摘要
液体活检为手术后检测无细胞DNA（cfDNA）中的残留疾病提供了新的机会，但可能会因鉴定克隆性造血所致的改变而混淆。在这里，我们通过对来自同一患者的匹配的cfDNA和白细胞进行超灵敏的靶向测序分析，来鉴定循环肿瘤来源的DNA（ctDNA）的变化。我们采用这种方法来分析CRITICS试验中患者的样本，该试验是可手术胃癌患者围手术期治疗的III期随机对照研究。在滤除匹配的白细胞的变化后，在符合多模式治疗条件的患者的术前治疗和手术后九周内分析时，ctDNA的存在可预测复发。
多峰治疗性处理可切除胃癌后的主要挑战是在手术后鉴定患者镜下残留疾病复发的高风险的1，2，3，4。目前可获得的成像技术和传统的血液生物标记物在手术后捕获最小残留疾病（MRD）状态的敏感性较差，并且在临床实践中不起作用5。新辅助化疗对切除标本的影响组织病理学评估已成为一个重要的工具，以提供预后信息6，7，8。但是，微观残留肿瘤，淋巴结浸润和不良的组织病理学反应不能衡量残留疾病的实时存在。更近的方法，如检测循环通过液体活组织检查肿瘤来源的DNA（小牛胸腺DNA）可以用于识别将从辅助治疗选项和进一步后续获益的患者提供新的机会的9，10，11，12。
从理论上说，在新辅助化疗和手术后的循环的能力，非侵入性地检测肿瘤特异性的改变具有迅速和动态告知MRD或临床前转移的存在的电势13，14。无细胞叶绿体DNA是从肿瘤细胞中释放到循环中，并在患者的早期和晚期癌症已经检测到15，16，17，18，19。液体活检方法的主要挑战是开发检测和表征大量无细胞DNA（cfDNA）中少量ctDNA的方法。各种各样的研究都集中在治疗过程中ctDNA的变化上，但主要集中在转移性疾病的发生上，并且主要集中在对有限数量的基因组位置进行分析，这些位置可能仅代表肿瘤克隆的一部分20，21，22，23，24，25，26，27，28。更近的研究具有常见的突变驱动的基因使用的面板，以允许多个驱动克隆的检测，通常在诊断时，在手术后，或在疾病进展16，18，27，29，30，31，32，33，34。然而，基于血液的深度测序方法已提出了关于检测和白血细胞（WBC）的误分类具有不确定潜在的克隆血细胞生成相关于cfDNA衍生变体的担忧18，35，36，37。这些研究通常评估的WBC DNA和cfDNA癌症患者在单一时间点18，38，39，40或在健康个体41，并没有试图以评估这些治疗的过程期间，预测临床结果。
在本研究中，我们应用匹配的cfDNA和WBC测序方法来准确检测可切除胃癌患者术前化疗后和手术后ctDNA的变化。我们假设术前治疗完成后进行ctDNA检测以及手术后进行MRD检测可以预测采用多模式治疗方案治疗的可切除胃癌患者的复发和生存率。总的来说，这些分析评估了一种策略，以区分ctDNA变异与与克隆性造血相关的cfDNA变异，并研究手术前后ctDNA的消除是否可以作为围手术期患者预后的预测生物标志物。
目前的研究是对研究者发起的，开放性，多中心，CRITICS（胃癌的诱导化学疗法后的化学放疗）研究（NCT00407186）的一部分患者进行ctDNA评估的预测价值的探索性分析。，可切除胃癌患者围手术期化疗（化疗组）与术前化疗加术后放化疗（III期随机对照）III期随机对照试验42。在2007年1月11日至2015年4月17日之间，来自荷兰，瑞典和丹麦的56家医院的788名患者被随机随机分配接受三个术前21天周期的静脉内表柔比星，顺铂或奥沙利铂和口服卡培他滨治疗，随后是三个患者术后静脉注射表柔比星，顺铂或奥沙利铂和口服卡培他滨（化疗组），或接受相同的术前治疗，然后放疗联合每日卡培他滨和每周顺铂（放化疗组）。
