干扰素的制备及检定
(一) 原理
干抗素是干扰素诱生剂作用于有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能蛋白质。它从细胞产生和释放出来以后，又作用于相应的其它同种细胞，使其获得抗病毒及抗肿瘤等多方面的免疫力。所谓干扰素诱生剂，是指能诱导有关生物细胞产生干扰素的一类物质。能诱导有关生物细胞产生α和β干扰素者称甲类干扰素诱生剂，如各种动物病毒、细胞内寄生的微生物等；可诱导T细胞产生γ干扰素的称为乙类干扰素诱生剂，如脂多糖、链球菌毒素、肠毒素A等。在实际工作中，制备干扰素多采用两种方法。一是用干扰素诱生剂诱导某些生物细胞产生干扰素，经提取纯化并检定合格后即可使用。该法所用的细胞多为外周血白细胞。二是采用基因工程法进行生产，即将干扰素基因导入大肠杆菌内，通过培养大肠杆菌来生产干扰素。目前，大规模生产干扰素主要采用基因工程法。下面仅以用干扰素诱生剂制备人白细胞干扰素为例介绍干扰素的制备方法。
(二) 材料和方法
1. 材料细胞培养设备(如培养瓶、多孔培养板、温箱、显微镜、旋转培养器等)、水浴箱等。
2.方法
(1) 制备诱生剂：采用NDV F系弱毒株，以鸡胚尿囊液形式保存于－20℃，其血凝滴度稳定在1∶640～1∶1280之间。大量繁殖时，用0.5%水解乳蛋白稀释100～1000倍，接种于9日龄鸡胚尿囊腔，置37℃培养72h后，收获尿囊液，效价测定应大于1∶640，无菌检查应合格。
(2) 制备诱生细胞：无菌采取人外周血(多用人脐带血，或血库贮藏血)，置于含肝素的无菌瓶内，于4℃保存不超过24h，诱生细胞(白细胞)不单独提取，以全血代替。
(3) 制备粗制干扰素：
①加诱生剂，按1ml抗凝全血加0.2ml诱生剂(即NDV F系尿囊液，其血凝滴度不低于1∶640)；
②加温吸附，将加有诱生剂的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃动一次，使NDV F吸附于白细胞上。然后以1000r/min离心20min，弃上清，留沉淀物；
③加营养液孵育诱生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle营养液于上述沉淀物中，混匀，置35～36℃温箱内旋转培养18～20h；
④离心及酸处理，将上述培养物以2000r/min离心30min，取上清，以6mol/L盐酸将其pH值调至2.0，置4℃冰箱5天灭活NDV；
⑤中性化，经5天酸化后，再用6mol/L氢氧化钠将pH值调至7.2～7.4，即为粗制干扰素。
(4) 制备精品干扰素：
①KCNS沉淀，取上述粗制干扰素，加KCNS并用2mol/L HCl调pH值为3.5，然后以2000r/min离心30min取沉淀；
②酒精提取，将沉淀溶于95%酒精(预冷至－20℃)，用2mol/L NaOH调pH值为4.2，以2000r/min离心30min取上清；用2mol/L HCl调pH值至3.5，离心后取上清，再将pH值调至5-6，离心后取上清，最后将pH值调至7.1，离心后取沉淀；
③过碘酸钠沉淀，将沉淀溶于PBS中，加过碘酸钠，并调pH值为4.5，用50%乙醇10倍稀释，离心后取上清，将上清液对0.3mol/L (NH4)2CO3(pH值7.6)在4℃下透析过夜。sephacryl S200柱层析：将sephacryl S200按要求处理后装柱(4～5×100cm柱)，用PBS平衡后，加样(即上述上清液)，用洗液洗脱。洗脱期间用核酸蛋白仪连续检测，收集相应峰即为精制干扰素。取样进行效价测定，按结果进行稀释，分装并冻干。
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