摘要
癌症蛋白质组学通过整合基因组学，转录组学和蛋白质谱分析（包括质谱法（MS）修饰），有望为癌症生物学和治疗功效提供新的见解。一个关键的限制是样品输入要求超过了许多临床上重要的材料来源。在这里，我们报告了使用组织保留样本处理和微型蛋白质组学进行核心活检的蛋白质组学方法。作为演示，我们分析了开始基于曲妥珠单抗的新辅助化疗之前和之后48-72 h的ERBB2阳性乳腺癌的核心穿刺活检。在与病理完全缓解相关的病例中，我们显示出对ERBB2蛋白以及ERBB2和mTOR目标磷酸位水平的更大抑制，并确定了治疗抵抗的潜在原因，包括缺乏ERBB2扩增，尽管扩增了ERBB2，但ERBB2活性不足以达到治疗敏感性；候选抗性机制包括雄激素受体信号传导，粘蛋白过表达和无活性的免疫微环境。蛋白质组学在活检规模的临床应用和发现潜力值得进一步研究。
癌症蛋白质组学将癌症基因组学和转录组学的数据与癌症蛋白质组学集成在一起，以提供对癌症生物学和治疗脆弱性的更深入了解。两者通过提高基因组畸变的和通过见解途径活化的功能注释，向人肿瘤显示了表征本多维方法承诺用于应用到精密肿瘤1，2，3，4，5，6，7
在这里，我们解决了蛋白质组学的组织要求，这限制了翻译研究的机会以及在癌症诊断中的适用性。例如，临床蛋白质组学肿瘤分析联合会（CPTAC）需要至少100 mg肿瘤组织，通常每个样品可产生有关> 10,000个蛋白质和> 30,000个磷酸位点的定量信息8。为进行临床诊断，需进行一次速冻的富肿瘤核心针穿刺活检（〜 <20 mg）必须提供足够的DNA，RNA和蛋白质以进行深层蛋白质组学分析。为了减少这些组织需求，我们现在介绍从单个14 G核心针头活检产生高质量DNA，RNA和蛋白质的方法，以用于大规模DNA和RNA测序以及蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析（活检三联提取，（BioTExt））以及基于微型液相色谱-质谱（LC-MS / MS）的蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析管线（MiProt），每个样品仅需25μg肽。作为原理的技术证明，我们将这些方法应用于旨在研究在开始化疗之前和之后48-72小时进行蛋白基因组分析的可行性的初步研究中。9，10。
为了进行微型标本处理，将嵌入了最佳切割温度（OCT）的核心活检组织进行连续切片，将交替的50um切片转移到3个不同的1.5 ml管中（图 1a）。将总共六个部分转移到每个管中。为了评估样品质量，在H＆E染色的第一个和第六个50μm切片之前和之后进行了5μm切片。需要进一步分析的平均肿瘤含量为50％。第一个试管用于提取变性的蛋白质和DNA，第二个用于RNA分离，第三个用于天然蛋白质和DNA。随后将变性的蛋白质用于本文所述的蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析，并将DNA和RNA用于基因组分析。天然蛋白质分析将在其他地方描述。
a在“活组织检查三联体提取”（BioTEXT）方案中，将患者来源的OCT嵌入式核心穿刺活检切片，然后提取DNA，RNA和蛋白质以进行深层蛋白质组学表征，并通过基于免疫组织化学的成像技术进行切片。b微型蛋白质组学（MiProt）工作流程可进行深层蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学表征，每个芯针活检含25μg肽。MiProt使用一个公共参考，可用于在单个TMT10 / 11复合体中的所有样品之间以及跨多个核心活检样品的多个TMT10 / 11复合体之间进行比较。
为了初步评估由BioTExt产生的分析物，从两个基底样乳腺癌患者衍生的异种移植（PDX）模型（WHIM2，WHIM14）和两个管腔模型（WHIM18和WHIM20）11收集了OCT嵌入的芯针活检样本。活检产量范围为2.5–14μgDNA，0.9–2.3μgRNA和280–430μg蛋白质。补充图1A提供了核酸的提取产率 。因为针头大小不同（14-22号规），所以使用串联质量标记（TMT）肽标记方法12将最低25μg的输入肽/样品的最低目标定为蛋白质组学的目标（图 1b）。）。由于质量标签是等压的，因此来自每个样品堆栈中相同肽段的信号处于MS1水平，从而提高了识别和定量的总体灵敏度，这是此输入规模的关键优势。相对于无标签方法，多路复用还将样品分析通量提高了10倍。成功的微尺度化需要对批量优化的CPTAC工作流程8进行几处修改，以实现低输入性能分析。这种整体方法称为微尺度蛋白质组学（MiProt）。
对PDX材料用于确定是否蛋白质组学覆盖芯针活检是与使用散装肿瘤优化工作流（临床蛋白质组学分析肿瘤协会（CPTAC）工作流）获得的那些8，11（图 2A）。从每个PDX模型中收集了两个针头活检芯。然后通过外科手术切除有芯的异种移植肿瘤，以进行大量材料分析。将芯嵌入OCT，快速冷冻，然后进行BioTExt处理，然后进行MiProt处理。剩余的散装肿瘤快速冷冻，cryopulverized以及使用所述原始CPTAC工作流进行分析8，13。使用随机的实验布局（补充数据1），使用原始CPTAC工作流程分析了每个样品总共300μg的肽，使用MiProt工作流程分析了每个样品25μg的肽 。蛋白质和磷酸位点的表达表示为每个样品的TMT强度与每个plex中包含的内部公共参比强度的对数比。两种工作流程均识别出10,000多种蛋白质，其中> 7500被鉴定为人类。在通过两种方法鉴定的蛋白质群体之间观察到了广泛的重叠（图 2b，补充数据 2A）。MiProt从每个核心中识别出超过25,000个磷酸位点，这些位点与大量CPTAC工作流程识别出的位点显示出实质性的重叠（图 2c，补充数据 2B，补充图 2A）。通过MiProt方法鉴定超过25,000个磷酸位点特别值得注意，因为相对于CPTAC整体工作流程8，定量位点的减少少于2倍，尽管每个样品使用的肿瘤物质少12倍。尽管先前的研究报道了少量组织材料14产生的蛋白质数量相对较高（〜4500），但我们仅使用25μg肽/样品获得的大量磷酸位点尚未在以前进行过描述。对于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据，在所有4种PDX模型中，大块肿瘤重复之间和核心重复之间的TMT比率均具有高度相关性（图 2d）。，补充图 2B）。除了蛋白质和磷酸位点的高度重叠外， 单个PDX模型的核心和大量表达之间也高度相关（Pearson相关，R > 0.65），这可以通过将来自核心和大量样品的紧密并置观察到在无监督的层次聚类中使用相同的PDX模型（补充图 2C）。
一个不相邻的，芯针活检进行从2基底和2个管腔PDX模型随后手术去除肿瘤的收集。使用MiProt工作流程对核心进行蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学表征，并使用Mertins等人8中所述的CPTAC工作流程对大块组织进行表征。b维恩图显示了在核心和大块组织中定量的人类与小鼠或人类蛋白质之间的重叠数。c维恩图显示人与小鼠或人磷酸位点之间的重叠。d在所有4个PDX模型中，来自核心和整体的每个样品之间的蛋白质（左）和磷酸位（右）的TMT比的Pearson相关性。Ë该热图显示了在整个和核心实验中鉴定出的关键差异调节的Luminal与Basal乳腺癌相关蛋白和磷蛋白的TMT比率（已鉴定的磷酸位点的平均表达）。˚F基因为中心和phosphosite为中心的途径或激酶活性富集分析使用GSEA进行（MSigDB“癌症检验印章”，左）和PTM-SEA（PTMSigDB，右），分别用于在散装（拍摄管腔-基底差异ÿ -轴）和核心（x轴）组织。使用limma导出的带符号Log10 p值对GSEA和PTM-SEA分析的差异特征进行预排序。在核心和体积中都显着的途径/磷酸签名以褐色表示。
