iHGG球体分为两大类，即细胞周期或细胞运动性以及细胞外和细胞内纤维重组，其中几个簇共享各种GO术语（图 5c）。实际上，这两个类别在小鼠中形成肿瘤后似乎都加重了，如与每个次级球簇相关的GO项数量的增加所表明的。细胞运动性术语的这种增加支持了我们关于PTEN -/- ; NF1 -/-的更显着扩散浸润的观察iHGG相比TP53 / - - ; PDGFRA Δ8-9 iHGG（补充图 12）。相反，除了与细胞周期相关的GO术语外，TP53 -/- ; PDGFRA Δ8–9 iHGG球体还由多种GO术语表示，其中许多对于每个次级球体都是唯一的，包括神经胶质细胞分化，对缺氧的反应，胚胎形态发生，并且类似于PTEN -/- ; NF1 -- iHGG球，与细胞运动相关的术语（图 5d）。同样，PTEN -/- ; NF1 -/-的间充质标记iHGG球在大多数星团上都是同质的，而proneural分数在本质上是异质的（补充图 13和14）。总体而言，即使两个iHGG模型都显示了从初级球到次级球的转录漂移，TP53 -/-； PDGFRA Δ8–9 iHGG似乎显示出较少的单向路径，并增加了异质性。
我们以前报道，染色体外DNA（ecDNA）在许多癌症类型普遍，特别是在GBM，并且ecDNA与药物治疗和肿瘤的异质性迅速发展抗性相关联30，31。为了确定我们的iGBM模型是否概括了ecDNA的生成，我们首先调查了原始输入的NPC是否具有核型异常或ecDNA痕迹。基于中期扩散的DAPI染色和数字核型分析，PTEN -/- ; NF1 -/- iHGG细胞是核型正常的（图 6a）。与之形成鲜明对比的是，从TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9获得的细胞的中期扩散iHGGs在染色体附近显示小DAPI染色的点，提示ecDNA（图 6b），与我们先前在GBM肿瘤样本中的发现一致31。此外，在通过再次植入主球获得的继发性肿瘤中，双重微小的结构变得更加明显（图 6c），并且通过掺入EdU而具有复制能力（图 6d）。的TP53 - / - ; PDGFRA Δ8-9 iHGGs也呈现显着的数目和结构染色体的改变（图 6E）。这支持了TP53 -/-的克隆稳定性； PDGFRA Δ8–9模型，其中基因组不稳定性或ecDNA可驱动动态加速克隆演变31，32。
PTEN -/- ; NFl -/-原代iHGG细胞的 DAPI染色，比例尺，10μm。b TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9原代iHGG细胞的DAPI染色。红色箭头表示ecDNA，比例尺为10μm（左），2μm（右）。c TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9继发性iHGG细胞的DAPI染色。红色箭头表示ecDNA，比例尺为10μm（左），2μm（右）。d TP53 -/-中期扩散中的染色体和ecDNA的EdU标记；PDGFRAΔ8-9次要iGBM，比例尺，5μm。Ë的光谱核型分析TP53 - / - ; PDGFRA Δ8-9 iHGG细胞。
我们还应用了PTEN -/-的无监督Louvain聚类；NF1 - / - iHGG继发性肿瘤（图 7A），并且在并行，TP53 - / - ; PDGFRA Δ8-9 iHGG继发性肿瘤（图 7B），以进一步比较间和我们的iHGG肿瘤模型的肿瘤内变性和分别发现了7个和8个不同的簇。每个簇都由一组独特的差异表达基因代表，这些差异表达基因如果按样品分层，则不会显示清晰的模式，如在单细胞水平存在肿瘤内异质性时所期望的（补充图 15） 。此外，PTEN -/- ; NF1-/- iHGG继发性肿瘤看起来比 TP53 -/-更均匀； PDGFRA Δ8–9对应物，因为在所有簇中均代表一式三份。相反， TP53 -/- ; PDGFRA Δ8–9 iHGG继发性肿瘤显示的簇包含所有样品的细胞，但也有仅包含两个或几乎仅一个样品的几个簇，表明肿瘤间变异性增加。