作为一项原则验证研究，我们对来自荷兰的50位未接受过治疗的未满足以下标准的患者的cfDNA和WBC样本进行了测序和分析：（i）参加了研究的两个部门之一，并接受了三个术前化疗周期；（ii）在采血后24小时内至少有两个连续的时间点可获得血浆，以进行cfDNA分析；（iii）基线时血沉棕黄或全血用于WBC分析；（iv）如果治疗后没有疾病，则进行18个月以上的临床随访（图 1a；补充图 1；补充数据 1）。）。我们的目标是根据术前治疗后的ctDNA评估和具有手术意图的术后MRD分析，预测生存结果。在分析的患者中，根据Lauren的分类，有25名具有弥散性亚型，有24名具有肠道亚型，其中1名被诊断患有腺鳞状胃癌（图 1b；补充数据 1）。21例患者接受了远端胃切除术，17例接受了全胃切除术，4例接受了食管癌切除术，1例接受了近端胃切除术。尽管入选治疗时最初有资格入选，但仍有六名患者在探索性剖腹手术期间显示出疾病晚期的迹象，因此未接受手术切除。另外一名患者由于未知原因未接受手术治疗。根据Mandard的肿瘤消退等级（TRG）确定术前治疗后的组织病理学消退。三名患者在手术时进行了三个周期的术前化学疗法（TRG 1）后完全消退，而10、15、13和2例患者分别处于病理I，II，III和IV期。术前三轮化疗后对切除标本进行集中回顾性病理评估，结果显示20例患者无淋巴结受累（ypN0）证据，而23例淋巴结浸润，其中10例ypN1（包括3 ypN1mi），7例ypN2和6例ypN3疾病患者。26例患者接受了放射治疗并联合顺铂和卡培他滨进行了术后治疗，而24例患者在术后接受了3个周期的表柔比星，顺铂和卡培他滨进行了无放射治疗。6例ypN3疾病。26例患者接受了放射治疗并联合顺铂和卡培他滨进行了术后治疗，而24例患者在术后接受了3个周期的表柔比星，顺铂和卡培他滨进行了无放射治疗。6例ypN3疾病。26例患者接受了放射治疗并联合顺铂和卡培他滨进行了术后治疗，而24例患者在术后接受了3个周期的表柔比星，顺铂和卡培他滨进行了无放射治疗。
研究原理图（一））。确诊为IB–IVA期胃腺癌且有资格接受全身化疗围手术期治疗的患者，随机随机分配接受三个周期的术前化疗，然后进行三个周期的术后化疗，或接受相同的术前治疗方案，然后进行术后放疗联合化疗。在研究入组时（基线），术前化疗三个周期（术前时间点）和手术后（术后时间点），为每位患者采血。首先对血液样本进行处理，以允许从血浆中提取cfDNA，并从白细胞（WBC）中提取基因组DNA（gDNA）。cfDNA和WBC gDNA文库都是用涵盖58个癌症驱动基因的80,930个碱基的自定义RNA寡核苷酸库捕获的。捕获文库以高覆盖率（> 30,000×）进行测序，然后进行序列比对，纠错和变异调用。在cfDNA中鉴定出WBC中检测到的突变并将其去除，从而可以鉴定cfDNA中的肿瘤特异性突变。在这项转化研究中，对部分患者的临床病理特征，手术治疗类型，病理分期和术后治疗类型进行了分析（n ＝ 50）（b）。MSI，微卫星不稳定性；MSS，微卫星稳定性；EBV，爱泼斯坦-巴尔病毒；ECC，表柔比星，顺铂，卡培他滨；CC，顺铂，卡培他滨。
对于每位患者，在试验入组时（基线时间点），患者接受术前化疗的三个周期（术前时间点）之后，手术后但在开始辅助治疗之前（术后时间点）收集血浆和血沉棕黄层（（图 1a；补充数据 1和2）。我们开发了一种方法，通过对cfDNA和WBC进行并行深度测序，然后独立于cfDNA的鉴定和去除WBC中检测到的与造血相关的变化，来独立于组织分析确定循环中的肿瘤特异性变化。对于cfDNA和WBC的测序分析，我们使用了下一代靶向错误校正测序方法来评估58个癌症驱动基因（图。 1a ; 补充数据 3 - 5）18。此方法是基于目标捕获和DNA片段的深度测序（> 30000倍）在整个80930 bp的编码基因区域，同时从PCR扩增和测序假象区分这些的识别cfDNA单碱基置换和小插入或缺失18。对于在cfDNA中检测到的，未通过匹配的WBC测序鉴定出的改变，我们使用等位基因的改变频率以及cfDNA和WBC序列的总覆盖率确定了这种改变是源自贝叶斯统计模型的肿瘤的可能性（请参见方法）。
为了估计在胃癌中检测测序方法的理论敏感性，我们确定了TCGA Pan-Cancer Atlas 43中胃腺癌的比例，其中58个分析基因中的一个或多个发生了改变。这些分析表明，由于436例胃癌病例中的384例在这些基因中至少有一种改变，我们的靶向专家组的敏感性约为88％（补充图 2）。总的来说，我们观察到与弥散亚型相比，肠道亚型患者基线突变等位基因分数的中位数水平明显更高（0.295 vs. 0％，p = 0.015，Wilcoxon秩和检验）（补充图 3a））。在分化良好，中度或分化较差的肿瘤之间，突变等位基因分数的水平之间没有统计学上的显着差异（p = 0.07，Kruskal–Wallis检验）（补充图 3b）。在我们的研究中，肠和弥漫性胃腺癌患者经历了类似的无事件（补充数据 1；补充图 3c）和总体生存率（补充数据 1；补充图 3d）。与原始试验的结果一致42，我们没有观察到与患者随机分组的术后治疗组相关的生存结局有显着差异（补充数据 1; 补充图 3e，f）。