除了WHIM20以外，所有PDX模型的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组水平上，关键的基础和管腔标志物的表达谱均显示出总体样品与核心样品之间总体趋势相似（图 2e），其中WHIM20磷酸化的EGFR，磷酸化的PGR和ESR1蛋白显示出减少核心相对于散装的表达，这表明在这个特定的PDX模型11中可能存在一些异质性。相比之下，在这些临床ERBB2（无ERBB2扩增）病例中不应高表达的乳腺癌标志物ERBB2在不同的PDX模型中表现出更均匀的表达。总体而言，核心提供了蛋白质组学数据，其结果与从大块组织的整体表达谱获得的结果一致。
为了解决微尺度工作流程是否捕获了管腔与基础亚型中差异调控的途径和磷酸酶驱动的信号传导，将途径水平和以激酶为中心的分析应用于大量和核心样品数据。单样本基因组富集分析（ssGSEA）应用于蛋白质组学数据，以及翻译后修饰设置富集分析（PTM-SEA）的磷酸化蛋白质组学数据15，16。大量组织分析所捕获的腔-基底差异与使用核心检测到的蛋白质和磷酸位点表达的差异高度相关（图 2f，补充数据 2C，D）。值得注意的是，该数据概括先前观察到的管腔-基底差异，为蛋白质组学数据集都为芯和大块组织提供一个质量度量2，6。在针对单个PDX模型的标准化TMT蛋白比率进行的批量与核心比较中，得出了相同的结论（补充图 2D）。尽管鉴定出的磷酸化位点减少了约40％，但在大块组织中鉴定出的大多数差异Luminal-Basal激酶特征被MiProt捕获（图 2f，右）。
基于PDX的初步数据鼓励将这些方法应用于蛋白质组学乳腺癌试验研究（发现方案1（DP1）；NCT01850628）。DP1的目的是研究从局部晚期ERBB2 +乳腺癌患者的核心活检中进行蛋白基因组分析的可行性。根据医生的判断，通常使用曲妥珠单抗联合帕妥珠单抗和化学疗法治疗患者。该方案旨在通过在治疗前和治疗后48至72小时（在全文中分别指治疗前和治疗中）采集样本来研究急性治疗的扰动。
如REMARK（针对肿瘤标志物研究的报告建议）17图（补充图 3）所示，可从19位患者中获得核心活检样品。可以对14例患者的样本进行蛋白质组学分析，因为5例患者的肿瘤含量<50％。不同核心样品的分析物产量各不相同，但较低范围的DNA，RNA和蛋白质产量（分别为0.4μg，0.2μg和45μg）足以证明优化的提取方案适用于临床活检标本（补充图。 1B）。还对10名患者的治疗中核心进行了蛋白质和RNA的分析，分析了四名患者获得的重复的治疗前和治疗中核心，以及一名患者的一式三份（图 3a）。总共分析了35个核心。使用来自单个基线核心的DNA对所有14位患者进行肿瘤和生殖系全外显子组测序。使用BioTExt从核心中分离的DNA产生的靶标覆盖率与从血液中分离的基因组DNA（使用标准有机提取技术生成）的靶标覆盖率相当（补充图 4A）。RNA测序成功完成了对应于14位患者中11位患者的30个核心的分析，而MiProt分析在所有35个可用核心中均获得了成功。
一个从DP1临床试验前和在治疗核心活检获得proteogenomics样品的概述。每个块指示从单独的核心获得的数据。b微型蛋白质组学组为DP1核心针头活检提供了高水平的蛋白质组学深度。右侧显示了汇总了所有蛋白质组学总覆盖率和所有样品突变基因数量以及所有分析核心的平均覆盖率的表格。c维恩图显示跨RNA序列，蛋白质组学和磷酸蛋白质组学鉴定的所有基因之间的重叠。d热图总结了ERBB2的蛋白质组学特征CNA，RNA和蛋白质表达水平的扩增子和邻近基因。红色的基因组构成了ERBB2扩增子的核心，并且在所有pCR病例（True ERBB2 + pCR设置在右侧）以及BCN1371和1369（True ERBB2）中始终显示出高拷贝数扩增，RNA和蛋白质水平+非pCR设置），但BCN1326（错误ERBB2 +），BCN1331和BCN1335（伪ERBB2 +设置）中的蛋白水平显着降低。箭头指向BCN1335中扩增的TOP2A基因。e底部的热图显示相应的Z所有14例患者中ERBB1-4的RNA，蛋白质和磷蛋白表达的得分。BCN1326，BCN1331和BCN1335中的ERBB3蛋白和磷蛋白以及ERBB4蛋白水平也显着低于一组pCR病例。
平均而言，我们从每个样本中获得了> 27,000个基因的拷贝数信息，测得的> 19,000个基因的mRNA转录本，并量化了每个样本中的> 10,000个蛋白质和> 17,000个磷酸位点，并且在不同数据集之间的基因鉴定有很大的重叠（图 3b，c，补充数据 3，4）。覆盖深度是类似于以前的大规模乳腺癌proteogenomics与磷酸化覆盖的例外，它实现了约以前的肿瘤体积级鉴定报告的网站数量的一半努力得到2，18。14例中有13例是ERBB2扩增由外显子测序与先前由TCGA和ICGC乳腺癌研究（补充图涉及许多基因的扩增和突变沿确认 4B）19，20。我们还观察到了相似的总体结构变化模式（补充图 4C），包括染色体1、8和20 20的扩增。mRNA和蛋白之间跨越患者芯中值基因明智Spearman相关（Ñ = 11）为0.38，与以前的批量聚焦proteogenomics研究（补充图一致 4D）1，2，4，18。另外，与MiRNA蛋白质表达衍生的共表达网络相比，从mRNA表达衍生的共表达网络在类似比例的途径中更好地预测了KEGG途径的功能，与先前针对已发表的CPTAC乳腺癌队列21报道的相似（补充图 5A）。对来自同一患者的重复，预处理和治疗中的核心进行了BioTExt样品处理可重复性的评估。基于500个可变性最高的基因的无监督分层聚类导致所有重复的核心在mRNA，蛋白质和磷酸位点表达水平上聚在一起，但BCN1365病例的样品除外，其中治疗前和治疗时谱在聚位点表达水平（补充图 5B）。
9/14例（64％）发生病理完全缓解（pCR），有5例手术残留癌（非pCR）。为了探究某些非pCR病例是由于ERBB2状态分配错误而引起的可能性，对跨越ERBB2基因座和邻近基因的17q染色体区域进行了蛋白质组学分析（图 3d）。最明显的是，BCN1326的外显子组测序未显示ERBB2或其他附近基因的扩增（图3d，上图 ），但显示出较低水平的ERBB2 RNA（图3d，中图 ）和蛋白质表达（图3d）。 ，较低的面板）比pCR病例高，提示假阳性（假ERBB2 +）。紧接在ERBB2两侧的基因（STARD3，PGAP3和GRB7，在图3d中以红色突出显示）的 基因表达水平也低于pCR病例，在功能上证实缺乏扩增驱动的基因失调。BCN1331和BCN1335可能代表假阳性的更微妙形式。尽管这些样品显示了ERBB2拷贝数的增加，但ERBB2蛋白水平仍然很低，类似于BCN1326。BCN1335显示出比ERBB2更大的TOP2A绝对扩增（见图3d黑色箭头） 上图），与所有其他情况相比，TOP2A蛋白明显过表达（图3d下图 ，注意该样品的RNA分析失败）。这表明TOP2A是潜在的替代驱动因素。RNA（BCN1331）和蛋白质（BCN1331和BCN1335）的STARD3，PGAP3和GRB7的水平在BCN1331和BCN1335中也很低。没有局灶性过表达而具有ERBB2基因拷贝增加的病例称为假ERBB2阳性（假ERBB2 +）。当将BCN1326，BCN1331和BCN1335作为一组与9个真正的ERBB2 + pCR病例进行比较时，分别针对STARD3，ERBB2和GRB7的蛋白质对数TMT比和每个基因的蛋白质对数比的算术平均值均显着较低（两次样本T -test;算术平均值：p = 0.0114，STARD3：p = 0.0255，ERBB2：p = 0.0073，GRB7：p = 0.0399；n = 3个假和伪ERBB2 +非pCR案例，n = 9个真ERBB2 + pCR案例）。ERBB2二聚体伴侣ERBB3和ERBB4以及磷酸化ERBB3的蛋白水平也显着不足（两次样本T检验; ERBB3蛋白：p = 0.0097，ERBB3磷酸蛋白：p = 0.0318，ERBB4蛋白：p = 0.0131；n = 3个错误的ERBB2 +非pCR病例，n = 9个真实的ERBB2 + pCR病例）（图 3e））。相比之下，ERBB2的剩余二聚体伴侣EGFR的蛋白质和磷蛋白水平似乎与ERBB2的水平无关，并且在非pCR样品中也很高，这表明当ERBB2被抑制时，EGFR同型二聚体可能在信号传导中起驱动作用。低22，23。中央免疫组织化学分析表明，ERBB2在BCN1326中为1+，在BCN1335和BCN1331中为2+，而所有pCR病例均被指定为3+染色（补充图 6A）。为了支持微尺度蛋白质组学的定量潜力，中心分析中IHC得分为3+的样品显示ERBB2表达水平明显高于得分为1+或2+的肿瘤（Wilcoxon两样本秩和检验，n 对于IHC 1+或2 +， = 5;对于IHC 3 +，n = 15，p = 0.00013）。平行反应监测（PRM）还被部署为相同样品上的正交无标记蛋白质定量方法， 在TMT和基于PRM的MS方法之间具有极好的相关性（Spearman Rho = 0.92，p = 0，n = 32）（补充图 6B-D）。