PTEN -/- ; NF1 -/-（a）和TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9（b）继发性肿瘤。UMAP图按样本（左上）或Louvain聚类（右上）进行颜色编码。在每个Louvain群集中找到的样品分布，按样品标识进行颜色编码（左下），每个样品的Louvain群集分布，按群集标识进行颜色编码（右下）。GBM分子亚型分析，基于每个Louvain簇中单个细胞的PTEN -/- ; NF1 -/-（c）和TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9（d））肿瘤。对于PTEN -/- ; NF1 -/-（e）和TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9（f）肿瘤，计算每个细胞的干性得分并将结果覆盖在UMAP图上（左上）或概括为小提琴每个群集的图（右上）。根据细胞周期状态（G1，G2M或S）对细胞进行分类，覆盖在UMAP图上（左下），并为每个Louvain簇计算其分布（右下）。
重要的是，当检查每个簇的GBM分子亚型时，PTEN -/- ; NF1 -/-样品在大多数情况下显示均质的间充质标记，但两个簇（'E'和'G'）除外（图 7c）。与之形成鲜明对比的是，源自TP53 -/- ; PDGFRA Δ8–9肿瘤的每个簇的亚型特征表现出独特的组合，其中三个簇占大部分前体神经信号，其余簇的贡献较小，但簇'O除外具有明显的间质特征（图 7d）。值得注意的是，对于两个模型，还观察到肿瘤内异质性，因为每个簇都呈现出不同分子亚型的特征，这是GBM患者样品的标志29。最后，与PTEN -/- ; NF1 -/-簇相比，一些TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9肿瘤簇在干性方面得分更高。而两个模型都显示了循环和非循环细胞的异质组成（图 7e，f）。总之，我们的等基因模型可以忠实地概述HGG病理生物学，包括肿瘤内和肿瘤内异质性，药物敏感性差异，ecDNA扩增和克隆快速进化。该肿瘤化身平台的变体可以应用于不同类型的癌症，除其他事项外，还可以用于研究克隆进化，体外和体内纵向评估以及在等基因背景下破译的基于基因型的治疗脆弱性。
通过引入该疾病特征性遗传变异的不同组合，我们从hiPSC生成了同基因iHGG模型。这些模型都概括了HGG的病理特征，但同时在组织形态，基因表达和倍性方面显示出明显的依赖突变的变化。我们的一些发现与以前的鼠标模型一致。例如，NF1缺失的肿瘤和PDGF-驱动的肿瘤表明间充质和原神经亚型的功能，分别在小鼠模型33，34，35，在那里，而后者肿瘤是敏感的药物前肿瘤呈对TMZ耐33。我们的模型，患者样本和以前的模型之间的这种一致性表明，少量驱动程序突变在确定肿瘤表型中起着关键作用。我们模型中呈现的异质性是GBM正确建模的基本特征，因为这一显着特征是令人困惑的方面，使得这些肿瘤难以治疗。虽然已经从多能细胞和基因组编辑技术的最新生成的几个型号15，我们iHGG模型是不同的方式，他们提出确切的GBM的病征性特征，并再现来自同基因细胞疾病的异质性。这些方法已经应用于其他脑肿瘤模型，例如髓母细胞瘤36。我们方法的局限性在于基因组工程是在hiPSC中进行的，hiPSC是GBM的无关来源细胞。但是，从适当分化的NPC和编辑过的hiPSC衍生出的肿瘤模型可以概括GBM病理生物学这一事实，这表明我们的平台具有潜力，可以通过将多种细胞谱系分化方案应用于hiPSC来进行更广泛的癌症建模。此外，最近使用脑类器官的3D体外脑肿瘤模型的发展表明，致癌突变的几种不同组合会导致类器官内肿瘤样成分的扩展，这将比常规细胞培养条件更好地近似体内条件37。多能干细胞的先进分化技术和基因组工程的这种应用使得能够引入实际上在患者样品中观察到的遗传改变，可以进一步开发下一代癌症模型。
EGFR激活和Ink4a / Arf失活的组合是在高级神经胶质瘤中常见的共同发生的基因改变，已被证明在神经胶质瘤的形成过程中在星形胶质细胞的去分化中起作用38。我们在NPC中工程化的遗传改变如何促进iHGG的形成有待进一步研究，并为研究促进细胞谱系指导转化的机制提供了理想的平台。同样，在原位植入之前，具有GBM相关突变的NPC如何不显示GBM亚型特异性转录组特征，如何通过体内转化过程呈现出这种特征，还有待进一步研究。
一旦使用我们的前神经和间充质iHGG模型获得异种移植肿瘤，这些肿瘤中的细胞便会保持致瘤性并在体内形成类似于原始肿瘤的继发性肿瘤，这在PDX模型中也可以看到39。由于该特征，一旦获得肿瘤，iHGG细胞就可以传代并维持为细胞系。此外，如此处所示，在hiPSC中引入遗传改变的不同组合是非常可行的，并且这种不同的编辑导致了不同的表型。因此，通过扩展我们的基因编辑范围，我们希望这些模型将使我们能够评估在不同癌症类型中发现的特定驱动基因变异的影响，由于大量获得性的客运突变和遗传背景，PDX模型不太可行是高度可变的样本。