我们评估了基线和术前化疗三个周期后所有50例患者的cfDNA。在基线时，我们检测到40例患者（80％）的cfDNA中的序列改变（图2a；补充数据 6）和31例患者（62％）的WBC中的序列改变 （图 2b；补充数据 7）。从cfDNA数据中删除了WBC衍生的变化（补充数据 8）后，我们在27位患者（54％）中检测到了54种可能具有肿瘤特异性的变化（图 2c；补充数据 9）。在ctDNA中检测到的最频繁改变的基因是TP53（22％），MYC（15％），PIK3CA（15％），KRAS（11％），HRAS（11％），BRAF（11％），ALK（11％），ATM（11％），KIT（11％）和CDH1（7％）（图 2c ;补充数据 9） 。根据TCGA 44建议的胃腺癌分子分类，我们发现爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）阳性（n = 3）或MSI高的患者ctDNA中PIK3CA突变的发生频率更高（60％）肿瘤（n = 2），而EBV阴性（n = 36）和MSS肿瘤（n = 37）的发生率（3％）。
使用超灵敏靶向测序技术检测50例患者的cfDNA（a）和WBCs（b）中的突变，仅表明有改变的病例。减去cfDNA中的WBC衍生变体后，在27个个体中鉴定出ctDNA中的肿瘤特异性突变（c）。密度图显示cfDNA变体（顶部，黄色），WBC变体（中间，紫色）和所得ctDNA变体（底部，蓝色）的突变等位基因分数分布（d）。WBCs中的突变等位基因部分水平（水平轴）和cfDNA中相应的水平（垂直轴）表明，在cfDNA中WBC的变化水平相似（Pearson相关系数= 0.91，p <0.001）。蓝点（e）的阴影表示在WBC中未检测到变异时，已识别出的变体是肿瘤来源的可能性。年龄（横轴）与每个患者中检测到的WBC变体的绝对数量（纵轴）之间的关联表明，WBC改变的数量随年龄增加（r 2 = 0.36，指数相关性）（f）。在cfDNA（上图）和WBC（下图）中检测到的TP53突变的位置和频率表明，cfDNA中TP53的大部分改变来自白细胞。在两个数据集中均未检测到一个TP53剪接位点突变（g）。基于cfDNA片段长度（bp）的cfDNA片段的累积分数显示，与WBC TP53变体（红色）和野生型TP53序列相比，具有肿瘤来源的TP53改变（蓝色）的cfDNA片段的分布发生了变化（p <0.001，Kolmogorov– Smirnov检验）（h）。
在WBC中受影响最频繁的基因是DNMT3A（45％），TP53（29％），EGFR（10％），APC（6％），AR（6％），ATM（6％）和MLH1（6％）（图 2b；补充数据 7）。使用多种方法这些改变的功能性预测分析显示，大多数的变化有可能是有害的或致病45，46（补充图 4A和补充数据 10）。在43个WBC衍生变体中，突变体等位基因分数的中位数为0.31％（四分位间距（IQR）0.18–0.63％），与在cfDNA中鉴定的53个肿瘤特异性变体中的突变体等位基因分数的中位数相似（0.31％，IQR 0.20 –0.55％，p = 0.96，Wilcoxon秩和检验）（图 2d）。我们观察到白细胞中突变等位基因部分的水平与cfDNA中相应变化的水平之间的高度相关性（Pearson相关系数= 0.91）（图 2e）。正如预期的那样，在白细胞中检测到的改变数量随年龄增长而增加（r 2 = 0.36，指数相关）（图 2f）。有趣的是，我们在DNMT3A和TP53中检测到WBC变体，ERBB4，MLH1，PDGFRA，FGFR3，ESR1，IDH2和ATM在cfDNA中没有任何肿瘤特异性改变的11例患者中进行了多个时间点分析（补充图 4b-1）。