为了测试蛋白质组学在治疗干扰研究中的可行性，研究了9例有pCR的患者和3例无pCR的患者的治疗前和治疗中的核心活检。在RNA水平上未观察到差异性治疗引起的变化（图 4a），而ERBB2蛋白水平在pCR病例中显示出显着降低（配对的Wilcoxon符号秩检验，p = 0.031，n = 7，对于pCR病例），比较pCR（n = 7）和非pCR（n = 3）病例的减少率的两样本秩Wilcoxon秩和p值不显着（p = 0.067）。但是，在pCR病例中，在48–72小时后，观察到ERBB2磷蛋白（所有ERBB2磷酸酶的均值）水平的下调大于非pCR病例（两个样本Wilcoxon秩和检验，p = 0.017，n = 3，非pCR病例） 对于pCR 情况，n = 7；图 4a）。为了进一步探索这些数据，采用了limma 24（一种专门设计用于小样本量研究的差异表达分析的更高级的统计方法）。（补充数据 5）。再次没有发现差异ERBB2 RNA表达用于任何比较（补充图 7）。但是，两种ERBB2蛋白均存在明显的pCR特异性下调（limma；p = 0.002， 对于pCR ，n = 7；p = 0.63； 对于非pCR，n = 2；和p = 0.029（对于pCR，n = 7，而非pCR，n = 2）和磷蛋白水平（p = 0.000014， 对于pCR ，n = 7；p = 0.88， 对于非pCR ，n = 2；以及p =对于pCR，n = 7，相对于非pCR，n = 2 ，为0.0086 （补充数据 5）。对单个磷酸化位点的差异分析还揭示了pCR特异性显着下调了ERBB2途径蛋白上的几个磷酸位，包括ERBB2和SHC1（与ERBB2 25结合的衔接子）上的位点（图 4b）。在位点水平磷酸蛋白质组学数据中观察到至少2倍的大多数显着变化以及影响ERBB2途径的变化（图 4b；补充图 7）。
具有治疗数据的每位患者的抗ERBB2治疗对ERBB2 RNA，蛋白质和磷蛋白水平的影响。通过配对的Wilcoxon符号秩和检验对每组的治疗前和治疗前ERBB2表达计算p值。pCR对非pCR p值来自Wilcoxon秩和检验，该检验比较了pCR患者与非pCR患者在治疗前至治疗前水平的log2倍变化。对于多核患者，使用平均表达值。 对于所有非pCR，n = 3； 对于pCR RNA，n = 6或n 对于pCR蛋白和磷蛋白，= 7。箱线图以中位数为中心，并显示每个组的第一和第三四分位数。星号表示未接受帕妥珠单抗治疗的患者BCN1369。b散点图显示了在pCR和非pCR病例中治疗前后各个磷酸酯的差异调节。通过差异表达的limma分析显示，对于p值<0.05的磷酸位点，非pCR的治疗中vs处理前log2倍变化（y轴）与pCR样品中的log2改变（x轴）在任一组（ñ 用于PCR = 7; ñ = 2（对于非pCR）。蓝色和绿色圆圈分别表示pCR和非pCR中的磷酸位点，单独两个组中均显示出明显的差异调节。紫色圆圈表示两组患者中磷酸酶的调节均明显。橙色菱形轮廓突出显示了KEGG ErbB信号传导途径（hsa04012）中蛋白质上的磷酸位。每个点的透明度反映了BH调整后的意义（调整后的p <0.05为实线，并且透明度更高的点具有较高的调整后的p值）。c PTM-SEA已应用于签名的-Log10 p-pCR（上图）和非pCR（下图）病例在治疗前后磷酸酯水平的limma差异表达分析中得出的-值。火山图显示了激酶签名的标准化富集分数（NES）。棕色圆圈表示FDR显着（<0.05）的签名。
鉴于ERBB2 22下游的激酶信号级联反应广为人知，因此将最近发布的磷酸位点途径分析工具PTM-SEA应用于磷酸蛋白质组学数据15（PTMsigDB：https : //github.com/broadinstitute/ssGSEA2.0）。图 4c显示了经过测试的比较的显着磷酸位点签名（仅在pCR中和仅在非pCR中，治疗前和治疗前的变化）（补充数据 6）。补充图 8图2显示了磷酸蛋白质组驱动标记的热图，在两组中的任何一种治疗后，磷酸标记均受到显着差异调节（FDR <0.05）。虽然在非pCR患者中CDK1和CDK2激酶（KINASE-PSP_CDK1，KINASE-PSP_CDK2）的推断活性上调，但治疗后mTOR活性（KINASE-PSP_mTOR）的下调是最明显的。
为了探索可能导致在非pCR病例中对治疗反应不足的候选生物学过程，对非pCR病例中每个预处理核心的数据进行了RNA，蛋白质和磷蛋白离群值分析，涉及一组预处理pCR核心。具体而言，相对于从所有预处理pCR核心建立的分布，针对给定的单个非pCR核心中的每个基因/蛋白质计算Z得分。在非pCR病例中ERBB2蛋白表达的Z评分与上述观察结果一致。BCN1326，BCN1331和BCN1335患者的ERBB2 RNA，蛋白质和磷蛋白水平为Z阴性的异常值患者BCN1369和BCN1371中的ERBB2表达位于pCR病例的正态分布内（图 5a，补充图 9）。从每个数据点（RNA，蛋白质组和磷酸化蛋白质组；请参阅补充数据7A）的异常值分析得出的Z得分 用于单样本基因集富集分析（ssGSEA）。图 5b突出显示了以免疫为中心和致癌信号通路的子集，这些信号通路在非pCR病例中表现出差异性富集。扩展列表可作为补充数据 7B获得。观察到来自单个患者的重复核心和多种数据类型之间存在一致的，显着丰富的途径水平差异（图 5b），证实了在临床环境中从核心获得的微型蛋白质组学数据可再现结果。有趣的是，相对于pCR类，不同的生物途径在每个非pCR病例中均表现出差异富集（图 5b，补充数据 7B）。
进行离群值分析以鉴定相对于所有预处理pCR病例的一组预处理样品，来自非pCR病例的每个预处理样品中差异调节的mRNA，蛋白质或磷蛋白。显示了所有患者中的ERBB2蛋白分布；棕色和绿色的条分别表示pCR和非pCR核心中每个蛋白质水平区的频率。该线显示了pCR样品的正态分布，从中得出每个非pCR样品的Z得分。相应的Z得分水平以红色表示。b热图显示了异常值Z的单个样本基因集富集分析（ssGSEA）的归一化富集得分（NES）-非pCR案例的得分。显示的是差异调控途径的子集，错误发现率低于25％（FDR <0.25）。c热图显示关键免疫检查点和T细胞标记（CD3）基因的表达水平，以及来自ESTIMATE，Cibersort和xCell的基于RNA的免疫和基质得分。d显微照片显示非pCR病例的抗CD3免疫组织化学染色图（原始放大倍数：20×）。e热图显示了所有预治疗患者的粘蛋白蛋白表达。f用载体，曲妥珠单抗，依维莫司或曲妥珠单抗和依维莫司的组合治疗WHIM8和WHIM35 PDX模型。该图显示了多个时间点的平均肿瘤体积（N 肿瘤植入和后续治疗后 = 15（1周前），N = 12（1周至4周），N = 9（4周后），误差线显示平均值的标准误差。