在我们的iHGG模型中，另一个惊人的发现是在TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9肿瘤中观察到非整倍性伴随ecDNA。在我们以前的分析中，在超过80％的源自GBM 31的PDX细胞系中观察到ecDNA ，这表明ecDNA的形成是GBM发病机理的基本特征。有趣的是，具有CDKN2A -/-和PDGFRA点突变的组合的小鼠模型显示具有双分钟染色体或ecDNA 40的脑肿瘤，而另一个在照射后产生脑肿瘤的CDKN2A -/-小鼠模型也具有ecDNA 41。使用针对最常见的结肠直肠癌基因（APC，TP53，KRAS和SMAD4）进行编辑的人肠道干细胞，发生了广泛的非整倍性，这些四倍体突变细胞在具有侵袭性癌特征的免疫功能低下的小鼠中生长为肿瘤12。连同我们的结果，这些先前的模型表明TP53或CDKN2A发生了变化在GBM和其他癌症类型中通常受到影响的，在导致非整倍性或ecDNA形成的染色体不稳定性的发生中起着至关重要的作用。总而言之，我们通过在hiPSC中引入必要的遗传改变的不同组合，为HGG提出了一个建模系统，从而导致肿瘤化身如实地概括了HGG的组织学，基因表达特征和细胞遗传学特征。由于这些化身忠实地表达了GBM的基因表达特征，因此我们希望这些模型将成为研究基于遗传驱动程序，基因组编辑的iPSC分化程序定义的起源细胞以及其他可能参数的癌症生物学的有用平台例如异种移植位置和性别差异。
使用人类多能干细胞的实验是根据UCSD人类研究保护计划（项目编号151330ZX）的规定进行的。人iPS细胞，CV-iPS-B细胞获自Lawrence SB Goldstein 42博士。在mTeSR1培养基（Stemcell Technologies）中，在涂有Matrigel hESC合格基质（Corning）的板上培养CV-iPS-B细胞。将NPC在含有Dlu / MAX（Thermo Fisher Scientific），DMEM / F12、1×N-2补充剂（Thermo Fisher Scientific），1×B-27补充剂（Thermo Fisher Scientific），50 mM的NPC维护培养基中的基质胶包被板上培养。抗坏血酸（Tocris），3 µM CHIR99021（Tocris）和0.5 µM吗啡胺（Tocris）。球形细胞悬浮于DMEM / F12中，悬浮液中含有GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific），1×B-27补充剂，20 ng / ml EGF（Stemcell Technologies）和20 ng / ml bFGF（Stemcell Technologies）。
表达Cas9-T2A-GFP和sgRNA 43的质粒pSpCas9（BB）-2A-GFP或px458 购自Addgene（Plasmid＃48138）。使用下面列出的顶部和底部寡核苷酸的组合，将每个靶基因的指定sgRNA序列克隆到px458中。
PTEN-内含子4位：5′-CACCGGAATTTACGCTATACGGAC-3′，
PTEN-内含子4底：5'-AAACGTCCGTATAGCGTAAATTCC-3'，
PTEN-内含子5位：5′-CACCGAACAAGATCTGAAGCTCTAC-3′，
PTEN-内含子5底：5'-AAACGTAGAGCTTCAGATCTTGTTC-3'，
TP53-内含子1顶：5'-CACCGGGTTGGAAGTGTCTCATGC-3'，
TP53-内含子1底：5'-AAACGCATGAGACACTTCCAACCC-3'，
TP53-内含子6-top：5'-CACCGCATCTCATGGGGTTATAGGG-3'，
TP53-内含子6底：5'-AAACCCCTATAACCCCATGAGATGC-3'，
NF1-intron 31-top：5'-CACCGATAGCACTCTTCCCGAGCTA-3'，
NF1-内含子31底：5'-AAACTAGCTCGGGAAGAGTGCTATC-3'，
NF1-intron 33-top：5'-CACCGCTTTGGGGAGGTCTTTCGTC-3'，
NF1-内含子33底：5'-AAACGACGAAAGACCTCCCCAAAGC-3'，
PDGFRA-内含子7-top：5'-CACCGATTTGTATGTAGCGGTCTGC-3'，
PDGFRA-内含子7底：5'-AAACGCAGACCGCTACATACAAATC-3'，