我们检测到cfDNA 中TP53的 21个序列变化，包括17个错义突变，2个无意义突变，1个框内缺失和1个剪接位点突变（图 2g；补充数据 6）。在TP53中观察到的cfDNA序列变化中，我们确定了WBC序列中的15个以及匹配的cfDNA中不存在的WBC中的三个变化（图 2g；补充数据 7）。从21 TP53最初在cfDNA中在基线时检测到的突变，只有6个被鉴定为肿瘤特异性突变，包括2个具有终止突变（Q192 *和S166 *）以及4个错义突变（R175H，V216M，N239S，R248W）。我们进一步评估了在cfDNA中检测到的21个TP53突变的片段长度分布。我们观察到，在循环中带有肿瘤特异性TP53突变的片段比带有与克隆性造血相关的TP53变异的片段（p <0.001，Kolmogorov-Smirnov检验）以及带有野生型TP53编码区的片段（p < 0.001，Kolmogorov–Smirnov检验）（图 2h; 补充数据 7 – 9）。这项研究中所有ctDNA和WBC变体与COSMIC体细胞变化数据库的比较表明，在与ctDNA变体相同的位置处具有变化的实体瘤富集，而血液系统恶性肿瘤在WBC变化的位置处具有变化（p <0.0001，χ 2检验）（补充图 5A）。总体而言，在基线时检测WBC变体和肿瘤来源的ctDNA变体在无事件或总体生存率方面未显示出统计学上的显着差异（补充图 5b-e）。
在使用上述cfDNA和WBC的平行测序鉴定ctDNA改变后，我们评估了术前化疗前后的ctDNA水平。30名患者具有可测量叶绿体DNA在基线或在过滤WBC的序列改变（图后的术前的时间点的 图2c），11经历叶绿体DNA水平的完全消除9周全身治疗后（补充图 6和7 ;补充数据 5）。例如，在诊断时出现肠亚型胃腺癌的患者CGST33，TP53 Q192 *和ERBB2的突变等位基因分数浓度分别为2.32％和0.64％R756Cfs * 2分别在术前完全消除。ctDNA的这种下降与在手术时获得的标本中的主要病理反应（TRG 2）一起发生（图 3a）。相反，有19例患者在术前时间点可检测到ctDNA（补充图 6和7；补充数据 5），包括CGST110患者的例子，该患者的突变等位基因分数在基线时为ERBB4 T639M 的0.15％，在基线时为0.12％。术前时间点（图 3b）。该患者在接受全身治疗9周（TRG 5）后未经历肿瘤消退，并在最初诊断后35个月最终死于复发性疾病（补充数据 1）。在确定的19例患者中，有3例的ctDNA水平低于基线检出限，但在术前时间点出现可检测的ctDNA，表明他们对术前治疗无反应（补充数据 8）。毫不奇怪，所有这些患者在手术后都复发了疾病，三分之二死于疾病（补充数据 1）。
基线和术前时间点在分子应答者（CGST33）（a）和非应答者（CGST110）（b）中ctDNA变体的水平。分子响应者中的变异MAF显示出ctDNA的消除，而在分子非响应者中ctDNA的水平相对不变。右侧显示了每种情况下代表Mandard肿瘤消退等级的代表性H＆E图像（放大20倍）。热图代表43例接受手术切除的患者的病理特征（TRG和淋巴结状态）和最高的突变等位基因分数。每种情况下，劳伦（Lauren）的分类都显示在底部（c）。术前时间点肿瘤消退程度与ctDNA状态之间的二分关联（p = 0.03，Fisher精确检验）（d），在肿瘤消退程度与疾病复发之间（p = 0.03，Fisher精确检验）（e），在病理之间淋巴结状态和疾病复发（p = 0.002，Fisher精确检验）（f），以及术前时间点的ctDNA状态与疾病复发之间（p = 0.02，Fisher精确检验）（g）。使用所有cfDNA序列变化，Kaplan-Meier估计术前已检测到未检测到变异的患者无事件存活的情况（对数秩p = 0.76； HR = 0.9； 95％CI = 0.4–2.1）（h）或仅使用从WBC过滤方法中鉴定出的ctDNA改变（对数秩p = 0.01； HR = 3.0； 95％CI = 1.3–6.9）（i）。