在差异途径分析揭示的复杂模式中，免疫相关和干扰素信号传导途径显示了来自三个病例中的两个的样品中数据集的一致上调，其中三个病例中ERBB2，BCN1326和BCN1331的表达较低。相反，对于其余的非pCR病例，这些途径显示出可变的下调。为了进一步探索这些发现，分析了T细胞受体（CD3亚型和CD247）和免疫检查点（PD-L1，PD1和CTLA4）基因的表达，并使用已建立的工具根据RNA-seq数据生成了免疫谱（ Cibersort，ESTIMATE和xCell）。免疫谱评分以及T细胞受体和可靶向免疫检查点调节剂的检测支持了BCN1326中相对于其他样品的主动免疫反应的存在（图。 图5c，补充图 10）。同样，免疫谱得分也表明BCN1331具有激活的免疫微环境，并且该患者的PD1 RNA表达高于其他任何病例（图 5c）。对五个非pCR病例的pan T细胞标记CD3进行了染色，以验证这些蛋白质组学发现（图 5d）。与主动免疫微环境一致（图 5c），BCN1326和BCN1331均显示出肿瘤T细胞浸润。相比之下，在BCN1335中观察到主要的肿瘤周围或“免疫排斥”的炎症反应，并且在两个由蛋白质组学证实的耐药性ERBB2 +病例BCN1371和BCN1369中观察到T细胞完全缺乏（免疫沙漠），与缺乏免疫信号传导相一致（图 5b）。
耐药病例中的其他可变差异特征包括PI3K / AKT / mTOR和MAPK信号传导，所有这些都代表了潜在的治疗机会。鉴于ERBB2蛋白水平非常低，BCN1331中的ERBB2途径活化是出乎意料的，但可以通过EGFR或磷酸化EGFR的表达来解释（图 3e）。在BCN1326和BCN1335的蛋白质和磷蛋白水平上，MYC靶标始终被上调，而在BCN1371的所有水平上，雄激素应答途径都被上调。与BCN1371中观察到的AR信号升高一致（图 5b），该肿瘤表现出具有高度嗜酸性粒细胞浆和AR表达的顶泌癌的组织学特征（补充图 11）中下部面板）。有趣的是，BCN1331还通过IHC表达AR，而未激活雄激素应答特征或顶泌功能（图5b，补充图 11），这与其他人指出的乳腺癌中AR表达和AR信号之间的脱节一致26。此外，对于患者BCN1371，我们没有观察到PI3K信号传导（图的显著上调 5B尽管）PIK3CA突变（E545K），与之间的脱节一致PIK3CA突变和效果通过反相蛋白质阵列（RPPA）当信令评估19，27。表 1总结了在每种非pCR病例中观察到的蛋白质组学特征。
为了进一步探索蛋白质组学数据中的治疗性耐药途径，进行了以患者为中心的RNA，蛋白质和磷蛋白异常值与已发表文献之间的关联分析（补充图 12）。对于每种基因或蛋白质，使用术语“乳腺癌”和“抵抗或复发”来搜索先前研究的异常基因与乳腺癌耐药性之间的关联。过滤后的PubMed引用计数最高的基因除了ERBB2外，还包括经过深入研究的基因，例如ESR1，BRCA1 / 2，TP53，EGFR和AKT1（补充数据 8）。不出所料，ERBB2是BCN1326，BCN1331和BCN1335中与关键字“抗性”相关的最突出的负蛋白和磷蛋白异常值（补充图 12）。此外，TOP2A RNA和蛋白质表达还与BCN1335中的“耐药性”密切相关，在这种情况下，扩增的基因座可能驱动TOP2A而不是ERBB2表达（补充图 12；图 3d）。患者BCN1369最突出的蛋白质组学异常值MUC6与包含关键字“抗性”的引用不相关（补充图 12）。尽管如此，多个粘蛋白家族成员在该患者中特别是具有高蛋白表达的异常值，其中两个具有与“抗性”相关的引证（补充图 12）。从图5e所示的热图中可以清楚地看出患者BCN1369中黏蛋白蛋白表达的持续高水平 。因为粘蛋白表达已经提出以掩盖ERBB2表位和曲妥珠单抗防止结合这一观察是显着的，如先前在细胞系中示出10，28，29。
由于不能直接在非pCR患者中探讨治疗假设，因此我们分析了先前发表的PDX面板的蛋白质组学分析，以确定在DP1研究中耐药性肿瘤的任何分子特征是否在ERBB2 +患者来源的异种移植物中（PDX）表型化。 ）6。有趣的是，与WHIM8（补充图13A）相比，WHIM35具有粘蛋白蛋白的高表达， 表明BCN1369的表型（补充图 13B）。用细胞系为基础的研究是一致的文献报道30，31，32，33曲妥珠单抗诱导的肿瘤消退中的粘蛋白阴性WHIM8但不是在粘蛋白阳性WHIM35（图 5F）。根据观察，BCN1369还表现出升高的PI3K-Akt-mTOR信号传导（图 5b），以及最近的报告显示mTOR介导的MUC1在多种乳腺癌细胞株30中的诱导，这些PDX模型还用小分子处理mTOR抑制剂依维莫司。在抗曲妥珠单抗的WHIM35模型中，依维莫司与ERBB2靶向治疗相结合可导致显着的消退（图 5f）。
在这里，我们报告了针对ERBB2 +乳腺癌患者的成功的微型蛋白质组学示范项目。在针芯活检的蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析之前使用的努力一次性分析14，34，35或离线SCX分级分离用超SILAC方法组合以量化〜2000-5000蛋白质和每个核心〜3800个磷酸化位点。这些先前的研究都没有将基因组分析纳入其工作流程。相比之下，我们的核心活检分析方法提供了深入的基因组，蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析，可识别PDX组织中的25,000多个磷酸化位点，核心活检组织中的> 17,000个位点以及两个中的11,000个蛋白质，以进行综合多组学分析。
我们在原理证明的乳腺癌临床研究中阐明了潜在的微型蛋白质组学，旨在检测抑制ERBB2途径的即时作用。尽管队列规模很小，但我们能够检测到ERBB2蛋白和磷酸化位点水平的统计学显着下调，以及针对pCR相关样品的下游mTOR目标的磷酸化位点扰动。在整个队列中具有完整数据的ERBB2 的7 个磷酸化位点（在补充数据4中确定的21个ERBB2总位点中 ），在pCR病例中均显示出下调（补充数据 5）。在确定的21个位点中，只有两个在细胞系中有详细特征（www.phosphosite.org）。它们是pY-1248，已知的自动激活位点36，和pT-701，它们可以用作负反馈位点37，尽管它们的体内作用在很大程度上尚未被探索。观察到的ERBB2蛋白水平的下调使ERBB2磷酸化在治疗中的作用复杂化，但是从生物标志物的角度来看，这些是次要问题，并不否认我们能够做出有效药代动力学观察的主要结论。同样重要的是，我们在这种情况下解决复杂性以评估对ERBB2信号的抑制的能力还通过下调mTOR（ERBB2下游激活的激酶，特别是在pCR患者中）的靶位点的特征来揭示（图 4c）。
考虑到被指定为ERBB2阳性的肿瘤的生物学变异性，很容易证明最初对ERBB2的蛋白质组学关注。测试指南旨在为尽可能多的患者提供抗ERBB2治疗，即使已认识到这种“全面”方法可能包括许多实际阴性病例38。由于样本量小且我们的研究管线基于研究，因此我们的分析无意是确定的或临床上可行的。但是，这些初步分析表明，可以检测到针对ERBB2导向治疗剂的三类耐药机制。错误的ERBB2 +以案例BCN1326为例。该病例最初由FISH诊断，但使用标准IHC（IHC 1+）重新分析时，ERBB2蛋白并未过表达。分析了三个独立的治疗前和三个治疗后的活检，这有助于排除肿瘤异质性可能是误诊的原因。第二类潜在的错误分类是伪ERBB2 +，由案例BCN1331和BCN1335表示。在这些情况下，有证据显示ERBB2扩增，但是蛋白质组学证据表明ERBB2不是一个强大的驱动因素，包括：（a）与pCR病例相比，ERBB2蛋白和磷蛋白水平较低；（b）最小的ERBB2扩增子（STARD3，PDAP3和GRB7）内其他基因的低表达；（c）缺乏二聚化伴侣ERBB3和ERBB4的表达。使用单次平行反应监测进行的ERBB2水平的正交测量表明，比TMT多重测定更有效的方法最终可以构成临床测定的基础（补充图 6）。）。尽管蛋白基因组学证据显示了真正的ERBB2阳性，但第三个耐药类别显示缺少pCR。在这里，蛋白质组学分析提供了需要考虑的抗药性候选机制，例如粘蛋白的上调，雄激素的活跃信号传导或缺乏抗肿瘤免疫反应。