PDGFRA-内含子9-top：5'-CACCGCCACGGGAACACTCTAAGA-3'，
PDGFRA-内含子9底：5'-AAACTCTTAGAGTGTTCCCGTGGC-3'。
通过将10 µM每种寡核苷酸，1×T4 DNA连接酶缓冲液（New England Biolabs），5U T4多核苷酸激酶（New England Biolabs）在37°C，95°C下孵育30分钟，对顶部和底部的寡核苷酸进行磷酸化和退火。持续5分钟，然后使用热循环仪以0.1°C / s的速度冷却至25°C。通过孵育25 ng px458、1μM退火寡核苷酸，1x CutSmart缓冲液（New England Biolabs），1 mM ATP（New England Biolabs），10U BBSI-HF（New England Biolabs）和200U T4连接酶（ （New England Biolabs）在37°C下放置5分钟，在23°C下放置5分钟，进行30个循环。通过使用U6测序引物：5'-GATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATT-3'的Sanger测序，证实了每个sgRNA序列的正确克隆。
解离之前，将人iPSC在10 µM Y-27632 RHO / ROCK途径抑制剂中培养2小时。使用Accutase（Innovative Cell Technologies）将细胞解离为单个细胞。将解离的hiPSC（1×10 6个细胞）重悬于100 µl人干细胞核因子检测试剂盒1（Lonza）的补充溶液中，该溶液总共含8 µg靶向每个基因的px458质粒组合，并使用B-016程序电穿孔Nucleofector 2b（Lonza）。电穿孔的hiPSC在mTeSR1中的基质胶包被的板上培养48小时。GFP阳性细胞然后通过流式细胞仪（SH800，SONY）和1-2×10 4进行分选。将分选的细胞接种在mTeSR1中10cm基质胶包被的板上。手工挑出分离的菌落，并将其铺板于重复的基质胶包被的96孔板中。
使用QuickExtract DNA提取液（Epicenter）裂解重复的96孔板之一上的hiPSCs克隆，并使用Platinum Taq DNA聚合酶高保真度（Thermo Fisher Scientific）进行基因分型PCR，反应体积为10μl，每个0.2μM底漆具有以下反应条件：94°C 2分钟； 94°C 15 s，55°C 30 s和68°C 4分钟的40个循环。PCR扩增子在琼脂糖凝胶中可视化（补充图 1）。下面列出了用于基因分型PCR的引物。
PTEN-i4-f：5'-GAGTCCTGACGAAATGTCCATG-3'，
PTEN-i5-r：5'-CCTGTT TTCCAGGGACTGAG-3'，
NF1-i31-f：5'-ACTCTGGAAAGGGATGGGAG-3'，
NF1-i33-r：5'-CCGGCTTCAGCTTCAAAGTAG-3'，
TP53-i1-f：5'-CCGATCACCTGAAGTAAGGAG-3'，
TP53-i6-r：5'-CCTTAGCCTCTGTAAGCTTCAG-3'，
PDGFRA-i7-f：5'-TGTACTCCTGTCCCCAGCTG-3'，
PDGFRA-i9-r：5'-TCCTGAGAGTCATGGCAATG-3'。
使用RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）从编辑过的hiPSC中提取总RNA，并根据制造商的说明使用RNA反转录为cDNA EcoDry Premix（Clontech）。在CFX96实时系统（Bio-Rad）上运行包含从10 ng等价RNA获得的cDNA的三重qPCR反应，以在以下反应条件下确认基因的指定靶点：95°C 5分钟，40个循环95°C持续15 s，56°C持续30 s。设计引物对以跨越每个靶基因的缺失区域。将数据标准化为GAPDH，并使用2-ΔCt公式确定相对转录水平。下面列出了用于RT-qPCR的引物。
GAPDH-RT-f：5'-AATTTGGCTACAGCAACAGGGTGG-3'，
GAPDH-RT-r：5'-TTGATGGTACATGACAAGGTGCGG-3'，
PTEN-RT-f：5'-CGAACTGGTGTAATGATATGT-3'，
PTEN-RT-r：5′-CATGAACTTGTCTTCCCGT-3′，
NF1-RT-f：5'-GCCACCACCTAGAATCGAAAG-3'，