术前化疗后，我们确定了7位反应者，其中3位实现了完全病理反应（TRG 1），4位达到了主要病理反应，表现出纤维化的外科手术标本和散在的肿瘤细胞（TRG 2）。所有七个应答者（100％）在术前均未检测到ctDNA（图 3c，d）。在19例表现出可测量但不完全或主要病理反应（TRG 3-4）的患者中，其中13例（68％）ctDNA阴性，在17例无病理改变（TRG 5）的患者中有10例可检测到ctDNA（59 ％）。总体而言，在43位患者中有30位（70％）的ctDNA分析与病理反应评估一致（p = 0.03，Fisher精确检验）（图 3c，d；补充图 8a）。）。
如预期的那样，复发与较低程度的病理反应相关（p = 0.03，Fisher精确检验）（图 3e），至少一个累及的淋巴结（p = 0.002，Fisher精确检验）（图 3f）且可检测到术前时间点的ctDNA（p = 0.02，Fisher精确检验）（图 3g）。TRG评分（TRG 1-2与TRG 3-5）和病理性淋巴结状态（ypN0与ypN +）与生存结果密切相关（补充图 8b，c）。值得注意的是，在术前检测到没有WBC序列过滤器的cfDNA中的突变并不能预测复发的风险（图 3h）。）或死亡（补充图 9a）。但是，当我们使用WBC指导的造血过滤器时，我们观察到在术前时间点检测到的ctDNA与复发风险明显升高和中位无事件生存期较短（18.4个月vs未达到中位值）相关（对数秩p = 0.012；危险比（HR）= 3.0； 95％置信区间（CI）= 1.3–6.9）（图 3i），以及更高的死亡风险和更短的中位总生存期（28.7个月vs.未达到中位值） （对数秩p = 0.03； HR = 2.7； 95％CI = 1.1-6.7）（补充图 9b）。
我们使用WBC过滤方法评估了所有20名患者的术后MRD，这些患者可从术后时间点获得血液样本。在手术后6.5周的中位时间收集血样（补充数据 1）。我们观察到肿瘤特异性突变的完全消除在cfDNA在术后时间点四个患者的主要肿瘤反应（TRG 1和TRG 2），包括在患者CGST32，谁显示出0.65％和0.24％的基线突变体等位基因分数浓度BRAF G469A和KRAS G13R（图 4a））。术前或术后均未检测到该患者的两个热点ctDNA突变，这与显示主要肿瘤消退的手术标本评估相符（TRG 2）（图 4a；补充数据 1和8）。相比之下，我们在16例轻度或无病理性肿瘤反应（TRG 3-5）的患者中，有9例检测到了术后肿瘤特异性突变，包括CGST68患者，该患者的HRAS D54Efs * 53移码突变等位基因分数为0.03％基线时间点发生突变。该患者在术前和术后时间点的HRAS突变等位基因分数逐渐增加，随后出现ERBB4D1184 *，手术后检出率为0.16％的突变等位基因分数（图 4b；补充数据 1和8）。
基线，术前和术后时间点的ctDNA变异水平在分子应答者（CGST32）（a）和无应答者（CGST68）（b）中。分子应答者中的变异MAF显示出ctDNA的消除，而在分子非应答者中ctDNA的水平继续上升。右侧显示了每种情况下代表Mandard肿瘤消退等级的代表性H＆E图像（放大20倍）。ctDNA的纵向表示来自20例患者，其术后时间点可用。黑色垂直线表示手术时间。绿色箭头表示在最后一次随访中无疾病迹象的患者（c）。使用所有cfDNA序列变化（log-rank p = 0.28; HR = 3.3; 95％CI = 0.4–29）（d）或使用仅从WBC过滤方法中鉴定出ctDNA改变（对数秩p = 0.001； HR = 21.8； 95％CI = 3.9–123.1）（e）。
在中位随访42个月后，我们观察到所有11例在术后时间点均未检测到肿瘤特异性突变的患者均活着并且没有复发（图 4c；补充数据 1）。另一方面，在术后时间点有可检测到的肿瘤特异性突变的9名患者中，有6名发展为疾病复发并死于转移性疾病（图 4c；补充数据 1）。术后无WBC过滤器的cfDNA突变检测无法预测复发（补充图 10a）或死亡（图 4d））。相比之下，使用WBC引导的造血滤器，对于术后可检测到肿瘤特异性突变的患者，我们观察到中位无事件生存期明显缩短，无疾病生存的风险高21.8倍（18.7个月vs未达到中位值；对数-等级p <0.001； HR = 21.8； 95％CI = 3.9–123.1）（补充图 10b）以及中位总体生存期明显缩短（28.7 vs.未达到中位值；对数等级p <0.001； HR = 21.8； 95％CI = 3.9–123.1）（图 4e）。使用ctDNA分析确定的疾病复发时间为1.3个月，而临床检测发生时间为10.2个月，导致ctDNA复发的中位前置时间为8.9个月（补充图 10c）。