我们强调，本文的目的不是做出明确的临床结论，而是说明微型蛋白质组学方法论可以揭示的广泛的耐药生物学，从而促进进一步的研究。我们承认，该初步研究中建议的治疗替代方案需要大量的进一步研究。例如，对于BCN1335，蛋白质组学特征（DNA和蛋白质）都表明TOP2A是更可能的驱动因素，其扩增和蛋白质表达均高于ERBB2。关于BCN1371中活跃的雄激素受体信号的证据（图5b）和BCN1369中的粘蛋白表达的证据（图5e）提出了其他治疗假设 。 ）。对于这两个例子，是在性作用的证据之前，曲妥珠单抗，但关于这些建议的机制临床诉持久争议29，39，40。
我们描述了PDX实验旨在说明如何分析proteogenomic可用于鉴定表型模拟假想抗性机制临床标本中观察到单独的PDX，从而推动该可驱动临床试验设计的替代疗法的临床前调查3，6。依维莫司在ERBB2 +乳腺癌中的临床试验显示，将长春瑞滨和曲妥珠单抗联合使用可改善无进展生存期（PFS），但该试验由于毒性而失败。我们的结果表明，在这种情况下使用依维莫司可以在ERBB2 +粘蛋白+肿瘤中重新考虑[ 41]。
本文提出的微尺度蛋白质组学分析的另一个重要特征是评估免疫微环境的能力。这是乳腺癌诊断与PDL1 +中PDL1抑制剂atezolizumab先进TNBC批准的关键方面42。PDL1 IHC用作阿特珠单抗的预测性生物标志物，但免疫微环境分析的最佳方法仍在研究中43。BCN1326和BCN1331是通过蛋白基因组分析挑战ERBB2阳性状态的诊断的示例，显示了PDL1，磷酸化PD-L1和磷酸化PD1表达的蛋白质组学证据，与观察到的浸润TIL模式一致。因此，将来，可以考虑通过蛋白质组学对PD1和PDL1进行评估，以预测PDL1 / PD1抗体的功效。
虽然这里将微尺度的蛋白质组学方法用于乳腺癌的临床研究，但它们显然可以扩展到任何其他实体瘤。尽管从核心针穿刺活检到可行结果（2-4周）所需的时间可能类似于下一代DNA和RNA测序，但所描述的分析并非为临床使用而设计。分析时间可以与样品处理的自动化可以降低，使用更快的仪器和正交气相馏分如FAIMS的44，45，46。此外，通过将使用BioTExt程序获得的一些变性蛋白重定向到针对较大临床发现数据集中描述的靶标开发的PRM分析中，可以很容易地将所提出的方案用作诊断工具，如ERBB2所示（补充图 6））。
总之，我们的研究为癌症患者的核心活检材料的蛋白质组学分析提供了方法。队列人数少，无法就临床效用得出任何明确的结论；但是，我们已经证明，在核心活检组织中鉴定相关蛋白质组学特征是可行的。现在，我们可以通过涉及大量患者的分析来寻求明确的临床结论。
对于PDX研究，所有动物程序均得到美国贝勒医学院（美国德克萨斯州休斯顿）的机构动物护理和使用委员会的批准（协议编号AN-6934）。将PDX肿瘤中的2–3 mm肿瘤块植入到3–4周龄SCID / bg小鼠（Envigo）的透明乳腺脂肪垫中，使其在不补充外源雌激素的情况下生长直至肿瘤达到200–250 mm 3。用于PDX生成的人体组织是在华盛顿大学圣路易斯分校收集的，并且需要患者的适当同意。对于堆芯和块体比较实验，首先从PDX模型中获得了两个不相邻的堆芯，将它们立即嵌入最佳切削温度（OCT）介质中并在液氮中速冻。取芯后，通过手术切除肿瘤，并将肿瘤块在液氮中速冻。对于治疗实验，将小鼠随机分为4组，分别接受（i）媒介物或对照组；（ii）依维莫司（每天每公斤体重5毫克）；（iii）曲妥珠单抗（腹膜内注射，每公斤体重每周30 mg）或iv）曲妥珠单抗和依维莫司的组合（按（ii）和（iii）所述给药）。有n 每只手臂= 15只小鼠。每3-4天通过卡尺测量肿瘤体积。对于所有动物实验，通过。在随机分组当天和治疗开始日期收集基线样品，然后在治疗后1周和4周收集样品。当肿瘤达到1500mm 3或在研究结束时间点处死动物。
获得知情同意后，通过诊断性乳腺活检诊断为ERBB2阳性的患者被纳入ERBB2 +乳腺癌的国家手术辅助性乳房和肠项目（NSABP）生物标本发现项目（DP1）（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/研究/ NCT01850628）。根据同意，在诊断性乳腺活检以及化学疗法和抗ERBB2治疗后48至72小时内，收集常规癌症护理和可选的在最佳切割温度（OCT）固定剂中保存的其他14号针头活检样本。在开始标准治疗之前，在第一次给药后至第二次给药之前的三周之内，以及在手术时，还采集了血液样本并将其压制成冷冻的小球，并送至华盛顿大学（密苏里州圣路易斯）用于研究目的。
收集活检样本，血液样本和医学信息（包括病理报告），并用研究编号标记，该编号是分配给样品和医学信息的唯一代码。链接到患者姓名的唯一代码编号与其他样本信息分开保存。纳入研究后，为每个患者的样品提供一个单独的唯一BCN编号（即BCN“ XXXX”）。所有后续的样本导数都与相应的BCN编号相关联。
患者能够提取样品，而不会受到任何惩罚或丧失应得的利益。但是，为了保护数据库的匿名性，一旦输入数据库，就不会除去来自样品的DNA序列或其他信息，以防止发生识别风险。
将14号针头人体活检标本包埋在OCT固定剂中，并保存在-80°C下。利用保持在-15至-23°C之间的低温恒温器，将每个活检切片切成50微米。在指定用于变性蛋白质DNA，天然蛋白质DNA或RNA提取的三（3）个1.5 mL微量离心管中，六（6）个50微米卷曲发生交替。在切片开始时以及在切片六（6）个间隔后，将5微米的卷曲安装在载玻片上，以进行苏木精和曙红（H＆E）染色并进行组织病理学确认。重复该过程，直到每个样品的所有试管中收集到六（6）个50微米的卷发为止。然后将样品从华盛顿大学（密苏里州圣路易斯）运到贝勒医学院（德克萨斯州休斯顿）进行后续处理。每个活检H＆E玻片（TC1，TC2，TC3，记录TC4和TC4并计算得出该活检的平均肿瘤含量（avgTC）。avgTC小于50％的活检标本从进一步处理中移除。
将带电的载玻片上的组织切片切成5 µm，并在二甲苯中脱蜡，并通过乙醇阶梯梯度重新水化。在以下缩写条件下，按照标准方案进行过氧化物酶封闭，热诱导的抗原修复和一抗孵育：ERBB2（SP3，Neomarkers）1：100，Tris pH 9.0；AR（441，sc-7305，圣克鲁斯）1:50，Tris pH 9.0; Muc1（sc-7313，圣克鲁斯）1：150，柠檬酸pH 6.0; CD3（多克隆，A0452，Dako）1：100，Tris pH 9.0。将所有一抗在室温下孵育1小时，然后用Envision Polymer-HRP抗小鼠/ 3,3'-二氨基联苯胺（DAB; Dako）方法进行标准显色染色。适当时，使用既定指南进行免疫组织化学评分。针对阳性和阴性对照评估了所有IHC结果。
将1 mL冷的70％乙醇（EtOH）加入指定用于变性蛋白质的试管中。将每个试管快速脉冲涡旋振荡30 s，并在4°C下以20,000 xg短暂离心5分钟。小心吸出70％的乙醇。加入1 mL冷的NanoPure水，并将管快速脉冲涡旋振荡30 s，并在4°C下以20,000 xg短暂离心5分钟。小心吸取NanoPure水。加入1 mL冷的100％EtOH，将管快速脉冲涡旋振荡30 s，并在4°C下以20,000 xg短暂离心5分钟。小心吸出100％乙醇。100 µL变性蛋白裂解缓冲液（8 M尿素，75 mM NaCl，1 mM EDTA，50 mM Tris-Cl pH 8.0、10 mM NaF，磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma； P5726），磷酸酶抑制剂混合物3（Sigma； P0044） ），抑肽酶（Sigma; A6103），亮丙肽（Roche; 11017101001），将PMSF（Sigma; 78830））添加到每个样品中，然后将其转移到微型超声瓶中。将所有样品在冰上孵育10分钟。孵育后，将样品在S220超声仪中分别以峰值功率：100.0，占空因数：10.0，每次猝发循环数：500，进行超声处理2分钟。将裂解液转移至1.5 mL标记的试管中，并在4°C下离心，最大速度（20,000 Xg），持续30分钟。将含有变性蛋白质的裂解液上清液转移至新的标记管中。将剩余的沉淀沉淀物速冻以用于随后的DNA分离。变性蛋白质的质量控制通过质谱仪分析得到验证。