NF1-RT-r：5′-AGCAAGCACATTGCCGTCAC-3′，
TP53-RT-f：5'-CCAAGTCTGTGACTTGCACG-3'，
TP53-RT-r：5′-GTGGAATCAACCCACAGCTG-3′，
PDGFRA∆8–9-RT-f：5′-GATGTGGAAAAGATTCAGGAAATAAGATG-3′，
PDGFRAwt-RT-f：5'-CGCCGCTTCCTGATATTGAG-3'，
PDGFRA-RT-r：5'-CTCCACGGTACTCCTGTCTC-3'。
通过琼脂糖凝胶电泳观察qPCR产物。
从先前的研究21中改编了从iPSC生成小分子神经祖细胞（smNPC）的方法。详细地，使用Accutase（Innovative Cell Technologies）分离了70-80％融合度的人iPSC，并以1×10 6细胞/ ml重悬在N2B27培养基中（DMEM / F12与GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific），1×N-2补充剂（Thermo Fisher Scientific），1×B-27补充剂（Thermo Fisher Scientific），150 mM抗坏血酸（Tocris）和1％青霉素/链霉素）补充有1 µM Dorsomorphin（Tocris），10 µM SB431542（Tocris），3 µM CHIR99021、0.5 µM Purmorphamine和5 mM Y-26732（Stemcell Technologies）。将三百万个细胞转移到未覆盖的六孔组织培养板的一个孔中，并在37°C，5％CO 2下孵育在90 rpm的振动器上。均匀的小EB在24小时内形成，并在随后的几天内增大。48小时后，用补充了Dorsomorphin，SB431542，CHIR99021和Purmorphamine的N2B27培养基进行完全培养基更换。此时，大约有2/3的EB被丢弃或将EB分散在六孔板的三个孔中，以减少最初确保均匀形成胚状体所需的高细胞密度。在第3-5天，用新鲜的N2B27培养基（补充了Dorsomorphin，SB431542，CHIR99021和Purmorphamine）进行了一半培养基更换。在第6天，撤回Dorsomorphin和SB431542，并用smNPC培养基（补充了3 µM CHIR99021和0.5 µM Purmorphamine的N2B27培养基）进行完全培养基更换。在此阶段，所有上皮细胞均清晰可见神经上皮褶皱。在第8天，通过用P1000移液器移液10–15次来研磨EB，然后将其涂在基质胶涂层的10 cm板上。3–4天后，将附着的EB片段和生长过度的细胞用Accutase（Innovative Cell Technologies）解离为单细胞，并以1：6-1：1：8的比例分裂到基质胶包被的板上。第一次传代后，每3-6天以1：10-1：15的比率传代细胞。在最初的几代中，在smNPC菌落之间可以观察到较大的扁平非smNPC，但直到几乎所有细胞系中的3-6代才逐渐消失。使用RNeasy Plus Mini Kit从分化的smNPC中提取总RNA，并根据制造商的说明使用RNA反转录为cDNA EcoDry Premix。在CFX96实时系统上运行包含从10 ng等价RNA获得的cDNA的三重qPCR反应，以在以下反应条件下确认NPC的分化：95°C 5分钟，95°C 40循环15 s，56°C 40°C 30秒 将数据标准化为GAPDH，并使用2-ΔCt公式确定相对转录水平。下面列出了用于RT-qPCR的引物。
Nanog-RT-f：5′-GAAATACCTCAGCCTCCAGC-3′，
Nanog-RT-r：5′-GCGTCACACCATTGCTATTC-3′，
Oct4-RT-f：5'-AGAACATGTGTAAGCTGCGG-3'，
Oct4-RT-r：5'-GTTGCCTCTCACTCGGTTC-3'，
Nestin-RT-f：5′-GGTCTCTTTTCTCTTTTCCGTCC-3′，
Nestin-RT-r：5'-CTCCCACATCTGAAACGACTC-3'，
Pax6-RT-f：5'-GCCCTCACAAACACCTACAG-3'，
Pax6-RT-r：5′-TCATAACTCCGCCCATTCAC-3′，
Sox1-RT-f：5'-CAGCAGTGTCGCTCCAATCA-3'，
Sox1-RT-r：5'-GCCAAGCACCGAATTCACAG-3'。