与胃癌相关的高死亡率反映了治疗选择受限时出现的晚期疾病的流行4。尽管多式联运根治性治疗的值接近，患者的一个显著比例将最终灭亡的局部区域复发，复发腹膜或远处转移的结果2，3。目前的方法来估算疾病复发的手术后风险主要依靠病理分期和微观残留疾病评分系统的评估6，7，8。但是，这些方法存在一些局限性，尤其是肿瘤消退分级量表，这使其在日常临床实践中难以实施8。此外，目前可用的影像学方法和血液蛋白生物标记物检测治愈性手术后残留疾病的敏感性较差，这为在胃癌MRD评估中进行ctDNA分析提供了机会。由于存在MRD，迫切需要选择需要辅助治疗的患者。在这里，我们已经开发出一种组织独立的测序方法，该方法使用匹配的cfDNA和WBC的超灵敏测序来检测术前化疗完成后以及可切除胃癌患者手术后cfDNA中的肿瘤特异性突变。
在这项研究中，我们调查了cfDNA和WBC的平行深度测序对检测与克隆性造血相关的cfDNA改变的价值，并使用此方法纵向推论了真正的肿瘤特异性改变，而与匹配的肿瘤分析无关。虽然叶绿体DNA分析检测MRD的已被用于多种实体瘤的13，14，23，27，32，33，47，48，这些努力已经使用了肿瘤引导方法来识别潜在的改变。我们方法的优势是无需肿瘤组织即可鉴定ctDNA，这可能无法获得或只能在有限的范围内使用，并且测序分析可能会因肿瘤内异质性而受到阻碍。
由于大多数cfDNA通常来自造血细胞49，因此使用无创液体活检进行MRD分析的主要挑战是将肿瘤特异性突变与与生物学变异相关的背景变化区分开。WBC衍生中出现的克隆造血的结果可能混淆是基于cfDNA表征，因为这些在共同的癌症基因驾驶员可能会发生液体活检分析改变38，39，40，41。如我们在此处所示，如果不对WBC DNA进行并行分析，则cfDNA分析将无法适当地确定从无事件生存和总体生存方面受益于围手术期治疗的患者。
但是，使用这些方法非侵入性地检测胃癌存在一些局限性，特别是在患有局部疾病的患者中。在这项研究中，尽管我们分析了相对少量的可用血浆样本的患者，但CRITICS试验的广泛随访时间可以准确确定临床复发率。尽管我们使用的专家组并不是针对胃癌的，但我们在基线时间点仍检测到大多数患者。在基线时未检测到的患者中，有61％具有弥散性亚型，突出显示了与此组织学特征相关的DNA脱落的潜在差异。尽管手术后ctDNA阳性，但仍有部分患者未复发，50，51，我们没有辅助治疗后评估叶绿体DNA的水平。未来的研究将探讨佐剂后ctDNA状况作为佐剂治疗功效的替代标志物的价值。肿瘤引导的个性化的方法可以改善这种方法的准确度 14，32，但是具有需要的肿瘤组织的缺点，是具有挑战性的实现作为广泛使用的标准化测试。尽管我们的方法将来可以通过专门针对胃癌设计的靶向研究小组并结合cfDNA 19的片段化分析得以改进，我们的努力为接受围手术期治疗的患者提供了ctDNA分析实用性的原理证明，值得在随机干预试验中进一步验证。
本研究是一项计划性的探索性分析，其对来自CRITICS研究（NCT00407186）的50名随机选择的患者进行cfDNA评估的预测价值，这些患者具有血浆样品并且至少在两个时间点适合进行基因组分析（图 1a；补充图。 1；补充数据 1）。CRITICS研究是一项针对可切除胃癌患者的围手术期化疗（化学治疗组）与术前化疗与术后放化疗（化学放疗组）的研究者发起，开放标签，多中心，III期随机对照试验42。来自荷兰，瑞典和丹麦的56家医院的788名患者被随机随机分配接受三个术前21天周期的静脉内表柔比星，顺铂或奥沙利铂和口服卡培他滨治疗，随后是三个术后周期的静脉内表柔比星，顺铂或奥沙利铂，口服卡培他滨（化学治疗组）或接受相同的术前治疗方案，然后接受术后放疗联合每日卡培他滨和每周顺铂（化学放疗组）（图 1a；补充图 1；补充数据 1））。试验入组时的基线血样均用于cfDNA和WBC靶向的深度测序（30,000x），然后进行独立的变体检出，并使用WBC过滤方法进一步检测肿瘤特异性突变（图 1a）。使用基线时来自同一患者的WBC测序数据鉴定了连续时间点的肿瘤特异性突变。