通过QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen； 51306）分离DNA。将DNA沉淀平衡至室温。将100 µL缓冲液ATL，然后加入20 µL蛋白酶K并通过涡旋混合。然后将样品在振荡加热块中于56°C孵育3小时。孵育后，将样品短暂离心。向每个样品中加入20 µL RNase A（20 mg / mL），然后脉冲涡旋振荡15 s，并在室温下孵育2分钟。将样品短暂离心，然后脉冲涡旋振荡15 s，并在70°C下孵育10分钟。短暂离心样品后，将200 µL Buffer AL加到样品中，然后脉冲涡旋振荡15 s，再于70°C孵育10分钟。再次短暂离心后，将样品小心地应用到放置在收集管中的相应QIAamp Mini旋转柱上，而不弄湿边缘。将带有样品的离心柱以6000x离心克 1分钟，然后置于一个新的收集管同时丢弃原始滤液。在不润湿边缘的情况下，将500 µL缓冲液AW2添加到离心柱中。将离心柱以最大速度（20,000x g）离心3分钟。离心后，将离心柱置于新的收集管中，并再次以最大速度离心1分钟。然后将离心柱置于新的1.5 mL微量离心管中。将100 µL缓冲液AE添加到每个离心柱中，并在摇动加热块中于室温孵育5分钟。将最终的DNA分离物以6000x g离心1分钟后，收集在其相应的1.5 mL管中。通过Picogreen分析验证了DNA质量控制。
将1 mL TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific; 15596026）添加到每个RNA指定的冷冻切片卷发管中，将其立即倒转3次，然后将其内容物转移到超声瓶中。样品分别在S220超声仪中超声处理2分钟，峰值功率：100.0，占空因数：10.0，周期/爆发：500。然后将所有样品孵育5分钟，然后转移到1.5 mL微量离心管中。加入200 µL氯仿后，将每个样品孵育3分钟，然后以12,000x g的速度离心在4°C下放置15分钟。弃去上清液。将沉淀在微型离心管中风干10分钟。将沉淀重新悬浮在20 µL无RNase的水中，并在56-60°C的加热块中孵育10-15分钟。使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen； 74106）分离RNA。向每个样品中加入10 µL缓冲液RDD和2.5 µL DNase I（Qiagen； 79254）。然后用无RNase的水使样品体积达到100 µL，并在室温下孵育10分钟。加入350 µL Buffer RLT，并与每个样品充分混合。之后，将250 µL 100％EtOH与每个样品混合，并将混合物快速转移至RNeasy MinElute离心柱（Qiagen； 74106）中，并置于2 mL收集管中，然后以12,000x g的速度离心。持续15 s。丢弃流通液，并向每个离心柱中加入500 µL 80％乙醇。将柱以12,000x g离心2分钟。弃掉流出物，将色谱柱放入新的2 mL收集管中。在旋转柱盖打开的情况下，将样品全速离心5分钟。离心后，将离心柱置于1.5 mL微量离心管中，并将14 µL无RNase的水直接添加至离心柱膜的中心。将离心柱以最大速度离心1分钟以洗脱RNA。通过Picogreen分析验证了RNA质量控制。
100 µL天然蛋白裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl，0.5％Triton X-100、1 mM EDTA，1 mM EGTA，10 mM NaF，2.5 mM NaVO 4，蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂混合物）在每个天然蛋白质样品中加入5％的蛋白质，然后将其转移到微型超声瓶中。每个裂解液管都分配了可追踪的质谱仪标签。通过Bradford分析测定的裂解液浓度为每个样品10 µL与800 µL去离子水混合。将200 µL Bradford试剂添加到每个去离子水中，再加入裂解物等分试样。将每个样品倒转并转移到指定的比色杯中。裂解物通过分光光度计与相应的空白样品一起测量。
来自核心活组织检查和种系血液样本的DNA进行了PicoGreen定量。满足最低PicoGreen定量输入要求（≥300 ng DNA，优选浓度10 ng /μL）的样品进入“体细胞全外显子组”工作流程，通过该流程对DNA进行体细胞全外显子组测序。此过程包括文库制备，杂交捕获，76 bp配对末端序列的测序，样品鉴定QC检查以及基于产品的基于连接的文库制备，然后使用具有38 Mb目标区域的Illumina Rapid Capture Exome富集试剂盒进行杂交捕获。
对所有文库进行测序，以尝试使用实验室Picard生物信息学管道实现肿瘤样本覆盖超过50倍覆盖率（+/- 5％）的85％的目标。所有测序均由实验室在Illumina仪器上以76个碱基对，双末端测序进行。皮卡德实验室流水线将来自特定样品的所有数据汇总到一个BAM文件中，该文件包含所有读数，所有读数的所有碱基以及原始/供应商分配的质量得分。
额外处理DNA样品以进行Fluidigm指纹检查。通过对一组高度多态的SNP（包括X和Y染色体上的SNP）进行基因分型，将为每个样品生成独特的遗传“指纹”。这些基因型存储在样品跟踪数据库中，并自动与生产管道中的基因型进行比较，以确保样品跟踪的完整性。
通过比较每个患者的肿瘤BAM文件与种系BAM文件，使用VarScan2从种系BAM文件和体细胞突变中识别种系突变（SNP和INDEL）。然后使用Annovar分别注释来自VarScan的SNP和INDEL vcf文件中每个患者的种系和体细胞突变。从产生的SNP多样本文件中提取具有影响基因蛋白质编码序列的“非同义SNV”，“终止收益”，“终止损失”和“剪接”注释的突变，并将其合并为所有患者的单个文本文件。同样，从每个INDEL multianno文件中提取注释为出现在基因外显子中的INDEL，并将其合并为一个文件。体表将体细胞SNP和INDELs合并为一个突变（唯一突变；补充数据） 3A）和按患者表的单个突变基因（补充数据 3B）。
我们使用了R包CopywriteR（版本1.18.0）47，它使用脱靶整体外显子组测序（WXS）读取来推断拷贝数值。如软件所推荐，所有肿瘤和正常WXS数据均具有足够的（> 500万）脱靶读数用于SCNA检测。CopywriteR包中实现的循环二进制分段（CBS）算法用于具有默认参数的副本数量分段。根据分割结果，我们使用简单的加权和方法总结每个样本的染色体不稳定性5。具体而言，将染色体内所有片段的绝对log2比值（指示这些片段的拷贝数畸变）通过片段长度加权并求和，得出染色体的不稳定性得分。通过汇总所有22个常染色体的不稳定性得分得出全基因组染色体不稳定性指数。接下来，我们使用GISTIC2（版本2.0.23 48）检索基因级拷贝数值（补充数据 3C），并在同类群组中调用显着的拷贝数更改（整数调用）。整数检出结果的严格阈值（2或-2）用于定义拷贝数异常的基因。