NPC的自发分化是通过将NPC在基质胶包被的板上的DMEM中添加10％FBS维持一周来进行的。
动物研究实验已通过UCSD动物护理计划（协议编号S00192M）批准，并根据其规定进行。使用Accutase（Innovative Cell Technologies）将野生型和经过编辑的smNPCs解离，用PBS洗涤，并以每只动物补充0.1％BSA的2 µL PBS 中的1×10 6个细胞重悬。将重悬的细胞保存在冰上，并通过立体定向注射（前1.0部1.0 mm，右前reg部2.0 mm，内层深3 mm）接种到4-6周龄雌性Nod scid小鼠（Charles River Laboratory）的纹状体中头骨）。还注射野生型hiPSC作为对照。
使用UCSD摩尔癌症中心病理学核心和高级实验室医学中心（UCSD）对石蜡包埋的组织块进行切片。组织切片用来自Dako（Cat＃Z0334）的GFAP（1：6000）抗体，来自EMD Millipore（Cat＃Ab6910; Lot＃3018858）的Olig2（1：300）抗体，来自Ventana Medical的Ki-67（pre-diluted47）染色来自Abcam（Cat＃ab190710）的Systems（Cat＃760-4286）和NM95（1：300）。载玻片在Ventana Discovery Ultra上染色。在95°C下使用CC1进行抗原恢复24–40分钟（对于GFAP，使用蛋白酶2进行抗原提取12分钟）。一抗在切片上于37°C孵育32分钟。使用OmniMap系统（HRP标记的山羊抗小鼠或兔； Ventana Medical系统）可视化一抗，并使用DAB作为色原，然后使用苏木精作为复染。冲洗载玻片，通过乙醇和二甲苯脱水，然后对GFAP和Olig2进行盖玻片免疫组化染色，分级如下：0（无细胞染色），1 +（<5％肿瘤细胞染色），2 +（5-50％细胞染色）和3+ （> 50％细胞染色）。对于每个模型，在六个不同的高功率场上手动计算Ki-67阳性。
从小鼠脑中切除肿瘤，并用手术刀切成小块，然后在37 ml的汉克氏平衡盐溶液（HBSS，Sigma）和0.4 ml的10x胰蛋白酶溶液（Sigma）中于37°C孵育20分钟。孵育后，添加200μl的10 mg / ml DNaseI储液（Sigma）并孵育60 s，然后添加6 ml HBSS以中和胰蛋白酶和DNaseI。通过用巴斯德玻璃移液管上下移液几次将肿瘤组织重悬。解离的组织通过滤网过滤，并通过400× g离心3分钟而离心下来 。将细胞重悬于1 ml PBS和9 ml ACK裂解缓冲液（Invitrogen）中，并在37°C孵育10分钟以去除红细胞。约1×10 6将细胞重悬于100 µl MACS / BSA缓冲液（Miltenyi Biotec）中，并与2 µl Fc封闭溶液（BioLegend）在冰上孵育5分钟。封闭后，加入5 µl的PE偶联的抗人HLA-A，B，C抗体（BioLegend），将细胞在冰上孵育15分钟。染色的细胞用500 µl MACS / BSA缓冲液洗涤两次。然后使用流式细胞仪（SH800，SONY）分选PE阳性细胞。将分选的人iHGG细胞保存在具有1×B-27补充剂（Thermo Fisher Scientific），20 ng / ml EGF（Stemcell Technologies）和20 ng / ml bFGF（Stemcell Technologies）的GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）的DMEM / F12中。
基于先前文献24进行了极限稀释试验。详细地，使用Accutase（Innovative Cell Technologies）将NPC和iHGG球解离为单个细胞，并将1、5、10、20、50和100个细胞/孔接种到96孔板中，每种实验条件重复五次。培养14天后，对每个孔和每个处理的球体总数进行定量。通过极限稀释法分析数据（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）。