如果患者具有组织学证实的胃腺癌（由美国癌症联合委员会定义，第6版），IB–IVA期52，则符合该研究的条件经食管胃十二指肠镜检查和胸部，腹部和骨盆CT评估。当大部分肿瘤位于胃部时，允许有胃食管连接部肿瘤的患者入组，因此可以由Siewert II型（真正的胃食管连接部）和III型（cardi门下胃部）肿瘤组成。患有Siewert I型（食管远端）肿瘤的患者不符合条件。当术前CT扫描提示腹膜癌变时，建议进行腹腔镜检查。根据赫尔辛基宣言进行了患者入组和基因组研究。该研究得到荷兰癌症研究所的医学伦理委员会和所有参与中心的审查委员会的批准。
从每位患者的切除标本中收集病理切片，并根据Lauren's分类标准53通过NCTvG进行集中检查，以确认组织学亚型。根据Mandard的TRG系统，由NCTvG确定组织病理学退化：（i）TRG 1，没有残留肿瘤（病理完全缓解）；（ii）TRG 2，剩下的分散的肿瘤细胞；（iii）TRG 3，纤维化超出肿瘤；（iv）TRG4，肿瘤长出纤维化；（v）TRG 5，无组织学退化迹象（补充数据 1）。为了检测EBV，在切除标本的H＆E玻片上划定了肿瘤区域。在足够量的肿瘤组织的情况下，每个肿瘤取三个核心用于构建组织微阵列（TMA）。切开TMA切片并用于Epstein-Barr病毒编码的RNA原位杂交（EBER-ISH）。如果由于化疗引起的病理（几乎）完全反应而在切除标本中几乎没有或没有留下肿瘤，则对诊断性活检标本进行EBER-ISH。使用U INFORM iViEW Blue ISH（v1.02.0023）和Benchmark Ultra IHC / ISH染色模块（Roche Diagnostics，荷兰）上的INFORM EBER探针根据制造商的规程（补充数据1）进行EBER-ISH 。
诊断活检标本中福尔马林固定石蜡包埋的组织块用于MSI分析。在H＆E载玻片上划定肿瘤区域。从标定的肿瘤区域分离DNA。MSI分析是使用MSI分析系统（MSI Multiplex系统，版本1.2，Promega）进行的，该系统由五个几乎单态的单核苷酸标记（BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24，MONO-27）组成），请按照制造商的说明进行操作。使用ABI 3500遗传分析仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）通过毛细管电泳分离PCR产物，并使用GeneMapper软件（Applied Biosystems，Foster City，CA）进行分析。将内部泳道大小标准添加到PCR样品中，以精确确定等位基因的大小并调整每次运行之间的差异。当所有标记物稳定时，将肿瘤解释为微卫星稳定（MSS）。如果一种标记物不稳定，则将肿瘤解释为MSI低（MSI-L），如果两种或多种标记物显示不稳定，则解释为MSI高（MSI-H）。MSI-L肿瘤包括在MSS类别中（补充数据 1）。
全血收集在K 2 EDTA管中，送至阿姆斯特丹VUmc的中央病理实验室，血浆和细胞成分通过在4°C下于1.5 ml微量离心管中以1300 rpm离心5分钟进行分离，并保存在-20°C直到DNA提取的时间。根据我们先前对ctDNA稳定性的分析54，我们仅将本研究中收集到的样品在采集后24小时内处理。使用Qiagen循环核酸试剂盒（Qiagen GmbH）从血浆中分离cfDNA，并在LoBind管（Eppendorf AG）中洗脱。使用Qiagen DNA Blood Mini Kit（Qiagen GmbH）提取来自WBC的高分子量DNA，然后使用聚焦超声仪（Covaris）剪切。使用Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）评估cfDNA的浓度和质量。具有高分子量DNA的cfDNA样品被排除在研究之外。