通过RiboGreen定量RNA，并通过RQS（RNA质量得分）测量RNA质量。不符合最低RiboGreen定量输入要求（≥500 ng RNA，优选浓度10 ng /μL，RQS> 5.5）的样品将用于进一步评估。处理足够质量的RNA样本以进行长插入特定链转录组测序。文库制备利用Illumina TruSeq RNA协议利用独特的高质量，高通量，低投入过程，该过程使用寡聚dT珠粒从总RNA中生成poly-A mRNA文库。RNA测序文库的构建包括poly-A选择，cDNA合成和使用链特异性Illumina TruSeq方案的文库构建。进入文库构建的每个RNA样品都将等分（ThermoFisher）ERCC对照。使用Illumina平台对所有文库进行测序，以尝试达到50 M个读取的目标，该读取对以101 bp的读取长度成对对齐（+/- 5％），这是使用我们的Picard生物信息学管道测得的。Picard管道将来自特定样本的所有数据聚合到一个单独的多路分解，对齐的BAM文件中，该文件包括所有读数，所有读数的所有碱基以及原始/供应商分配的质量得分。
Picard工具提供的SamToFastq函数用于将每个样本的BAM文件转换为fastq文件。RSEM工具用于计算来自fastq文件49的每个基因的估计阅读计数（RSEM）和每千碱基转录片段的碱基对片段数（FPKM）。对于手稿中描述的分析，将每个样品的非0 RSEM数据进行高四分位标准化，并删除所有样品中读数为0的基因（0个读数视为NA）。使用上四分位数归一化的RSEM数据使用ESTIMATE，Cibersort和xCell推断基质含量（ESTIMATE和xCell），免疫浸润（全部）和肿瘤免疫细胞谱（Cibersort和xCell），并使用log2转换的上四分位数归一化RSEM数据用于以下所述的异常值和LIMMA分析50，51，52。
对于CPTAC工作流程，对4个PDX模型进行了过程复制（8个TMT通道），并以TMT十重格式对2个公共参考（CR）样本进行了分析。第一个共同参照（CR1）由等比例的4种低温粉碎的PDX块状肿瘤衍生的肽构建而成。第二个通用参考文献（CR2）已用于先前的蛋白质组学乳腺癌PDX研究中，该研究包括这四个模型6。对于MiProt工作流程，分析了每个模型包括8个TMT通道的2个核心的8个独立核心，以及2个TMT十重格式的通用参考。如上所述，第一个CR（CR3）由来自8个核心的等比例的肽组成，而第二个CR是主体CR（CR1）的等分试样。蛋白质和磷酸化位点的表达以每个样品的TMT强度与每个plex中包括的CPTAC工作流程的CR1或MiProt工作流程的CR3所包含的内部公共参比强度的对数比的形式报告。为了分析源自患者的核心穿刺活检，使用了TMT-11复式格式，其中前9个通道包含来自9个核心穿刺活检的肽，而后两个通道（131 N，131 C）包含两个不同的CR。通道131 N包含CR4，该CR4由来自所有14位患者的相同比例的肽构成。通道131 C包含CR5，该CR5以前曾用于表征大量乳腺癌亚型（https://cptac-data-portal.georgetown.edu/cptac/study/disclaimer?accNum=S039）。对于此手稿，所有比率均相对于CR4进行了计算。对于PDX和临床核心分析，将TMT11 plex内的样本随机化以减少批次效应（补充数据 1）。
将8 M尿素中的蛋白裂解物用1 mM DTT处理45分钟，然后再用2 mM碘乙酰胺（IAA）处理45分钟。用50 mM Tris-HCL pH 8.5将8 M尿素稀释至2 M的终浓度。将蛋白裂解物与内肽酶LysC（Promega）以1:50的浓度（μgLysC到μg蛋白质）孵育2小时，然后与胰蛋白酶（Promega）以1:30（μg胰蛋白酶的浓度微克蛋白质）。两种酶消化均在室温下进行。蛋白质消化后，将肽酸化至终浓度为1％甲酸，然后使用50 mg Sep-Pak柱（Waters）纯化。用50％乙腈和0.1％甲酸从Sep-Pak柱上洗脱肽。使用Nanodrop（Thermo Scientific）使用280吸光度测量肽浓度。为了进行定性评估，将0.5μg肽在与Q-Exactive + LC-MS设置（Thermo Scientific）连接的nLC1200上运行。将洗脱的肽速冻并使用speed-vac设备干燥。对于CPTAC工作流程，如前所述，总共用300μgTMT试剂标记了300μg肽8。对于MiProt工作流程，用200μgTMT试剂标记100μL50 mM Hepes pH8.5中的25μg肽（过量8倍）。将TMT和肽混合物在室温下孵育1小时。在淬灭过量的TMT试剂之前，将每个样品总共1μL阶段滴加到C18圆盘（EMPORE C18）上，并在30分钟的梯度中运行总共0.5μg的肽段以评估TMT标记效率。另外，将每个样品中的2μL汇集在一起并脱盐。总共0.5μg肽以110分钟的梯度运行，以评估混合比例。与普通内部参比（CR）相比，我们允许部分TMT标记超过99％，完全TMT标记超过94％，混合比例在+/- 15％以内，对于TMT10-plex设置和131N， TMT11-plex设置为131C。使用6μL的5％羟胺（Sigma）淬灭过量的TMT试剂，然后孵育15分钟。根据混合比例混合一个plex中的所有样本，以实现所有通道的均等量。用100mg Sep-Pak软骨（Waters）纯化肽，并用speed-vac装置干燥。
对于碱性反相（bRP）分离，将约250μg肽溶解在500μL5 mM甲酸铵和5％乙腈中。离线安捷伦1260 LC与30 cm和2.1直径的色谱柱连接，流速为200μL/分钟，用于bRP分离。肽被分成72个级分，最后被串联成24个级分。每个级分总共将2μg肽转移到质谱仪样品瓶中以进行整个蛋白质组分析，但是每级分仅注射0.5μg进行整体蛋白质组分析。将这24个级分进一步串联（通过每6个级分合并）为4个级分（每个级分〜62μg肽）以富集磷酸肽。
CPTAC工作流程已在2之前进行了描述。简而言之，对于CPTAC工作流程，将3000μg的肽溶解在1000μL的5 mM甲酸铵和5％乙腈中。如上所述使用30 cm和4.6直径的色谱柱进行离线分馏。将总共72个馏分连接到总共24个馏分中，并对每个馏分分析0.5μg肽进行全细胞蛋白质组学分析。为了基于IMAC的磷酸肽富集，将这24个馏分进一步串联为总共12个馏分（通过合并每个第二馏分，每馏分产生〜250μg）。
磷酸肽富集使用Fe3 +固定金属亲和色谱（IMAC）完成。为此，将Ni-NTA（Qiagen）珠子用HPLC级水洗涤3次，然后与100 mM EDTA（Sigma）孵育30分钟，以去除珠子上的Ni 2+。将小珠用HPLC级水洗涤3次，然后与FeCl 3（Sigma）温育45分钟。再次用HPLC级水洗涤珠，然后重悬浮Fe 3 +的琼脂糖珠中装有重悬缓冲液，其中含有甲醇，乙腈和0.01％的乙酸，比率为1：1：1。对于CPTAC和MiProt工作流程，将干燥的肽重悬于50％乙腈和0.1％三氟乙酸（TFA）中的最终体积为500μL，并补充97％乙腈和0.1％TFA至终浓度为80％乙腈和0.1％TFA。每个级分总共使用20μL50％浆液进行磷酸肽富集。将IMAC珠和肽在室温下于转杯式旋转器上孵育30分钟。离心分离出小珠，并用200μL80％的乙腈和0.1％TFA重悬，然后直接转移到条件C18阶段提示上。使用500 mM K 2 HPO 4从珠子上洗脱磷酸肽将pH 7缓冲液加到C18尖端上，用1％甲酸洗涤，最后用50％乙腈和0.1％FA洗脱到质谱仪LC小瓶中。
将Proxeon nLC-1200与Thermo Lumos仪器耦合使用来进行蛋白质组和磷酸蛋白质组数据采集。肽以110分钟的梯度运行，有效梯度为86分钟（6至30％的缓冲液B，其中含有90％的ACN和0.1％的FA）。对于核心的磷酸化蛋白质组学分析，进行了第二次注射，并在145分钟的梯度中进行了120分钟的有效梯度分析（6至30％的缓冲液B，其中含有90％的ACN和0.1％的FA）。采集参数如下，MS1：分辨率-60,000，MS1注入时间：50 s，MS2：分辨率：50,000，MS2注入时间：110 s，AGC 5E4。以2秒的循环时间进行数据采集。