使用Accutase（Innovative Cell Technologies）将初级iHGG球解离，用PBS洗涤，并以2.5×10 5重悬每只动物加入2微升PBS和0.1％BSA补充的PBS细胞。将重悬的细胞保存在冰上，并如上所述接种。接种iHGG细胞7天后，通过腹膜内注射媒介物（DMSO）或50 mg / kg TMZ（Selleckchem）对小鼠进行治疗。在最初的3天中每天对小鼠进行一次治疗，然后进行2天的药物假期，然后再对小鼠进行2天的每天一次，随后进行2天的药物假期和另一组每天2天的一次药物治疗。每4周重复此组处理，并记录存活小鼠随时间的百分比。在CFX96实时系统上运行RT-qPCR评估MGMT表达，以确认在以下反应条件下可分化为NPC：95°C 5分钟，95°C 40循环15 s，56°C 30 s。将数据标准化为GAPDH，并使用2-ΔCt公式确定相对转录水平。下面列出了用于RT-qPCR的引物。
MGMT-RT-f：5'-GCTGAATGCCTATTTCCACCA-3'，
MGMT-RT-r：5′-CACAACCTTCAGCAGCTTCCA-3′，
用Karyomax（Gibco）以终浓度0.1 µg / ml处理细胞1–3 h，即可获得中期细胞。收集细胞，用PBS洗涤，然后重悬于0.075 M KCl中15-30分钟。滴加Carnoys固定剂（3：1甲醇/冰醋酸）以终止反应。将细胞再用Carnoys固定液洗涤3次，然后将其滴到湿润的玻璃载玻片上以制备中期细胞。DAPI已添加到幻灯片。用Olympus FV1000共聚焦显微镜捕获图像。
光谱核型分析是在应用光谱成像处进行的。
使用Illumina HiScan系统（Illumina）通过数字核型分析，分析了使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）从NPC和iHGG细胞中提取的基因组DNA。
为了检测DNA复制，将细胞用EdU标记，并使用Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594成像试剂盒（Invitrogen）进行检测。简而言之，将细胞用EdU（10 µM）脉冲标记1 h，然后使其进入中期12 h。加入KaryoMax（0.1 µg / ml）3小时以将细胞停在中期。然后收集细胞，并准备中期扩散31。将处于中期的细胞滴到载玻片上，并通过在室温下将Click-iT反应混合物直接应用到载玻片上20分钟来检测EdU。然后用2x SSC洗涤载玻片，并用含DAPI的抗褪色封固剂封固。使用配备QIClick相机的Olympus BX43荧光显微镜对中期细胞成像。
使用安捷伦Tapestation评估了总RNA的质量，所有样品的RNA完整性指数均高于9.0。按照制造商的说明，使用llumina的TruSeq链式mRNA样品制备试剂盒（Illumina）生成RNA库。使用STAR 2.4.0 h将RNA-seq读段与人类基因组（hg19）进行比对（outFilterMultimapNmax 20，outFilterMismatchNmax 999，outFilterMismatchNoverLmax 0.04，outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonicalUnannotated，outSJfilterOverhangMin 6 6 6 6，seedSearchStartLmax 20，使用从数据库中排列的1S基因） Gencode V19 44，45。读取与外显子的坐标重叠的使用HTSeqcount计数（-s反向-a 0 -t外显子-i gene_id -m联盟）46，47。用DESeq2 48处理原始读取计数，并且仅考虑平均读取计数超过20的基因进行分析。使用DESeq2 49中包含的方差稳定转换函数对原始读取计数进行转换。计算每个基因的标准化表达的均值和标准差，并通过从每个表达值中减去均值并除以标准差来确定Z得分。
对于次生肿瘤细胞的scRNA-seq，将肿瘤从小鼠脑中切开，切成小块，然后在含有1x胰蛋白酶（Sigma）的HBSS（Sigma）中于37°C孵育20分钟，然后机械解离用玻璃移液器获得单细胞。使用Accutase（Innovative Cell Technologies）将培养的球细胞解离。根据制造商的规程，使用Chromium Single Cell 3'Gel Bead，Chip and Library Kits v2（10x Genomics），通过Chromium Single-Cell基因表达溶液处理单细胞。简而言之，将单细胞重悬于PBS中的0.04％BSA中。将总计一万个细胞添加到每个通道，平均回收3040个细胞。然后将细胞在Chromium仪器中以乳化液的形式分配到Gel Beads中，发生细胞裂解和条形码逆转录RNA，然后进行扩增，剪切，5'衔接子和样品索引连接。