来自cfDNA的下一代测序文库和来自WBC的剪切高分子量DNA的制备量为8.4至250 ng（补充数据 2）。如先前所述准备基因组文库18。简而言之，使用了用于Illumina的NEBNext DNA库制备试剂盒[New England Biolabs（NEB）]，并对制造商的指南进行了四个主要修改：（i）库纯化步骤采用了珠上Ampure XP方法，（ii）试剂量相应地调整以适应珠上策略，（iii）在连接反应中使用八个具有8 bp条码的独特Illumina双索引衔接子池，并且（iv）用HotStart Phusion聚合酶扩增cfDNA文库。基因组文库的制备如前所述18。使用Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）对cfDNA基因组文库的浓度和质量进行了评估。
使用安捷伦SureSelect试剂和一组定制的针对58个基因的杂交探针（补充数据3），按照制造商的指导进行捕获 。捕获的文库用HotStart Phusion聚合酶（NEB）扩增。在生物分析仪（Agilent Technologies）上评估捕获的cfDNA文库的浓度和质量。使用Illumina HiSeq 2500（Illumina）上的100 bp配对末端测序对文库进行测序。
如前所述18进行了下一代序列数据的初步处理，用于分析cfDNA和WBC样品中的序列变化。简要地说，Illumina CASAVA（序列和变异的一致性评估）软件（1.8版）用于双索引适配器序列的解复用和屏蔽。使用NovoAlign将序列读数与人类参考基因组（hg19）进行比对，并使用Needleman-Wunsch方法55对选择区域进行额外的比对。
如上所述，使用VariantDx 55（个人基因组诊断）在cfDNA中识别了由点突变，小插入和缺失组成的cfDNA中候选肿瘤特异性突变，如前所述18。简而言之，仅在以下情况下，才将这种改变视为候选的体细胞突变：（i）三个不同的配对读物包含cfDNA中的突变，并且血浆中包含特定突变的不同配对读物的数量至少为总不同读取的0.05％对 或（ii）一个不同的配对读段包含cfDNA中的突变，并且还至少在另一个时间点以（i）中指定的水平检测到该突变；（iii）在基线以一次不同读数的水平收集的样品的匹配WBC测序数据中未鉴定出碱基不匹配或小插入缺失（补充数据 8）; （iv）在自dbSNP衍生的常见种系变体的定制数据库中不存在碱基或错配的错配；（v）碱基的改变并非源于错位的基因组比对，包括旁系同源序列；（vi）该突变落在蛋白质编码区内，并被分类为错义，无义，移码或剪接位点改变。如果核苷酸变化和氨基酸变化与COSMIC数据库中报告的20例以上癌症病例的变化相同，则将候选变化定义为体细胞热点。
对于通过cfDNA测序鉴定但未通过WBC测序鉴定的突变，我们计算了该突变是肿瘤衍生的概率相对于该突变是造血的概率。cfDNA和WBC测序中突变发生变化的观察到的读数的采样分布是一个二项式参数，由该突变的总覆盖率和未知概率θ来确定。下的肿瘤来源的模型，θ WBC是零和仅θ CFDNA是未知的。对于造血模型中，我们假设θ WBC和θ CFDNA是相同的。作为现有对于θ CFDNA，我们使用了β形状参数为2.4和340的分布，使大部分质量松散地集中在样本中观察到的突变等位基因频率上，该样本在cfDNA和WBC测序中均已识别出突变。该先验条件等同于每340个不同分子具有2.4个读数变化的样品。从先验采样大量的θs，我们为每个模拟的θ计算了观测数据的概率。这些概率的遍历平均值近似于在模型上有条件但在θ上无条件的观测数据的可能性。假设先验赔率为1，则后验赔率（POs）与贝叶斯因子相同，我们获得了该突变是由PO /（1 + PO）引起的肿瘤的概率。我们对仅通过cfDNA测序确定的每个突变进行了此分析。
使用多种方法确定统计学显着性。使用Wilcoxon的秩和检验或Kruskal-Wallis检验对连续变量进行两向和三向比较。分类变量的独立性是由Fisher精确检验评估，并χ 2次测试。使用软件包Maftools 56在R中进行了突变组的可视化。皮尔逊相关系数用于确定WBC变体与cfDNA中鉴定的相应变体之间的关联以及WBC变体的数量与年龄之间的关联。使用对数秩检验评估两组之间的生存差异，并使用生存软件包在R中实施。所有假设检验都是两面的。
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