针对人类（临床样品）或人类和小鼠（PDX样品）RefSeq蛋白质数据库搜索原始文件，其中补充了553个小开放阅读框（smORF）和常见污染物（Human：RefSeq.20111003_Human_ucsc_hg38_cpdb_mito_259contamsnr_553smORFS）： （20160914_Human_Mouse_ucsc_hg19_mm10_customProDBnr_mito_150contams），使用Spectrum Mill套件vB.06.01.202（Broad Institute和Agilent Technologies），如先前详细所述6。对于TMT定量，需要仅对赖氨酸进行完全标记，同时允许对肽N进行欠标记的“仅Lys”选项-termini被使用。半胱氨酸的氨基甲酰甲基化被设置为固定修饰，N端蛋白乙酰化，蛋氨酸氧化（甲氧基），天冬酰胺脱酰胺化，肽N端谷氨酰胺和氨基甲酰甲基化半胱氨酸环化成焦谷氨酸（pyroGlu）和将焦-氨基甲酰基甲基半胱氨酸设置为可变修饰。对于磷酸化蛋白质组分析，允许将丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的磷酸化作为其他变量修饰，而禁用天冬酰胺的脱酰胺作用。胰蛋白酶Allow P被指定为蛋白水解酶，最多允许缺失4个切割位点。对于蛋白质组分析，允许的前体质量转移范围是-18至64 Da，以允许pyroGlu和每个肽最多4 Met-ox。对于磷酸化蛋白质组分析，范围扩大到-18至272 Da，每个肽最多允许3个磷酸化和2个Met-ox。前体和产物的质量公差设置为±20 ppm，肽FDR设置为1％，采用目标诱饵方法，使用反向蛋白质序列42。对于PDX分析，如前所述 6在Spectrum Mill中启用了特定于亚组（SGS）的选项。这使我们能够更好地解剖人类和小鼠来源的蛋白质。如果观察到了来自直系同源蛋白质的人类和小鼠肽的特定证据，那么将无法区分两者（共享）的肽。但是，如果只有一个物种有特定证据，则物种之间共享的肽会保留下来，从而产生一个蛋白质组，其中一个亚组仅归因于与特定肽一致的单个物种。
为了生成蛋白质和磷酸肽比率，校正了同位素杂质和蛋白质相对丰度的报告离子信号，并使用与蛋白质或磷酸化位点匹配的所有PSM的TMT报道离子强度比的中值确定了磷酸化位点。不含TMT标签，前体离子纯度<50％或正负反向得分（所有假阳性识别的一半）的PSM除外。为了标准化TMT10 / 11plex实验中的定量数据，将TMT强度除以每个磷酸位点和蛋白质的指定通用参考值。通过中位数居中和中位数绝对偏差定标进一步标准化Log2 TMT比率。
ERBB2蛋白的两种独特肽（VLQGLPR和GLQSLPTHDPSPLQR）用于PRM分析。通过Orbitrap Fusion Lumos质谱仪结合EASY-nLC1200系统（Thermo Fisher Scientific）进行PRM分析，分析了用于蛋白质组分析的肽。使用溶剂A（0.1％甲酸的水溶液）将最大压力为280 bar的1μg肽上样至捕集柱（150μm×2 cm，粒径1.9μm），然后在硅胶微柱（150μm）上分离×5 cm，粒径1.9μm，梯度为4–28％的流动相B（90％乙腈和0.1％甲酸），流速为750 nl / min，持续75 min。并行使用了数据相关采集（DDA）模式和PRM模式。对于DDA扫描，通过扫描m / z在Orbitrap中执行前体扫描300–1200，分辨率为200 m / z时 120,000 。通过四极杆以2 m / z的窗口分离出最多20个强离子， 并通过归一化碰撞能量为32％的高能碰撞解离（HCD）进行碎片化，并通过离子阱以快速扫描速率对其进行检测。自动增益控制的目标是5×10 5 离子，前驱物扫描的最大注入时间为50毫秒，而10 4离子，MS2扫描的最大注入时间为50毫秒。动态排除时间为20 s（±7 ppm）。对于PRM扫描，通过四极杆在0.7 m / z窗口中分离预选的肽， 然后使用HCD进行归一化碰撞能量为32％的分离，然后通过Orbitrap在200分辨率下以30,000的分辨率扫描产物离子（MS2） m / z。每个肽的扫描窗口设置为4分钟。为了进行相对定量，Proteome Discoverer 2.0软件（Thermo Fisher Scientific）将原始光谱文件压缩为mgf格式，然后与原始数据文件一起导入Skyline。我们通过删除未识别的光谱并调整AUC范围来验证每个结果。最后，将每个肽的至少六个最强产物离子的面积之和用于结果。
使用mRNA和蛋白质表达数据的共表达网络构建以及KEGG通路的基于网络的基因功能预测进行了21，并在OmicsEV（https://github.com/bzhanglab/OmicsEV）中实现。
使用来自患者的一组基线样品中显示出病理完全缓解的每个基因或蛋白质的数据来建立该基因/蛋白质的正态分布。对于每个基因，Z通过确定非pCR中表达值偏离该分布平均值的标准偏差数，计算非pCR情况下每个基线样本的-score。通过Shapiro-Wilk检验，在表现出病理完全缓解的患者中，将具有低方差（方差<1.5）且不具有正态分布的基因/蛋白质清除掉，然后再进行后续分析。对于磷蛋白水平离群分析，评估了每种蛋白的所有磷酸位的平均水平。使用单个样本基因集富集分析（ssGSEA）和MSigDb基因集，对每个非pCR样本中每个数据集的离群值Z得分进行路径分析，方法如下所述。
limma R软件包用于分析具有治疗前和治疗前核心的患者组，以便分别比较每个数据集中pCR和非pCR患者在治疗中与治疗前的表达（RNA，蛋白质，磷蛋白（每种蛋白质的平均磷酸位水平）和磷酸位点数据集），并比较pCR患者与非pCR患者在治疗前后的表达变化。来自BCN1368和BCN1369的样品未包括在该分析中，因为它们没有接受完整的治疗方案（未获得帕妥珠单抗）。首先通过获取所有含有每个完全定位位点的肽段的平均值来处理此分析的磷酸水平数据，这是由Spectrum Mill确定的。对于此分析，包括给定患者的重复核心，但使用limmaplicatCorrelation函数来为每个患者得出共识以进行差异分析。将每个数据集中的每个基因（或位点）拟合到线性模型，并对每个组（治疗中pCR，治疗前pCR，治疗中非pCR和治疗前非PCR）的系数和每个plex（考虑批次效应），并进行审核使用线性模型估计的残差通过limma进行每个比较的T检验。使用以下描述的参数，将PTM-SEA应用于该分析的带符号log10转换后的p值。
使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）和翻译后修饰标记丰富分析（PTM-SEA）进行路径分析。在随后的分析之前，通过对重复样品取平均值，将对技术重复样品的蛋白质和磷酸酯测量值进行合并。散装和核心材料的通路水平比较是基于有符号的log10变换的p值，该值是通过使用limma R软件包分别比较散装和核心样品的腔内肿瘤和基底肿瘤从适度的两次样本T检验得出的。对于蛋白质组数据，我们首先对每种蛋白质应用两次样本温和的T检验，并得到转化的p通过保留每个基因符号的最显着的p值，ssGSEA的- 值（参见上文）崩溃到了以基因为中心的水平。对磷酸水平的数据进行limma分析，以得出每个磷酸化位点的转化p值（见上文）。在两个方向上位于7个氨基酸的磷酸化位点侧翼的序列窗口被用作唯一的位点标识符。对于PTM-SEA，仅考虑通过Spectrum Mill软件确定的完全本地化的磷酸化位点。多重磷酸化肽段上的磷酸化位点使用Krug等人15中描述的方法进行解析。
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