进行了安捷伦高灵敏度D5000 ScreenTape分析（Aglient Technologies）以对文库进行质量控制。库在Illumina NovaSeq上测序。使用10x Genomics提供的Cellranger工具包（版本2.0.1）进行多路分解，与hg19转录组的比对和独特的分子识别符折叠。总共处理了42,558个单元，每个单元具有〜53,000个映射读取。使用Scanpy v1.3.3软件包对输出数字基因表达矩阵进行了分析 进行了安捷伦高灵敏度D5000 ScreenTape分析（Aglient Technologies）以对文库进行质量控制。库在Illumina NovaSeq上测序。使用10x Genomics提供的Cellranger工具包（版本2.0.1）进行多路分解，与hg19转录组的比对和独特的分子识别符折叠。总共处理了42,558个单元，每个单元具有〜53,000个映射读取。使用Scanpy v1.3.3软件包对输出数字基因表达矩阵进行了分析 进行了安捷伦高灵敏度D5000 ScreenTape分析（Aglient Technologies）以对文库进行质量控制。库在Illumina NovaSeq上测序。使用10x Genomics提供的Cellranger工具包（版本2.0.1）进行多路分解，与hg19转录组的比对和独特的分子识别符折叠。总共处理了42,558个单元，每个单元具有〜53,000个映射读取。使用Scanpy v1.3.3软件包对输出数字基因表达矩阵进行了分析50。将所有样品的矩阵连接起来，并丢弃至少在20个单细胞中未检测到的所有基因，剩下20,521个基因用于进一步分析。从分析中删除表达基因少于600个或大于8000个的细胞，以及转录基因表达超过80,000个或线粒体表达的0.1％的细胞。对于不同的样本子集组合分析，过滤步骤是相同的，除了去除细胞的特定基因和转录阈值： PTEN -/- ; NF1 -/-球形（少于600个或超过7000个表达的基因，以及50,000笔成绩单）， PTEN -/- ; NF1 -/-TP53 -/- ; PDGFRAΔ8-9球体（少于600个或7000个以上表达的基因和超过70,000个转录本），TP53 -/- ;肿瘤（少于600个或超过8000个表达的基因和超过80,000个转录物）； PDGFRA Δ8–9肿瘤（表达的基因少于600个或6000个以上，有40,000个以上）。将数据进行对数归一化，并缩放至每个细胞10,000个转录本。使用filter_genes_dispersion函数，flavor =“ cell_ranger”，确定了前4000个可变基因。进行了PCA，保留了前25个主要成分（对于PTEN -/- ; NF1 -/-球，PTEN -/- ; NF1分别为21、20、23和24- / -肿瘤中， TP53 - / - ; PDGFRA Δ8-9球体和 TP53 - - / PDGFRA; Δ8-9分别肿瘤，）。使用这些主成分，可以使用pp.neighbors函数计算20个邻居和标准参数的邻居图。用tl.louvain函数和标准参数（以及 PTEN -/- ; NF1 -/-球， PTEN -/- ; NF1 -/-肿瘤， TP53 -/-的分辨率分别为0.4、0.4、0.7和0.4来计算Louvain簇） ; PDGFRA Δ8–9和 TP53 -/- ; PDGFRA Δ8–9肿瘤）。分别使用pl.heatmap和pl.matrixplot函数生成每个样本热图的单细胞表达和均值表达。分别使用tl.score_genes和tl.score_genes_cell_cycle函数计算TCGA分子亚型以及干细胞和细胞周期基因的单细胞得分（请参阅补充数据 1）。使用tl.rank_gene_groups函数（方法=“ wilcoxon”）为每组卢旺素簇确定差异表达的基因。为了对主球和次球进行GO分析，将每个Louvain簇的差异表达基因（对数大于0.5的log2倍且p调整值小于0.05）用作Metascape 51的输入（见补充数据 2）。（多个基因列表选项和标准参数），使用14个样品中所有表达的基因作为背景。浓缩结果总结在补充数据 3中。
所有统计分析均使用GraphPad Prism 6软件进行。数据代表在至少三个独立实验中获得的结果。通过不成对的t检验分析数据集以确定显着性（p <0.05）。使用对数秩（Mantel-Cox）检验分析Kaplan-Meier曲线和生存比较。
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